Luận văn nghiên cứu phát hiện lectin thực vật có khả năng ngưng kết Đặc hiệu với một số vi khuẩn gây nhiễm Độc thực phẩm phổ biế

Nghiên cửu khả năng gây ngưng kết của lcein lên một số nhóm vi khuẩn gây ngộ độc 3.3 Nghiễn cửu mỗi tương tác giữa lectin với một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập 3.2.2 KẾT

DẠI HỌC QUỐC GIA IIA NOL

TRUONG PAT HOC KHOA HOC TỰ NHIÊN

Mai Thị Đàm Linh

NGHIÊN CỨU PHAT HLEN LECTIN THUC VAT

CO KHA NANG NGUNG KET BAC HIEU VOI

MOT SO VI KHUAN GAY NHIEM BOC THU'C PHAM

PHO BLEN

LUAN AN TIEN Si SINH HOC

Hà Ni - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KIIOA HỌC TỰ NIIÊN

Mai Thị Đảm Linh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIEN LECTIN THUC VAT

CO KHA NANG NGUNG KET BAC HIEU VỚI

MOT SO VI KIUAN GAY NIIEM DOC TIC PHAM

PHO BIEN

Chuyên ngành: Vị sinh vật học

Mã số: 62 42 40 01

LUẬN ÁN LIÊN SĨ SINII HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.LS Bài Phương Thuận

3 PGS.TS Kiểu Hữu Ảnh

Hà Nội - 2014

Chương 1:Tổng quan tài liệu

1.1Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Trên Thể giới

1.L2 Tại Việt Nam

1.2 Ngô độc thực phẩm đo vì khuẩn

1.3 Một số vỉ khuẩn gây bệnh qua đường thực phẩm thường gặp 1.3.1Vi khuẩn Sialuanella và cáo bệnh do Salmonalla

1.3.2 Shigella va bénh ly tryckhuan

Bic diém sinh hoe cia Shigella

Ngô đỏc thực phẩm do S#¿gei«

1.3.3 Zacherichia coli gây bệnh

Dac điểm sinh học của vi khuẩn E coli

1.3.3.2 Cáo nhóm # coi gây bệnh

1.3.5.4 Tiệnh đường ruôt- đa đầy do Bacllus cereus

1.3.5.5 Vibrio cholera

13.5.6 Clostridkam botidiman va ben do Clostridium batulinum (Bondlism)

1.4 Các kĩ thuật phần tích, kiểm tra vi khuẩn (rong thực phẩm

1.4.1 Các phương pháp truyền thông

1.4.2 Các phương pháp hiện đại

1.4.3 Phương pháp sử đựng lectin

1.5 Lectin và các ứng đụng trong chẩn đoán ví khuẩn

1.5.1 Lectin

1.5.1.1 Dink nghia lectin

1.5.1.2 Nguồn lactin trong tự nhiên

1.5.1.3 Cần tạo phán tử leetin

1.5.1.4Tinh đặc hiệu đường của lectin

1.5.1.5 Ứng đụng của lectin

1.5.2 Các ứng dung ciia lectin trong chan đoán vi khuẩn

1.5.2.1 Ứng đụng của †celin trong chân đoán các vì khuẩn Giam đương

1.4.2.1 Ứng dung lectin trong chấn đoán vi khuẩn Giam âm 49 1.5243 Môi liên quan giữa tính đặc hiện đường của lecfin và khả năng gầy ngưng kết vi

khuẩn

1.5.3 Ý nghĩa cúa việc sử dựng lectin làm công cụ chân đoán vi khuẩn

Chương 2: Dỗi tượng và phương pháp nghiện cửu

2.1 Đối lượng nghiền cửu

2.2 Dụng cụ - hỏa chất môi trưởng,

2.2.1 Lod chat — sinh phẩm, thiết bị đừng trong nghiền cứu vi sinh vật

2.2.2 Hoa cha

sith phẩm, thiél bj dimg trong tach chidl vi nghién eu vé teetin

2.3.3 Mai trường nuôi cấy

2.3 Phương pháp nghiên cửu

2.3.1 Phân lập và định đanh vi sinh vật

2.3.1.1, Kỹ thuật phát hiện §fmomella, Siigella trong thực phẩm

2.3.1.2 Phương pháp phát hiện 8 cofi trong thực phẩm theo Ki thuật IMViC 60

2.3.2.2 Xúc định hoạt độ leetin bằng phân tmg ngưng kết hồng cầu 65

2.3.2.3 Phân ứng ngàng kết giữa các tế bảo vi khuẩn và lectin 66

2.3.2.4 Phương pháp tiến hành phân ứng đặc hiệu đường 67

2.3.2.5 Xác dịnh ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của lectin 7 2.3.2.6 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ của leetin 68

2.3.2.8 Phương pháp sắc ký trao đối ion trên ct CM- Sephadex d9 2.3.2.9 Phương pháp điện di biển tính trén gel polyacrylamide (SDS-PAGE) a

3.1 Nghiên cửu khả năng gây ngưng kết của lcein lên một số nhóm vi khuẩn gây ngộ độc

3.3 Nghiễn cửu mỗi tương tác giữa lectin với một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm phân lập

3.2.2 KẾT quả gầy ngưng kết của lecbin thực vật với vi khuẩn phân lập BB

3.2.2.1 Tác dụng gây ngưng kết của lootin với các chủng thuge chi Salmonella 38 3.3.2.2 Tác dụng gây ngưng kết của lectin v6i Shigella 9 3.3.2.3 Tác dụng của lectin lên các loài vi khuẩn thuộc chỉ 7.eoli 9 3.3.2.4 Tac dung cia lectin lên các loài vi kiman thuge chi Staphylococcus 96

3.3.2.5 Nghiên cứn tỉnh chất gây ngưng kết đặc hiên của lectin 48 ứng đụng lectin vio

3.4 TINH CHẾ VẢ NGHIÊN CỬU DẶC TÍNH HÓA SINH MIỄN DỊCH CỦA 2 LECTIN

CHON LUA

3.4.1 Tỉnh chế và nghiên cửu đặc tính toctin hạt Đậu ma

3.4.1.1 Lựa chọn đệm chiết thích hợp cho quả trình tĩnh chế

3.4.1.2 Tỉnh chế lectin hạt Đận ma bằng kết tủa phân đoạn nhờ điền chính pIE

3.4.1.3 Tỉnh chẳ ĐM-CP2 trên cột sắc ký trao dỗi ion CM- Scphadcx

3.3.1.4 Nghiên cửu một số tính chất hóa sinh của lecin hạt Dậu ma

3.4.2 Tình chế và nghiên cửu đặc tính leetin từ cây Tủ câu đồ

3.4.2.1 Sắc kí qua cột trao đổi ion DE-52 Cellulose

3.3.2.2 Kiểm tra độ tỉnh sạch của chẻ nhầm bằng điện đi biển tinh

3.3.3.3 Nghiên cửu một số đặc tính của lectin Tú cầu đả

BANG DANH MUC CAC CHU VIET TAT

eb Trung tam kiểm soát và ngắn ngửa Dệnh dịch

(Centers of Disease Control and Prevention)

galactosarnine

BAGE Tiện di trên gel polyacrylanud

(Polyacrylamide gel Elsctrophorasis ) PRS Phosphate buffered saline

PCR Phan ting chudi tring hop (Polymerase Chain Reaction)

PWGA ? Wheat geim agglutinin (ectin mam ina my)

'Tïnh hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam

Các phân tử lrên bể ruặt tế bào có khả năng tương tác với lectin

Một số đặc điểm quan trọng của lectin trong việc ứng dụng thành các sản phẩm chẩn đoản vi sinh vật

Tăng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập được trên thực phẩm

Sự tương tác giữa lectin thực vật với các vi khuẩn nghiên cứu

ác dụng ức chế của đường lên các dịch lactin thô

Kết qué phan lap Salmonella trén gác mẫu thức ăn

Két qua phan lap Shigelfe trén các nhóm thực phẩm Két qua phan tmg sinh hoa cita cde ching 2 coli phan lap Kết quả ngưng kết với kháng huyệt thanh của các chúng nghiên cứu

Sự có mặt của Šplyfococeus œreus trên các mẫu thức ăn Kết quá thí nghiệm xác định enzyan coagulase của các chủng phản lập Tác đụng gây ngưng kết của leclin với Salmonalla

Tác dung gay ngung két ctia lectin voi Shigella flexnert

‘Tac dung gay ngung két otia lectin véi vi khmdn J «oi

Sự tương tác giữa Icctin với các loài vi Klnain Stapiiplocacens

Sự tương tác giữa lectin với các vị khuẩn nghiên cửu

Kết quả loại bô protein tạp DCT lectin hạt Đậu ma bằng pI1 3.5

‘Két qua loai bé protein tap DCT lectin lat Dau ma bang pll 9.5 Kết quá vẻ tỉnh đặc hiệu đường cúa lectin Dau ma

Khả năng ngưng kết vi khẩn của địch thô và chế phẩm hat Dậu ma

Kết quả tĩnh chế lectin Tủ cầu đỏ qua cột DE — 52 Kết quá và tỉnh đặc hiệu đường cúa lectin Tủ cầu đỗ

Táo đụng gây ngưng kết của lectin Tú cầu với các vi khuẩn nghiên cứ

Câu trúc kháng nguyên O của a#monella O6,7

"âu tric khang nguyén O cia Salmonella 062 ssp.arizonae Cfu tric khang nguyén O cila Shgella flemert serotype Y

M6 hinh edu tao dc t6 vi khudn Shigella

Surxdm nhap cila Shigelia trong lễ bảo biểu mô ruột Câu trúc của oligosaccbaride (1) và O-polysaccharids (3) cúa Z colt

Ø150

Can tris lép glycan cla Staphylococcus aureus

‘Vi ti lign két đặc hiện đường Gal/GaNAc ctia 4 loai lectin hg Dau

Lectin ConA ngung kết với E, col; giản tiếp qua duong mannose

Đồ tị biểu điển mỗi tương quan giữa mật độ quang học và nông độ

protein chuẩn theo phương pháp Lowry

“Kết quả phản ứng sinh hoá của chủng Sa6woneiia phân lấp Hin dang t8 bao ci clring Shigella

Két qua cdc phan img sinh hod cia ching Shigella Hình thái khuẩn lạc và tế bào củn E.eoli

Kết quả phẩm mg sinh hoa ctia E.coli

1lỉnh ảnh khuẩn lạo 8 aureuz trên môi trường Chapman

Tinh ảnh tế bào ofa ching 4 aureus phan lap

11ỉnh ảnh khuẩn lạc ca 8 œzeus trên môi trường Baird-Patker ohita

Tông đỏ img ga Kết quả ngưng kết của loctin thực vật với chủng §almonella

Tĩình ảnh ngưng kết của các nhóm †ectin thục vật với chủng Z «ai

Sơ đồ khoá định loại c&c chủng vị khuẩn # col¿

Sơ đồ khoá định loại céc chting thude chi Staphylacoccns

Sơ đỗ khoá định loại tổng quát cáo loài vi khuẩn nghiên cứu

Sắc ký đồ DM-CP2 trên cột CM-Sephadex

Ảnh điện đi Isetin hạt Đâu ma

Anh hướng của pH lên hoạt độ lectin hat Dau ma

Đô bên với pI1 của lectin hạt Đậu ma

6 bén véi nhiệt của leotin hạt Dâu ma

Shc ki dé oft DE - $2 Cellulose cia dich chiết thô Tú cầu đó

Ảnh điện đi lectin Tủ cầu đỏ

Ảnh hướng của pH lên chế phẩm lectin Tú cầu đỏ

Ảnh hướng của nhiệt độ lên chế phẩm leetin Tú cầu đó

MỞ ĐẦU

'Thực phẩm an toản có vai trò quyết định đối với sức khỏe con người, tới chất

lượng cuộc sống hiện tại cñng như phát triển giếng nòi Việc không đảm bão an toàn

vệ sinh thực phẩm (ATVSTP) có thể dẫn đến ngộ độc thực phẩm, nhiễm trừng thực phẩm và bệnh do thực phẩm Mỗi năm Việt Nam cá khoáng 2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm hoặc ngô độc có liên quan đến thực phẩm, chỉ phí cho việc giải quyết các vụ

ngd ddc ude Linh trên 2000 tỷ đẳng/năm [2

Nguyên nhân gây ra ngô độc thực phẩm thường gắp là do hóa chit, do dộc tổ,

do vị sinh vật Luy nhiên nguyên nhân chính gây ngộ độc thục phẩm là do nhiễm vị

khuẩn và chủ yếu lập trưng vào các vì khuẩn nih: Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Staphylococus aureus, Vibrio cholerae, Clostridium petfringens [40] Sẽ lượng, các ca ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn vẫn ngày cảng tăng, không chỉ ỏ những mước dang phát triển ma cả các nước có nên kinh tế vững mạnh Để làm giâm nguy cơ ngô độc thức ăn cân có nhiều biện pháp đẳng bộ từ việc trang bị kiến thức cho những người liên quan trực tiếp đến thực phẩm, chủ động làm sạch môi trưởng, thực hiển quy trình

vệ sinh để phòng sự ô riễm và đặc biết là cần thường xuyên kiểm tra phát hiện mức

độ ô nhiễm vị khuẩn gây bệnh đối với thục phẩm

Có rất nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra, phát hiện sự có mặt của vĩ khuẩn trên thực phẩm như phương pháp nuôi cấy truyền thông, phương pháp sử dụng,

sinh học phân tứ hay phương pháp miễn dịch Phương pháp sử dụng sinh học phân tử

cho kết quả nhanh, chính xác nhưng lại tốn kém, đôi hỏi trang thiết bị và nguyên vat liêu déng bộ với chi phi cao long khi phương pháp truyền thông đòi hỏi thời gian và công sức lớn của kỹ thuật viên và vẫn là phương pháp được dùng phổ biến tại các

phang thí nghiệm ở Việt Nam [72] Tuy vậy, phương pháp vẫn gặp phải một số khó

khăn khi triển khai lại gác phòng thí nghiệm nhỏ Huởng nghiên cửu sử dung lectin

trong phát hiện, phân loại vi khuẩn đang được quan tâm trong thời gian gần đáy Ưu

diễm của phương pháp nảy là cho kết quá nhanh, không đất tiền, độ lặp lại cao, các

nguyên liệu trong thí nghiệm bên và để bảo quản [45], đặc biệt là có thể

các phòng thí nghiệm phân tích nhỏ

Lectin li một protein không có chức năng xúc tác, không có tính chất miễn dịch

nhưng cỏ khả năng liên kết thuận nghịch, phi hỏa trị cáo carbohydrate mà không làm

thay đối cầu trúc của carbehydrate được liên kết [55] Bể mặt của tế bảo ví khuẩn có xrhiểu gốc dưỡng có khả nắng tương tác với lectin, mang tinh đặc hiệu cao Do vậy, dựa

vào mối tương tác lecfin — vi khuẩn có thể nhận biết được nhóm ví khuản nào có liên

kết đặc hiệu với lecun, Lừ đó sử dụng lectin dé nhận biết được nhóm này Đã có nhiều công bố về việc sử dụng lectin dễ phát hiện một sé vi khuan, diễn hình nữ lectin từ đậu tương (SBA) và ốc sên (IPA) để nhận biết Bacillus anthracis — vi khuẩn gây bệnh tham — một vị khuẩn rất khó phân biệt với các chúng Bacdius khác, leclin trầm lúa mỹ (WGA) giúp phát hiện vi khudn Neisseria [41] Lectin đã trở thành một chất thử tiểu

chuẩn dùng trong phản loại vi sinh vật học [110] Thêm vào đó vì leetin có hoạt độ cao

xiên tác dụng ở những nông dò rất loãng, có tính đặc hiệu vá có thể sử dụng ở dạng din xuất gắn enzym, vàng, các đồng vị phóng xạ hoặc các chất chuẩn Nguồn lectin được

sử dụng nghiên củu trong phân loại vị khuẩn thường có nguồn gốc từ thực vật đo có nhiều ưu điểm như nổng độ lectin cao, dắc hiểu với nhiều loại dường, dễ tách

chiết [S6]

Việt Nam là một mưỏc nhiệt đới với nguôn thực vật phong phú Đây chính là

1rguẫn cúng cấp loctin đổi đào mà chứa duợc khám phá Trong nước, các lcctin thực

vật mới được tập trung nghiên cứu vẻ các đặc tính, quá trình tình sạch và ứng dụng,

trang y học Tướng nghiên cứu ứmg đụng lectin trong phát hiện vị sinh vật chỉ được bắt

dẫu một vải năm trở lại dây Kết quả bước dẫu ch thấy việc xác dịnh các vị khuẩn gây bệnh bằng lectin có độ đặc hiệu cao, ổn định, cho kết quả nhanh, đễ thục hiện và ít tốn

kém [20, 21, 22] Tuy vậy các nghiên cứu mới chỉ đừng lại ở việc thăm dò khã năng,

10

ngưng kết của lectin dối với một số loài vị khuẩn Tại Việt Nam chưa cỏ công trình nghiên cửu nảo thống kẻ đây đủ về mối tương tác đặc hiện của lectin với các loài ví +khuẩn gây bệnh, đặc biệt là vị khuẩn gây bệnh qua thực phẩm Do tiểm năng ứng dụng, lớn của lectir, luận án được tiến hành với những mục tiêu:

1 Phát hiện, nghiên cứu, tuyển chọn được các nhóm lectin tương tác đặc

liệu với các nhóm vi khuẩn gây ngô độc thực phẩm phân lập tại Việt Nam

3 Tinh ché, xác định dược một số lính chải các leetin có biểu hiện tương

tác đáo hiệu với vi khuẩn, bước đầu xây dụng quy trình phát hiện vi khuẩn gây ngộ độc

thực phẩm bằng phân ứng ngưng két voi lectin

Những đồng gúp mới cũu luận án:

1 Tây là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về các nhóm leclin thực vật gảy ngưng két đặc hiệu với môi só vi khuẩn gây bệnh qua đường thực

phẩm

2 Bước đầu xây đựng được quy trình phát hiện va phân biệt 4 vi khuẩn

Eschesrichia coli gay bénh (HPEC), Shigella flexneri, Staphylococcus aureus và

Salmonella bang, lectin

3 Đã đưa ra được quy trình tính chế tách chiết một số lectin cô ngưng kết dắc hiệu với vi khuẩn Eschesrichia coli gây bệnh (EPEC) va vi khuan Salmonella,

il

Chương 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 TĨNH TÌNI NGỘ DỌC THỰC PHẨM TREN THÉ GIỚI VẢ Ở VIỆT NAM

1.1

„ Trên Thế giới

'Theo ước tính cũa WHO (2008), hàng năm trên Thẻ giới có khoảng 130 triệu

người mắc bệnh tiêu chây, trong đó xắp xỉ 70% là đo truyền qua đường ăn uống như ăn phải thực phẩm bị nhiễm bẩn, hóa chất hay ví sinh vat gay bénh [108] Cũng theo WHO, hon 49 mde dang phét triển trung bình có tỷ lệ chết do tiêu cháy ỡ trẻ em dưới

Š tuổi là 6,694, chiếm 36% ca tử vong do mợi nguyên nhân của trẻ em đưới Š buổi Ở

Mỹ, theo thống kẻ cúa Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh (CDC) thì mỗi năm có khoảng 5% dân số bị ngộ độc trong năm, với khoảng 5000 người chết [40] Tại

Tháp, bàng năm có khoảng 75 vạn ca ngộ độc thực phẩm (1210 ca/10 vạn dân) trong

do 7 vạn ca cấp cứu trong tỉnh trạng nguy kịch, 113 nghin ca phải nhập viện [80] Lại

Thai Lan, An Độ Philipin có khoảng 100 người vào viện hằng ngảy do nguyên nhân

sử dụng thực phẩm không an toàn Theo thống kế ở PhiRpin thí tiêu chảy là một trong

10 nguyên nhân gây bệnh chính với tổng số 19.498 ca (1997) và 19.598 ca (1998) [S0]

Dac biết năm 2011, một biến chúng , cofi cực độc đã gây tình trạng nhiễm khuẩn thực phẩm bùng phát tại Đức và một số mước châu Âu khác với 16 người chết và hơn 1.000

người mắc bệnh, trong đó gân 100 người có nguy cø tử vong Theo Trung tâm Kiếm soái và Ngăn ngừa địch bệnh châu Âu (SCDC), đã có 9 trường hợp được thông báo ở

'Thụy Điền, 4 người trong số đó có đi du lịch tới phia bắc nước Đức Vụ dịch này đã gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp châu Au khi ECDC théng báo vi khuẩn bị lây nhiễm qua các thực phẩm như đưa chuột, cả chua, giá dễ

12

1.1.2 Tại Việ Nam

Theo thống kẻ, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 3000 - S000 nạn nhân nhập viện và 30 - LO0 ca tử vong [1] Nhà nước cũng, phải

đánh một kinh phí rất lớn cho việc điều trị, xét nghiệm và điều Ira tìm nguyên nhân rusÖ

Nguyên nhân hàng đầu trong các vụ ngộ dộc thực phẩm là do vì sinh vậL Trong,

số đó, vi khuẩn chiếm tí lệ cao vả là nguyên nhân chính gây ra cáo vụ tiếu cháy hàng,

loạt (chiếm 33-49%) [2] Cáo vi khuẫn gây bệnh thường p&p 1 Sabnonella, Shigella, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholerae Bệnh thường xây ra do

thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế

ấn nâu chưa kĩ, để lâu ở nhiệt độ thường, thực hiện khâu vệ sinh kém [23]

én, bảo quản như thức

Salmoneila la nguyên nhằn của 70% vụ ngộ độc do vị khuẩn, có trong nhiều loại thực

'phẩm (đồ nguội, thịt nguội, nghêu sò, gà chia niu chin, sản phẩm từ sữa sông ) nhật

là pác món šn chế biến Lừ trứng tươi hoặc còn hơi tươi sống |40| Độc lố lừ vị sinh vật cũng là một ương các nguyên nhân chiếm 20-30% các vụ ngộ độc tưực phẩm tập thể

‘Trong số này, ví khuân Sfapkplococcus aureus hiện diện nhiều trong, các môn ăn làm

‘bang tay (bánh ngọt), vi khuân Clostridium perfringens hay phat sinh trong cac mén được nau, nudng va ham nóng

Ngoài ra, ngộ độc thực phẩm còn có nguyên nhân là do thực pham bi 6 nhiém hóa chất (chiếm11-2

quân thực phẩm, hóa chất bão vệ thực vật 7% số vụ ngô độc là do ăn phải thực phẩm

2) như cyanua, asen, các kim loại nặng, benladol, hỏa chất báo

còn tôn dong hóa chất hay bị dầu độc qua nước, thức ấn, không khí

1.2 NGỌ ĐỘC THỰC PHẢM DO VI KHUẢN

Ngô độc thực phẩm có nguyên nhân từ vì khuẩn được chia thanh 3 nhóm chính

©_ Nhiễm trùng phát sinh từ thực phẩm (Foodborne infections)

Nhiễm trùng phát sinh từ thực phẩm xây ra do ăn phải thức ăn nước uống bị uhiém các vì vỉ sinh vật và vưut gây bệnh đường tiêu hóa Các tế bảo sông của các tác nhân gảy bệnh đường ruột xăm nhập qua đường thực phẩm, sinh sắn và sinh độc tố

(nhiễm trùng) Đại điện của nhóm này là cdc vi khuin nhu Salmonella, E cali, Shigella, Camplyobacter, Listeria,

* Bénh nhiém và gây độc phat sinh từ thực phẩm (foodborne toxicoinfections)

Các tác nhân gãy bénh trong nhém nay bao gầm mật số trực khuân Gram đương, xinh bảo tử và một số trực khuẩn Gram âm Các vì khuẩn sinh trưởng, hình thành và

giải phóng ra độc tổ sau khi xâm nhập vào hệ đường ruột — dạ dày Thông thường

chúng cản phải có mặt ở những nổng độ cao mới đủ để gây bệnh Các vi khuẩn gây

bệnh thường gặp là Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Vibrio cholera, F coli gây bệnh đuờng ruột

14

« Bénh ngộ độc phát sinh từ thực phẩm (Joodborne imloxieaHons)

Các vi sinh vật gây bệnh là các chủng tạa ra độc tố khi chúng sinh trưởng trên

thực phẩm và các thành phản của thực phẩm Độc tố cỏ thể là các protein hoặc các

phân từ hữu cơ không bên hoặc bên với nhiệt Một độc tổ có thế gây ra các triệu chứng

đường ruột, triệu chứng thân kinh, thậm chỉ có thể gây ung thư Bệnh ngộ độc thực phẩm cỏ nguồn góc vi sinh vật xảy ra do ăn phải một loại thực phảm chứa độc tô đã được hình thành từ trước đó Nhóm vi khuân có sinh độc tổ hay gặp trong thực phẩm là

Stapiplocaccus aureus, Clostriduan bo(uiiiam

Vĩ khuẩn là một trong những nguyên nhân chính gây ra ngô độc thục phẩm, chịu trách nhiệm cho khoảng 40% các vụ ngộ độc do vi sinh vật Các báo cáo về số lượng các ca ngô độc thực phẩm trên thê giới trong 3 năm gần đây (2010 — 2013) che thấy cơn số nảy không những giảm đi mà còn có nguy cơ tăng cao, đặc biệt ở muội số

nham vi khudn quan trong nhu Salmonella, Ƒisteria [105] Dễ giảm thiểu tỷ lệ ngộ

độc thực phẩm cân ri nhiều các biêu pháp phối hợp đồng bộ rong đó việc phát hiện xuức độ ô nhiễm v¡ khuân gây bệnh trên thực phẩm là diễu cốt lõi Quả trình xác định

đúng nguyên nhân gây bệnh sẽ đóng vai trò chính trong cồng tác đảm bảo vệ sinh an

toàn thục phẩm, làm giảm các vụ ngộ độc thực phẩm và bệnh tật do vĩ khuẩn gây ra Ngoài ra, việc xác định này còn gitp cho việc chú động kiểm tra đánh giá các số liệu

dịch tễ học như xác định loại thực phẩm, nguyên nhân truyền bệnh, phát sinh ngộ độc

hoặc khu vực và diễm vụ dich nao dã là nguồn lây lan tử đỏ sẽ có những chỉnh sách

hop ly trong céng tac dim bio ATVSTP

1.3 MOT SO VI KITUAN GAY RENII QUA THUC PHAM TITUGNG GAP

Theo bảo cáo của WLIO va CDC (2013) về nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm trên thế giới trong 2 nằm 2009 - 2010, Sømonella đứng thứ nhất trong số các vi khuẩn sây ngộ độc thực phẩm, dứng thứ hai trong số các nguyên nhân sinh học gây ngộ dộc

thye phim (chi sau Norovirus) [44, 105] Shigella va E coli cing đúng trong nhóm

15

năm vi khuẩn gây ngộ dộc thực phẩm phổ biến nhất Còn về ngộ dộc thực phẩm do độc +6 sinh hoc, Stephylecoccus aureus đông vai trò chính cùng với vi khan Clostridium perfringens Tai Viét Nam, cac nghién ctu gan day cũng cho thấy 4 nhỏm vi khuân này là nguyên nhân của nhiều vụ ngộ độc lớn [5,12,13]

1.3.1 Vì khuẩn Salmonella va cac bgnh do Salmonella

Tiảng nắm Việt Nam có khoảng 10.000-20.000 trường hợp mắc thương hàn, và

có khoảng hàng chue người tử vong mỗi năm [4,13] Bệnh tân phát ở nhiều tình hay

†ạo ra các vụ dịch nhỏ ở đẳng bằng sỏng Cửu Long, ven biển miễn Trưng, một số tính

đồng bằng Bắc bộ và ở miễn núi phía Bắc

Sabmonelia thuộc họ Emferabacteriacea, là vi khuẩn gặp nhiều trong tự nhiên

nh ở ruột gia súc, động vật có vú hoang đại, bò sái, chím và côn rừng Ví khuẩn Salmonella được đặt tên theo nhà khoa bọc đã phát hiện ra chúng - Damiel Salmon

Phan lớn các thành phản của vi khuẩn đã được xác định và cho thay rằng các serovar

ctia Salmonella cd mite tuong déng về trình tự ADN cao (95 -99%} Do vay hệ thống,

định đanh hiện nay cho rằng Safmonella chỉ có bai loài đó là S enterica (tén lién quan

đến nguyên nhân gây bệnh đường ruột của vi khuẩn) và S bongori Salmonella enteriea có Ö dười loài (subspecies) gdm Salmonella enterica subsp enterica,

Salmonella enterica subsp salamae, Salmonella enterica sibsp arizonae, Salmonella enterica subsp diarisonae, Salmonella enterica subsp hanlenae va Salmonella

enterica subsp indica hoae subspecies |, Ll, Ula, IIb, 1V va V1) [38] Trude day S

16

bongori la mét thanh vién ctia S enterica subspecies V nhung sau đỏ được tách ra thành 1 loài riêng biệt

Salmonella la truc khuan Gram âm, có thẻ đứng riêng rẽ hoặc xép thành chuỗi,

có khả năng đi đồng, không sinh nội bảo tử (Hình 1.1) Samonella là vì khuân yếm khi

tủy tiên, có sức đẻ kháng cao Ching phát triển ở nhiệt độ 6°C — 42°C (thich hợp nhất

là 35°C - 37°C) và pH 6-9 (thích hợp nhất ở pH 7.2), tại nhiệt độ 18°C - 42°C chúng có

thể sông được 15 ngày, khi đun nỏng 60C chúng sống được 10 phút và chỉ 2 phút ở 100°C đã tiêu điệt được loài vi khuẩn này [18]

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Salmonella Hinh 1.2 Thanh phân kháng nguyên của vi

dưới kính hiển vi điện tử khuẩn Sa#monella

(Nguồn: www dmacasia.com) (Nguồn: www.bact-wisc.edu)

Salmonella mang 3 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên roi (kháng nguyên

TH), kháng nguyên thân (kháng nguyên O) và kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên Vi)

(Hình 1.2)

Kháng nguyên roi (kháng nguyên H)

Kháng nguyên H đóng vai trò quan trọng trong cơ chế gây bénh ctia Salmonella

Kháng nguyên H không tham gia gây bệnh nhưng chúng kích thích cơ thể tạo thành

khang thé khang H gây nên hiện tượng ngưng kết Phản ứng ngưng kết nảy cỏ ý nghĩa

thực tiên đề chân đoản bệnh thương hàn [52]

17

‘Theo Kauffmann, cic Salmonedla déu có kháng nguyên H dưới 2 pha: pha 1 được ghỉ bằng chữ viết thường a, b, c, đ hoặc pha 2 duge ghi bang cac chit sé A Rap

1,2 Hai pha này dược mã hỏa bởi gen fiiC hoặc /7¡B [52]

Không nguyên thần (khẳng nguyễn O}

Kháng nguyên O có ở tất cả các loài Salmonella Kháng nguyễn O được thể hiện ở trên bề mặt của lớp mảng ngoài và được quyết định bởi chuỗi đường đặc hiệu ở trên bê mật tế bảo Đây là thành phân quan trọng trong việc tạo ra độc tổ của Salmonella Khang nguyén O cũng là vị trí quan trọng trong quá trình nhận biết tế bào cũng như liên kết vị khuẩn với các thành phan khác, trong đó có lectin

Ban chat của kháng nguyên O 14 lypopolysaccharide (LPS) trong dé chudi O vươn ra ngoài tế bảo được cau tao béi cdc phân tử dudng gém D- galactose, L — yhamnose,D mannose [47] Cau tric oligosaccharide ctta 14i git cho các tế bào biểu

mô nhận ra và tiếp nhận vi khuẩn, kháng nguyên © cần thiệt cho sự tạo thành kháng

Truyết thanh Dựa vào Ihanh phan khang nguyén O, Salmonella chữa thành 2 nhỏm: một

nhóm có N-acetylghucosamine (GIeNAc) hoặc N-acetylgalactosamine (GaINAc) trong

câu trúc và nhóm kia có galactose (Gal) là đường đâu tiên trong đơn vị © lap lai [38]

Thanh phin carbohydrate ương câu trúc kháng nguyên O ở Sabmoneila rất da dạng

Một số câu trúc oligosaccharide của kháng nguyên © được chí ra trong hình 1.3, 1.4

Hình 14 C4u tric mét phin khang nguyén O cia Salmonella O62 ssp.arizanae [38]

Chu thich p> cic monosaccharide & dang pyranose, Trong so dé Kanffimann — While, cdc khang nguyén O được phân chúa thành các

nhóm riêng biệt và được đặt tên bat dẫu từ nhỏm A bao gồm các kháng nguyên O:1, 0:2, 0:12 đến nhóm Z, nhóm chỉ có một kháng nguyên đưy nhất là 0:50 [52]

Khủng nguyên bễ mặt (Kháng nguyên X— Kháng nguyên VỤ

Tả kháng nguyên bề mặt bao bèn ngoài thành té bao vì khuẩn, đưới đạng một mảng mồng nên không nhìn tháy dược dưới kính hiển vị thường,

Kháng nguyễn Vĩ giúp vị khuẩn chống lại sự tiêu diệt trực tiếp của các bd thé

và đại thực bào, sống sót và nhân lên trong các đại thực bào Ngoài ra nó còn làm giảm

khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào cơ thé vat chi Vi vay dé có thế có hiệu qua

xâm nhiễm cao cũng như Iránh dược khỏi sự lấn công của hé thong inién dich eda co thể vật chủ, v¡ khuẩn cân có cơ chế điều khiển chặt chẽ sự hoạt động của kháng nguyên

Vị

Kháng nguyên Vi bao bọc kháng nguyên O giúp kháng nguyên O không bị tấn

công bởi bẻ thể và kháng thể trong tế bảo vật chú nhưng tính chất này làm ngăn cản khả năng ngưng kết của kháng nguyên O Vi vậy, trong nhiều trường hợp kháng

xgnyền O chỉ được bộc lô ra khi phá huỹ kháng nguyên Vĩ bằng cách đụn nóng canh

khudn trong 1 gid 6 100°C kháng nguyên Vi dễ bị phân huỷ bới axit, phenol và nhiệt

độ

19

1.3.1.2 Ngộ độc thực phẩm du 8øimonelfa

Salmonella khéng chí là tác nhân gây ra các bệnh thương hàn và phỏ thương

hản mà còn gây ra chúng ngô độc thực phẩm Các bệnh này nêu không được chữa trị

kip thời đều gây ra những biển chứng nguy hiểm làm ảnh hưởng tới sức khoế con người và có thể dẫn đến tử vong, Thực phẩm có nguồn gốc từ động vật như thịt bỏ, thịt

gả, thịt lơn, trứng, sữa có liên quan nhiều đến các vụ địch ngộ độc do Salmonella Ngoài rả Sabnonella cũng có thể xâm nhập qua các thực phẩm có nguồn gốc từ thực

vật (do sử đụng nước ban để rửa), hải sản, cá có vậy

Mic dù Saknonella có hơn 2500 typ huyết thanh khác nhau nhưng chí cỏ một số xrhởm liên quan thường xuyên đến các bệnh phát sinh Lừ thực phẩm đo sự khá nhan về

dia Li cũng như khả nãng gây bệnh của một serovar hay một chủng Các nhóm Salmanelia thường, gặp là S Typhimureum, S Enteritidis [14]

Co ché g&y bénh cia Salmonella

Hầu hết các vi khuẩn Sabmonella không gây bệnh thương hàn đều xâm nhập vào

cơ thể người qua thúc ăn, cũng có khi lây từ người sang nguời Sau khi vào hệ tiêu hóa,

vi khuẩn sẽ xâm chiếm ruột hỏi và ruột kết, xâm nhập vào biểu mồ ruột, nhân lên ở

trong đó và các hạch lympho

Tiệp đến, chúng nhân lên mạnh mẽ trong nội bào và lây lan sang các hạch

lympho ruột và dị khắp cơ thể nhờ hệ tuân hoàn Chúng, bị bắt giữ bởi các tế bảo của lưới nội mô I1ệ thông tế bảo này sẽ làm hạn chế và điều khiển tốc độ lây lan của vi khuẩn Tuy nhiên, tủy thuộc vào typ huyết thanh và hệ thông bảo vệ của cơ thê mà vỉ khuẩn có thể lan tới các cơ quan như gan, lách, xương,

Sau khi xâm nhập vào xuột, hậu hết Salmonella déu tao ra cac cytotoxin có khả

nang kim hãm sự tổng hep protein gây ra các phản ứng viêm rất mạnh hoặc tạo ra các

khất u Tuy nhiên, sự xâm thiểm vào các tế bào biểu mô trước đó có thể gây ra sự tổng

hợp và giất phóng các cytokcine trước viêm gồm: 1L-1, LL-6,1L-8,TNE-2,IEN-U,MGP-I

va GM-CSF Ching kích thích các phân mg viêm xây ra đữ đội và có thể gây tên thương ruột, Buột bị tổn thương sẽ làm xuất hiện các triệu chứng như sết, én lạnh, dau bụng, tăng bạch câu và tiêu chảy,

1.3.2 Sigellø và bệnh ly trực khuẩn

1y là bệnh thường gặp trên toàn câu, nhất là ở những nước đang phát triên, điều kiên về sinh thiêu thốn Đây lá nguyên nhân gây ra khoảng 14.000 trường hợp tử vong trong tổng số 125 triều ca mắc bệnh mỗi năm tại châu A [112] Việt Nam năm trong, danh sách 1 trong 6 nước châu Á có tý lệ mắc bệnh cao (2,1 ca/1000 dân/năm ở mọi độ tuôi và 3,2 oa/1000 đân/năm ở trẻ em đưới 5 tudi), cao hom rất nhiều so với oắc rước phát triển (3,7ca /100 000 dân/ năm của Mỹ năm 1999 hoặc 3,2 ca /100 000 đân /năm ở TIã Lan từ năm 1996 đến năm 2000) [39]

Chỉ S/mgella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, nhom

Eweherichiae và có tên là trực khuẩn ly Tên vĩ khuẩn được đặt theo tên của nhà khoa

học Nhật Bản Kiyoshi Shiga - người đã phát hign ra Shigella dysenteriae typ | vao nam

1896 Tiếp đó các loài được phát hiện là § /ievneri, § boydii va § sonnei (tên loài được đặt theo tên người phát hiện), Bốn lưài trên được phân loại dụa trên sự khác biệt

về sinh hoa tong dé Shigella dysenteriae nằm ở nhóm A gồm 12 serotyp, 3 fiexneri

thuộc whéw B gém 6 scrotyp, S hoydii thuge nhém C với 23 seroLyp và S sonnei cd 1

serotyp (nhém D) [39] Việc phân loại các serotyp dựa trên các thành phân kháng,

nguyên O của lipopolysaccharide (LPS) ở mang ngoài Cơ chế gây bệnh của Sñigziia

rất phúc tạp nhưng chủ yếu là phá hủy thành ruột đo độc tổ Shiga gày hoại tử biểu mộ,

sây loét, viêm vá cháy máu

1.3.2.1 Đặc diễm sinh hoc ctia Shigella

Shigella lá trực khuẩn Gram âm, không co khã năng di déng, kj khi khéng bat

‘bude Shigelfa khéng cd va, khéng cé tién mao, tiêm mao, không sinh bảo ti

21

Shigella co hai loai kháng nguyên: kháng nguyên O va khang nguyên K

Kháng nguyễn © la co ở tất cả các chúng S#/ecla, có tính đặc hiệu cao, là thành

phần kháng nguyên của thành tế bào Kháng nguyên O là một phức hợp protein,

poliovid va lipid Trong 46 protein ca tính kháng nguyên, polioz4d quyết định tỉnh đặc

hiệu của kháng nguyên, còn lipid quyết định tính độc, Lầu hết các kháng nguyên O là heteropolysaccharides duoc cầu thành từ 3 -5 đơn vị O theo đường thắng hoặc phân

thánh, Khác với Salmonella, vị lí của các đơn vị dường trang cấu trúc khẳng nguyên

O cla Shigella mang đặc điểm điển hình của các vi khuẩn đường ruột Mỗi kháng,

nguyên O bao gồm N-acelyl-D-glucosamine (D-GleNAc) va (hoặc) N-acely]-D-

palactosamine (D-GalNAc) Mét sé loại dường khác thường gặp trong cầu trúc nay là

L-thamnose (L-Rha), D-glucose (D-Gle), D-galactose (D-Gal), D-glucuronie acid (D- GlcA), D-galac-turonic acid (D-GalA) va D-inannose (D-Man) Thém vao đó D-ribose

(D-Rib) cũng bắt gặp ở một số cầu trúc khang nguyén © va một vải đường khác nữa

như L-fucose ([-Eue), N-aeetyk-D-mannosamine (D-ManNAc), N-acetyl-L- quinovosaruine (L-QuiNAc), N-acetyl-L-fucosanine (L-EueNAc), 4-amino-4-deoxv- D-quinovose (D-QuiN), L-iduronic acid (L-IdoA) va N-acetyl-D-galactosaminuronic acid (D-GalNAcA) [39] Moi khing nguyén O cia Shigella tit D1, BIB va FI-FS có tính axit do sự có mặt của axit dường (hcxuroric hoặc pscudaminic aeid) hoặc các hợp chất không phải là carbohydrate có tính axit nhw lactic acid bi ether héa (glycolactilic acids), pyruv

Hinh 1.5 Cdu trac khang nguyén O cia Shigelia flexneri 036 [112]

Chủ thich p: cée monosaccharide 6 dang pyranose

22

Kháng nguyên K là KR vỏ bẻ mặt chi 6 & Shigella nhom A vá nhóm C Kháng,

nguyén K nam ở bên ngoài kháng nguyên thân, nó có thé rim đưới dạng một lớp vỗ dày hoặc duéi dạng một lớp rất mống Ban chất polysaocharide của nỏ mang tỉnh đặc

thiệu cho từng typ huyết thanh Trong ngìmg kết, kháng nguyên O thường bị ức chế bởi

kháng nguyên K bọc kin bên ngoài Vì thể để tránh hiện Lượng này cần phá huỷ khang nguyên K bằng cách đun canh khuẩn ở 100°C trong 1 gid

Kha ning sinh độc tô

Cae nhém Shigella đều cô nội độc tổ (endotoxin) Riéng S shiga va 8 smitzii con có thêm ngoại độc tổ (exotoxin) Cư trú tại một vị trí nhật định Irong cơ thể vật chủ, trực khuẩn chỉ sinh sản ít, không tìm thấy trong máu va các co quan bên trong, nhung Shigella tao ra độc tổ và độc tổ sẽ lan trần ra khắp cơ thê đề gây bệnh và có thể gây chết cha vật chủ

Nội độc tổ của Sñigeffa thường thay biếu hiện thông qua các phan img trong, xuột Nội độc tổ có cầu tạo như kháng nguyên thân, bán chất là lipopolysacelaride

(PS) Kgoại độc tổ của S shiga va S smitsii (Shigella nhóm A) có độc tính rất mạnh với hộ thần kinh trung ương Dưới tác dụng của fomnol và ở rhuệt độ 40C trong ruột

tháng ngoại dộc tổ mất tính độc nhưng vấn con tinh kháng nguyên và có khả năng kích

thích cơ thế hình thành kháng thể

Độc tố ly có cân tao gdm 2 thành phân: tiến phân A và tiễu phản B Trong đó

tiểu phân A có tác dụng như một eazym, còn tiểu phan B chịu trách nhiệm bảm vào tế bảo cảm thụ Một phân tứ độc tổ gềm 1 tiểu phan A va 5 tiêu phản I3 Tiểu phan A gdm

2 chuếi polypeptide (AI và A2) Tiểu phân A và B được nổi thông qua câu nổi disunfua (8-5 ) (hình 1.6) Trọng lượng phân tử của tiểu phân A là 38Da, mỗi tiểu phản

Ð có trọng lượng phân tử là 7,7 kDa [64]

kề ụ

Hinh 1.6 M6 hinh cau tao doc to vi khuan Shigella

(Nguon: http://textbookofbacteriology net/Shigella htm!)

Khi tấn công, vi khuẩn bam vao té bao vat chi, su bam dinh nay tác động lên

actin Khi vi khuan da bam dinh vào tế bảo, các sợi actin trở nên dảy hon thanh F-actin

ở ngay dưới vi trí bám của vi khuẩn Khi actin đã được sắp xếp lại, chúng tạo nên các giả túc kéo vi khuẩn vao trong bốc thực bảo của tế bảo Vi khuẩn tiết ra chất

eytochalasins B vả D ngăn cản quá trình trùng hợp actin đề ngăn cản quá trình thực

bảo Lúc đỏ tiêu phần B bảm vao glycolipid ở bê mặt tẻ bảo chủ Sau khi gắn vào bê mặt của tế bảo vật chủ, tiêu phần A chui vào trong tế bảo gây rồi loạn chức năng tế bảo

và làm ngừng quá trình téng hop protein cla té bao chủ, làm bất hoạt tiểu đơn vi 60S

của ribosom bằng cách tách câu nói N-glyeosidie của adenosin ra khỏi rARN 28S 1a

một thành phần của ribosom 608 [91]

1.3.2.2 Ngộ độc thực pham do Shigella

Shigella xâm nhập vào thực phẩm qua con đường nhiễm phân từ người mang vi

khuẩn một cách trực tiếp hoặc gián tiếp Shigella chỉ gây bệnh cho người vả khi Chỉ với số lượng chỉ từ 10-10” tế bảo vi khuân đã cỏ thẻ gây bệnh [39]

Vị khuẩn dễ dàng đi qua hàng rào bảo vệ axít dạ dày của cơ thẻ, xâm nhập vào

tế bảo biểu mô của niêm mạc ruột giả Tại đây vi khuẩn sẽ nhân lên, gây tôn thương tế

bao vật chủ và tạo ra hình ảnh loét đặc trưng ở đại tràng (Hình 1.7)

“Thành ruột non xi:

TH € Ni ác EK Đai thục bio bi vỡ giải phóng vi khuẩn

. Hình 1.7 Sự xâm nhập của Shigella flexneri (Nguén http://cmr.asm.org/content/21/1/134/F | expansion html) Cli thich: 8 flexneri vot qua hang rao béo vé ctia té bao biéu mé rugt thong qua té

bao M và cư trú ở đại thực bào Sau đỏ vi khuẩn lan tỏa ra khắp các tế bào biểu mô ruột từ

pha màng nội bào xâm nhập vào trong tế bào chất Từ đây vi khuải

bào biểu mô khác và gây ra các phản tng viềm

ấp tục lan sang các tễ

Tổn thương ban đầu của các tế bảo biêu mô đại tràng là sự phá hủy các vi nhung

mao Vi khuẩn xâm nhập vào trong tế bảo nhở các thụ thể đặc hiệu ở be mặt của vĩ

khuẩn (được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid xâm nhập) Màng tế bảo biéu mô

lõm vào, đưa vi khuân xâm nhập vảo bên trong tế bảo Từ các túi không bao, vi khuan

tiếp tục xâm nhập vào trong các bảo tương, nhân lên vả lan truyền sang các tế bào bén

cạnh và đi vào tổ chức bạch huyết đại trang Qua trinh nay gây ra phản ứng viêm cấp,

xuất tiết, chảy máu, tiêu hủy tế bảo niêm mạc Vi khuẩn chết hàng loạt giải phỏng ra

nội độc tổ vả cả ngoại độc tổ (đổi voi S shiga va S smitzii) Tai ché néi độc tổ giải

phóng sẽ gây xung huyết, tạo thành những, ö loét và mảng hoại tử Ngoài ra nó còn tac

động lên thản kinh hệ vận động, hệ cảm giác và hệ thực vật gây co that lam tăng nhu

động ruột Người bệnh xuất hiện các triệu chứng dau quan bung, mot ran, tiêu chảy, rồi

loạn các chức năng của ruột, mắt cần bằng nước và điện giải [17,18]

1.3.3 Escherichia coli gay hệnh

Với phát hiện của Theodor Escherich vào năm 1885, # coi? được biết đến là

mệt vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc, hình que, khơng sinh bào tử, vơ hại, là một vi khuẩn bình thường trong hệ đường ruột của người Nhưng từ giữa những rữnn 1940, đã

cĩ nhiều bằng chứng cho thấy một số chúng J7 eol? nhiễm trùng qua đường thực phẩm

gây ra tiêu chây và được gọi là E coli gây bệnh đường ruột ví dụ như chủng O157:H7, Ơ104-H21 E sọi O157:H7 cĩ thể gây ra tiêu chây nghiêm trọng, ra máu hoặc đạn

tụng, tiếp đến là thiệt hại nghiêm trọng trong hệ thơng các cơ quan cơ thế như suy thận

[57]

1.3.3.1 Bac diém sink boc cia vi khudn E, coli

E coii thuậc nhĩm vì khuân đường ruột Enterobacteriaceae, phan bé nhiéu

trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc Trong đường ruột chủng hiện điện nhiêu ở đại tràng nên cịn cĩ tên gọi là vi khuẩn đại tràng, Những chủng vơ hại là thành viên oũa khu hệ ví sinh vật bình thường trong đường ruơt, cĩ ích cho cơ thể vật

chủ do cĩ khả năng tiết vitamin K2 và cạnh tranh khơng cho các vi khuân cĩ hại phát

Triển VƯỢt trội

E coli là trực khuẩn Gram âm, thường đứng riêng lê, từng đơi hay từng chuối ngắn, kích thước dai ti 1-4 Hưn và rộng từ 0,4-0,7 tưn Vi khuẩn cĩ nhiều tiêm mao

xung quanh than và một lơng roi (tiên mao), va khang cd bảo tử Vỏ capsul chỉ xuất

Tiện ở nhĩm cĩ độc lực

E ooli bao gồm 3 loại kháng nguyên chính [61 } Kháng nguyên lơng (KN H), kháng nguyên thân (KN ©), khang nguyén bé mat (KN K) Cac ching 2 coli duge dit tên, phân loại dựa vào các đạng serorype O:K:H (vi dụ Z soli O86:K62:B7) [83]

Khang nguyéa O: F coli co khoang 150 yếu tơ huyết thanh khác nhau Kháng nguyên này cĩ khả năng chịu nhiệt Đây là thành phan quan trọng của vị khuẩn Kháng,

nguyên Ĩ cĩ thành phần lá polysaccharide Những loại dường thường gặp trong thánh

phân kháng nguyên O của Z cọi là D-Glep, D-GlcpNAo,D-Galp, D-GalpNAc,D-

Mang, and L-Rhap |65| Bằng cách sử dụng phương pháp sắc kỉ lỏng cao ap, Wen Yi

đã cơng bộ thành phần đường trong cầu trúc Ị của E coli O§6 bao gồm œ-Galp, œ-

Phucp, œ-GalpNAc, và B-Galp(E), Kết quả phân tích sự metyl hĩa các thành phần chuối

O đã cho thấy sự cĩ mặt của 4,6-đi-O-methyl-galactose, 3,4,6-tri-O-methyl-galactose,

2,3,4-tri-O-methyl-fucose, - 2-deoxy-2-N¬methylaoetarnido-4,6-di-O-nethyl-galaclose, 2-deoxy-2-N-ethylacetamido-3,4,6-tri-O-methyl-palactose theo tỷ lệ 1.0:1.0:1.0.1.4:0.4 [106]

at Rha(1-23)f-p- GlepNAc!(1-43}-f-5- Gy NAe"4(Slac){192)-Greal

#§pSlz

1

4 93) B-D-GlepNAc"'4(Stae)-(12}-<1-4-Rhap™1+2}-ce Rhap"(143)-at-Rhap! {143}6-0-GlepNAc- (> 2

Hình 1.8 Cấu trúc aligosaceharide (1) và O-polysaccharide (2) của Z coli 0150183]

Chủ thích p: các rnonosacchariđe ở đang pyranose

« Kháng nguyên H: cĩ khoảng 40 đạng khác nhau và là kháng nguyên khơng chu nhiệt

+ Kháng nguyên K: gồm cĩ kháng nguyên L và l3 khơng chịu nhiệt vả kháng nguyén A M chịu nhiệt tới 120C

1

2 Các nhĩm E coli gay bénh

Mic dù A coli cĩ nhiều serolype khác nhan nhưng phan lớn chúng đều là những,

vị khuẩn vơ hại Khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiềư kèm theo khả năng, sinh độc tổ thị lùe đĩ ngộ độc mới xây ra

1 coli cơ 2 loại độc tơ là:

ie a

- Ngoại độc tổ: Phá huý thành niềm mạc, hấp thu qua dường bạch huyết gây hoại từ và gây nhiễm độc thân kinh

- Nội độc tổ: phá huỷ thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngô độc thản

kinh và biểu hiện nhiều triệu chứng khác

Dựa vào cáo đặc điểm sinh học, khả năng và cách thức gây bệnh, E coli được chúa thành 5 nhỏm:

Enteropathogenic £ coli (EPEC)

Từ nhiều năm nay EPEC diroc xdc dinh dua vao nom huyét thanh O1 va Lype thuyết thanh O: H, Loại E cøïi này không sản xuất độc tó ruột mặc đủ văn gây tiêu

cháy Khả năng gây bệnh của LPHC liên quan tới đặc tỉnh “bám dinh vá loại bố “ của vị

khuẩn Quá trình phát triển của bệnh điển ra theo 3 piai đoạn như sau: Bảm đính tại chỗ, truyền tin hiệu, vả bám dính chặt [26] Ba giai đoạn nảy liên quan tới vai trỏ của

cáo yếu té saw plasmid EAP (PRC adherence factor) c trong lượng khoảng 60 kDa

Khi bám vào tế bào biểu mô nó sẽ tạo niên mội đường truyền tín hiệu khác trong tế bảo Gen chịu trách nhiệm cho hoạt động truyền tin hiệu dugo m4 hod tai LIE, LIE tai tiép tục mã hoá cho hệ thông tiết typ II, các protein tiết và indmin [101] Các protein tiết gồm có: cạp A, cap B, csp D và các gen mã hoá cho hệ thống tiết typ II là sep và sẻ [6#] Sự bám dinh chặt của EPlIC vảo tế bảo biểu mô vật chủ thông qua intimin - olem ở màng ngoái lễ bảo vĩ khuẩn có trọng lượng khoảng 94 - 97 kDa được mã hoá

béi gen eae, Gen nay co mat 6 EPHC và EHEC nhưng không có ở ETEC, #, coli bình

Thường ở ruột vả các vì khuẩn khác [26]

Enterotoxigenic E coli (ETEC)

JITLC la nguyén nhan gay tiéu chảy hàng đầu ở trẻ em trong các nước dang phát

triển cũng như là nguyên nhân phố biển nhất của tiêu chảy du lịch EBTEC xâm nhập

vào bÈ mặt ruột non và gây liêu chấy bằng cáo độc lỗ ruột và yếu tổ bám đính Chúng,

có thể tiết ra một trong 2 loại dộc tổ là LT (Heat -labile toxin ) va ST (Heat stabile toxin) hoặc cã 2 loại độc tổ

LT 1a phan ti oligomer duoc mã hoá bởi gen elf va ef LT cé cau trúc gồm 2 tiểu phân A va B3 Trong đỏ 5 tiểu phan B bao quanh tiểu phân A thông qua các cầu nối

disunfua (S-S)

Si la phan ty monomer chita nhiều vị trí cystei của câu nói disulfza (S-8) Độc

tố ST gồm 2 loại: Sta và STb Thụ thể bám của Sta là enzym ở màng tế bảo: guanylate

cyclase C (GC-C) GC-C nằm ở đỉnh của tế bảo biểu mô ruội, kích thích boat bod san

sinh ra nhiễu loại enzym trong tế bào, chuyển hoá AMP thành AMP vòng, Luong AMP vòng tăng đột ngột dẫn đền tăng tiết CÌ trong tế bào và giảm hâp thụ NaCl của nhưng, mao rudl, nước lừ tế bảo chảy vào lòng ruột dẫn đến tiêu chảy cấp tính [17]

Entervhemorrhagic E coli (EHEC)

THEC gây bênh thông qua 2 cơ chế:

- Gây tốn thương mô học: Sự bám của EHEC vào niềm mạc ruột làm thoái hoả

nặng các vi nhưng mao Các yếu tế độc lục trong cơ chế này là một plasmid có trọng,

hong phân tử 60 MDa, intimin - một protein mang ngoài có trọng lượng phân tử 97

kÙa, và một cụm gen dic lap ene, HspA, EspB, EspD, Sep, esơ nằm trên nhiễm sắc thể

- Cơ chế sinh độc tế tuột: EHEC tiết ra độc tổ gọi là veretoxin kí hiệu là St: - 1n6t loai protein mang tink KN manh với gen mã hoá nằm trên nhiềm sắc thể SIx gồm Stel và Stx2 Chúng tạo nên độc tổ đồng dang với độc tô của vị khuẩn l‡ Siigeifa [S2] Sœx ] và SIx2 đều có 2 tiếu phân A và B Tiểu phan A mang tinh chat của một enzym, tiểu phần B có chức năng gắn với một thụ thẻ dặc hiệu glycolipid ki hiéu la Gb3 Các Gb3 thường thấy ở các tế bảo biểu mô thuộc lớp tế bào biểu mô thận, tế bảo biểu mỏ

muội Sx với hoạt tỉnh enzym xâm nhập vào lẺ bào chất, ức chế quá trình tổng hợp protem tại bảo tương và gây chết tế bảo nảy, Stx chỉ phá huỷ chọn lọc trên các tế bảo Tang mang chức năng hấp thụ và bảo tổn các tế bảo vừng kẽ Quá trình này kết hợp với

quá trình tốn thương mô học lảm ting tiết nước vào lòng ruột dẫn dén tigu chảy phân

Tước

Entervinvasive E cali (ETEC)

11C xâm nhập vào tế bảo biểu raô của đại tráng, tiết ra một hoặc nhiều độc tổ ruột và gây tiêu chảy Các gen cản thiết cho sự xâm nhập nằm tại plasmid kí hiệu là pin có trọng lượng phân tử là 140 kDa, gen chủ yếu là gen mã hoà cho hệ thông tiết typIH Bộ máy này cần thiết cho sự tiết các protein đóng vai trẻ trong khả năng gây thệnh cia F coli Do M4 cac gen tong hop cdc protein tiél /pad, IpaD, cdc protein xâm nhip IpaC, Ipa B, Ipa D, lpa H |102] đen sẵn xuất dộc tỏ là sen năm ở plasmid Nó

mã hoá cho một protein độc tổ có trọng lượng là 63 kDa

Enteroaggregative E cali (EAEC)

Đặc tinh ca HAHC 18 tiét chat nhdy vao niêm mạc ruột, ví khuẩn bao quanh

át nhây tạo thành một lớp màng mông, nhảy, tại đây chúng phá huỷ tế bào nho déc 16

triển Đây là nguyên nhân gây ra khoảng 185000 trường hợp mắc mỗi răm |78] Việt

Nam nằm trong danh sách các nước thuộc khu vực Đông Nam Á thường hay xuất hiện 1gộ độc thực phẩm do in cau vang cao nhất trên thế giới Hơn nữa, mước 1a lại lá mộội nước có nên kinh tế đang phát triển, diễu kiện sinh hoạt cou yéu kém, vẫn dễ vệ sinh thực phẩm, vệ sinh nguồn nước sinh hoạt và việc xứ lý rác thái chưa thực sự được chủ trong Bay chính la điều kiện giúp cho ÿ aureus lây lan và phát triển thành các vụ địch,

kéo theo những tổn thất nặng nễ về mặt kinh tế cũng ni con người

30

1.3.4.1 Đặc điểm sinh học

Tu cau khuan Staphylococcus 1a vi khuan Gram duong, hinh cau, đường kính

khoảng 0.8 — 1.5 jum, te bao thudng tu lai thanh dam hinh chim nho S aureus khong

di động, kị khí tùy tiện, không sinh bảo tử, một số chủng có mảng giáp Cấu trúc thành

tế bảo của một số vị sinh vật trong đó có S/aphyloeoceus có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của tế bảo, tỉnh chất gây bệnh [92] Thành tế bào của

Staphylococcus duoc cau thanh tit murein, teichoic acids và các protein liên kết với

thánh Murein bao gồm các đơn vị glycan được liên kết với nhau qua cau nỗi peptide

Câu trúc gÌycan - murein ctia Staphylococcus bao gém N-acetylglucosamine (GlepNAc), phan đuôi N-acetylmuramic acid (MurpNAc) - thanh phan cung cấp liên ket J-(1,4) của các đơn vị disaceharide lặp lại - và MurpNAe là đại diện cho phân cuối

Hình 1.9 Cấu trúc lớp glycan cia Staphylococcus aureus [44]

(a: cau trúc bậc 3 của đơn vi disaccharide-peptide lap lai, b: sơ đỏ sắp xếp các don vi nay)

31

Dựa trên phương diện gây bệnh, tạ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chỉnh:

Tụ cầu khuẩn sink enzym coagulase

Nhờ enzym coagulase, trên mỗi trường nuôi cấy oó máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc mẫu vàng Do vậy vỉ khuẩn nay côn gọi là tụ câu vàng, Các ví khuẩn quan

trọng của nhỏm này là: Sfaphpiococcus aureus, Siaphylococcus inlermedius

Tự cần khuẩn không sinh eHzpm coagulase

1o không, có enzym coagulase nên trên môi trường nuôi cây có máu, khuẩn lạc

có màu tring nga Trén lam sang thường gợi các vị khuau này là tụ cầu trắng Cac vi khuẩn nhóm này bao gém : S.epidermidis, S saprophyticus, S haemolyticus, S capitis, [28] Ngoai ra edn 06 16 ching ta cdu khuẩn khác không hiện diện ở người

Phân lớn các tụ cầu khuẩn gây bệnh chúa snzyrm dezoxyribonuclease có thể

phan hay axit dezoxyribonucleic

1.3.4.2 Kha năng sinh độc tố [43]

Tụ cầu vàng có khả năng sinh ngoại độc lố và nội độc lố Ngoài sự sẵn sinh enzym coagulase và yếu tổ kết cụm, tụ câu khuẩn còn sẵn xuất một số enzym vả độc tổ quan trong góp phân tạo nên độc lực mạnh znế của chủng vi khuẩn này:

- Ilyaluranidase: enzym này có khả năng pha hủy chất cơ băn của các cơ quan, giúp vị khuẩn có thê phái tan (rong do

- Hemolysine va leukocidine: pha hdy hồng cầu (lam máu) và gây chết các lế bảo

hạt cùng như đại thực bảo

- Hxfoliatme: có khả năng phả hủy lớp thượng bị vả gây tốn thương da tạo các

bong mước Vi du điển hình là hội chứng T.yel† đo tụ câu

- Năm độc tổ ruột (enterotoxine A, I, C, D, E) bên nhiệt Các độc tổ ruột này

dóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm

32

- Độc tổ gây hội chứng sốc nhiễm độc : lả nguyên nhân gây nên hội chứng sốc

nhiễm độc, một hội chứng số

dm trong,

Tiêu hết các chủng tụ cầu khuẩn đều sản xuất được enzym penicillinase (beta-

laclamase) Erzynu nảy phả hủy vòng beta-laclarn, câu trúc cơ bản của các chất khang

sinh ho penicilin nhw penicillin G, ampicillin va ureidopenicillin, lam cho cáo chất

khang sinh này mắt tác dụng [46] Đặc biệt các chủng các chủng tụ câu vàng dé khang 1nothicilin (MRSA — Ä4ethictin resisiam Staphylococeus aureus) đang trở nền phd bién

và là môi nguy hai trong cộng đông vì nó cé khả năng kháng được nhiêu loại chất kháng sinh thể hệ mới nhất [78]

1.3.4.3 Nhiễm độc đo S aureus

Ngô độc thức ăn đo S areus có thời gian ủ bệnh ngắn hơn so với các nhóm vỉ

khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác, chi 1-6 giờ (trung bình 2-3 giờ) sau khi ãn

phải thức ăn có chứa độc tố Dộc tố này bên với nhiệt nên khi nâu thì tụ cân khuẩn bị

tiên điệt nhưng độc tổ vẫn tôn tại Biểu hiện của nhiềm độc gêm : hội chứng sốc do độc

tố, hội chứng tróc đa hay ngộ độc thúc ăn Các quá trình nhiễm độc do tụ câu khuẩn

trải qua 4 bước: sự xâm nhập chủng vi khuẩn sinh độc tố, sản xuất độc tổ, hấp thu độc

tố và gây độc cơ thẻ |92.Triệu chứng của bệnh: nôn ói, dau quần bụng và tiêu chảy, tiểu chảy không kèm theo máu và ít mắt nước hơn so với vị khuẩn tả và 2 coli, không, xuấi hiện sốt hay phát bạn (đây là đặc điểm để phân biệt giữa ngô đốc thực phẩm đo Lụ cầu váng với các nhóm vị khuẩn khác) thần kinh người bệnh bình thường Phan lớn trường hợp bệnh đều tự khởi và hồi phục trong 8-24 giờ sau khởi phát Những trường hop năng có thế bị giảm thể tích và tụt huyết áp [48]

1.3.5 Các nhắm vi khuẩn khác

1.3.5.1 Bénh do Listeria

Bénh do Listeria (Listeriosis) gay ra 6 ngudi d& duoc thira nhận từ lâu Bệnh xây ra không nhiều thường chủ yếu ở trẻ sơ sinh, người cao luỗi và người có hệ [hẳng

miễn dịch không hoàn thign Bénh do Listeria gay ra 6 ngudi dược coi như một bệnh

cơ hội Tuy nhiên, sự có mặt của 7, monacpfogenes trong nhiều loại thục phẩm có nguồn gốc từ động vật và thực vật và các bệnh có nguồn gốc từ thưc phẩm bị lây nhiễm chỉ mới được công nhận gần day L monocytogenes do Joseph Lister phat hién la truc khuẩn nhé Gram duong, dinh duéng lank, néi bao tay tién, ki khi khéng bắt buộc, không sinh bao ti, di déng Yéu té gay déc ctia L monocytogenes là một loại hemolysin dic biét, listeriolysin O Nó được tạo ra trong pha sinh trưởng của tế bào

Các tác nhân gây bệnh xâm nhập vào các mô của cơ thể và sinh sẵn bên trong tế bào

của cơ thẻ, từ đó giải phóng ra dộc tỏ |82, 87 |

1.3.8.2 Các hệnh da Campylobacter (Campylobucteriosis)

Campylobacter gay ra các bệnh viêm dường ruột-dạ dày ở người Ở nhiều nước, số ca Campylobacteriosis cỏ thể vượt xa tầng số các bénh do Salmonella va Shigella Thc pham cé lién quan rất nhiều dén Campylobacteriosis là sữa tươi và thịt gà nâu chưa chin Campylobacter lay tryén qua đường phân miệng, qua quan

hệ tỉnh đục [S0] Mặc đủ có một số Campylobaeier spp có liên quan đến bệnh Campylobacteriosis song chi cd C jejuni được phân lập trong bầu hết các trường hợp

mac C jejuni la vi khudn hình que, Gram âm, đi động, không sinh bảo tử Tế bao

nhỏ, dễ gãy và có bình xoắn C 7gumi chứa một độc tô đường ruột không bên nhiệt,

chịu trách nhiệm với các triệu chứng bệnh đường ruột Độc tổ phân từng chéo với dộc

tổ tả và đác điểm tao thành độc tố được liên kết với plasmid Ngoài ra, các chứng tac

ra một yếu tô xâm nhập cho phớp các tế bảo xâm nhập và thiết lập trong các lế bảo

biểu mô ở cả ruột non và ruột già của người [17]

1.3.5.3 Bệnh viêm đường rugt- da day do Clostridium perfringens

Viêm đường ruột gay ra béi C perfringens bing phát đêu có số lượng người mắc bệnh lớn Ở Mỹ, vào những năm 1960 và 1970, nó có liên quan tới trên 7% tổng,

số các vụ bùng phát phát sinh từ thực phẩm và trên 10% tổng số người mắc bệnh

34

Vào những năm 1980, tý lệ bùng phát phát sinh từ thực phẩm giảm xuống khoảng, 3% tổng số các vụ địch, khoảng 59% tổng số người mắc bénh [91]

Trong sé 5 typ C perfringens, cdc chime thuéc typ A during tham gia vao cdc

bệnh nhiễm lrùng - gây độc phát sinh từ đực phẩm Độc tổ ruột có liên quan dén bệnh phát sinh tử thục phẩm lá một protein không bên nhiệt JDö là một protein nội bảo được tạo ra bởi tế bảo trong quá trinh hình thành bảo tử trong ruột và được giải phóng ra Khác với các độc tô của các vĩ sinh vật gãy ngô dộc thực phẩm, độc ló ruột

được sẵn sinh trong đường tiêu hỏa Các thông số môi trường đổi với sự sản sinh độc

tổ ruột gó liên quan đến môi trường hình thành bảo Lữ: Một số bảo cáo cho rằng, ngoài ruột, sự hình thành bảo tử vả tạo thánh độc tổ ruột ở những nồng độ nhất dinh cũng xây ra trong một số loại thực phẩm [17]

1.3.5.4 Bệnh đường ruột- dạ dày do Öacilius cereus Bacillus cereus là những trực khuẩn Gram đương, đi động, tạo thành nội bảo

tử ở chính giữa của lế bào Bacillus cereus sin sink it nhat hai kidu độc Lô ruột (độc

tổ gây nôn và độc tổ ruột), mỗi loại có liên quan tới từng kiểu triệu chúng đặc thù [18] Đậc tổ được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của tế bảo ở phạm vi nhiệt đỗ sinh trưởng và dược giữ lại trong lế bảo Chỉ khi các tế bảo bị dung giải độc tổ mới được giải phóng ra Chủng tổn tại trong đường ruột nhưng cũng có thể tồn tại trong, thực phẩm Do vậy các trưởng hợp bệnh cũng có thể được cơi như ngộ độc thực phẩm giống như ngộ dộc thực phim do Staphylococcus

1.3.5.5 Vibrio cholerae V.cholerae thuée ho Vibrionaceae, là căn nguyên gầy nên bệnh tả Theo thông, báo của WHO mỗi năm có tới 8 triệu lượt người ở mọi lứa tuổi phải nhập viện vì tiêu

chảy do ví khuẩn tã, và hơm một phần ba s6 ca Lữ vong là ổ trễ em đưới 5 tuổi

V.cholerae dage chia thành 3 type huyết thanh khác nhau: Inaba, Ogawa,

Hikojima Kháng nguyên cũa E.eholerze gêm 3 yêu tố A, B, C tạo nên Sự khác nhau

35

giữa các type huyết thanh Ja rat lon Type Ogawa san xuất KM A và B, lượng nhỏ C

do vậy có thê

Type Inaba chỉ sản xuất KN A và C Type Ilikojima san xuat 08 3 yé

xây ra phân ứng chéo với kháng huyết thanh type Inaba và Ogawa [17]

Vi khuẩn tả xâm nhập vào cơ thể thông qua thức ăn, nguồn nước bị nhiễm khuẩn Sau khi xâm nhập, vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột và phát triển nhờ có pH thích hợp (pH xắp xí 8) và tiết déc t6 (choleragen cholera toxin CL)

13.8.6 Clostridium botulinum va bink do Clostridium botulinum (Botulism)

Các bệnh botulism xây ra sau khi ăn phải thực phẩm chứa độc tổ butulin có độc

luc cao tr Clostridium botulinum, Butulin 14 mét dgc té than kinh va tao ra ede tigu

chứng thân kinh củng với một số triệu chứng ở da day.Trit khi st dung các biên pháp điều trị nhanh chóng, nếu không bệnh rất dễ gây tử vong Bệnh do C botulinum xdy ra

ở trẻ em khi trẻ ăn phải bảo tứ Clostridiun, các bảo tử nảy sẽ náy mắm, sinh trướng, vả

xinh độc tổ trong lệ đường ruội- đa dày và gây ra các triệu chứng đặc thù

1.4 CÁC KỸ THUẬT PHÂN TÍCH KIEM TRA VI KHUAN TRONG THUC PHAM

Trong phân lớn cáo trường hợp ngô độc thực thậm do vì khuẩn, triệu chứng ngô độc thường đa dạng, nhiều lúc không biểu hiện rõ và diễn biển khá phức tạp Do vậy công tác tìm đúng thủ phạm gây ngô độc là vô củng quan trọng giứp cho việc điều trị

và theo đối diễn biển địch chuẩn xác, kịp thời

Kỹ thuật phân tích kiểm tra vi khuẩn trong thục phẩm đựa trên một số công,

nhiều bước kỳ thuật phức tạp vả thời gian kéo đải Bước đầu lả thu thập các mâu thực

phẩm sat đó tiền hành phân lập trên các môi trường đặc hiệu để kiểm tra sự có mặt của

vị khuân Các vị khuẩn phân lập lại tiếp tac được kiểm tra bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng loại và so sánh với bảng kết quả sinh hóa định danh vi khuẩn (bang sinh hóa bao gỏm các đác điểm sinh hóa đặc trưng nhật để phân biệt các loài vi sinh vật gay bệnh) [9] Quy trình nảy thường tổn rất nhiều thời gian, công sức và phụ thuộc vào

kinh nghiệm của các kỹ thuật viên mới cho kết quả chính xác [72] Tuy vậy đây vẫn là xuột phương pháp sáng giá, một công cụ hữu ích trong việc xác định sự cỏ một của một

số vị khuẩn trong thực phẩm mà phản lớn các phòng kiểm nghiệm thực pham trong, nước sử dụng Việc phát hiện các vi sinh vat trong thực phẩm và thức ăn chăn nuồi

theo tiêu chuẩn Việt Nam vẫn dang được thực hiện theo phương pháp nảy [25]

Hiện nay, các thủ nghiệm sinh hỏa truyền thông dé dink danh vi sinh vật đã có thể được thực hiện đơn gián hơn ở dạng đĩa giấy, que giấy Ngoài ra còn có cáo bộ kít

cho phép thực hiện hàng loạt thử nghiệm hóa sinh theo một quy trinh hai lựa chọn đế

dinh danh vi sinh vat Bé kit nay dang din dugc phổ biến với ưu điểm xác dịnh dịnh tướng phân biệt các chứng vi sinh vật, kiểm tra chuyên sâu về phân loại vi sinh vật đồng thời các bước tiên hành thường đơn giản, tiết kiệm thời gian, công sức hơn so với

phương pháp nuôi cấy thông thường, Các bộ tcat thường sử dụng la APL, Rosco, Tuy vậy mỗi bộ kit chỉ cho phép định đanh được một số vi sinh vật, chỉ phí thử nghiệm đất

tiên [23]

“Kỹ thuật màng phẩm khé (petrifiim)

Đây là kỹ thuật mới với sự góp sức của các môi tường sẵn dưới dạng petrilhi

nhằm hỗ trợ cho phương pháp nuôi cây truyền thống Mẫu thực phẩm được cấy truyền

trên màng phim đã tái tạo độ Ấm thích hợp và tạo thành gel Sau đó màng phim được

đưa vào tả cây để quần thé vi sinh vật phát triển, tiếp theo tiên hành kỹ thuật nhuộm

mâu dễ xác dịnh chúng vị sinh Kỹ thuật mảng phim khô có thuận lợi không mắt công, chuẩn bị môi trường, thao tác thuận tiện tiết kiệm dung tích môi cây

1.4.2 Các phương pháp hiện đại

Phương pháp miễn dịch

Thương pháp thử nghiệm hập phụ miễn địch gắn enzym (ELISA) cũng được sử

dụng ngày cảng rộng rối và quan trọng hơn trong nghiền cứu, chân đoán và xói nghiêm

do nó có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, Phương pháp này đã được phát triển ở quy mô thương mại và được sử dụng để phát hiện một số tác nhân gây bệnh phát sinh từ thực pha va déc t6 eda cling gdm Salmonella, L monocytogenes, C jejuni Mimmich di

sử dựng IgG kháng lại kháng nguyên roi của Sabnonella ‘Yyphimurium để phát biện

Salmonella hay việc sử đụng enzym đánh dau bing avidin — biotin da phat hién duoc Salmoneila trong, cae miu thu phim véi gidi han 25CFU/g Tuy nhiên phương pháp

BLISA théng thuong chi phát hiện được vi khuản trong mẫu thực phẩm với nêng độ 10*— 10° CFUAnt (g) do vậy vẫn cần phối có bước tặng sinh Irước khi phân tích

KF thudt khuéch dai phan ing polymerase (PCR)

PCR la phin ứng có sự tham gia của các onzyr nhầm khuếch đại một đoạn axit

nucleic mong muén Day là một kỹ thuật m vivo cho phép nhân nhanh một đoạn gen

mong mudn lên hàng triện lần trong một khoảng thời gian ngắn Phản ting PCR hoan

toàn dựa theo quả trình sao chép ADN trong tế bảo, trong đó ADN dược nhản lên theo

cơ chế bán bao tan PCR 4a được chứng minh là một trong những gông cụ hữu hiệu

trong chân đoán nhanh các bệnh truyền nhiễm [68,102] Kỹ thuật này hiện nay dang

được áp dùng trong nhiều lĩnh vực như khoa học hình sự, mô bệnh học, các chẩn đoản trước sinh và chẵn đoán về các mắm bệnh [24]

PCR đã được sử dụng để chuẩn đoán, xác định nhanh Shigella, Salmonella và

4 coli, Hai đoạn gen im¿11 và inu12 đã được sử dụng làm trình tự thiết kế một cặp mỗi để phát hiện Sabnonella trong các mẫu thục phẩm bằng phương pháp PCR [86]

38