Luận văn nghiên cứu sự lưu hành của virus cúm b tại miền bắc việt nam

Với những gánh nặng bệnh của virus cúm B như vậy, việc triển khai nghiên cứu về sự lưu hành, dặc diểm dị truyền cũng nay đặc tỉnh kháng nguyên của virus cửm B tại Việt Nam là hết sức câ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HA NOI TRUONG DAI HOC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHAM HOAI LINH LY

NGHIEN CUU SU LUU HANH CUA VIRUS CUM B TAI MIEN BÁC

VIET NAM

Chuyén nganh: Vi sinh vat hoc

Mã số: 60420107

LUẬN VAN THAC Si KHOA HOC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : T8 Nguyễn Lê Khánh Hằng

GS TS Pham Văn Ty

HA NOI-2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam dou đây là công trình nghiên cứu của riêng lôi,

Các số liệu, kết quả trơng luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

bố trang bái kỳ công trình nào khác

TIỌC VIÊN

Pham Hoai Linh Ty

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin tỏ lòng kinh trọng và biết ơn sôu sắc tới:

« Ban Giảm hiệu Trường Đại hạc Khoa học Tự nhiên - Đại học QGHN

© Ban Gidm đắc, Ban Chủ nhiệm Khaa Liri, Viện VỆ sinh Dịch tễ TƯ

Đã tạo diều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu,

Tôi xin dược lỗ lòng biết ơn sâu sắc tới Thấy hướng dẫn khoa học: T6 Nguyễn

Lê Khánh Hằng, Khoa Virit, Vign V8 sinh Dich tẾ Trang ương đã tận tình chỉ bảo

và đầu đất tôi trong suốt guả trình nghiên cứa từ bước đấu tới khi hoàn thiện luận văn, tạo mọi diều kiện nghiên cứu thuận lợi dễ tôi có được kết quả như ngày hôm

nay Tôi cũng xin được gửi lời căm on chân thành nhất đến GS TS Pham Van Ty, Trường Đại hạc Khoa học Tự nhiền, ĐHOGHN đã hướng dẫn tôi những kiến thức

chuyên ngành hữu ích trong suỖI quá trình học tộ

và nghiên cứu

Tôi xin iran trọng cảm ơn các Thấy, Cô BG min Vi sink vat hoc, Khoa Sink học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN dã cho lôi những kiến thức

chuyên ngành quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi đễ tôi hoàn thành khóa học

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS 1 Lê Thị Quỳnh Mai, Phó Viện

tưởng Viện Vệ sinh Dịch lỗ Trung wong, ThS Ilodng Ưũ Mai Phương, TH

Nguyễn Cơ Thạch cùng các anh chị công tác tại Phòng Thủ nghiệm Củm, Khoa

Viritt, Vién VỆ sinh Dịch (Ế Trung ương đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, nhiệt tình

hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suất quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận vấn

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời căm ơn sâu sắc tôi gia đình, bạn bè và đồng nghiệp - những người đã tiên thêm cho tôi nguồn động viên quý giá, luôn bên cạnh

chia sé va giúp dé dé ti dat âược thành quả hôm nay

Tà Nội, ngày L4 thông 4 năm 2014

Phạm Loài Linh Ly

1.1.1 Đặc điểm chung SH TH TH TH KH TH TY KH HT sec

1.1.2 Hình thải vả cầu trúc vuưion của virus cửm H

1.1.3 Cấu trúc phân tử của virus cúm B và chức nồng,

1.1.4, Cơ chế nhân lên của virus cúm l -

1.2 SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TRÊN THẺ GIỚI

1.3 SỰ LƯU HÀNH CỬA VIRUS CỨM B TẠI VIỆT NAM

1.4 SỰ TIỀN HÓA CUA VIRUS CUM 1

1.5 BIẾU HIỆN LẮM SÀNG VÀ SINH BỆNH HỌC BỆNH CỨM

1.5.1 Biểu hiệu làm sảng cửa bệnh cúm:

1.6.2 Dự phòng

1.71 An toàn phòng thí nghiệm

1.7.2 Thu thập mẫu để chân đoán virus

1.7.3 Phương pháp phân lập chúng và định typ virus

1.7.4 Phương pháp xác định trình tự gen (Sequenee)

CHUONG 2 DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

23.1 Binh typ virus bing phan (mg ngin ngưng kết hồng cấu

(HAD ¬ " sete ees

2.3.3 Phương pháp phân tích kết quả và xử lý sẻ liệu

3.1 KET QUA PHAN LAP VA KHUECH BAI CAC CHUNG

VIRUS CUM B TAT MIEN BAC VIET NAM, 2010-2012

3.1.1 Sự hơu hảnh của virus cúm E tại miền Đắc Việt Nam, 2010-2012

3.1.2 Kết quả phân lập virus cứm B tại miên Bắc Việt Nam, 2010-

3012

3.2 DẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM B, 2010-

3.3 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYÊN VÀ PROTEIN HA CÁC CHỦNG

VIRUS CUM B TẠI MIỄN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012

3.3.1 Sự phân bố cáo chúng virus cum B theo thoi gian

3.3.2 Kết quá khuếch đại đoạn gen LLA của virus cúm l3

3.3.3 Cây gia hệ gen 11A

3.3.4 Proteim LLA cà cà sec

3.4 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYEN VA PROTEIN NA CAC CHUNG

VERUS CUM B TẠI MIỄN BẮC VIỆT NAM, 2010-2012

3.4.1 Kết quá khuếch đại đoạn gen NA của virus cứm H

3.1.2 Cây gia hệ gen NA

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

Acid Deoxy Ribonucleic Acid Ribonucleic

Centers for Disease Control and Prevention (Trung idm phong chống

về kiêm soát bệnh tật Hoa Kỳ)

Temaglutination Assay (hương pháp ngưng kết hồng cầu)

Llemaglutination Inhibition test (Phdn img ngdn ngưng kết hông cầu)

Influenza like illness (Hi chiang etim)

Madin-Darby Canine Kidney Celis (Tế bào thận chó thường trực)

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tông hop chudi polymerase} Quadnvalent Tnfluenva Vaccine (Vac xin gdm 4 ihanh phan virus

HINI, H3N2, B/Yamagata va B/Victoria) Phite hop Ribonuclcoprotein

World Ilealth Oganization (T6 chức Y tả Thế giới ) Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Kết quả phân lập virus cúm B tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012

Kết quả định typ virus cúm B bằng phương pháp HAI, 2010-2012

Hiệu giá HI của các chúng virus cứm B, 2010-2012

So sánh hiệu giá TIAI giữa hai dòng I3/Victoria và I3/Yamapata

So sanh khang nguyén virus cam B tại Miễn Bắc Việt Nam với

thanh phan vac xin cúm tại Bắc và Nam Dán cầu theo khuyến cáo

của TCYTTG, 2010-2012

Số lượng chúng phân tích gen LLA và NA

VỊ trí aet amin thay đổi trên protem HA dòng B/Vitoria, 2010-

2012

VỊ trí axit amin thay đổi trên protemn LIA đóng l3/Yamagata, 2010-

2012

Số hượng trung bình axit amin thay đổi trên protein IIA so với

vius dự tuyển vắc xin của TƠYTTG, 201 0 -2012

Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dong 13/Vitoria, 2010-

2012

Vị trí mmát amin thay đổi trên protein NA đồng B/Yamagata, 2010-

2012

Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein NA so với

virus dự tuyển vắc xin của TƠYTTG, 201 0 -2012

Mö hình câu trúc chưng của virus cúm

Cu trinh nhân lên của virus cúm

Các vị trì đột biển trên cẩu trúc khỏng gian 3 chiếu của

Neuraminidase

Sự lưu bành của virus cúm 13 tại miễn Bắc Việt Nam, 2010 -

2012

Tỷ lệ lưu hành 2 dòng kháng nguyén virus cim B theo nim

Sân phan gen HA sau PCR

Sản phẩm gen HA sau khi tỉnh sạch

Cây gia hệ gen HA (1140 nuelsotide) dòng J/Yamagala vả dong B/Victoria, 2010-2012

Cây gia hệ gen HA (1140 nueleotide) dòng, B/Vietoria, 2010-

3 012

Cây gia hé gen HA (1140 nucleotide) dong ByYamagata, 2010-2012

Vị trí axit amin thay déi tén protein ITA déng B/Victoria

‘Vi tri axit amin thay doi trên protem HA dong B/Yamagata

86 axil amin khac nhau trên protem HA dòng B/Victolis giữa các chúng nghiên cửu vả chúng dự tuyển vắc xin

Sân phẩm gen NA sau khi tính sạch

Cay pia hé pen NA (1957 nucleotide) déng B/Victoria va ding B/Yamagata, 2010-2012

Cay gia hé gen NA (1557 nucleotide) déng ByVietoria, 2010-

2012

Cây gia hệ gen NA (1557 mueleotide) dòng B/Yamagala, 2010-2012

Vi tri axit amin thay đổi trên protein NA đồng B/Victoria

Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA đòng B/Yamagata

Số axit amin khác nhau trên protem NA dòng B/Victoria giữa các chúng nghiên cửu vả chúng dự tuyển vắc xin

$6 axit amin khác nhau trén protein NA dong B/Yamagata

giữa các chủng nghiên cứu và chững đự tuyên vắc xin

Cae vi tri axit amin trên prote NA của 2 dòng l/Yamagata

và B/Victoria liên quan đên đột biển kháng thuốc hoặc giảm

độ nhạy của thuốc oselLamivtr và zanamivir

MỞ ĐẦU

Hàng năm lrên Thế giới cũng như tại Việt Nama, virus cúm vẫn tiếp tục gây

Ta các vụ địch/ đại dịch củm với tí lệ mắc và tứ vong cao [31] rong dé, virus cum

A duoc quan tâm nghiên cứu hơn cả đo loại virus nảy có khả năng gây ra các

én dx dich HINI (2009) cíng

đieh/đại dịch nghiêm trọng, gần đây nhất có thể

như các vụ dịch do virus cúm độc lực cao lây truyền từ gia cảm sang người AJHSNI Neuyén nhân là đo virus cúm A có đối tượng gây nhiễm đa dạng như gia

cfm, thủy cằm, châm di cư, động vật có vú và người |8]

Trong nhiều thập kỷ qua, vữus cúm B được biết đến như một loại virus gây

bệnh cảm lạnh thông thường, không gây thành dịch/dại dịch lớn Khác với virus

cứm A, virus cứm lš chỉ có những thay đổi nhỏ kháng nguyễn (đột biên) [43] Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu đã cho thấy triệu chứng lâm sảng khi nhiễm cúm B cũng như tỷ lệ nhập viện và tử vong lên quan đến củm B và viêm phổi đo bội

nhiễm cũng tương tự khi nhiễm virus cúm A Tại Mỹ, trong giai đoạn 2004-2008,

trong 309 trẻ tử vong liên quan đến vims cúm mùa có 34%⁄4 trường hợp tử vong đo virus cún B [23] rong mủa củ 2011-2012, tỷ lệ trẻ em tứ vong do virus củn B

chiêm tới 38 % (44/115), trang đỏ chỉ có 50% số trẻ em được điều trị các loại thuắc

kháng virus Chính vì vệ

¢ trường hợp nhiễm cúm B rị

v đã không có cơ hội

được diễu trị và can thiệp kịp thời tránh bội nhiễm, biển chứng dẫn tới tử vong |18| khi nghiên cứu 45 trường hợp tt vong do virus cam B cho thay 1/3 trong số này bội nihiểm vì khuẩn Staphylococeus aureus, rong đô số rường hợp Lữ vong trong 3 và 4

ngảy sau khi nhiễm virus 1a 50% va 70% [20] Như vậy, thời gian tử khi nhiễm

virus cửm B đến khi tử vong nhanh hơn so với virus cửn A/HIN1 1918, A/H2N2

1957, A/H3N2 1968, A/HINIpdm 2009 và A/H3N2 |21, 26, 32, 35,| Mặt khác,

virus cum B két hop voi các virus gây viêm đường hỗ hấp khác sẽ có khả năng gây

biển chứng nguy hiếm cho trẻ em, người giả, người suy giảm miễn địch hoặc mắc các bệnh mạn tỉnh và phụ nữ mang thai nếu không cỏ biện pháp phòng ngừa kịp thời.

Trên thể giới, từ những năm 1970, vắc xin củm được sản xuất lả vắc xin da

giá, thành phần vắc xin bao gdm 2 phân týp vims cứm A (A/IINI, A/II3N2) va 1

déng virus ci B (Trivalent influenza vaceine - TTV) Vao nhimg năm của thập kỹ

80, virus cum B đã xuất hiện 2 dòng, B/Yamagata và B/Victoria, lưu hành đồng thời

ở nhiền nước nhưng thành phần vắc xin vẫn lựa chọn chúng đại điện cho một dong

>

khang nguyén virus cinn B [

7, 4Ñ] Vì vậy, những năm virus cứm B lưu hành

động kháng nguyên thì hiệu quả của vắc xia dự phòng sẽ hạn chế, Mặt khác, nhiều

ầm đã có sư không phủ hợp giữa chủng virus cúm Ð đang km hành và chủng virus cứm B được lựa chọn trong thành phần vắc xin hàng năm

Tại Việt Nam, kế từ khi dịch viêm đường hô hắp cấp tính nang (SARS), cam

gia cam A/HSN1 xuat hiện năm 2003 dến nay gánh nặng bệnh củm gân dây đã dược quan tâm nhiều hơn Tuy nhiên, virus cùm 1š đường như vẫn chưa được quan tâm

đúng mục Với những gánh nặng bệnh của virus cúm B như vậy, việc triển khai

nghiên cứu về sự lưu hành, dặc diểm dị truyền cũng nay đặc tỉnh kháng nguyên của virus cửm B tại Việt Nam là hết sức cân thiết Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tải:

“Nghiên cứa sự licu bành của virus cium B tại mién Bac Viét Nam”

Với mục tiêu:

1 Xác định đặc điểm di truyền gan HA và NA cũa vừus cảm B lưu hành tại miễn

Bắc Việt Nam, 2010-2012

2 Xác Ãịnh đặc tính kháng nguyên và các avit amin thay đối liên quan đến sự thay

đỗi đặc tính khẳng nguyên của virus cứ

‘Trong 46, virus cam A lưu hành phổ biển trên gia cảm, người và các động vật khác

như lợu, ngựa là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên oan cầu Virns cúm B

và C chỉ lưu hành chú yếu ở người vả thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ [8] Gay ra dich bênh theo mùa là đặc tỉnh của virus cứm A và l, xảy ra chủ yếu vào cuối mia thu và đầu mùa đông Khi có những thay đối lớn kháng nguyên (antigenic shift) xuất hiện ở kháng nguyên của virus cum A, các vu dich lớn có thể

xy ra với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao Virus cúm B3 không có những thay đổi lớn

kháng nguyên tưng có thể tiến hóa bởi những thay đổi nhỏ kháng nguyên

(antigenic drift) va khéng gây nên các vụ đại dịch nghiêm trọng Tuy nhiên những,

"biển chứng thế nặng có thể dẫn tới tử vong đo virus cúm B đã được ghỉ nhận

Danh pháp quốc tế được quy dịnh cho virus cum B duge viết như sau: B/nơi phan lập/mã số T'TN/Zmăm phân lập (ví dụ: B/HongKong/330/2001) Do sự thay đổi

vẻ kháng nguyên bể mặt của vwus cúm B hau như không quan sát được nên danh pháp quốc tế của virus cúm B khéng co sự tham gia của kháng nguyên bể mặt HA

và NÀ như đối với đanh pháp quốc tế được quy định cho virus cim A

Virus cam B được phần chia thành 2 đỏng kháng nguyễn phân biệt vào những năm 1980, đỏ là dòng B/Vicloria (B/Vicloria/2/87-lineage viruses) va dong By/Yamagata (B/Yamagata/] 6/88-lincage viruses) Cae dong virus nay duge dit tén

sau khi xuất hiện các đại diện đầu tiên 14 B/Victoria/2/87 - like virus va

T/Ysmagata/16/88 - like vừus [48]

1.12 Hình thái và câu trúc của virus cúm B

Thành phần cầu trúc của virus củm B gồm co: 1% ARN, 70% protein, 20%

lipit va 5-8% carbohydrate Virion ctim (hat virus hoan chỉnh, dạng vưus nghỉ ở

ngoài tế bảo) có hình dang rat da dang: hinh cau, hinh trimg hoặc hình sợi kéo dải

tới 2000nm, đường kính trung bình từ 80-120nm Virus củm B có cầu trúc phức tạp

và có vỏ ngoài bao bọc Vỏ ngoài vius cỏ bản chất là protein có nguồn góc từ mảng,

tế bảo chất của vật chủ, bao gồm một số glycoprotein và một số protein dạng trần không được glycosyl hoá Các virion cúm cỏ các tính chất hóa lý như rất nhạy cam khi xử lý bằng cách đun nỏng, dùng dung môi lipit, chất tây rửa không chứa ion,

formaldehyde, tac nhan 6 xi hoa, kha nang lay nhiém của các virus cúm cũng bị

giảm đi sau khi chúng tiếp xúc voi bite xa

|HA

NA M2

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc chung của virus cam

*Nguén: Funtional and structure studies of influenza B virus Hemagglutinin

by Fengyun Ni [22]

Trên bề mặt vỏ ngoai virus cé dinh cac gai glycoprotein, đó là các kháng

nguyên haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Virus cúm chỉ có một gai

glycoprotein Protein HA gay ngưng kết hỏng cầu, có vai trò quyết định trong việc

gắn virus vào tế bảo chủ, protein NA có chức năng phả vỡ liên kết giữa virus và tế

‘bao chủ đề giải phóng virus ra khỏi tế bào nhiễm Tỉ lệ TIA/NA là 4⁄1 (hình 1.1)

1.1.3 Cần trúc phân tử của virus cúm B và chức năng

Genome ci virus clu B gém 8 phôn đoạn giống rửủư virus cúm A, oon

virus cum C chỉ gồm 7 phân doạn, trên mỗi phân doạn có thể ghi dâu cho nhiều mật +nãä di truyền Sợi ARN của virus cứm JA soi đơn âm, có chiều đài khoảng ~13.6kb

đối với virus củm A và ~14.6kb dối với virus cúm B |6] Mỗi phản doạn mă hoá

cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc

Bang 1.1 Các nhân đoạn ARN của virus cứm và chức năng |52|

1 PB2 Tim thấy trong quá trình tổng hợp ARN théng tin

5 Bi (nRNA) Đông với trò làm ernzvme phiên mố: gắn kết,

_ kéo dải, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp virus thế

hệ mới trong tế bào chú

3 PA Tim thấy trong quả trình tổng hợp ARN virion (vRNA)

4 HA Thân tử có câu trúc trimer, cất bởi enzyre thuỷ phân

„ thành HAI và HA2, là cơ số cho khả nẵng nhiễm trùng

) TIA gắn với tế bào túc chủ, dung hợp giải phỏng phức

hop ribonucleaprotein (RNP), mở đầu cho quá trình

nhân lên của virus

5 NP 1à thành phân protein chủ yêu của phúc hợp RNP, chứa

một trong các kháng nguyên đặc liệu lýp, phân biệt 3 (Nucleoprotein)

typcim A B,C

6 NA Thân tử có cầu trúc tetramer, thuỷ phân bằng protease,

cho phép virus tiến qua lớp mêm địch tới các lễ bảo của

đường hồ hấp trong, quá trình nhiễm trủng,

Loại bỗ phân tử axit sialic cia phan tit HA tir cde virion

NB(=M2) mới được tổng hợp, làm 16 LLA ra ngoai, ting kha năng

nhiễm tring

7 MI-M2 MI: là kháng nguyên đặc hiệu týp, có chức năng ổn

định cấu trúc virus, diéu khiến hoại tỉnh RNA-

polymerase và tham giá vào quả Hình lắp rap virus

(70%) M3: kệnh ion

8 NB1-N82 La protein không cầu trúc, kết thúc quá trình tổng hop

protein của tế bào túc chủ, chỉ có trong 1é bao nhiễm

cúm Ö có cầu trúc và chức năng tương tư phân đoạn HA cửa virus cúm A, dé la mét

kháng nguyên bẻ mặt chủ yêu, giúp virus bam định và xâm nhấp vào tế bào chủ [10,

47] Khác với vừa cúm Á, vừn cúm B được ghỉ nhận chỉ lưu hành ở người và bái

cấu Vì vậy chí quan sát thấy các thay đổi nhỏ kháng nguyên ở virus củm 13, Các thay đối nhỏ kháng nguyên ở phân đoạn HA của virus cúm B xuất hiện như ở virus

cứm À, bởi sự tích tụ của cáo axit amin thay thé trong polypeptide HAL, nhung chi

khoảng 1⁄4 tỉ lệ nảy ở virus cảm Á, Do đỏ virus cứu B không gầy ra dại dịch như xuột số virus cian A

Vào những năm 1980, virus cúm B đã được phân chia thành hai dòng kháng, nguyên phân biệt là B/Victoria và B/Yamagata Hai dong virus cứm B được phân biệt bởi sự khác nhan @ axit amin vị tí 269 Axit main vị trí 269 của ding

Yamagata la Pro nhưng ở tất cá cáo virus dòng Victoria là Ser Sự biến dỗi từ Pro sang Ser là một biến đối bất bảo toàn, liên quan đến sự phân phổi điện tích (trưng

tỉnh [hành có cực) và hình đăng của các nxit amin [19]

Tiiện nay, thử nghiệm ngần ngưng kết hỏng cầu ([leamagelutinin inhibition

test ~ HD) sử dụng kháng huyết thanh dặc hiệu với hai dòng virus đã cho phép phân biệt hai dòng kháng nguyên này của virus cúm l3.

1.1.4 Cơ chế nhân lên của virus cúm B

—_

ut

Céive ummm CRNA (+)

‘Mang té bao

Hình 1.2 Chu trình nhân lên của virus cúm

* Nguôn: Funtional and structure studies oƒ influenza B virus Hemagglutinin [22]

Đầu tiên, virus sẽ gắn vào các thụ thẻ đặc hiệu trên mảng sinh chất của tế bào chủ nhờ gai glycoproteim HA theo nguyên tắc khóa - chìa Các thụ thẻ đặc hiệu có

ban chất lả các axit sialic (N- acetyl neuraminic acid - NANA) Sau đỏ virus xâm nhập vào bên trong tế bảo theo cơ chẻ nhập bảo Các virion virus ấn sâu vao mang

tế bảo tạo hộc rồi khép lại tạo túi nội bảo hay bọng (endosome) nằm bên trong tế bảo chit Bom proton trong endosome van chuyén II’ vac lam cho pli trong endosome giảm xuống 5, pH thập tạo điều kiện cho protein F (usion) chải lên cắm vào màng endosome như chiếc neo, kéo vỏ ngoài virus sát với endosome va tién

hành dung hợp với màng endosome đế giải phỏng mueleocapsid vào tế bao chat Su hợp nhất này chỉ xây ra khi phân lử HA tiên thân (HAO) phân tách thành HAI và

HA2 nhờ protease phố biển là fuim Phân tử HA2 có đầu - N đóng vai trò hoà tan

trung gian giữa võ virus và màng nội bảo (hình 1.2) Protein M2 4 virus cim A hay còn gọi là kênh ion (lon - clsnuiels) cũng đóng vai trỏ quan trong trong quá hình

thay dỗi pH và dung hợp này

Hầu hết các vưus ARN tiến hành sao chép trong tế bảo chất vì chúng, có thể xnã hỏa cho tất cá các enzym cần cho sao chép genome má không cẩn đến các

enzym của tế bảo nằm trong nhân, nhưng đổi với virus củm, chúng lại cản bộ máy

cắt nói của tế bảo nên genome cua chung phải dược đưa vào nhân Sau khi hợp nhất mang, nucleocapsid được vận chuyển vào trong nhân tế bào Trong nhân, sợi ARN

(-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ABK (1) theo cơ chế bố sưng IeARN @ŒĐ| sửờ enzyme RNA - polymerase phụ thuộc ARN của vinn Chính các

SARN (P) này lại được dùng làm khuôn dé tang hop các sợi ARN (-) mới là nguyên

vật liệu đi tuyển của vi C

chỉnh về độ dai (cd dé dai da - full length ARN), khéng duge mii hod ¢ dau 5° va

không được ađenyl hoá ö đâu 3' Các ARN (-) mới này một phần được phiên mã

soi ARN (-) duge tao thành này là một sợi hoàn

tạo ra các mRNA (1) ngắn hơn Sau đó, quá trình địch mã thành các protoim với các

chức năng khác nhau xảy ra ở tễ bào chất Các protein nay bao gồm 7 protein cau

trac PBL, PB2, PA, LLA, NA, NP và M1 và 3 proter không cầu trúc NS1, N2 vá

M2 déi với virus cứm A va 1 protein khdng cdu trie NB déi vei virus cium B Cac

protem N81, M1 và NP được vận chuyên vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới

tổng hợp đề hình thành nên nu¡cleocapsid, sau đá được vận chuyển ra tế bào chất

Tại đây, các protern HA, NA, M2 dược chuyển qua lưới nội chất tới bộ máy Golgi,

tương tác với nhau, bao bọc nucleocapsid, khối đầu cho việc náy chổi của virus llạt

virion mdi dược tạo thành bằng cach nảy chỗi từ màng, sinh chat Phan bi NA phan cắt axit sialio giãi phóng vims ra khỏi tế bảo chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm

mới [8]

1⁄2 SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM B TREN THE GGL

Hoạt dộng của virus củm B dược báo cáo trên nhiều quốc gia trong những, nam pan đây với sự lưu hành đồng thời của cả 2 dòng I3/Yamagata và đòng

cáo biển thể thuộc dong Yamagata da lan ra khắp thể giới, trang khi các chứng của

đòng B/Victoria/2/87 trước dỏ lại tiếp tục lưu hành ở Châu Á rồi sau đó trải qua các tiến hóa không phụ thuộc trở thành dòng phân biệt về dặc tính kháng nguyên [46]

Tiên thế giỏi, hai dòng vírns củm B dấu được xác định lưu hành hàng rằm, tuy nhiên một trong hai dong sẽ chiếm ưu thế trong từng năm Dựa vào kết qua giảm sát này, Tổ chức Y tê thê giới (TƠYTTG) sẽ đưa ra khuyên cáo về sự lựa chọn dong khang nguyén B trong thành phan vac xin cum hàng năm cho các nước thuộc khu vực Bắc bắn cầu hoặc Nam bán câu Trong giai đoạn từ năm 1999 đến năm

2002, dong B/Yamagala chiếm ưu thế hon đá được lựa chạn vào thanh phan vắc

xin Cae virus cm B thude dong Yamagata trong giai doan nay có đặc tính kháng

nguyên và di truyền giống với chúng I3/Sichuan/379/99, Trong giai đoạn tiếp theo

từ năm 2002 đến nằm 2004, ở cả Nam bán cầu va Bắc ban cầu déng virus ctan B

chiém wu thé lai la déng Victoria với các virus có dặc tỉnh kháng nguyễn vả dị

truyền giống với chủng I⁄IIongKong/330/2001 Tương tự như vậy, dường như sự tau hành của virus cúm B có một quy luật lặp lại 2-3 năm một lân Khi ma trong giai đoạn từ năm 2004 đến năm 2006, dòng, Yamagata quay trở lại chiếm ưu thể trên

thê giới với đại diện lả chủng B/ShangTiai/361/2002 Trong giai đoạn từ năm 2006

đến năm 2008, trên cả Nam bán cầu và Bắc bán cầu, đồng chiếm ưu thể là đồng

Viotoria với đại điện là chúng 13/Malaysia/2506/2004 Trong giai đoạn tiếp theo từ

20

năm 2008 dến năm 2009, dòng virus củm B lưu hành chiếm ưu thể là dòng, 'Yamagata với đại diện là chúng B/Forida/4/2006

Từ năm 2009 đến năm 2011, vưus cứm B xuất hiện ở trên khắp các Châu

luc, cã 2 đông virus cúm B là đông Victoria và đòng Yamasata lưu hành đồng thời nhưng dòng chiếm ưu thể là dòng Victorin Cac virus cir B thuộc dòng Victoria co

andi quan hé gan gũi vẻ dậc tinh kháng nguyên vả di truyền với chúng vắc xin B/Brisbane/60/2008 Phân lớn các virus thuộc đèng Yamagata cé cac dic tinh gan với ching dại dién trsde dé 1a cling B/Florida/4/2006 Tuy nbién bat dau từ cuối năm 2011, cã 2 déng cúm B được quan sát thấy với tí lệ ngang nhau 6 mét sd qudc

gia, điển nay gợi ý đến khả năng quay trở lại lưu hành của đòng Yamagata mặc đủ

số lượng vữus thu thấp được là tương, dối it Hau hết các virus dong Yamagata di

có sự khác biệt vẻ tỉnh kháng nguyên vả di truyền với chứng 13/1lorida/4/2006 trước

đó mà có các đặc tính có mồi liên hệ gắn hơn với chủng B/Bangladesh/333/2007, B/Hubei- Wujiang/1 58/2009 và B/Wisconsin/1/2010 Trong năm 2012, hoạt dộng

lan rộng và có tỉnh chất vùng miễn của virus cúm B_ được báo cáo trên nhiều quốc gia, vùng miễn và lanh thé ở Bắc bán cầu trong giai đoạn từ tháng 2 đến tháng 7 bao gồm Chiu My, Chiu A va Chau Au Ở Nam bán cầu, hoạt động này cũng dược báo cáo ở Telivia, Hcuador, Paraguay và Peru trong khoảng tháng 6 đến thang 8 Châu Đại dương và Châu Úc các vụ địch cũng xuất liệu vào tháng 8 Ở Nam Mỹ,

hoạt động của virus củm B tăng lên vào tháng 7 và trở nên mang tỉnh chất ving niên vào tháng 8 Trong thời gian này vẫn cé sự lưu hành đồng thời của cá 2 dang

virus cửm tuy nhiên động Yagarnala đã tăng lên ở một số nơi và trở nên chiếm tị thế Và phản lớn các virus thuộc dòng Yamagsta dêu có mối liên hệ mật thiết về tình chất kháng nguyên vả dị truyền với chứng I3/Wisconsin/1/2010 [46]

Vào cuối năm 2012 và đầu năm 2013, hoạt động virus cứm B tăng lên ở Nam

‘Mf tir thang 11 với các vụ địch mang tính chất vùng miễn được báo cáo ở Mexioo

và Mỹ Các vụ địch lan rộng cũng được báo cáo ở Châu Au vao thing 1 nim 2013

Ở Châu Á, hoạt động của virus củn B nhìn chung thấp Lloạt động cua virus cam B

21

không liên tục và mang tính chất ving miễn cũng được bảo cáo ở một số quốc gia ở Tiắc Phi Trong thời điểm này, virus cúm I3 vẫn hm hành ở cả 2 dang đồng thời, ty nhiên các virus cúm Ð đòng Yamagata vẫn tiếp tục tăng tỷ lê và trở nên chiếm tru thé ở nhiều quốc gia Hầu hết các virus thuộc đóng Yamagata phân lập được trong,

giai đoạn nảy có tính chất kháng nguyên phân biệt với chủng vic xin trước đó là /Wisconshư1/2010 mà có những đặc lính có mối liên hệ gần hơn với ching

ByMassachusett/2/2012

Nhìn chung có thể thấy rằng sự lưu hành của virus cún B trên Thế giới trong, thời gian qua tuân theo một quy luật 2-3 năm lại thay đổi dòng chiếm ưu thể là dòng,

ByVictoria hoge dong B/Yamapata

13 SỰ LƯU HÀNH CỬA VIRUS CUM B TAI VIET NAM

Hội chimg cm (influenza like illness - TT) 14 mt wong 26 bệnh truyền

nhiễm có tỷ lệ mắc cao nhật trong các bệnh truyền nhiễm gây địch tại Việt Nam Vai trò của virus cio trong TL] cũng như ảnh hưởng cửa nhiễm virus cúm, gánh

xăng bệnh tột cùng với các biên chứng, đo virus cúm gây ra như viêm phỏi cấp tính,

phụ nữ có thai 3 tháng đầu nhiễm virus cửm với sửo khỏe cộng đồng tại Việt

Tam vẫn chưa có những thông kê chính xác Bắt đầu từ năm 2001, việc giám sáL

chủ dòng sự lưu hành của virus củm dã được triển khai tại Hà Nội Theo Niên giám

thống kê các bệnh truyền nhiễm 2001-2005, tỷ lệ hội chứng củm trung bình trong 5

xiăm (2001-2005) là 2040,4/ 100.000 đân, đứng đâu trong 10 bệnh có tý lệ mắc cao nhất tai Viét Nam [1-5] Nam 2006, Viện Viện Vệ sinh Dịch tế (VSDTTU) dã bước

đầu thiết lập và triển khai hệ thống giám sát củm trọng điểm dé phát hiện và xác định các chủng virus củm gây bệnh hàng năm ở 15 điểm trong toàn quốc Kết quâ giảm sát cho thấy virus củm hưu hành đẳng thời các chúng củ mua khác nhau như

A/H3N2, A/HIRI và B Khác với virus cúm A là các phân týp A/H3N2 hoặc

A/HTNTcó thể là cắn nguyên chính trong mỗi năm và xuất hiện xen kế giữa các răm, virus cứm l3 lưu hành hảng năm (Nguồn ?ử Chương trình giám sát Căm Quốc

Gia-Vién V8 sinh Dich 8 Trung ương do CDC-JMỹ tài tre)

22

Trong giai doạn từ năm 2001 đến năm 2008, tại miễn Bắc Việt Nam, virus

cứm 3 và các virms cứu mùa khác là A/II3N2 và A/TIINI lưu hành quanh năm,

thường tập trung vào 2 thời điểm lá cunổi mủa xuân (thang 2-3) và giữa mùa hè

(thàng 7-8) Trong đó, virus cúm B lả căn nguyễn chú yếu gây ra các vụ dịch vào cuối mùa xuân (2001, 2006 và 2008), virus cảm A/TIINI hoặc A/ITẩN2 là căn

Trguyên chủ yếu gây ra các vụ dịch vào giữa mùa bè Đặc biệt virus cúm B đồng vai

trỏ gây bệnh nổi trội vào năm 2001 Đặc tỉnh kháng nguyễn của virus cúm B lưu

hành tại miễn Đắc Việt Nam trong giai đoạn này tong déng với các chủng virus cứm được Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo cho sân xuất thành phản vấn xin khu vực Bắc bán cầu cho từng năm Cụ thể là sự xuất hiện dòng kháng nguyên Yamagata được xác định tại Miễn Bắc Việt Nam vào các năm 2001, 2005 va 2008,

dòng Victoria vao các năm 2003, 2004, 2006 và 2007 Đã xác định dược sự lưu thành đồng thời của 2 dòng, kháng nguyên của virus củm B trong củng một năm [7]

1.4 SỰ TIÊN HÓA CỦA VIRUS CUM B

Ở vims cứm A có thể xây ra các biển đối trong vật liệu di truyền rửnư sự thay đổi kháng nguyêm: thay dải nhỗ khang nguyén (antigen drift) hoc thay đổi lớn

khang nguyén (antigen shift) [15, 27] Nguyên nhân là do virus A có đổi tượng gây

nihiềm đa đạng như gia cầm, thủy cằm, chữn di cứ, động vật có vú và người Mã vậL

liệu di truyền ARN của virus luôn chịu tác dộng của vật chủ trong quá trình xâm

nhập vao bên trong tế bào, tiến hành phiến mã, nhân lên, tích hợp, nảy chải vả giải

phông virus mới ra khỏi tế bào vật chủ Kết quả là đã xây ra các đột biển trong vật

liệu di truyền hoặc sự pha trộn các phân đoạn gen cửa virus cum A khae nhau khi cùng đồng nhiễm trên một tế bào thông qua quả trình trao đổi và tích hợp Sự biến dỗi trong vật liệu di truyền của virus cứm A chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch lẻ tế hoặc đại địch cúm cho nhân loại Những thay đổi trong vật liệu di truyền

của virus cúm À là động lực cho sự tiên hóa của nó [8]

So với virus cứm A, đối tượng gây nhiễm cửa virus củm l3 it hơn rất nhiều, chi bao gồm can người và hãi cầu Do đó sự tiên hóa của virus cún B cũng xảy ra

23

với tân suất tháp hơn [33, 361 Hiện nay trên thể giới lưu hành 2 dòng củm B là đông I1/Vietoria/2/87-like virus và đóng B/Yamagata/16/88-like virus, trang đẻ

đồng B/Vietoriz/2/87-like virus lưu hành chủ yên ở Đông Nam Á còn đông B/Yamagata/16/88-like virus lưu hảnh trên khắp thể giới trong thế ký XX [48, 49]

Sự trao đối chéo và tích hợp vật liệu đi truyền của virus cúm B chỉ xảy ra khi hai

đồng này lưu hành đồng thời Hiển lượng này đá được giủ nhận ở một số nước

Châu Âu vào nắm 2001 |57|

1.5 BIỂU HIỆN LÂM SẢNG VẢ SINH BỆNH HỌC BỆNH CỬM

Tiệnh cúm 1a bệnh viêm nhiễm cấp tính đường hồ hâp gây nên bởi virus cúm

1.5.1 Biểu hiện lâm sàng của bệnh cũm

San thời gian ñ bệnh từ 2 - 4 ngày, bệnh thường khởi phái đột ngộ với các

triệu chứng toàn thân như sốt cao, rét run, cơ thể rất mệt và yêu Đồng thời xuất

tiện những đấu hiện viêm đường hô hấp như ho khan, đau họng và viêm mũi Với

trồ cm những triệu chứng như viêm tai giữa, buôn nỏn và nôn cũng thường xây ra

Bién chứng thưởng gặp nhất cửa cúm là viêm phổi, trong đó viêm phối do bội nhiềm vi khuẩn là dạng phổ biển nhất và viêm phối nguyên phát là dạng rằm trọng nhật Bệnh cứm kèm bội nhiễm vi khuẩn làm cho bệnh nặng lên nhiều lần [6]

Phương thức lây ưuyễn virus cúm từ người sang người là virus cú có ương

chất tiết hô hấp và hạt khi dung được phát tán trong không khí do bệnh nhân củm

he và hắt hai đà thải virus ra không khí từ khoang mi Phương thức lây truyền

virus cảm từ động vật sang người là do con người đã tiếp xúc trực tiếp với gia cắm, 'tphân gia cảm bị bệnh hoặc ăn thịt gia câm, tiết canh gia cảm chưa nu kỹ Nhiễm

24

trùng dâu tiên dược gây ra bởi virus cúm là viêm đường hỗ hấp trên, do virus xâm nhập và nhân lần chủ yếu trong tế bao biểu mô trụ của đường hô hấp và gây phá

thủy nhung ma, nơi được coi là hàng rào bảo vệ đâu tiên và quan trọng trong hệ

thống hô hấp của cơ thể, dẫn đến hoại tử và bơng biểu mô hô hấp Kèm theo sự

nhân lên của virus, interferon được phát hiện trong giai đoạn cập tính của bệnh là

xuyên nhân của sự nguy hiểm đo nhiễm virus cúm [6]

Virus cium B kết hẹp với các virus gây viêm đường hô hap khác sẽ có khả

xăng gây biến chứng rguy liểm cho trở em, người giả, người suy giẩm miễn địch

hoặc mắc các bệnh mạn tính và phụ nữ mang thai néu không có biện pháp phòng,

ngừa kịp thời Ngoài ra virus cúm B cản có khả năng gây bội nhiễm vi khuẩn

Staphylococcus aureus với lỹ lệ tử vong cao [30]

1.6, DIÊU TRỊ VÀ DỤ PHONG BEND CUM

1.6.1 Các thuấc kháng virus

Thiên nay, có 2 nhóm thuốc được sử dụng để dự phòng và điều trị củm [8]

Dé la

- Nha thuốc ức chế hoạt động kênh ion M2: 2 loại Ende

+ Amantadine va Rimantadine (Flumadine)

- Nhém thuốc ức chế neuraminidase (NATSs): 4 loại thuốc

+ Oseltamivir (Tamiflu &) va Zanumivir (Relenza ®)

+ Peramivir (Rapiacta ®) vé Laniaamivir (Inavir ®)

Để điều trị virus củm B nên sử dụng các thuốc ức chế Neuraminidase lả Oseltamivir, Zanamivir, Pemmivir và Laninamivir, không sử dụng thuốc ức chế kênh iơn M2 như đối với virus cum A vi virus củm B không có protein M2 Tất cả các thuốc đều có tác dụng điều trị hiệu quá nhất nếư được sử dụng trong vòng vải

giờ khi triện chứng bắt đản và thường, được phép sử đụng trong vòng 48 tiếng sau

khi có triệu chững đầu tiên Thuốc có tác dụng làm giảm bớt mức độ trầm trọng của bệnh cũng như các triệu chứng củm và làm rút ngắn thời gian bệnh khoăng 1 - 3

neay

25

Thuốc ức chế neuraminidase: Virus củm B khi muỗn giải phỏng virus thế

hệ mới ra khỏi tế bảo nhiễm cần cỏ sự tham gia trực tiếp của enzyme nieuraminidase Neuraminidase của virus tham gia cắt tách các phân dư axit sialic từ

mảng gÌycoprotein của virus, đóng một vai trò quan trọng khi phỏng thích các hạt

virus thể hệ mới vả tạo điều kiện thuận lợi cho virus lan rộng trong đường hô hấp

Thuốc ức chế có tác dụng can thiệp vào chức năng bình thường của enzyme

neuraminidase (NA), tte che hoạt động ctia enzyme nay do đó ngăn cản sự giải phóng virus khỏi tế bảo nhiễm, virus sẽ bị giữ lại bên trong tế bảo vả không cỏ cơ

hội tân công các tế bảo khác

Hình 1.3 Các vị trí đột biến trên cấu trúc không gian 3 chiều của Neuraminidase ( * Các axit amin được đánh số dựa trên hệ thông đánh số

N2NA Các vị trí đột biển tương ứng trên virus cảm B/Beijing/1/87 la

.Asp196, Ile220, Ser248 và Gi406 Đỗi với các tịp virus cám B lưu hành

trong thời gian gần đây, các vị trí đột biển trơng ứng lần lượt là Asp197,

11e221, Ser249 và Giy407)

Nguén: Shuji Hatakeyama, Norio Sugaya, Mutsumi Ito, et al, JAMA [50]

26

Trong nghiên cứu giám sát sự giảm hoặc kháng thuốc điều trị của virus cúm

Á và I trên thế giới giai đoạn 2004-2008 cho thấy đã xác định được 12/3261 (0,4%)

chủng kháng thuốc và 16/3261 (0,5%) chủng giảm độ nhạy với thuốc điểu trị Oseltamivir hoặc Zanamvir Trong đó, xác định được 3 chủng giám độ nhạy với thuốc (đột biến tại 1I271Y, I222T và T326J) [54] Nghiên cứu tại Nhật bản 2004-

2005, xuất hiện 1/74 (1,44) chủng có đột biển tại vị trí G4078 làm giảm độ nhạy

của Oseltamivir dối với bệnh nhân nhiễm virus cúm B sau khi điều trị 7/422 (1,7%)

chting virus cim B xuất hiện đột biển tại các vị trí DI97N, I221T, 5249G Tỷ lệ chẳng virus giảm/kháng thuốc ở virus cứ B (1,494) là thấp hơn so với virus etm A (5,59-18%), tuy nhiên những chúng, nảy dã dược ghi nhận lây truyền từ người sang,

người [S0]

Như vậy, việc sử dụng cáo loại thuốc kháng virus như oseltamivir và

zanamivir cé thé din đến những đột biến thích nghỉ trên gen NA cửa vims củm và

có thể dân dén kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc điều tị Vì vậy, việc kiểm soát phác để điều trị, giảm sat sự kháng thuốc của virus cứm và nghiên cửu, phát triển thuốc mới trong điều trị bệnh cúm là điều rât cân thiệt

1.6.3 Dự phòng

Biện pháp hữu hiệu của sức khỏe cộng đồng dễ dễ phòng virus cim A va B

la gây miễn dịch bằng cách sử dụng vic xin cum Tuy nhiên do tỉnh dễ bị biển dị cửa virus cứm nên việc sân xuất virus cium gap nhiều khỏ khăn Vắc xin lam lừ kháng nguyên của týp virus gây bệnh củm năm nay rất khỏ báo vệ được cơ thé déi

với tp gây bệnh củm năm sau Có hai cách khắc phục khó khăn trên trong nghiên

cứu phát triển vẫc xin cúm: một là sân xuất vắc xin cúm da typ khang nguyên: hai là căn củ vào dụ đoán dich tế học để dự đoán týp virus com mdi sẽ xuất hiện trong

tầm tới đề sản xuất vắc xin phòng ngữa týp đó Khôi lượng vắc xin sản xuất hang

âm thường không đáp ứng đũ nhu câu của cộng đồng nên việc lig vac xin thường, được ưu tiên cho những, đôi tượng sau:

27

-_ Nhỏm dỗi tượng cô nguy cơ cao: người giả trên 65 tuổi, người tán tật, trẻ em, bệnh nhân suy hô hấp, suy tìm, bệnh chuyển hóa như đãi tháo đường hoặc

mắc các bệnh mạn tinh khác, phụ nữ mang thai

- Nhom tiếp xúc với các tác nhân gây bệnh: nhân viên lam việc trong phòng,

thí nghiệm

nih sab

~_ Nhóm người làm việc lại vac dich vu công gông: nhân viên y lề,

Ve xin nên được tiêm sớm vào mùa thu trước đợt bùng nỗ bệnh cửm và

wide lai hang nam dễ duy trì chẳng lại những chủng virus cúm phổ biến nhất Hiện

nay có các loại vae xin cum nw sau:

Vac xin bat hoat (Inactivated vaccine): Vae xin bat hoat 26m cac phân typ virus củn được bất hoạt bởi formalin hoặc ether Bao gém các loại sau [25]:

- VẶc xia toản bộ hạt virus bất hoạt sử dựng formabn hoặc ñ-

propiolactone

- Vie xin tiểu đơn vị Hoặc kháng nguyên bề mặt HA và NA (subumit hoặc

surface)

-_ Vắc xin thành phản tách rời của virus: toàn bộ hạt virus nhưng bị tách rời

bing ether (split)

Vắc xin sống gidm ddc luc (Live attenuated influenza virus - LAIV)-dugc

phát triển đựa trên các kỹ thuật di truyền, người ta tạo ra các chủng virus không gây bệnh, được ghép gen rã hóa tổng hợp HA và NA Vắp xin cúm

sống giảm động lực được sử dụng bằng cách nhõ vắc xin vào mũi hoặc bơm

xịt vắc xin vào mũi họng Vắc xin này có hiệu lực kém hơn các loại vắc xin

bất hoạt và chỉ đừng ho người khốe mạnh trong độ tuổi 5 - 49 113, 41]

Vac xin bat boat bang công nghệ di truyền ngược (Reassortment vaccine): ta tao các virus từ các phân đoạn gen có lựa chọn khác nhau bằng kỹ thuật di

lruyén nguge (reverse gericlic) [39, 40, 42]

Hiện tại, vắc xin củu mùa đang dùng phổ biến là vac xin sống, bất hoạt, thanh phan vac xin báo gồm virus cfm A/AIN1, A/H3N2 và B Thanh plan vie xin

28

cúm theo mùa hàng năm cũng lựa chọn chúng đại diện chơ ruột dòng kháng nguyễn Yamagata hodc Victoria Vi vay nhiing nằm virus cửm B lưu hành cả 2 đòng kháng,

T:gnyên thì hiệu quả của vắc xin dự phòng là hạn chả

1.7 CHAN DOAN VIRUS HOC

ĐỀ có thể chấn đoán chính xác lác nhân gây bệnh của bệnh Iruyễn nhiễm,

chúng ta khong thể chỉ dựa trên dấu hiệu lâm sảng và triệu chứng, vì một bệnh có thể có nhiều căn nguyên và mỗi căn nguyễn có thế gây bệnh với những biển hiện

lâm sảng và triệu chứng nặng hay nhẹ khác rửau Do đó việc chấn đoản trong

phòng thi nghiệm lả rất quan trọng, siúp cho các nha lam sảng có thé chân doan

được chính xác

Bén cạnh các kỹ thuật chân đoán cúu cơ bản, nhờ có sự phát lriển của khoa học kỹ thuật mẻ ngày nay đã có nhiều các kỹ thuật chân đoàn mới nhanh và hiện đại

hơn Nhờ đó sớm xác định được sự nhiễm virus cứm để có các biện pháp xử lý,

cách li, diều trị kịp thời, giúp tránh lây nhiễm trong cộng đồng , tránh dược những thiệt hai to lớn về tỉnh mạng con người và kinh tế mả các vụ dịch củm có thể gây ra Quá trình phân tích các mẫu bệnh phẩm trong phỏng thí nghiệm od giá trị quan trọng trong việc tim hiểu dặc diểm sinh học của tác nhân gây bệnh, quả trình sinh

kháng thể sau khi lây nhiễm, cũng như quả trình khu trú và phát tán virus trong cơ

thế

1.7.1 Án todn phòng thí nghiệm

Trong phỏng thí nghiệm chản đoán vims, làm việc với những mẫu bệnh

phẩm lâm sàng có thể tiểm làng tác nhân gây nhiễm đưới dạng khí đụng, rà nhân

viên phòng thí nghiệm có nguy cơ phơi nhiễm hàng ngày Do dó, an toản phỏng thú

nghiệm là hết sức quan trọng và cần thiết, trong quá trình làm việc cẩn có những trang thiết bị cũng như các phương tiện bảo hộ phù hợp để bão vệ cả người làm việc

cũng như công việc dang lảm không bị nhiễm chéo,

29

1.7.2 Thu thận mẫu để chấn đoán virus

Thu thập mẫu để chan đoán virus cần quan tâm đến thời gian lây mẫu sau khi mắc, vị trí lây mẫn, cách bão quan và vận chuyến có liên quan đến kết quả chan

đoàn phỏng thí nghiệm

TĐể phân lập virus, mẫu bệnh phẩm cản thu thập trong giai đoạn sóm của

bệnh (thời gian nhiễm virus huyệt và trong suối thời gian đào thải vi

Đẻ chân don huyết thanh, các mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cáp va

giai đoạn hỏi phục cân được lấy theo đúng thời gian quy định, vi dụ như mẫu huyết

thanh lấy trong giải đoạn cấp được lây càng sớm càng tối, mẫu huyết thanh lây trong giai đoạn hỏi phục lẫy sau dé 2 - 4 tuần

Tara chọn loại mẫu để thu thập đổi với từng bệnh đồi hôi có sự hiểu biết về

bệnh sinh của bệnh đó

1.7.3 Phuong pháp phân lập chúng và dịnh typ

rus Phin lp chitng virus

Phân lập virus được coi là “tiéu chun vang” trong gidm sat cum |17] Ching

virus phân lập được trong vụ dich được nghiên cửu về các đặc điểm sinh học cũng như sự biến đổi đi truyền và tính chất kháng nguyên, từ đó có thể dự đoán được sự lan truyền của chủng một virus mới có độc lực cao trong giai doạn tiếp theo và lựa

chọn thành phần vac xin cum hàng năm phủ hợp

Việc phân lập virus cúm B củng với các virus cúm rùa khác là A/H1N1 va

A/H3N2 dược liên hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 và sử đựng đồng

tế bảo căm thn MDCK Virus ctm B có thể nhãn lên trên các dỏng tế bảo tiên phát

Thư lễ bảo thận khi, thận chuột đất, thận bê hoặc lrên động tế bảo thường trực nhur MDCK, Vero MDCK là dòng tế bảo thích hợp nhất dễ phân lập virus cúm trên người Ưu điểm của phương pháp phân lập trên tế bào MDCEK: là đơn giản, thuận tiên, để thục hiện, có thể phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm trong một lân tiến hành Để sản xuất vắc xin thi phương pháp phân lập trên trừng vẫn là lựa

chọn tôi tra vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn virus với hiệu giá cao [24,

30

43] Việc sản xuất vắc xin trên tế bảo MIDCK vả Vero củng dang dược nghiền cứu

[14, 29],

Ngoài ra đối với virus củm gia cảm (cúm A/HSNI): là vưus nguy hiểm mức

độ 3 (heo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập virus phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an loàn sinh học cấp độ 3 và được TCYTTG khuyến cáo lá phan lap trên trừng gã dạt tiêu chuẩn (Speoifie Pathogenie Eree - SPE) 10-11 ngày

Cáo phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phan ứng giải trình tự bằng phương

phap enzyme va khi giải trình tự thường sử dụng các máy phân tích chuối tự động

như ABI PRISM 3130-Avam (Applied Biosystens), hoặc Beckman Coulter (Mỹ)

Đổ thực hiện được giải trình tự của các máy tự động thì các mach ADN don sản

sinh ra trong ông nghiệm phải được đảnh dẫu huỳnh quang để các vạch điện di của

cde mach đơn này phát sáng khi đã qua một chùm tỉa sảng laser Sự xuất luận của

các đideoxynucleotide (các nucleotide mắt góc -OH ở vị trị cacbon 3' vá dược thay

bằng -1I, đã được đánh đâu hượnh quang với các máu khác nhau) trong quá trình tống hợp ADN bố sung (mâu gen cân giải trình tự ở đạng ADN sợi đơn) tạo ra

những đoạn ADN có độ đài khác nhau Những đoạn ADN này được điện di qua nao quản từ nhỏ đến lớn và các dideoxynnelectide được phát hiện bởi đâu đọc

laser Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các đídeoxynuoleotide được phát hiện bởi đầu dọc lascr |8|

Câu lạo của một máy giải trình tự tự động gồm Hai phần chính là phần điện

di với gel polyacrylamide và phân phát hiện các vạch diện dị Phẩn diện di

olyaerylamide là các ống mao quản chứa gel Phân phát hiện vạch điện đi là những

con mal cảm quang và muội chủm tia laser di qua trước nó Trong suốt quá trình diện

31

di, mỗi khi có một vạch điện di di qua chủm tia laser thì vạch diện di sẽ phát sảng,

lên và sự phát sáng này sẽ được cơn mắt cảm quang ghỉ nhận và lưu lại thành một đính cường đó ánh sáng trong biếu đỗ Từ biến đồ của các đỉnh cường độ sáng này,

„máy sẽ so dong của các đính tương ứng với các máu để cuối củng phan tich thanh

trình tự của đoạn ADN

Phương pháp xác dụnh trình tự gen dòng một vai trỏ quan trọng trong việc

nghiên cứu đặc điểm đi truyền học, so sánh giữa các gen của virus cúm để xảy dựng,

gây gia hệ, Quá do dó thể xác định được: lần suất tiện hỏa, cáo đột biện trên một số

gen liên quan đến khá năng tăng độc lực cúa virus, giảm độ nhạy của thuốc kháng,

virus và phát hiện các yếu tổ tiểm tàng của sự trao đối và tích hợp của các chứng

virus cúm đang lưu hành

32

Chương II

ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHIÁP NGIHIÊN CỨU 2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiền cứu là tổng số 115 chúng virus củm B dược phan lap tir

bệnh phẩm lâm sảng thu thập trên bệnh nhân hội chúng cửm trong 3 năm (2010 -

2012) lại Hà Nội và các tỉnh ruiền Bac Viel Nam Cae ching virus củm nảy được

cung cáp bởi Phòng thí nghiệm Củm - Viện Vệ sinh Dịch tế Trung ương,

22 VAT LIEU

2.2.1 Ching virus cim B

Cae ching phân lập virus cúm B được sử dụng trong nghiền củu gắn có hiệu

gia virus dat > 8 don vi HA xác định bằng phương pháp ngưng kết hỏng cầu (HA)

2.2.2 Sinh nhầm

2.3.2.1 Sinh phẩm sử dụng cho định tp virus

Đô sinh phản kháng huyết thành chuẩn dùng trong phản ứng ngắn ngưng kếL hồng cầu (HI) để dink typ virus củm được TCYTTG cung cấp hàng năm (2010 -

2012) tùy theo từng năm

3.2.2.2 Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp xúc định trình tự gen

12 primer (CDC - My)

- cADN SuperscriptITl Reverse Transcriptase, P/N 02321, Invitrogen

- Hotstar Hafidelity Polymerase Kit, Cat No 202605, Qiagen

- Bộ sinh phẩm tinh sạch săn phẩm PCR: Qiaquick PCR Purification kit 250, CaLNo 28106, Qiagen và Qiaquiek Gel Extraclien kí 250, CaL No 28706, Qiagen

- Bộ sinh phẩm che chu kỳ nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide

(Cycle sequencing): BigDye Torminalor v3.1 Cycle Sequencing kit P/N

4336917, ABL

- Bésinh phẩm tỉnh sạch sản phẩm đã gắn cdc dideoxynucleotide : Big Dye X

Tenminator Purification Kit, Cal No 4376486, ABL

2.2.3 Trang thiết bị và đụng cụ

22.3.4 Trang thiết bị

Trang thiết hị

Phỏng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2

Tủ an toàn sinh hoe cap dé 2 (Biosafety Cabinet - Class2)

Tủ âm CO,

Tủ lạnh 4°C, - 20°C va - 80°C

May li tam

Mây khuếch dại gen

Máy phân tích trình tự gen ABI-3130 Avant

May lic (vortex)

Hang Viện VSDTTU Bioguell - Anh Jouan - Pháp Sanyo - Nhật Rotofsx - Mỹ Biorad - Mỹ THiachi - Nhật

IKA - Malaysia

2.2.3.2 Dung cu

- Phiên nhựa 96 giếng, đáy chữ U và day chit V

+ Pipet tr déng vị lượng các loại từ 0,Su] đến 1000u1

-_ Pipet đa kênh các loại từ 20pl đến 30001

-_ Đầu cên vô trùng các loại, có phin lợc tứ 0,5ul đến 100041

-_ Tuýp eppendorf các loại tù 02ml đến 1,5mL

Va các dựng cụ thí nghiệm cân thiết khác

2.3 PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Tinh týp virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (TII)

2.3.1.1 Chuẩn dộ hiệu giá kháng nguyên bằng phan ing ngưng kết hồng câu

(A)

35

Phương pháp nay được tiến bảnh trên phiến nhụa 96 giếng dây chữ V (hỏng, cần gà) hoặc phiên nhựa 96 giếng đáy chit U (hang cfu chuét lang)

+* Các bước tiễn hành:

(1) Chuẩn bị hỏng câu gả 0,5% hoặc hổng cầu chuột lang 0,75% trong dung dịch độm PBS, pH 7,2

(2) Cho 50p] dém PBS vao cae gigng tit hang thir 2 dén hang thứ 12

@) Cho 1001 hén dịch môi cấy virus vào giếng đâu tiên Trộn đều và chuyến 50} hén dich mày sang giếng thứ 2, pha loãng bậc 2 hẳn dich mudi cdy virus

từ hàng thử 2 đến 12, Loại bỏ 50H] ở hàng cuối củng

(4 Cho 50ul hồng câu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% vào toàn bộ

96 giảng, Lắc dêu, ú 30 phút (với hông cầu gà) hoặc 60 phút (với hồng cau

chuột lang) ó nhiệt độ phỏng,

+ Nhận định kết quả: Hiệu giả kháng nguyên là độ pha loãng cudi củng của

kháng nguyên gây ngưng kết hỏng cầu hoản toàn Đó chỉnh la một don vị ngung kết hỏng cầu của kháng nguyên, SOI kháng nguyên 8 don vi hay 25pl

kháng nguyên 4 đơn vị

2.3.1.2 Định pip virus bằng phân ứng ngắn ngưng kết hông câu (HT)

s* Xử lý kháng huyết thanh chuẩn:

Trước khi tiến hành phân ứng, HT cần xử lý kháng huyết thanh chuẩn dễ loại

bỏ những chất ức chế không đặc hiệu có trong kháng huyết thanh chuẩn

(1) Cho 1 thể tích kháng huyết thanh kết hợp voi 3 thé tich dung dich RDE (enzyme pha bry các thụ thể-Recepter Destroying Iinzyme) Ủ 37C

trong 18 giờ hoặc qua đêm (2) Bat hoat tại nhiệt độ 56°C trong vòng 30 phút

(3) Bố sung 6 thẻ tích nước muối sinh lý NaC1 0,85% dé kháng huyết thanh

chuẩn được pha loãng 1/16

+* Các bước tiểu bảnh:

36

(1) Cho 25/1 đệm PBS vào các giếng từ háng B tới bảng H (trừ cột 6 và cột

12) của tắm rinựa 96 giếng Cột 6 và cột l2 cho SOul dém PBS (3) Cho 50ul kháng huyết thanh chuấn đã xử lý vào hàng A (trừ các giếng

A6, A13) (3) Hút từ hàng A chuyển xuống hàng B 25ul kháng huyết thanh chuẩn và

- Phan tng đọc được khi:

+ Kháng huyết thanh chuẩn: ngăn ngưng kết hoàn toán

+ Chứng hồng cầu: ngăn ngưmg kết hoàn toản

- Higu gia ức chế ngưng kết hỏng cảu của chủng virus: là giả trị tại dộ pha

loãng cao nhất của khang huyết thanh chuẩn và chủng virus gây nên hiện

tượng ngăn ngưng kết hẳng câu

-_ Phân týp của virus được xác định tại kháng huyết thanh chuẩn cho hiệu

giá ngăn ngưng kết hồng câu cao nhất

2.3.2 Giải (rình bự gen

2.3.2.1 Tách chiết vật liệu di truyền từ ching virus cit phân lập được

Su dung b6 sinh phim tach ehiét ARN: QLAamp viral RNA Mini Kit, 250 preps, Cat No 52904, Qiagen Các bước thực hiện tách chiết theo thường quy bộ sinh phẩm như sau

37

GQ) Trộn dễu 140! mẫu (dịch nổi phân lập thu hoạch được) với 560ul đệm AXVL Ủ tại nhiệt độ phòng trong 10 phút

(3) Thêm 560nl Ethanel tuyệt đổi (100%) vào hỗn địch trên, lắc đến bằng may vortex réi li tâm nhẹ

() Dặt cột QIAamp spin vào tuyp li tam 2ml sach Chuyén 630pl han dich fan yao cdl QTAamp spin Li tam 8000 vòng/phúư1 phút T.oại bỏ luýp Hi tâm Sau dó lặp lại bước (3)

(4) Đặt cột QIAamp spin vào tưýp li tâm 2ml sạch, rửa cột QIAamp spin bằng 500u1 dụng dịch đêm AWI, lí lâm 8000 vòng/phúU/1 phút T.oại bố tuyp li tâm

(5) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp lỉ tâm 2ml sạch tiếp tục rửa cốt QAamp

spin bằng 500nl dưng dịch đệm AW2, lí tâm 14000 vong/phuv’3 phúi Logi bé dung, dich trong tuyp li tâm

(6) Dặt cột QLAamp spin vao tuyp li tam vừa được loại bố đụng dich Li tâm 14000 vòng/phúy1 phút Loại bố tuýp lí tâm

(7) Dặt cột QLAamp spin vào tưýp eppendorf 15ml sạch Cho 60ml dưng dịch đệm AVE vào chính giữa màng lọc của cột, ủ tại nhiệt độ phàng trong 1 phút, li tâm B000 vòng/phúƯ1 phút Loại bé edt QLAamp spin Phân đung dịch thu được trong tuýp lí tâm chính là ARN của chủng virus thu thập được

(8) Bao quin ARN tai -20°C hoặc -80°Ơ

2.3.2.2 Téng hop soi ADN 86 sung (CDNA)

Với những đoạn gen có kích thước > 1000bp, cản phải tổng hợp sợi ADW bê trợ sau đỏ mới thục hiện phương pháp ĐCR

39