Luận văn nghiên cứu phát hiện virus gây bệnh thối Đen mũ chúa black queen cell virus trên ong mật Ở miền bắc việt nam

dự phỏng cho bệnh không chính xác có thể đẫn đến sự xuất hiện của vi khuẩn kháng kháng sinh, đồng thời dẫn đến tôn dư kháng sinh trong các sản phẩm của ong, Vi vậy, nghiên cứu phát hiện

DAI HOC QUOC GIA HA NỘI

TRUONG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRINH THT THU

NGIHÊN CỨU PHÁT IIỆN VIRUS GAY BENII

THO] DEN MŨ CHÚA (BLACK QUEEN CELL VIRUS)

TREN ONG MAT 0 MIEN BAC VIET NAM

\ VAN THAC Si KHOA HOC

Hà Nội, năm 2014

DAI HOC QUOC GIA HA NỘI

TRUONG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRỊNH THỊ THU

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH

THIÓI ĐEN MŨ CHÚA LACK QUEEN CELL VIRUS)

TREN ONG MAT O MIEN BAC VIET NAM

Chuyên ngành: Vĩ sinh vật học

LUAN VAN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG ĐẪN KHOA HỌC: TS Đồng Văn Quyền

T% Trần Thị Thanh Huyền

Hà Nội, năm 2014

LOLCAM ON

Dé hoàn thành tốt bài luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiéu sir ding viên, gián dé cha các cá nhân và tập thể

Thước tiên tôi in được gi lời biết ơn chân thành nhất tôi TS Đẳng Vấn

Quyền — Trường phòng Vì sinh vật học phân từ, Phỏ Viêu trường Viên Công nghệ

sinh học dã lưởng dẫn và tạo điều kiện lôi nhát cho tôi dược nghiên cửa và thực

biên luân văn tại phòng Vì sinh vật học phân tử Qua đầy, tôi cũng xin gửi lời cảm

ơn tới NCS Hà Thị Thu cùng các cô chủ, các anh các chị và các em đang công fác tại phòng VSVUPT luôn nhiệt tinh giập 4, tao cho tôi môi trường nghiên củu và làm việc nghiêm túc

Tâi xin gi lài biết ơn tới ban lãnh đạo trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội dã hiên tạo điển kiện !ỐL cho tôi bọc lậu và phải triển Đẳng thời tôi cũng xi bày 6 long biét on tot TS Tran Thi Thanh Huyền, các thấy

cô trong bô môn Vì sinh vật học đổ giúp đỡ tôi trang suốt quả trình tôi học IẬp tại

trưởng

VÀ cuỗi cùng, tôi cũng xia gửi lài cảm ơn đến bạn bè, người thân, những người đã luôn sải cánh cùng tôi, châu sẻ và động viên tôi không ngừng nỗ lực vưan lần trong hạc tẬP cũng nhự trong cuộc sống

Một lần nữa tải xi chân thànÊt cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Trinh Thi Tho

MỤC LỤC

MỞ BẦU

GHƯƠNG I: TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ BÁC ĐIỂM SINH HỌC CỦA LOÀI ONG

1.1.1 Nguẫn gắc của ong

tu

ba

1.1.2 Hình thải cầu tạo ngoài của ong

1.1.3 Vị trí phân loại của ong,

1.1.5 Miễn địch học ở ong,

1.2 TỈNH HÌNH THỊ TRƯỜNG MAT ONG TREN THE, lẽ crới VA TRONG KƯỚC 8

1.2.1 Tình hình thị trường mật ong trên thể giới 8 1.2.2 Tình hình thị trưởng mẬI ong ở Việt Nam 10

1.3 MOT SO BRNI THƯỜNG GẶP Ở ONG 12

1.3.1 Banh ở ong do các tác nhân gây bệnh không phải virue 12

1.4 CAC PHUONG PHAP CHAN ĐOÁN PHÁT HIỆN VIRUS Ở ONG MẬT 23

1.4.1 Phương pháp PLISA (xét nghiệm hắp thụ miễn địch liên kết với enzvme) 13

1.4.2 Phương pháp phản ứng chndi tring hop (PCR) z4

1.4.3 Phương pháp RT ~ PCR sen meiee ¬-

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHẲN ĐOẦN VIRUS GÂY BENH TREN ONG

CHUONG 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIEN CỨU 27

3.3.3 Xác định nẵng độ RA bằng máy quang phổ nanodrop 1

2.3.4 Téng hop cDNA lit RNA téng sé

3.3.5 Khuếch đại doan DNA die hign cho BQCY hy cDNA bing phan img PCR 3.3.6 Điện đã kiếm tra trên gel agarose 1%,

2.3.11 Tinh sạch plasmid tái tổ hợp

2.3.12 Giải trình tự gen bằng máy xác định trình tự tự động ABI 3100

3.3.13 Nhân đồng gen mã hóa heliease và xây dụng cây phát sinh loài

CITUONG 3 KET QUA VA TITAO LUAN

3.1 PHÁT HIỆN SỰ LÂY NIIÊM BOCV TREN ONG MAT G MIEN BAC VIET

NAM

3.1.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số

2 Phát hiện BQCV bằng kỹ thnat RT-PCR

3.1.3 Tách dàng sân nhẩm RT-PCR đoạn DNA đặc hiện BQCV

3.1.4 Kết quả giải trình tự đoạn DNA đặc hiện RQCV'

3.2 SỰ PHÂN BỎ CỦA BQCV TẠI MIỄN BẮC VIỆT NAM

?ỦA BQCV LƯU HANH TRE

GÁC TỈNH MIỄN BẮC VIỆT NAM

KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

TÀI LIỆU THÁM KHẢO

1 36

37 3B

wD

40

Ö 4l

4

Từ viết tắt

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TÁT

'Tên Tiếng Anh dy dd Tén Tiếng Việt

BLAST Basic local Alianment Công cụ tìm kiểm trình tự cơ bản

Bp Base pair Cặp bazd

BQCV | Black queen cell virus 'Virus gây bênh thôi đen mũ chúa

cDNA | Complementary DNA DNA bé sung

DEPC | Diethyl pyrocacbonate

DNA | Deoxyribenleotide acid

Nop |_| National Centre far Trung tam quôc gia về thông fin

Biotechnology Information công nghệ sinh học

OD | Optical Density Mật độ quang học

PCR | Polymerase Chain Reaction | PPhảnúng chuỗi trùng hợp

Rnase | Ribonuclease

REpCR | Revese bamsoripbsc Polymerase Chain Reaction Thần ứng chuối Ging hyp sao chép nguge

DANH MUC HiNH

Hình 1.1 Ông chúa cúa đàn ong nội

Tình 1.3 Ong chúa cửa đần ong ngoái

Linh 1.3 'Tốp 10 nước đạt kim ngach xuất khẩu mật eng lớn nhất thế giới nãm

Hình 1.4 ‘Antu b bị nhiễm BQCV —

Trình 1.5 Nhộng bị nhiễm BQCV

linh 1.6 Ong chúa khỏe mạnh với mũi chủa mở nắp

Hinh 1.7 Sơ đồ câu trúc genơm BQCV

Hình 2.1 So đồ mô tả các bước thực hiện trong nghiên cứu

Minh 2.2 Veetor tách đông pC.R2.1

Hình 3.1 Kết quả điện đi trên gel agarose xáo định cảo mẫu đương tính với

Hình 3.4 Trình tự đoạn [DXNA ngoại lai gần trong vector pCR2.1 147 14 hep:

Tình 3.5: Kết quả so sánh trình tự meleotide đoạn DNA đặc hiệu BQCV Tun

hành ở Việt Nam với trinh tự nueleotide của 3()CV từ Nam Phi

Hình 3.6 Tý lê nhiễm HQCV giữa các tỉnh miễn Bắc Việt Nam

Hình 3.7 Cây phát sinh loài BQCV đựa trên trình tự gen mi hóa Helicase

+?

48

48 a9

DANH MUC BANG

Bang 1.1 Tinh hinh nhap khẩu mật ong vào Mỹ năm 2013 11

Báng 2.2.Thảnh phần phản ứng của hỗn hợp B

Bảng 2.3 Chủ trình nhiệt cho phân ứng tổng hợp eDNA 32

Báng 2.4 Chu trình nhiệt cho phân ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiều 33

Báng 2.5 Thành phần phán ứng gắn nói DNA vào veotor tách đồng 36

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cất plasmid in snneouen 3p

Bang 2.8 Chu trình nhiệt cho phan img PCR khuéch dai đoạn DNA mi héa

Báng 3.1 Kết quả so sánh trình tự nuolodde doạn DNA tách dòng với các

MO DAU

'Từ xa xưa, ơng cững như các sản phẩm tử ong lả những món quả quỷ giả ma

dal dic

thiên nhiên ban lặng cho con người Ông có ruặi ở khắp moi noi tran b

biệt là những nơi có thêm thực vậi phơng phú về đa đựng Nghề nuôi eng đa và

đang muội đồng vai tro quan trong trong đời sống cơn người Ông cũng cấp chờ

chúng ta các sẵn phẩm có giá trị cao như một ong, phân hoa, sữa chúa, keo ong, nọc

ong Mật ơng, phân hoa là sản phẩm chỉnh thu từ ong mật, nó không những cỏ tác

dụng cưng cấp chất đỉnh đưỡng cho con người mà còn là phương thuốc quỷ chữa

bệnh Sáp ong, keo ong, nọc ong ciíng là sản phẩm có giả trị dùng để chữa bệnh và

là nguyễn liệu cho một số ngành công nghiệp |6] Ngoài việu cung cấp các sản

co quam trọng trong nông nghị

phẩm quý kể trên thì on ong côn có vai trò hết

gúp phẩn làm lãng nẵng suất cho nhiều loại cây trồng thông qua quá trình thụ phân cho hoa,

Việt Nam nằm Irơng khu vực nhiệt đới gió mùa, khi hậu nóng ẩm mưa nhiều,

Ất tốt dể nước ta phái triển

nghề nuôi ong rnật, nhưng cũng là điều kiên thuận lợi cho các bệnh ở ong phát triển

thâm thực vật phong phú và đa dang Đỏ là điều kiện

[1] Hiện nay, Việt Xam có khoáng 1.500.000 đàn ơng với sản lượng trén 37.000

tan mật ong Đây là một trong 1U sản phẩm xuất khẩu hàng đầu của cả nước và dang có xu hưởng tăng theo từng năm Tuy thiên những năm gần đây, ngành ơng

của nước ta đeng phối đổi mặt với việc xuất khẩu không ổn định đo tỉnh hình dich

bệnh và vẫn để tồn đư kháng sinh có trong ruật ong

Ong mặt thường bị lên công bởi nhiễu tác nhân gôy bệnh bao gdm virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trừng Các đữ liệu nghiên cửu về hệnh ong những nẩm gần đây cho thấy, một trong những nguyên nhân chính gây tổn thất cho nghề nuôi ong của nước †a là do virus, đặc biết là virus gây bệnh thỏi dan mũ chúa (Black queen

cell virus) lo côn thiểu kiến thức về bệnh ong mật, hoặc khống biết chỉnh xác

nguyên nhân gây bệnh, người nuôi ong thường sử dựng kháng sinh để kiểm soát tất

cả các loại bệnh bao gồm cả virus Tuy nhiên, bệnh ơng đo virms không thể được

sử dụng rộng rãi thuốc kháng sinh nhưr là một điểu trị

điều trị bằng kháng sinh Vĩ

dự phỏng cho bệnh không chính xác có thể đẫn đến sự xuất hiện của vi khuẩn kháng kháng sinh, đồng thời dẫn đến tôn dư kháng sinh trong các sản phẩm của ong,

Vi vậy, nghiên cứu phát hiện các virus gây bệnh trên ong mật trong đó có virus

gây bệnh thôi đen mũ chúa là rất gần thiết và là cơ sử khoa học cho việc phòng

chỗng bệnh, dé sa các biên pháp khoanh ving đập tắt dịch bênh góp phần phát triển bên vững ngành nuôi ơng

XuẬI phát từ các cơ sở trên, chúng lôi thực liện để lài: "Nghiên cứu phát biện

viuy gây bệnh thối den mit chita (Riack queen cell virus) trén ong một ở miền

"Bắc Việt Nam" với các mục dích nghiên cửu như sau:

- _ Chấn đoản Black quen cell virus trén ong mit

-_ Xác dinh sw phan bé eva Black queen cell virus tai các trại nuỏi ong một ở

miễn Bắc Việt Nam

- _ Xác định nguồn góc tiến héa ctia Black queen cell virus gây bệnh trên ong mật ớ miễn Bắc Việt Xam

Tả tải được thực hiện tại Phòng Vi smh vật học Phân tử - Viện Công nghệ sinh học — Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 1: TONG QUAN TAI LIEU

1.1 MOT $6 ĐẶC DIEM SINH HOC CUA LOAI ONG

1.1.1 Nguồn gốc của ong

'Trong lịch sử phát triển của sinh giới thì đông vậi có hai hướng tiền hoá đỏ là

động vật không xương sống và động vậi có xương sông Trơng động vật không cỏ xương sống thì phát triển nhất là ngành chân đôi, trong đó có loài ong Ong có nguồn gốc từ ngành động vật chân đốt, có lên khoa học là Arlnopoda, chân đốt mỏ

nguồn gốc từ giun đốt (Annlidss) xuất phát từ lớp giun nhiều tơ (Polychacta) Quá trình chuyến hoá tử giun nhiều tơ sang ngành chân dỗt là một quá trình phúc tap hoà về mặt câu tạo

Tang Cuficul >Vẻ kiin(bộ xương ngoài)

Biểu bì mổ cơ > bó cơ

Chủ bên > Chỉ phân đốt

Mạch màn lưng >Tim

Cơ quan thị giác phải triển phức tạp Các đốt trước tập hợp thánh đâu, đốt giữa

thành ngực, đốt phân sau chuyển thành phần bụng Bên cạnh đó xuất hiện thêm mét

số cơ quan mới: ông khí, ông Malpighi [3]

1.1.2 Hình thái cầu tạo ngoài của ong

- Cơ thể ong chia làm 3 phân rõ rệt: Dẫu, ngực và phần bụng, các phân này được nỗi với nhan bảng cảo khớp đông

- Có 1 đổi râu

- Có 3 đôi chân và 2 đôi cảnh

- Bên ngoài có lớp vỏ kitin gồm nhiên tắm nối với nhau tạo nên bộ xương

ngoài

- Trong một tố ong có 3 cấp: Ong chúa có kích thước lớn nhất, cánh ngắn, bung dai, cé mau nau den hoặc vàng, ong thợ có kích thước cơ thể nhỏ nhất, có màu

vàng hoặc màu nâu xám hoặc đen xám có sọo vàng, bụng nhọn; ong đực có màu

đen, cảnh đài, tụng ngắn

1.1.3 VỊ trí phân loại cửa ong

'Trong thê giới động vật, ơng mật thuộc ngành chân đốt (Arthropoda) hay lớn

6 chân (Tlecxapodz), phân ngành có ông khỉ (Tracheala)

Lớp sân trùng (Insecta)

Tộ cảnh màng (lymenoptera)

Lig ong mat (Aptsdae)

Giống ong mat (Apis)

Trên thể giới hiện nay có 7 loài ong cho mật, trong đó ở Việt Nam có 4 loài chính:

+ Ong châu Au (Ong ngoai): Apis mellifera (A mellifera)

+ Ong N6i dia (Ong chitu A): Apis cerana (A.cerana}

+ Ong Khoai (Ong gac kéo): Apis dorsata (.dorsata)

+ Ong Hoa (Ong mudi): Apis florea (A.florea)

Trong rỗi loài lại phân chúa thành các phản loài khác nhau như: Đối với ong, châu Âu (4.meilifera) có các phân loài: Ong Ý, ong Trung - Nga, ong Cacpat, ong

Crain, ong vùng Capcazo, Đối với ong châu A A.cerana 06: A.cerana cerana,

A.cerana indica, A.cerana japonica Méi phân loài đồ lại có nhiễu đạng sinh thái

1.1.4 Các k

ong ữ Việt Nam

Trong 4 loài ong được nuời ở Việt Nam thủ có 2 loài ong có giá trị kinh tế

cao, được nuôi rộng rãi đề lây mật và các sản phẩm khác đó là ong nội (ong Châu

A) A-cerana'va ong ngoại (ong chau Au) A.mellifera, Hai loai nay có những đặc điểm khác nhau và bỏ sung cho nhau Còn một số loài ong hoang đã như ong khoai

(A.dorsata), ong đã (4Liaboriosa) hay ong hoa (4,ñorea) thì vẫn chưa được nghiên

cứu, thuần hóa và việc khai thác mật của các loài nảy chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ, chủ yếu mới đừng lại ở mức khai thác và săn bắt trong tự nhiên

+ Ong nội (4pis cerana)

Hình 1.1 Ong chúa của đàn ong nội

Ong néi A.cerana la giong ong bản địa ở Việt Nam Trung Quốc và một số nước khác Ở nước ta, ong nội phân bỗ rộng khấp cả nước ngoại trừ rừng tràm U

Minh Ong nội có kích thước trung bình, đặc tính chăm chỉ, chịu được các điền kiên

sông bất lợi, ít địch bệnh, chất lượng mật tốt, mật ong bán được với giá thành cao Tuy nhiên, ở ong nội năng suât mật thâp, ong khả hung dữ, đễ bốc bay va dé chia

đàn Do là loài ong bản xứ nên ong nội thích nghĩ tốt với nguồn hoa rải rác, điều

kiện khí hâu hay thay đổi Ong nội cỏ thể nuôi từ các quy mô từ hộ gia đình tới nuôi

chuyên nghiệp, nhưng nó thích hợp hơn với kiểu nuôi quy mô nhỏ trong gia đình

với vốn đầu tư ban đầu thấp và chủ yêu là cung câp sản phẩm phục vụ tiêu dùng

trong nước Năng suât mật ở ong nôi chỉ đạt trung bình khoảng tử 10 - 15 kg/

đàn/năm Để phát triển ong nội, người nuôi ong cần chọn các đàn có tính tụ đản

cao, chọn giông ong tốt và quan tâm tới phòng bệnh để nâng cao năng suât cũng như chât lượng mật [1]

© Ong ngoai (Apis mellifera)

Hình 1.2 Ong chúa của đàn ong ngoại

Ong ngoại ⁄wellj/era cỏ nguồn gốc tử châu Âu, châu Phí, được nhập vào

nước †a từ những năm 60 với hỉnh thức thương mại vả đã thích nghỉ tốt với điều

kiên khí hâu và nguồn hoa ở nước ta Đặc biệt ở vùng Nam Bộ và Tây Nguyên là

những nơi eó nguồn hoa tập trung (cao su, cà phê, bông trắng ) do đó năng suat

mật của ong ngoại rât cao, bình quân đạt khoảng 25 - 30kg/dan/nam Loai ong nay phát triển thích hợp với kiểu nuôi chuyên nghiệp với trình độ chuyên môn hóa cao,

vốn đầu tư ban đầu lớn Ong ngoại có kích thước lớn hơn ong nội, chúng khả hiền,

có khả năng tụ đản và dự trữ mật cao hơn so với ong nội Mật ong của ong ngoại

chủ yêu là để xuât khẩu Tuy nhiên, so với ong nội thì ong ngoại có sức chịu dung

kém nên ở những nơi có nguồn hoa rải rác và điều kiện khí hậu khắc nghiệt thì việc

nuôi ong ngoại là không thể Bên cạnh những giả trị kinh tế mà ong ngoại đem lại

thì việc nhap ong A mellifera citing mang theo cac loai ky sinh va bénh như bệnh

thoi au tring chau Âu, bệnh âu trùng túi, bệnh bảo tử tring Nosema gay nguy hai

cho cac loai ong ban dia 6 méi dia phuong, truéc khi hia chon nuéi giéng ong nội

hay ong ngoại thì người nuôi ong cân phải cân nhắc về số lượng cây, nguồn mật,

khả năng đầu tư về thời gian cũng như nguồn vốn để quyết đình [1]

1.1.5 Miễn địch học ở ong

1.1.5.1 Các hàng rào vật lý và hóa học

Virus ong mật thường xâm nhập vào vật chủ qua đường tiêu hóa thông qua

thức ăn hoặc do các chân thương trên bê mật cơ thể, mặc đù chúng cứng có thể trực tiếp đã vào máu qua vét cắn của ký sinh trùng hoặc côn trùng khác Cũng như những,

loài côn trừng khác, ong một có thể sử dụng cả các hàng rảo vật lý và hóa học đỗ tránh nhiễm trùng, Cả hai hàng rào vật lý và hóa hoc đều là nuễn địch không đặc hiệu ănang tính chất bẩm sinh) ở ong mật Các hàng rảo vật lý bao gôm các bội xương ngoài hay lớp biểu bỉ bèn ngoài, lớp lớt krtin của khi quán, niêm mạc lớp

biểu bì của ruột trước và ruột sau Các màng ngoài bao quanh ông tiều hóa, một lớp

lót kiin của ruột giữa, tạo thành môi giao điện thử hai bảo vệ cáo mô từ mỗi trưởng,

Bên ngoài và cững có chức năng như môi rào cần thâm đề giữ tắc nhân gây bệnh mà

xâm nhập lừ nguồn thức ăn vào khoang mâu thông quá thành ruột Ngoài ra, môi trường sinh hóa của ruột cũng cỏ thể hình thành hàng rào hóa học ức chế sự nhân Tên và lẫy lan của tác nhân gây bệnh đến các mô cơ thể,

1.1.3.2 Miễn dịch tẾ bảo

Mặc đù các hàng rào vật lý và hóa học thường giữ cho tác nhân gây bệnh không xâm nhập vào cơ thể, tuy nhiền các tác nhiên gầy bệnh đổi khi vượt qua các

hang rào phòng thủ và bắt đầu nhân làn Bất cứ khi nào các rào cân vật lý và hóa

học bị phá vỡ, ong mật có thể chủ đông tự bảo vệ mình khói bị nhiễm trùng bằng,

cách sử đụng một phản ứng miễn địch tế bảo đại điện cho tuyển phòng thủ thứ hai

và nó xuất hiện ngay lập tức khi nhiễm trùng Muc tiêu chính của hệ thống miễn địch là nhận ra các mầm bệnh và sự khác biệt giữa các phân tử của cơ thể và các

phân tử Ìạ bên ngơài Khi một vỉ sinh vật được nhận ra là các phân tử lạ, hệ thông,

miễn địch được kích hoạt đề gắn kẾt mội phan ứng phòng thủ để giết hoặc loại bö

những kế xâm nhập Côn trửng thiểu globulin miễn dịch, sự nhận ra các phân tử lạ đạt được bằng các thụ thế (PRRS) - các protein miễn địch được mã hỏa đễ nhận ra

các tác nhân gây bệnh liên quan (PAMPS) hiện diện trên bề mặt của vi sinh vật.

PERC cé hai nhém: Cc protein nan biét peptidoglyean (PGRPs) va céc protein

liên kết Gram am (GNBPs) Cac lign két eta PAMPs voi PGRPs va GNHPs kích

mời loạt các phản ứng phòng vệ tế bào không đặc hiệu bao gầm sự thực bào, hình

thành nốt nhỏ, đóng gói và melanin hỏa

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bảo bị nhiễm trừng đã được cho lá đặc

trưng của ong mật [29] Hai enzyme quan trong 1a phenol oxidase va glucose

dehydrogenase đóng một vai trò quan trọng trong việc tổng hợp melanin và cần

thiết cho bảo vệ chống lại xâm nhập vi sinh vật và ký sinh trùng, eö mặt trong màu

của ong mật [47] Các gen mã hỏa serine, protease và sexpins ma tham gia vio cdc liên kết của PAMPs với PGRPs và CINIPs đã được xác định trong bộ gan của loài

ong mật, cho thấy ơng một có một hộ thông rriễn dịch cho phép chúng bão vệ chống,

lại cde vi sinh vật và ký sinh trùng, Tuy nhiên, Yon thé nde ong ruật chống nhiễm virus qua phản ứng tự vệ trung gian tế bảo vẫn chưa được xác định

1.2 TÌNH HÌNH THỊ TRUONG MAT ONG TREN THE GIGI VA TRONG

NƯỚC

1.2.1 Tình hình thị trường mật ong trên thế giới

Trong những năm qua, thị trường mật ơng thế giới có khá nhiều biến đồng,

giá mnật ơng liên tục tăng cao Theo số liệu thống kê năm 2013 của Hiệp hội nuôi

ong quốc tế (APIMONDIA), sản lượng mật ơng thế giới đạt khoảng LỦW triệu tân/năm Trang đó, đứng đầu là Trung Quốc có sán lượng mật øng lớn nhất (khoảng, 440.000 tần) Mặc đù, mật ong của Trmg Quốc trong những năm 1999 bi nhiễm khẳng xinh nên chân Âu và Mỹ đã hạn chế nhập khẩu bên cạnh đó mật ơng Trung

Quậc x ải khẩu vào tlị tường Mỹ đang bị giảm xuống do việc ấp đại luật chồng,

phả giá ấp dụng che các nhà xuất khẩu hiện nay của Trung Quốc Tuy nhiễn, Trung,

Quốc vẫn lả nước xuất khẩu lớn nhất với sản lượng xuất khẩu khoảng 185.000 tần,

det doanh thu khoảng 255 triệu USD trong năm 2013.

Đứng thứ hai sau Trung Quốc về sản lượng xuât khẩu mật ong lả Argentina

Nước nảy đã xuất khẩu gan 115.000 tan mat ong, đạt doanh thu 217 triệu USD

trong năm 2013 Thị trường tiêu thụ mật ong của Argentina chủ yêu là các nước

Châu Âu, trong đó Mỹ là nước nhập khẩu mật ong lớn nhất của Argentina với 41.581 tan, tiếp đến là Đức với 34.988 tân, Anh 16.843 tan va Italia 14.811 tan

Mêxicô là nước đứng hàng thứ ba trên thể giới với sản lượng xuất khâu năm

2013 là 85.600 tân mật ong, đạt doanh thu trên 116 triệu USD và đứng thứ 5 trên

thể giới về kim ngạch xuất khâu Theo số liệu công bổ tại triển lãm mật ong 2013

(Exomiel 2013) tổ chức tại Mêxicô, hiện nay nước này có tới 58.000 gia đình

chuyên nuôi ong với số lượng 23 triệu đàn Thị trưởng xuất khẩu chủ yêu của Méxicé la Dite, Arap Xéut, Nhật Bản và Mỹ [48]

Tép 10 nước đạt kim ngạch xuất khẩu mật ong lớn nhất thế giới năm 2013 được thể hiện cụ thể ở (hình 1.3) [50]

: | | Hh In

về vê vế dể ae

'Hình 1.3, Tốp 10 nước đạt kim ngạch xuất khẩu mật ong lớn nhất thé gidi nim 2013

Tuy nhiên, ngành thương mại mật ong thế giới đang đứng trước những thách thức đòi hỏi các nước phải đáp ứng được những yêu cầu của khách hàng, của các

nhả nhập khẩu vẻ các tiêu chuẩn và pháp chẻ Các thị trường quan trọng như châu

Âu và Mỹ đang đôi hỏi các tiêu chuẩn cao hơn về sản xuất, quản lý, đảm bảo chất lượng và các phương pháp kiểm soát chất lượng Sự tồn dư các chất kháng sinh,

thuốc bảo về thực vật và các loại dược phẩm khác om Jai rong wal orgy diac

chứng mình là những rồi ro chủ yêu trong thương mại mật ơng th

Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh và thuốc bảo vệ thực vật đang trở nên phổ

biển tại nhiễu khu vực trên thế giới, đặc biệt là ở các nước đang phát triển Đây

được xem là một trơng những nguyên nhân chỉnh làm cho mặt ong tại các nước này

khó cạnh tranh khi xuất khẩu sang các thị trường châu Âu và Mỹ,

1.2.2 Tình hình thị trường mật ong ử Việt Nam

Việ

Nam có nhiều lợi thể, đặc biết về điều kiện tự nhiền để phát triển sin

xuất và xuất khẩu một ơng Năm 1994, có nước mới chi có khoảng 40.000 dân ong,

đến năm 2001 la 270.000 dan va hién nay ước tinh cả nước có khoáng trên 1.500.000 đản Từ những năm đâu của thập niên 90, Việt Nam đã bắt đầu gia nhập thi trường xnất khâu mật ong trên thể giới, try nhiên với số Tương hạn chế Từ năm

2000, Việt Nam đã trở Thành anột quốc gia xuất khẩu mật ơng có ủy tín trên thể giới

Hiện may, thco số liệu thông kê Việt Na dứng thứ 6 trên thế

(gi va đứng thử Hai ð

châu Á (sau Tmg Quốc) về lượng mật ong xuất khẩu sang hai thi trưởng xuất khẩu

lớn là EU và Mỹ Hội nuời ong Việt Nam được Hội nuôt ong thể giới công nhận là một thành viên tỉch cực trong số 58 thánh viên của tổ chức nảy Năm 2013 lượng

mật ơng xuất khẩu cúa Việt Nam vảo Mỹ lần đầu trên vượt rnỗc 30.000 tân đại kim

ngạch gần Bũ triệu 1ISD [49]

“Theo bảo cáo thị trưởng mật œmg của lôi đồng quốc gia Mỹ ngày 24/01/2014: Năm 2013 Mỹ nhập khẩu 142.925.543 kg mật ơng với giá trị

455.511.802 USD Các nước xuất khẩu mật ơng chủ yến vào Mỹ là Argentira, Việt

Nam, An Bd, Umguay, Camda va Brasin (bing 1

Bang 1.1 Tình hình nhập khẩu mật ong vào Mỹ năm 2013

Nguôẫn: Theo bảo cáo thị trường mật ong của Hội đẳng quắc gia Mỹ ngày

Qua bằng số liệu trên có thể thầy:

- Về khối lượng mật ong nhập khẩu vào Mỹ, đứng đầu là Argentina 41.581.668 kg,

đứng thứ hai là Việt nam 39.501.060 kg, thứ ba là Ân Độ 24.852.692ka, tiép theo là

cac nude Uruguay, Brasin va Canada

- VỀ giả trị đứng đầu là Argentina đạt giá trị 136.501.855 USD, thứ hai là Việt Nam

75.668.847 USD, rồi đến Ân Độ, Canada, Brasin va Uruguay

- Về giá một ong bình quản/kg cao nhất là Canada đạt 4,61 USD, các nước khác 3,99, tiếp đến Brasin 3,31, Argentina 3,28 và thập nhật là Việt Nam 2,48 USD ‘kg

Với lượng mật ong xuất khẩu sang cả Trung Đồng, Nhát bản, EU và một số nước

châu Ả khác chúng ta đã xuất khoảng 34.000 tân, kim ngạch xuất khẩu đạt khoáng

85 triệu LISD là một bước tiến nhãy vọt của ngành nuôi ong Tuy nhiên, với giá

xuât khâu bình quân 2,48 LISD/kg mật là giả qua thập so với giá xuất khẩu bình quân vào Mỹ là 3,18 LISI/kg Điều này nói lên chất lượng mật ong nước ta vẫn còn

thấp hoặc chưa được đồng đều so với các quốc aia khác

Theo Hiệp hội nuôi ơng Việt NanL Việt Nam tiếp tục thu được kết quả lôL

trong việc xuất khẩu mật ong với thế giới trong báy tháng đầu nấm 2014 Tổng công, 77.00 tấn mật ong đã được xuât khẩu sang 14 quốc gia và vùng lãnh thổ

1.3 MỘT SỞ BỆNIT THƯỜNG GÁP Ở ƠNG

Giống như các động vật khác, ong mật cfing dễ ding rắc một số địch bệnh

và bi nhiễu động vật khác lẫn công Bệnh tật, đại địch nêu ở mức độ nhẹ thủ lâm cho

đản ong suy yếu, giảm quân sỏ, giãm năng suất và chất lượng mật, còn nêu ở mức

độ nặng thi lam cho dan ong bj chet hoặc bỏ tố bắc bay gây thiệt hại kinh tế rất lớn

cho người nuôi ong

1.3.1 Bệnh ớ ong do các tác nhân gây bệnh không phãi virus

1.5.1.1 Bệnh thôi Âu trùng chân Âu (DATCA)

Bệnh thôi âu tring chau Au do Wiitc tìm ra lần đâu tiên ở châu Âu vào năm

1912 Hiện nay bệnh cỏ mật ớ khắp nơi, cả những vùng nuôi ong chiu Au A

mellifera và những ving nud ong chau A A cerana Người †a còn gọi bệnh thôi âu

trùng châu Âu la bệnh thôi âu trùng mở nắp hay thôi âu trùng tuổi nhỏ vì bệnh này

thường gây chết các Ấn trùng ở 3 - 4 ngày tuối Trong mật số trường hợp âu trừng chết bị chua nên còn gọi là thổi ân trùng chua hay thôi ấu trùng đảm Các ân trùng mới chết có màn trắng bệch, sau ngả thành màu vàng nhạt, vắng sẫm rồi nân đậm,

xác chết thối rữn và tụt xuống đây TỔ tổ Ở cáo đàn ong bị bệnh, năng suất trật giảm

từ 20 — 80% Bệnh thối ấu trừng châu Âu có ở Việt Nam từ năm 1969 đo nhập ơng,

từ ngoài vào không qua kiểm địch, và tử năm 1969 dến nay bệnh thôi âu trùng châu

Âu đã xuất hiện ở tắt cả các nơi nuôi ơng nội

Bệnh thôi án trùng châu Âu do vi khuin Mellisococeus pluton (M_ pluton)

gay ra M Phion hinh cau, hai dau hoi kéo dai như mũi giao, bat mau Gram đương

và có kích thước khoảng 0.5-0,7 x 1 pưn, Ví khuẩn không có khả năng sinh nha bào, chúng thường đứng đơn lé, thành cặp hoặc tạo thành chuỗi dài Khi bệnh xãy ra

thường thấy sự cỏ mặt một số vi khuẩn như Paenibacilius alvei va Brevibactllus

laterosporus [42] Tuy nhiên, người ta mới chỉ xác đình được AZ piudon là tác nhân

chính cịn gác vì khuẩn khác chỉ là nguyên nhân thử phát Ä# phươn chiếm đoại

thức ăn của âu trùng, nên nhu cầu ăn gũn án trìng tăng cao, buộc tg nuơi dưỡng

phải cho Âu trùng an nhiều lần Đây cũng là nguyên nhân lùu lây lăn 04, pluton

trong đàn ong Trước khi bước vào vụ mật, số lượng ân trùng cĩ trong đản tăng lên

nhanh, nhưng lượng ong nuơi dưỡng khơng đủ nên âu trùng bị đĩi, bệnh dé bing phát và biểu hiện rõ AZ piufon cĩ khả nàng tơn tại trên cầu ong khoảng 1 năm, và khi gặp điểu kiện thuận lợi nĩ lại tiếp tne gây bệnh cho dan ong [20]

1.3.1.2 Bệnh thấi Âu trùng châu MẸ (T4TCM)

Bệnh thơi âu trùng châu Mỹ do vị khuẩn Paenibacillus larvae (p lavae) gly

rẽ, ví khuẩn cĩ khả năng sinh nhá bảo [2E] f2 Jarvae là lên gọi được phân loại bú từ:

tén ban dau la Bacillus larvae

P larvas cĩ kích thuốc 2,3- 3 pm x 0,5-0,8 pm Nha bào cĩ kích thước 1,3

pm x 0.6 pm [49] P larvae gây bệnh ở tơ cả các giai đoạn của ấu trừng ơng nhưng

ấu trùng non mẫn cắm với P larvae hom cc au trig gia [12] Mỗi ấu rừng nhiềm

bệnh sau khí chết chứa khoảng 2,5 tỷ nha bào Nha bảo cĩ khả năng nảy mâm sau

nhiễn năm tên trữ Nha bảo cĩ sức chỗng chịu với mơi trưởng nhiệt độ cao và cả tia

UV Nĩ vẫn cĩ khá năng sống xĩt khi bị xử lý bằng formaldehyde 10% trong 5 giờ

Âu trùng bị nhiễm P /ørvzø từ nguồn thức ăn thơng qua ong thợ nuơi dưỡng, hoặc từ ong thợ mang nha bảo khi làm vệ sinh tổ [25] Sau khộng 1 ngày ấu trừng

ăn phải nha bào, nha bảo nãy mâm trong ruột giữa của âu trùng và nhân lên với to

độ rất nhanh, đi chuyển từ ruột ra khắp các mơ Sự sinh sơi nảy nở của vi khuẩn gây

bệnh nhanh đến mức ấn hùng bị chết trong vịng với ngày, thường lá sau khỉ lỗ tổ

đã được vít nấp, lâm cho các cầu nhộng khơng đồng đều, tuầu bị sậm lại, trên mặt

câu nhộng xuất hiện những ấu trừng bị bệnh, nắp vít bị lõm xuống khơng bình thường

13.1.3, Bénh du tring véi (Chalkbrood)

Bệnh ấu trùng vôi ở ong mật được gây 1a béi nam Ascosphaera apis

(apis) Nha bảo năm có dạng quả mảu xanh nâu thấm Cẫu tạo của một nang nha bào (kích thước khoảng 47 - 140umn) gồm nhiều bóng nha bảo (9- 19m), tran mdi

bóng lại có rất nhiều nha bảo nắm có kích thước 3.0 — 4.0 x 1.4— 2.00 [42]

Âu trùng nhiềm nha bào 44 apiz từ thức ân Nha bào nay mam trong lumen

cửa tuội ấu Irừng, đặc biệt là ở vùng cuỗi cơ thỄ ẩn trùng Hệ sợi năm san đỏ phá

hủy thành ruột và thâm chỉ phá vỡ cả phần cuỗi cơ thể âu trùng, phần dầu của âu tring it bị ảnh hường San đó chủng bắt đầu phát triển bên ngoái âu trùng

Bệnh thường xảy ra trên âu trùng ong thợ và ong đực Âu trùng chết sau khi

đã được vít nắp khoảng 2 ngày Trên các cầu nhỏng xuất hiện lỗ thủng trên nắp vit của âu trùng Khi chưa được vít nắp, những ấu trùng chết lúc đầu được phủ một lớp phân trắng, căng phòng như bọt biển và chiêm hết lỗ tổ Sau đỏ, chúng trở nên cứng, khỏ và có hình đạng gidng nhu xác trớp Thường nhĩmg xác Âu trừng chất vẫn giữ nguyên màu trắng mêu chúa chỉ bị một chủng mầm ký sinh, nhưng niểu có lui

chủng nẫm ký sinh thì chúng sẽ chuyển sang au xám và đen Ở giải đoạn này ấu

trùng bệnh sẽ được ong loại bố ra ngoài Bệnh được tim thấy ở châu Âu,

Scandinavia ớ Nga, Xew Zealand, Mỹ, Canada, Argentina, Nhật Bán, Philippines,

thimg ong có nhiều đâu vết phân màu vàng hoặc màu đen Bệnh gây chết ong,

trướng thành, làm giám tuéi tho vả làm thể đản ong giảm sút dẫn đến giám nảng

suất mật Dôi khi bệnh này làm cho ong chúa bị chết Nha bào Ä'osena apiz có hình

oval lớn, kích thước 4-6 x 2.4m và chímg chỉ phát triển trong tế bảo biểu mô hệ

tiêu hóa của ong trưởng thành [42] Khi các ong bị nhiễm bệnh đi bài tiết phần có nha bảo rơi vào cây có, ao hồ, rảnh nước sau đó ong khoẻ mạnh đi lấy nước, hoặc

mật phân họa ăn vào bị nhiễm bệnh và lây lam ra cả tô Đề chấn đoán chính xác phải

nghiền nát bụng cúc con ơng nghỉ Tà bị bệnh, thú lấy chát lông soi đưới kính Hiển vì

nếu thấy các nha bảo dựng trực khuẩn ở các muứp có phát huỳnh quang là nhà bào cia Nosema apis Bệnh gây hại phố biên trên các đản ong nuôi ở nhiều nước trên

thể giới, cả các nước ôn đới và ở các nước nhiệt đi [1]

13.15 Ve ky sinh Varroa dectructor (Chi tin)

Ve ky sinh Parroa dectructor thude ho Parrediac cé nguồn gỗc từ ong Châu

Á Apis cerzna nhưng lại Ít gây 1ac déng cho loai ong nay Ve ky sinh tran nhéng

ong đực và rât ít thấy kỷ sinh trên nhéng ong thợ do vòng đới ong thợ ngắn, âu trằng ong thợ chỉ nằm trong lỗ tổ vít nắp 11 ngày, mặt khác đo ơng Thợ có tập tỉnh

tự dẹn vệ sinh cho nhan, cắn và tiêu điệt ve Khi nhộng ong đực bị vơ kỷ sinh nhiều

kỹ sinh Førroa thường bị chết trong vòng Từ I đến 3 năm

1.3.1.6 Le ký sinh †ropilaelaps mercedesae (lí nhỏ)

Loài vẽ này có nguồn góc từ ong khoải Apis dorsata Khi ong Châu Âu

.ALmellfera được âu nhập vào Châu Á thủ loài vợ này chuyển sang ký sinh trên ơng

Châu Âu và gây thiệt hại còn lồn hơn cả vẽ Pa Tuy thiền, ve Trapdaelaps chỉ

ký sinh trên âu trùng vì vậy ở các nước ôn đới thời gian ong qua đông kéo đài 5 — 6

thang, dan ong không nuôi âu trùng nên ve Tropifaelaps không tôn tại được [3] Các

kết quả nghiên cứn cho thấy néu dan ong khuyết nhông và du tring 21 ngày sẽ tiêu

điệt được chỉ nhỏ Chính vi nguyên nhân này nên người nuôi ong áp dụng các biện

pháp nhĩ loại bỏ câu nhéng, nhốt hoặc thay chúa để đàn ong khuyết nhông ‘Theo

Háo cáo Du an diéu tra nganh ong 2010 cia Neuyén Ngoc Vimg diéu tra tỉnh hình nhiém chí nhỏ tai mét sé tinh chin nudi ong phát triển thì 95 — 100% trai ong bị

nhiềm chỉ nhỏ [11]

1.3.2 Bệnh ở ong do virus gây ra

Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thay virus là nguyên nhân chủ yếu lây nhiềm và gây chốt ong thậm chỉ gó thể hủy điệt cả đản ong [15; 45] ÍL nhất có 18

lợi virus khúc nhau đã được phát hiện ở trên ơng [20, 27] Tuy nhiền, hồu hết các

bệnh ở ong đền do 6 loại virus chỉnh san đây gây nên bao gồm: Sacbrood virus

(SBV), Deformed wing virus (DWV), Acute bee paralysis virus (ABPV), Black queen cell virus (BQCV), Chronic bee paralysis virus (CBPV), va Kashmir bee

virus (KBY) Trong đó BQCV là một trong những virus được phát hiện nhiều nhất

trên thể giới [45] Các virus gây bệnh trên ơng một là các virus có hộ gen là NA,

có 3 đạng kích thước 17, 30, 35 trú Hệ gơn cửa những virus này có thể là RXA sợi đôi hoặc RNA sợi đơn RXA sợi dơn hoặc là RNA(Đ) hoặc là RNAC) Các virus ong mat di duoc phan loại thành hai nhóm chính la: Pavirus va Dicistrivirdae

Dicistroviridae) [35, 38] Virus này lần đầu được phân lập từ âu trùng ong chúa chất

và từ nhộng đã bị phản hủy một phần trong cac mi chia miu den, nơi chúng được nuôi dưỡng Khi bị nhiếm virus này, mũ chúa xuất hiện các mảng vá có màu đen,

do đó người ta gợi virus này là virns thối đen mũi chúa [36,17]

BQCV xuất hiện phễ biến ở các cơn ong trưởng thành Tuy nhiên, nó lại ảnh

hưởng lâm sảng chủ yếu ở giai đoạn âu trùng hoặc nhộng của ong chúa Trong giải

đoạn đầu cũa bệnh, au trừng nhiễm bệnh xuất hiện màu vàng nhạt giống như những,

con bị bệnh đo virus sacbrood (SBV) và khỏ khăn khi chui ra khỏi kén Âu trùng và

lá

nhộng bị nhiễm virus sẽ biến đôi thành màu đen và chết nhanh chỏng Cuỗi củng

mũ chúa trở thành màu đen là một triệu chứng đặc trưng của bệnh BQCV, Ong thợ cũng có thể bị nhiễm BQCV Các nghiên cứu vẻ ong thợ ở Pháp và Ảo tìm thấy tỷ

lệ lây nhiễm BQCV tương ứng lả 86% và 30% nhưng chủng thường không biểu hiện triệu chứng bệnh ra bên ngoài [15, 27]

bao gồm đuôi polyA Hệ gen chứa một tỷ lệ cao của A va U, bao gồm 29,2% A,

30,6% U, 18,59% C và 21,6% G Virus có hai khung đọc mé (ORF) ma héa protein

không câu trúc ở đầu 5' và protein câu trúc ở đầu 3' Ở đầu 5' (ORFI) bắt đầu từ

codon khéi dau 1a AUG tai vi trí nueleotit 658 đến 660 và codon kết thúc là UAG tại vị trí nueleotit 5623 đến 5625, mã hóa protein không câu trúc (helicase, protease,

RNA polymerase ) Ở dau 3’ (ORF2) bat đầu tử codon khởi đầu là CCU tử vị trí

nucleotit 5834 đến 5836 va codon kết thúc là UAA tai vi tri nucleotit 8393 đền

8395, mã hóa protein câu trúc (protein capsid) Các protein này được kí hiệu là VPI, VP2, VP3, VP4 véi kich thước lần lượt là 44, 42, 29 và 6kDa [39]

(Nonstructure protein) (Capsid protein)

Poly (A)

Helicase Protease Replicase VP2 VP3 VP1

VP4

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc genom BQCV

+ Đặc điểm của gen mã hóa helicase:

Heliease là một trong những enzyme cần thiết cho quá trình nhân đôi của

DNA Nó sử dụng năng lượng ATP cắt đứt liên kết H› đẻ tháo xoản câu trúc xoắn kép của DNA Từ đó DNA xoắn kép trở thành DNA sợi đơn đồng thời tạo chạc tái bản giúp cho quá trình sao chép điễn ra theo đúng nguyên tắc bán bảo toàn

Trong câu trúc hệ gen của BQCV, trình tự nucleotide của gen mã hỏa Helicase nam trong ving ma héa ORF1 Hiện nay vai trò chính xác của enzyme này

trong BQCV vẫn chưa sáng tỏ Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho rằng enzyme này

liên quan đến sự khác biệt về độc lực giữa các chủng BQCV khác nhau trên ong

mật [22,32]

~ Khả năng gây bệnh và mỗi quan hệ với Nosema apis

Giống như SBV, BQCV có thế nhân lên ở nhộng trong điều kiện phòng thí

nghiệm Tuy nhiên, Khi cấy BQCV vào Âu trùng ong thợ và ong trưởng thành thủ

thường khơng phát triển được Khi ơng trưởng thành bị đồng nhiễm HQCV và ky

sinh trừng N apis tli sẽ bị giảm tuổi thọ sơ với ong chỉ bị nhiễm ký sinh (rùng [19]

Đặc biệt, nến ơng được nuối bằng các nha bào đã bị nhiễu virus thả ong sẽ bị niễm BQCV Khả nồng nhiễm BQCV ở ong sẽ tăng lên khi cĩ mặt của M apis BQCV

liên quan dễn ký sinh trủng đường ruột À àz cả trơng tự nhiên và trong điều kiện

phịng thí nghiêm.heo khảo sát của những nhà nuơi ong ở Ảo cho thấy NV, apis

được tìm thay cĩ mặi trong 78% mẫu ong đương tỉnh voi BQCY va 73% dan ong bị

nhiễm N àiz cũng đơng thời bị nhiễm BQCV Ong trưởng thành ở các đàn ơng

tường cĩ nhiều khả năng bị nhiễm W- apše và RQCV Âu trùng ong chúa cĩ thế bị

nhiềm bệnh do ãn phải thực phẩm chứa lượng lớn virus được tiết ru bởi các con ong, trưởng thành bị nhiễm bệnh Trong tự nhiền ong thợ non đường như hiếm khỉ bi nhiễm với BQCV, bởi vi du trùng ong thợ nhận dược it thức ăn hợn trong một thời

gian ngắn hơn so với âu trùng ong chúa (âu trùng ong thợ và ong due chí được nuơi bằng sữa eng chủa trong 3 ngày đâu cỏn các ngày sau được nuơi bằng hỗn hợp mật

và phân hoa) Tuy nhiên, virus nảy được phát hiện như là một bênh nhiếm tring

khơng biểu hiện rõ ràng ở nhộng ong thợ từ các đàn ong ở Úc đường như khỏe

lên đền 58% số ơng trường thành trong mùa hè Virus này tiếp tục tồn tại ở một số

đân ơng trong suất năm Tuy nhiên, ti lệ nhiễm trừng BQC'V ở nhậng thấp hơn ở

ong trưởng thành, với tơi đa là 2% trong mùa h¿

BQCV được phát hiện ở nhiễu nơi trên thế giới Dĩ là nguyên nhân phế biển

nhất gây tử vong ở ân trừng ong eltia 6 Uc Tai Ue, virus nay da diroc coi 1A nguyén nhân phổ biển nhất gây nên cái chết của ân trùng ong chủa vì nó đã được phát hiện

trong huyết thánh với tỉ lệ 499% của mẫu bệnh [1 3] BQCV cũng thường được phái

Biện trong đản ong mật không biểu hiện rõ răng ở Đan Mạch Ở Đức vào nấm 2001,

BQCV đã được phát

tong Âu trừng ong thợ bị bệnh bằng phương phap PCR

[43] Ngoài ra, sự nhiễm BQCV trên ong cũng đã được báo cáo ở Bắc Mỹ, Trung

Mỹ, Chau Âu, Châu Dại Lương, châu Ả, châu Phi và Trưng Dòng

- Cơn đường lây nhiễm và biên pháp điều tri BOCY

+ Con dường lây nhiễm

BQCV có thể tắn công ở các giai đoạn phát tiển khác nhau của ong mật, bao

gồm trúng, au trùng, nhộng, ong thợ trưởng thành và ong chủa Số lượng cá thể

trong đàn lớn và tỷ lệ tiếp xúc cao giữa các thành viên tạo điểu kiện môi trưởng lý tưởng cho việc truyền các tác nhân gây bệnh Virus được lầy truyền theo chiêu ngang (giữa nhữmg cơn ong thông qua thực phẩm bị nhiễm khnẩn/phân, hoặc ve

varroi), Hoặc theo chiều đục (chuyển từ ong chia cho con gái), Virus thường lồn tại

trong ong mt cach liểm ẩn, không giết chết ong ngay cũng như không biểu hiệ

tức dâu hiệu của bệnh Tuy nhiên trong những điểu kiên nhát định chúng có thể ảnh

địch bệnh này cân phải kiếm soát được tác nhân gây bệnh Nosema và Varroa

Ngoài ra, việc về sinh môi trưởng sạch sẽ, lựa chợn giỗng ong tốt và cho chế độ ãn

uống phủ hợp cũng góp phẩn ngăn chân sự lây lan của BQCV trong các đản ong,

20

Acute bee paralysis virus (ABPV}

Dây là loại virus gây bênh trên ong được tìm thây phổ biển rộng rãi ở hầu hết

các quốc gia trong liền minh châu Âu ABPV ảnh hưởng đến ong trưởng thành khỏe

xrạnh gây rưn và tê liệt trong vòng vài ngày sau khi bị nhiễm bộnh ABPV đã được xác định là một yêu tổ chỉnh góp phần vào tý lệ tử vong của loài ong mật ở các đàn

bị nhiễm khuẩn bởi 1% Javobsond, ABPV lây nhiễm qua tuyển nước bọt của ong,

trưởng thánh và trong thức ăn mà các chất tiết dược thêm vào đó Nó có bộ gen là

soi RNA đơn với 9.470 nucleotide không bao gồm đuôi poly A [37] ABPV chưa

bao giờ được phát hiện ở ong trướng thánh đã chết hoặc âu trùng bằng phương

pháp miễn dịch Phương pháp tối ru được sử dung để phát hiện virus này là kỳ

thuật sinh học phân tử [23, 30]

L323, Chronic bee paralysis virus (CBEW

Virus nay ay nhiễm œng ó các giai đoạn trưởng thành, âu trùng và nhéng trơng đó tân công chủ yến ở giai đoạn trưởng thành Các CRPV lần đầu tiên được

phân lập vào năm 1963 và nhiễm trừng có thể ảnh hưởng tiêu cực bất kỳ đân nào

trong thả nuôi ong đà yếu hay nưạnh Nhiễm trng CBPV biểu hiện một số H

trứng: Đầu tiên, hầu hết ong mmật xuất hiện máu den, không có lông, bóng nhỡn Thứ

hai là ong bị nhiễm bệnh không tích cực đóng góp vảo nhiệm vụ xây tổ và nó

thường bị những con ong bình thường khác tân công bằng cách tỉa cảnh Thử ba là

ong không có khả năng bay, rưn rấy, tê liệt hàng loạt và cuỗi củng là chết [41]

CBPV có bộ gen là RNA Lao gdm hai soi riêng biệt của RNA lương tụ được gợi

là RNAI của 3674 bp và RNA2 của 2305 bp không bao gồm đuôi poly A [40]

1.3.3.4 Naecbroad virus (T21T7)

Bệnh âu trìng túi là một bềnh thường gặp ở ong mật Bệnh do Sacbrood

virus gây ra làm chết hàng loạt ân trừng ở trước giai đoạn hóa nhông [28] Au tring

khỏc mạnh thường phát triển thành nhộng trong vòng 4 ngày sau khi chủng được vít

nắp, nhung néu au tring bị bệnh TATT thỉ khổng thẻ hinh thành nhỏng [21]

Dâu hiệu ban đâu của ong khi mới nhiễm SBY 14 16 bi bit kin, toàn bộ cơ thể

2L

âu trùng bị biển đạng như một cái túi, phía trên nhọn, phía dưới cha một chất lỏng trơng suỗi, cỏ màu hơi vàng Âu trùng chết không có mùi chua Màu sắc thay đối từ màu trắng duc sang nau vàng, âu trừng chết bị khô dẫn ding vay wu Banh dich bừng phối vào mùa xuân khi mà các ân trừng bắt đầu nở Bệnh xuất Tiện ỡ nhiễu rười trên thế giới, ở Anh có đến trên 80% sé du trùng bị chết là do virus 8acÖrood gây

ra Tại Australia, bệnh âu trủng túi gây hậu quả nghiêm trọng cho người nuỗi ong,

tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa tìm ra các loại thuốc nào đặc hiệu đổi với virus này

Virus ¢6 hinh dang gidng Picornavirus [34] Hiện nay, SBV được xếp vào họ Wfiavbss cô bộ gen là RNA sợi đơn đương, có đường kinh là 2#nm, không có vỏ bọc xung quanh và không có biểu hiện đặc biệt khi xr hap 12 gen RNA trong

tự véi thinovirus vé thimh phan base (G+ C= 3

phân hủy trong acid SRV là virus gầy bệnh ở ong đầu tiên được giải trình tự hoàn chỉnh, hệ gen RNA kha dai (8,832 nucleotide), đài hơn so với các loại Pieomavirus ở hệ gen động vật có vú và là sợi dơn, chứa một khung đọc mở lớn (179 dén 8752 nu) mã hỏa cho

chudi protein 2858 acid amin: protein cu tric, protein helicase, enzyme protease và

RNA polymerase

13.2.4 Deformed wing virus

Deformed Wing Virus (DWV) 1a virus có bộ gen là RNA, là 1 trong 18 virus

đã tiết gây bệnh nhiều trên ong 1uật, 4ptz meffðra Vitus này lần đầu được phân

lập từ ong mật có triệu chứng ở Nhật Bàn vào dầu những năm 1980 và hiện nay

đang phổ biển lrên toàn thể guới bất cứ nơi nào tim thay ve Varrae [15] DWV cing

đã được phát hiện bằng xét nghuệm huyết thanh trong ong lin 4 florae Fabr va ong

mat chin A 41 cerana Fabr (Alen and Ball, 1996) va bang RT- PCR trong ong vò

vẽ [31] Virus DWV gay ra di tit cénh va bung thường được tìm thay trén ong mật

đã trưởng thành ở các đàn bị nhiễm ve Varroa Những triệu chứng này bao gồm các

phần phụ bị hư hởng, đặc biệt cánh bị rút ngắn và trở nên võ đựng Ong có triệu

chứng suy giãn nghiêm trọng tndi thọ (thưởng ít hơn 48 giờ) và chúng thường bị

trục xuất khỏi tổ

Hệ gen của virus này được công bỏ năm 2006 Hệ gen gầm 10140 nucleotide trừ 1 đuôi poly A và chứa 1 khung đọc mở đơn mã hóa cho 1 polyprotein 328 kDa Đâu S` của trình lự trưng lâm mã hỏa là trình te din đầu không mã hóa đãi 1144

nuclotide (ỨTR) Đâu 3 tình lự rã hóa là vũng không mã hỏa đài 317 nuclvotide

được gắn đuôi poly Á.Thành phần hệ gen gồm 29,3% Adenosine, 15,8% Cylusine;

kỹ thuật sinh học phân tử hiện đạủ Hiện nay có rât nhiều các công nghệ và các công

cụ có sẵn để phát hiện, định lượng chính xác protein và tự nuclsotide của các tác nhân gây bệnh như virus, vị khuẩn, ký sinh trùng Các kỹ thuật hiện đại cho phép

phát hiện những biên đổi dù rất nhỏ (thay đổi 1 hoặc 1 vài nuelsotiđe) trong trình tự DNA của tác nhân gây bệnh Các phương pháp chấn đoán cô điển phát hiện bệnh

bao gồm xác định triệu chứng biểu hiện bệnh, quan si đưới kinh hiển vị, xéi

nghiệm sinh học và phường pháp huyết [hanh học Mỗi phương pháp có điểm mạnh

và điểm yếu riêng nêu cần lựa chọn công nghệ phủ hợp nhất với yêu cầu chấn đoán

của từng tác nhân gây bệnh Với sự phát triển của khoa học nói chung và sinh học phân từ hiện đại nói riêng, các kỹ thuật chấn đoán phát hiện hiện đại hiện nay có thể phát hiện bệnh ó giai đoạn sớm, với độ nhạy và độ chỉnh xác cao, tiên lợi và đơn giản trong sit dung [16]

1.4.1 Phương pháp ELISA (xét nghiệm hấp thụ mién dich lién két voi enzyme)

ELISA chit wiét tit của cụm tir Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Day

là kỹ thuật được sử dựng phổ biến nhất để xác định kháng thả (KT) đặc hiệu chồng virus ở thời điểm xuất hiện triện trứng hay ngay sau khi xuất hiện triệu chứng Kỹ thật này cho phép xác đỉnh KT ở nông độ rất thầp (khoảng 9,1ngản) Nguyên ly

của phương pháp này là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - khang thé (CX -KT)

KT được đánh đâu bằng cách gắn với cnzvine, khi thêm cơ chất thích hợp cnzwmc

sẽ phân giải cơ chất cho sản phẩm có màu ELISA giúp xác định sự có mặt hay

23

không có mật cửng như lượng KN trong mẫn nghiên ct [10]

- Ưu điểm: Ưu điểm quan trong nhất của kỹ thuật này là độ nhạy cao, có thể phát

ấp; thao lắc nhanh, đơn giản, Ít lồn kém

hiện được phức hợp KN — KT ở nồng độ

- Nhược điểm: Độ đặc hiệu không cao và dỏi hỏi độ tình sạch của mẫu lớn

1.4.2 Phương pháp phẫn ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

PCR là chữ viết tÁt của cụm từ Polymerase Chain Reacion, được Kary

Mullis và các cộng sự phát triển vào năm 1983, Đây được xem là một trơng những

phat minh cé tính chất đột phá lớn nhất của lĩnh vực sinh học phân tứ vá công nghệ

sinh học hiện đai [7]

Hiện nay, PCR là một kỹ thuật phổ biển nhằm khuêch đại (tao ra nhiều bắn

sao) một đoạn DNA má không cần sử dụng các sinh vật sống như £ coli hay nam men PCK được sử dụng trong các nghiên cửu sinh học và y học phục vụ nhiền mục

đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di trưyển, nhận dạng, chấn đoán những

Ếm trimg, lách đỏng genc, và xác

bệnh nh nh huyết thông,

®Nguyễn tắc của PCR lá dựa trên cơ sở lính chất biến tỉnh và hồi tính của

DNA và nguyên lý tổng hợp DXATrên cơ sở trình tự của doạn ĐNA khuôn, đoạn môi, nueleotid tự do và enzyme DNA polymerasc có thể tông hợp được

DNA giới hạn bởi các doạn mỗi Một phản ứng PCE gồm nhiễu sán phẩm ở các

chu kỳ trước lại làm khuôn cho các chu kỳ tiếp theo, vì vậy số lượng bán sao tạo ra

theo cập số nhân Một phản ứng PCE thường thực hiện từ 20 — 40 chu kỷ nên từ l bản DNA khuôn ban đầu có thé tao 2° — 2" ban sao DNA [2]

- Ứn điểm: Thời gian thư hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được mệt trình tr DNA đích Thực hiện đơn giân và ít tốn kém (nỏ được thực hiện trong ông

nghiệm plastie nhỏ gồm thành phản tôi thiểu được thực hiện đồng thời) Độ nhạy và

DNA can khuếch đại khổng vượt quá 3kb Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiền lần) Sai sót trang phản ứng còn đo sử dụng Lnzymes ~Laq-polymerase

(khoảng 10 sai sói cho một lần sao chấp)

1.4.3 Phương pháp RT — PCR

- RT — PCR (Reverse Iraneriplase polynerase chai 1ectiorD là kỹ thuật PCR cải tiấn từ kỹ thuật PCR chuẩn, được sử dụng đễ nhân các đoạn DNA từ mạch khuôn RNA, Thực chất kỹ thuật RT PCR gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn đoạn phiền mã

ngược tử mạch khnén RNA tao cDNA va giai doan khnếch đại đoạn cDNA bing

cặp mỗi đặc higu RT — PCR thutmg duge ạo 1a Une vidn eENA Ion tit

ử dựng

mắt lượng rất nhỏ mRNA; sử dựng trang việc nhận biết các đột biến đa hình đưa

vào trình tự phiến mã ngược và được sử dụng trong việc định lượng ruức độ biểu hiện của gen Ngoài ra, RT ~ PCE còn cỏ một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng

được sử đụng trong việc chấn đoán các bệnh do virus RNA

- Nguyên tắc của phân ứng RT ~ PCR

Về nguyên tác, bước đầu tiên của phản ứng IÈT-PCR là quá trình phiên mã ngược

tir phién mu mRNA 4é tao ra soi đơn cDMA Trong kỹ thuật RT — PCR có sự tham gia cia hai loai enzyme la enzyme phién mã ngược (cversctanseiplasc ) và DNA

polymerase Mét primer chgodeoxynucleotide s& gan vio mRNA và sau đó chủng sẽ

được kéo đài nhd mét enzyme phién mã ngược có hoạt tính polymerase dé tao fhanh ban sao cDNA Ban sao này sau đỏ sẽ được khuấch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ: hai Tùy theo mục đích của xét nghiệm, prirer sử dung để tạo cDNA đầu tiên có th

được thiết kế đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên ml‡NA hay có thể được thiết kế

để gắn vào nhiều vị trí trên mRNA [5] Hién nay, RT — PCR là một trong những phương

pháp phố biển nhất được sử đụng để phát hiện virus gây bệnh hiên ơng mật

1.5 TỈNH HÏÌNH NGHIÊN CỨU CHẤN DOAN VIRUS GÂY BỆNH TRÊN

ONG VIET NAM

6 Vial Nam, nghé madi ong da duege hinh thành từ rất lâu, tuy nhiên những

nghiên cửu về virus gây bệnh trên ong vẫn còn rất hạn ché, có rất it công trình được

v a

công bê Trước đầy, việc phát hiện sự cé mat virus thudng dua vào những phương pháp truyền thông như kinh hiển vị điện tử, huyết thanh hoc hay miễn dich hoc Các phương pháp này có những bạn chế như tốn nhiều thời gian và độ đặc liệu thấp đến đến xáu định sai virus liên quan Ngày nay, kỹ thuật được sử dụng phố biến để

ác bệnh đơ virus hại tiên thực vậi và động vật nới chung và đối với bệnh

phát

do virus gây hại trên ong mật nói riêng là kỹ thuật RT - PCR Năm 2094, lần đâu

tiên Lê Thanh Hòa và công sự đã giảm định virus gây bệnh trên ong bang phương pháp sinh học phân tử tại các trại ang ở Hòa bình, Hải Hưng [4] Tai Trung tam nghiên cứu ong 1'W, Lệ Quang 'Irung và cộng sự (200%) đã bước đầu mg dung ky thuat multiplex RT-PCR/RFLP dé phat b

Phar Hồng Thái và oộng sự (2011) đã sử đựng kỹ thuật RT- PCR để phút hiện

virus trên đam ong nội tại 16a Binh

SBV vA DWV trên ơng mật nuôi tại Hà Nội [8] Trương Anh Tuấn và cộng sự (2013) đã sử dụng kỹ thuật RT — PCR nghiên cứu mức đỏ nhiễm 6 chủng virus phô biển và gây hại nghiêm trọng cho ong mật nuôi tại Việt Nam [9] Mặc đù vậy, các

nghiên cứu mới chí tiền hành trên quy mô nhỏ nên cần thiết phát có những nghiền

cứu ở quy mô toàn quốc về địch tŠ học phân tử của các virus gây bệnh trên ơng, về

đặc điểm phân tử hệ gen của các virus gây bệnh Lông thời chúng †a cũng cẩn phát triển được các phương pháp chân đoán có thể đồng thới phát hiện được nhiễn loại

vius trên củng một phẩm ứng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn Các kết qua nghiễn cứu do sẽ làm cơ sử đề dự báo và đưa ra các biện pháp phòng trừ hiệu quả các bệnh do virus gây ra trên ong ruật đang được nuôi và khai thác ở nước ta

26

CHUGNG 2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

2.1 HA DIEM THU MAU

- Các mẫu ong mật được thu thập tại Š tỉnh mién Bie Vidi Nam, bao gdm

Hưng Yêu, Điện Biên, Hòa Bình, Bắc Giang, Nghệ Au

- Các thí nghiệm được tiền hành tại Phòng Vì sinh học phân tử

sinh học, Viện han 1am Khoa học va Công nghệ Việt Nam,

2.2 VAT LIEU VA HOA CHAT

Viện công nghệ

2.2.1 Vật liệu

Vật liệu là các mẫu âu trùng và ong trưởng thành được thu thập từ các trại

nuôi ong ở 5 tỉnh miền Bắc Việt Xam ở trên

2.3.2 Hóa chất và sinh phẩm

© Sink phan

Bộ xinh phẩm SuperSeipt™ Finsi-SHDNA Synthsis Systern (Invitrogen) dé tong,

hop cDNA, bé sinh phim TA cloning Kit do hãng Invitrogen cung cap dé tach ding

gen, b@ sinh phim do hing Fermentas cung cấp sử dụng dé tinh sạch vector tai to hop, bé sinh phim GenJE!™PCR Purification Kit (Fermentas) dé tinh sạch sản phim PCR, vector tach déng pCR2.1, bé sinh phim BigDye” Terminator v3.1

Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) dings dé giai trình tự gen

«Hóa chất

EDTA (Ethylendiamin tetraacetic acid), SDS (Sodium dodecyl sulphat), Trizol (phenol, pH=8, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate), Chlerofonn, 1s amylalcohol Phenol, Acetat natri, Acetat kali, Ethanol, NaCl, ‘I1is-IICL, Tris

base, Acid acetic, NaOll, Agaross, Pir, Giyoerol, Bromophen-l Blue, X-gal,

Khing sinh Ampicilin, TAB (Tris, acid acctie-Filylendiamin tetra

dùng trong nghiên cứu sinh học phần tử của cáo hãng uy tin nhu Sigma, Merck, Invitrogen

= Dung dich dùng cho điện đi DNA

- Dung dich đèm điện di gốc TAE 50% có thành phần như sau

-_ liệm tra mẫu DNA (Loađing buẾRr) 3X: _

- Lò vi sớng (Sanyo, Nhat Ban), may lắc ổn nhiệt 37°U, máy khuấy từ (RotoLab,

OSD, tủ lạnh sâu -20°C, -75°C (Sanyo, Nhat Bản), máy khuấy trên Vortex (RoloLab, OSD, may quang phd nanoDrop (Thennosciencis), may soi chụp ảnh gel (Bio-Rad), can phan tich 104 (Meter Tolodo), bộ nguồn điện đi (Bio-Esd), tủ cấy v6 wing Senyo), pipclruan các loại (Gilsor), nồi khử ting (Nhat bind, cân điện 10”

*g (Mettler Toledo), máy ly tâm lạnh (Sorvall Biouge Eresco), máy PCR, máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100, Applied Biosystems, Mỹ)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để xác định sự lây nhiệm của BQCV trên ong mit (4pis ceruna va Apis

mellifera) 8 mot số tính miền Bắc Việt Nam, chúng tời tiến hành theo sơ dễ nghiên

cứu nu sau:

2%

'Thu thập mẫu ong du tring và trưởng thành

"Tách chiết RNA tổng số Xác định nông độ RXA bằng máy quang phố

Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số

J

Thực hiện phản ứng PCR với cặp môi đặc hiệu TQCV

J

Diện di kiểm tra trên gel Agarose 1%

Gan sin phim PCR vao vector tach dong PCR2.1

2.3.1 Phương pháp thu mẫn

Âu trùng ong, ong trưởng thành được thu thập từ các trại nuôi ong ở 5 tính

miễn Hắc Mỗi tính thu mẫu ở 6 trại, mỗi trại thu 3 đàn khác nhau, mối đàn thu 100

Âu trùng và 100 ơng trưởng thành Hỏi trại thu mẫu sách nhau ¡nhất là 10 km Mẫu được ký hiệu bằng các chữ cái như ong tưởng thành ký liệu là T và âu trùng ký hiệu là A, chữ số kèm theo được đánh thco thứ tự thu thập mẫu như sau: Hưng Yên, Điện Biên, Hòa Bình, Bắc Giang, Nghệ Án Sau dỏ mẫu được bảo quản trong Ethanol 100% va gitt 6 -20°C cho dén khi sit dung

2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA tông số

thánh

Mỗi dan ong lấy ngẫu nhiên 10 cá thế âu trùng và 10 cả thể ong trưởng

Tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo các bước sau [44]}

Khử trmg dụng cụ nghiền mẫu

Rita mấu âu trừng và ong trưởng thành bang DEPC

NghiÊn mẫu bằng N: lỏng, bỗ sung thêm nước đã xử lý Rnase

Bồ sung 50001 Triol, trìx đếu

Ly tâm 12000 víp 6 4°C trong 2 phùt

Logi bd vim, bd sung Clorofirme isoamyl (24:1) theo 16 1:1 với địch mẫn

Ly tam 12000 v/p 6 4°C trong 30 phút

Hit dich néi va bé sung Isopropanol với tí lệ 1:1

Ta ở nhiệt d} phong trong 5 phiit

Ly tâm 12000 v/p ở 4'C trong 30 phút để thu tủa RNA

Rửa tia lai bing 1 ml Ethanol 70%

Ly tam 12000 v/p trơng 15 phúi ở 4

Lâm khô RNA trong box

Hoa lại clin RMA trong 30 pl netic vé trùng đã loni RNase

Xác định đô tính sạch va ndng độ RNA trong cac miu RNA téng số bằng

may quang phổ nanodrop.