Luận văn xác Định chất cấm sibutramine trong thực phẩm chức năng giảm béo bằng phương pháp hplc

chất hữu cơ trưng hoà bị ion hoá thành các lon phân tử hay ion mảnh của phản tử mang điện dương hoặc âm, cáo gỗc tự đo trong điều kiện áp suất thấp, Sau đó, các lon được đưa sang bộ phậ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYEN TIEN LUYEN

XAC DINH CHAT CAM SIBUTRAMINE

TRONG THUC PHAM CHUC NANG GIAM BEO

BANG PHUONG PHAP HPLC

LUAN VAN THAC SY KHOA HOC

HA NOI-2014

ĐẠI HỌC QUOC GIA HA NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYEN TIEN LUYEN

XAC DINH CHAT CAM SIBUTRAMINE

TRONG THUC PHAM CHUC NANG GIAM BEO

BANG PHUONG PHAP HPLC

LUAN VAN THAC SY KHOA HOC Chuyên ngành : Hóa phân tích

Mã số : 60440118

Người hướng dẫn : TS Lé Thị Hồng Hảo

HA NOI-2014

Tôi xin dược gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm

nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đề

tôi được học tập và hoàn thành để tài này

Tôi cũng xin gửi lời câm ơn tới các anh, chị và các bạn đồng nghiệp tại

labo Hóa — Viên kiểm nghiêm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp do tôi rắt nhiều trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối củng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động,

viên, chia sé mọi khó khăn củng tôi

1Hà Nội, năm 2014

Hoc vién

Nguyễn Tiên Luyện

1.1 Giới thiệu vẻ thực phẩm chức năng giãm bẻo - 2

1.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng giảm béo chứa sibulramine 3

1.3.1 Tính chất lý hỏa của Siburainine 4

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PIIÁP NGITÈN CỨU 7

2.3 Phương pháp nghiện cửu cà St 2t estes ceeatenseiceeeaee wi?

2.3.1 Phuong phap Tay m@tic.ccccccccscsssesceesssssssssmmssssseccessssssnneeeesssssaneee „17

2.3.2 Phương pháp xit ly mẫu

2.5.2 Thiét bi, dung cu

Chuong 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Téi rà điêu kiên tách và xác dinh Sibutramine bing HPLC

3.1.1 Lya chọn bude song hấp thụ ảnh sáng,

3.1.2 Lua chon mét sé diéu kiện sắc ký ———

3.1.3 Khảo sát pha động,

3.2 Khảo gái quy trình xử lý nấu

3.2.1 Khảo sát đưng môi chiết với viên nang cứng,

3,2,2 Khảo sát dụng môi chiết với viên nang mêm mm

3.3.3 Khảo sắt thời gian chiết mẫu "¬—¬

3.2.4 Khảo sát quy trình loại béo trong mẫu thực phẩm chức năng,

3.3 Thắm định phương pháp phân tích sesesssssaneanee

3.4 Kết quả xác dinh sibutramine trong một số sẵn phẩm thực phẩm chức

Chương 4 KET LUAN

TAI LIBU THAM KHAO

PHU LUC "—

DANH MỤC

iC KY HIBU- TU VIET TAT

AOAC Association of Official Tiiệp hội cộng đồng phân tích

CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản

EST Electrospray Ionization lon hỏa phun điện tử

Cục quần lý thực phẩm và

dược phẩm Hoa Ky

GC-MS as Chromatography Mass Íc lụt thối phổ

Spectrometry

Chromatography High Performance Thin Layer | Sắc ký lớpmỏng hiệu nã

KN National institute for food Kiếm nghiệm an toàn vệ sinh:

TCMs/ws — atid Chromatography tandem Ste tý Tông ghép khối phố

Log Lint of Quantifeation Giới bạn định lượng

sD Standard Deviation Tô lệch chuẩn

Bang 1.1 | Thérnghiém lam sang dai han vai sibutramine 4

Bing 3.) | Thanh phan hệ dụng môi phá động 27

Chương trinh gradient cia hé pha déng amoni acetat -

vin nang cing

- Kết quả khảo sát dụng môi chiết sibutramine cho mẫu

Viên nang mêm

Bảng 3.6 | Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu 37

Bảng 3.7 | Kết quả khảo sát dung môi loại béo 39

Bang 3.8 | Kết quả khảo sát khoảng luyễn tĩnh 44

Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường

chuẩn

Bang 3.10 | Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống 4T

Bảng 3.11 | Độ thu hôi của phương pháp với viên mang mỗm 47

Bang 3.12 | Độ thu hỏi của phương pháp với viên nang cửng, 48

Bang 3.13 | Dộ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng, s0

Bang 3.14 | Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mẻm 50

Kết quả phân tích sibutramine trang một số mẫu thực

DANII MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 | 8ø để khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 14 Hin 31 | Quy trình phần tích mẫu dự kiến 19

3.2 | Sd ky dé dung dich chuẩn sibutrandne với phá động 1 28

Hình 33 | Sắc ký để dung địch chuẩn hỗn hợp với pha động 1 19

Hình 3.4 | Sắc ký để dung địch chuẩn sibutramine với pha động 2 29 Hin 3.5 | Sắc ký đồ dụng địch chuẩn hễu hợp với phá động 2 30

Tinh 3.6 | Sắc ký đỏ dung địch chuẩn sibutramine với pha động 3 31

llình 3.7 | Sắc ký đồ dụng dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 3 31

Tĩmh 3.8 | 8ắu ký đồ dụng địch chudo sibutramine voi pha dong 4 32 Tình 39 | Sac ky dé dung dich chuẩn hễn hợp với pha động 4 32 THình 310 me bã nến điễn diệu quả chiết sibutramine trong mau vién 34

Hình 311 Bieu a bia diễn diệu qué chiet sibutramine tong mauvién | 4,

Tinh 312 trong 5 phút Sầu ký đồ phân tích mẫu trắng TPƠN them chuẩn siêu âm 3

Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm

Tình 314 Sắc ký để phân tích mau trắng TPCN them chuẩn siêu âm 3g

THình 3.17 | 8ắu ký đồ phân tích mẫu TPƠN măng mềm chưa loại béo 40

Tlinh 3.18 | Sắc ký đổ phân tích mẫu TPCN nang mềm đã loại béo 40

` Sắc ký đỗ phân tích mẫu TPCN nang mềm thêm chuẩn

THình 3.20 | Sắc ký để đụng địch đánh giá độ phân giải 42

Tĩình 321 | Sắc ký để đụng địch chuẩn sihutramine 200ng/m] 42

Hình 3.22 | Sắc ký đề của dung địch mẫu trắng TPCN giảm béo 43

A 2 Sầu ký đồ của dụng địch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn 3

Sắu kỷ đồ của dung địch mầu trắng TPCN thêm chuẩn

DAT VAN DE

Béo phi hiện không còn là vẫn để của riêng các nước phát triển ma

nay còn là vấn nạn của cả các nước đang phát triển Báo cáo mới nhất của

WHO di chi ra ring khoáng 1,5 tí người tưởng thành có độ tuổi trên 20 được

xếp vào nhóm thừa cân Trong số đỏ hơn 200 triệu rơm giới và gần 300 triệu

nữ giới ở trạng thải đã béo phí Theo ước tính đến nắm 201

ế có khoảng 2,3

tỉ người thừa cân và trên 700 triệu người béo phả, Một số liệu khác cho thấy

gần 43 triệu trẻ em đưới 5 tuổi đã bị thừa cân tính đến nắm 2010 [25] Chính

vì thể nhụ câu giảm béo cũng theo đó mà tăng lên Phương pháp điều trị giảm

béo thường được áp đụng là ăn kiêng, kết hợp hoạt động thể lực Nhưng

phương pháp này thường khó thực hiện và kém hiệu quả Vì vậy, mọi người

thường tìm đến các loại thuốc giảm béo để táng cường tác đụng giảm cẩn Năm bắt được nhu cầu cấp thiết này, nhiều công ty sân xuất thực phẩm chức năng đã chớp thời cơ đưa ra các sản phẩm phục vụ cho như câu nay Để tăng tác dụng của sắn phẩm, các công ty đã không ngần ngại đưa vào sắn phảm các chất có tác dụng nhanh vả mạnh, nhằm tiêu thụ sản phẩm một cách nhanh

chong Trong nhỏm các chất thường được cho thêm dé ting hiệu quả giảm

béo một cách bắt hợp pháp có hoạt chất Sibutramine Nó có tác động đến hệ

than kinh trung tương làm tăng lượng sorotonin và noradrenalm trong, não, từ

đó tạo cảm giác no và không thèm ăn Chất này đã bị cẩm sử dụng ở nhiều

nước trên thể giới, trong đó có Việt Nam [4], [L2], [16] Do đó việc phát hiện đượo sibulramine có mặt bái phép trong thực phẩm chức n

ng giúp giảm béo 1à một yêu cầu thực tiễn trong kiểm soát tính an toàn của loại sân phẩm này

Tuất phát từ yêu câu thực tiễn kể trên, chúng tôi đã nghiên cứu chọn đề tải

“Xác định hàm hương chất cắm sibutramine trong thực phẩm chức năng giảm

béo bằng phương pháp IIPLC” Dây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ chính xác cao và có khá năng ứng đụng rộng rãi tại Việt Nam.

Chuong 1 TONG QUAN

1.1, Giới thiệu về thực phẩm chức năng piảm béo

Thực phẩm chức năng giãm béo là những sản phẩm của quá trình chẻ biển thực phẩm hay thảo được đã được các nhà sản xuất nghiên cứu để bổ

sung và thay đổi một số thành phần đỉnh đường, có tác dựng tốt cho sức khoẻ Các loại thực phẩm chức năng giảm béo đa số được sản xuất dưới dang viên

nén, viên nang, dạng bột, đạng cao hay dạng trả nhưng không được cơi như

một loại thuốc chữa bệnh, đây có thể coi la mét dang thực phẩm giảm cản

nhanh Hiện nay trên thị trường cỏ rất nhiều loại thực phẩm chức nâng giảm

ay lai voc dang, cin đổi

Dé tang tac dụng của sản phẩm, các công †y sẵn xuất đã đưa vào san

phẩm các chất có táo dụng nhanh và mạnh, nhằm tiêu thụ sản phẩm một cách nhanh chong Những chất giảm béo sử đụng đầu tiên gồm có nhóm các chất

cường adrenaln (phentermin, benzphetamin, phendimetrazin, mazindol,

diethylpropion, phenylpropanolamin) va nhóm chất cường serotonin

(fenfluramin, dexfenfluamun) Tuy nhién, phenylpropanolamin - mét tac

nhân thuộc nhóm cường adrenalin đã bị cảm lưu hành tại thị tường Mỹ vào

béo giúp người béo phì

thang 10 năm 2000 do các nghiền cứu cho thấy nó làm tăng, nguy cơ tại biển mạch máu não như xuất huyết đột quy khi nó được sử dụng như một chất giảm cân ở phụ nữ [L4] Cũng như vậy, các chất cường serotonin mặc đủ cũng

có hiệu quả trong việc hỗ trợ giênu gân nhưng chúng cũng đã bị cảm lưu hành

trên thì trường Mỹ từ thẳng 9 năm 1997 đo các nghiên cứu cho thấy nó làm

thay đổi van tim va tang huyết áp động mạch phổi [15] Sibutramine (thuộc nhỏm chất ứo chế tái thu hồi serotonin-neradrenalin) chỉnh thức được hu

hành tại Mỹ từ tháng 2 năm 1998, sau đó nó đã được sử đựng cho điều trị béo

phi trong khoảng 40 quốc gia trên thế giới

Sibutramine đã được chứng mỉnh là có hiệu quá trong việc điều trị béo phì Một số nghiên cửu lâm sản ngắn hạn cho thấy sibutramine có tác dụng

giảm cân có thể đo sự kết hợp của giảm sự thèm ăn, gây cảm giáo no và có thể

cảm ứng của sinh nhiệt Thiệu quá ban đầu của nó làm giảm cân vì vậy nó

được coi như là một phương thức tiếp cận để giảm cân hiệu quả [21] Tuy nhiên sibutramine lại có những tác dụng phụ trằm trọng liên quan đến hệ thần

kinh trung ương, làm tăng nhịp tìm, tăng huyết áp, thậm chí là nhổi mau co

tim [24], do đó nó đã bị cắm lưu hành trên nhiều thị trường như thị trường,

châu Âu [12], Mỹ [16] và cả thị trường Việt Nam [4]

1.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng giảm béo chứa

sibutramine

Theo Co quan Quan lý Dược phẩm và Thực phẩm Tĩoa Ky (FDA), các sản phẩm thực phẩm chức năng giúp giảm béo có chứa một số thành phần hóa chất khác không được nhà san xuất công bổ rõ ràng và sứ dựng cao hơn mức

quy định Các chất này gây độc cho hệ tìm mach, than va gan cia ngudi néu

sử dụng dài ngày, đồng thời rất nguy hiểm với người cao huyết áp, người mắc

bệnh động mạch vành, xung huyết, loạn nhịp tin, tăng nhân áp, tai biên hoặc đột quy:

Sibutramine được biết đến dưởi dạng biệt được Sibutral Dây lá loại thuốc chỉ bán theo chỉ định của bác sĩ, làm giảm cảm giác thèm ăn, tác dụng,

vào trung tâm nhận thức vẻ đói và no ở não, thường được sứ dụng như thuốc chống trầm cảm, chán sống Một thời gian sau khi uéng, nỏ làm giám trung bình 5% trọng lượng cơ thể Sibutramine duge Co quan Quán lý Dược phẩm:

và Thực phẩm Hoa Kỳ cắp phép từ tháng 11-1997 Được bán tại Pháp từ năm

2001 nhưng ngay lập tức, y học đã nhận ra những tác dụng phụ qua 2 trường

hợp tử vong tại Italia Năm 2002, Ialia cắm bán loại thuốc có chứa 8ibunanine Đến nằm 2007, Pháp cũng cắm bán Năm 2009, các nhà khoa

học Mỹ nhận ra tgười uống Sibutrarmin côn có nguy cơ tự tử - là hiện Lượng,

thường xảy ra với những loại thuộc điều trị chứng chân đời

Tại Singapore, Co quan Khoa học Ý tế (HAS) cũng đã cắm lưu hành Oxy Elite Pro Tiến lành thí nghiệm, HAS nhận thấy Oxy Elite Pro có chứa Sibulramine chứ không phải được chiết xuất từ thảo dược rủ? lời quảng cáo

ham lượng 21,5 mg, vượt quá 43% liều lượng cho phép sử đụng hằng ngày

Tại Việt Kam, mặc dù Cục quận lý Dược — Bộ Y Tế đã bạn hành Quyết đình số: 120/QĐ-QID ngày 14/4/2011 về việc rút số đẳng ký của thuốc do phân ứng có hại, theo đó tất cả các thuắc cé chtra hoat chat Sibutramine ra

khỏi danh mục các loại thuốc được cap số đăng ký thông hành trên thị trường,

Việt Nam tuy nhiên, qua đợt kiểm tra mới đây của các cơ quan chức năng đã

phát hiện trên địa bàn thành phố Hà Nội vần đang hiện điện một số loại thuốc

và thực phẩm chức năng cỏ chưa hoạt chất nguy hiểm nảy

Theo thông tin từ Cục an toàn thực phẩm Bộ Y tế, rất nhiều trường hợp sau khi sử dụng thực phẩm chức năng cỏ chứa thành phản hoạt chat

Sibutramine đã phải nhập viện trong tình trạng sức khỏe và tính mạng bị đe

dọa Hoạt chất Sibutramine có tác dụng giúp những người béo phi giảm cân, nhưng lại đặc biệt nguy hiểm với người tiêu dùng, nhất là những người có tiên

sử bệnh huyết áp va tim mạch Các sản phẩm nảy gây nhiều chứng roi loan

nguy hiểm cho cơ thẻ chúng đe dọa sức khỏe va tinh mang người sử dụng

Theo TS Nguyên Hùng Long, Phó cục trưởng Cục An toản thực phâm

Bộ Y tế phân tích: “Đối với người có tiên sử bệnh tim mạch, loại sản phẩm

này gây rồi loạn và làm tăng nhịp tim Như vậy, nó làm cho người mắc bệnh

vẻ tim mạch sẽ thêm nặng Thậm chỉ nêu sử dụng liêu cao, nó còn cỏ thẻ gây rồi loan nang né hon 6 hé thong tim mạch” Cơ quan chức năng cảnh báo rằng, thuốc giảm cân hay thực phảm chức năng cỏ chứa Sibutramine trên thị trường hiện nay có hoạt chất rất độc hại và thực tế đã có nhiều người sử dụng

phải nhập viện trong tỉnh trạng sức khỏe nguy kịch

1.3 Tổng quan vé sibutramine

1.3.1 Tính chất lý hóa của sibutramine

~ Công thức phân tử: C,;H„CIN (Khối lượng phân tử: 297,5 đựC)

~ Công thức câu tạo:

- Danh pháp quéc te: (+/)-1-(p-chlorophenyl)-a-isobutyl-N,N-dimethyl-

cyclobutan-methylamin [Š]

~_ Trong cac che pham chúng thường ton tai 6 dang Sibutramine hydroclorid

monohydrat

- Dé tan: D6 tan ciia sibutramine hydrochlorid monohydrat trong nude 1a 5,2

mg/mL Sibutramine kiểm tan nhiều hơn trong alcol, độ tan tăng dân theo

d6 dai mach C tir methanol dén octhanol [5]

- Nhiét 46 nong chay: Sibutramine kiém cé nhiét d6 nong chay la 55,15°C va

enthalpy la 60,75 J/mol; Sibutramine hydroclorid monohydrat co nhiét độ

nong chay 6 119°C [5]

- Sibutramine base hap thu anh sang trong ving UV-VIS Cue dai hap thu tai

bước sóng 225 nm [23]

1.3.2 Tính chất dược lý của Sibutramine

Sibutramine hap thu tét qua đường tiêu hỏa (779%) Thời gian đẻ thuốc

đạt nông độ đỉnh trong huyết tương là 1 giờ và thời gian bản thải là 1,1 gid

Sibutramine phân bổ nhanh chỏng và rộng rãi đến các mô Khi đùng đường uống sibutramine bị chuyên hóa đáng kể khi qua gan lần dau, Sibutramine được chuyên hóa bởi cytochrom P450 CYP3A4 thành hai amin (gọi là chất

chuyên hóa có hoạt tỉnh 1 và 2) với chủ kỳ bán rã tương ứng là 14 giờ và 16

giờ Nông độ đỉnh trong huyết tương của chất chuyên hỏa có hoạt tính 1 và 2

đạt được sau 3-4 giờ Các chất chuyên hỏa thải trừ chủ yếu qua nước tiểu

[I3]:

Sibutramine da duoc đánh giá như một thuốc chồng trầm cảm tiêm tảng

do các cơ chế đã được chứng mình là tác động đó cũng tương tự như các

thuốc chồng trằm cảm ba vỏng, chẳng hạn như amitriptyln Tuy nhiên,

siburamine không có tác đựng phụ của thuốc chống trâm câm ba vòng bao pdm budn ngủ, tác dụng kháng acetylcholin thế đứng [21]

Sibutramine là một hoạt chất có tác động đến hệ thân kinh trưng ương,

làm gia tầng lượng serotonin và noradrenalin trong não, từ đó tạo cám giác no

và không thèm ăn [21]

Trong co thể, sibutramime chuyển hóa nhanh chóng thành các chất

chuyển hóa dcsmethyl: Ml (mono-desmclhyl sibutramin) va M2 (di- desmethy! sibutramin) va stbutramme tác động dược lý chủ yếu thông qua 2

chất chuyên hóa này để gây a tae dung giảm cân [11] [R]

Thử nghiệm làm sàng đã chứng minh sibntramuine có hiệu quả như một

chất giảm cân với liễu lượng khác nhan, từ 10 đến 20 mg/ngày [21]

Bảng 1.1: Thứ nghiệm lâm sàng dài hạn với sibufyannne

Tác dụng không mong muốn: Sibutramine đỏng thời cũng kích thích quá múc hệ thần kinh trung ương vá ảnh hưởng một vài khía cạnh như bên

chỗn, khô miệng, đau đầu, tê liệt và những dị cảm (Cảm giác khác thường như bị châm chích, kiến bỏ) có thể xảy ra Iơn thể nữa, nó còn liên quan đến

tăng nguy cơ tim mạch như tăng áp lực máu, nhịp tim va thường tăng nguy cơ

đau tìm cũng như đột quy [20] Do những nguy co nay, sibutramine da bi cam

lưu hành trên thị tường châu Âu từ ngày 21/1/2010 [12] Từ tháng 8 năm

2010, Mỹ đã chống chỉ định mới cho các bệnh nhận biên 65 Luổi do các tác

dụng phụ thực tế qua gác nghiên cứu lâm sảng của sibutenine [17] Tại Việt

Nam, các chế phẩm chứa sibutramine da bi rit sé ding ky luu hành theo

Quyết định số 120/QĐ-QT.D ngày 14/4/2011 của Cục quản lý Dược — Bộ Y tẻ [4] Tuy nhiên, đo nhu cầu giảm béo của những người thừa cân nên hiện nay,

nhiều loại thuắc giảm béo dưới mác thục phẩm chức năng có chứa sibutramine van được bản trản lan trên thị trường,

1.3.3 Một số phương pháp xác định Sibutraminc

Tiên thể giới, đã có rất nhiều nghiên cứu đưa ra các phương pháp xác

định sibutramine với nhiễu kỹ thuật phân tích khác nhan nỈnr: Sắc ký khí khối

phé GC-MS [22], Sắc ký lòng khdi phé LC-MS/MS [10]; Điện di mao quản

CE [28], Sắc ký lớp móng hiệu năng cao HPTLC [7], Sắc ký lóng hiệu năng cao HPLC [23], [7] [6], [26]

1.3.3.1 Phương pháp sắc ký khi khối phổ GC-MS

Trong, phương pháp sắo ký khí khỏi phổ, sau khí qua cột tách, các hợp

chất hữu cơ trưng hoà bị ion hoá thành các lon phân tử hay ion mảnh của phản

tử mang điện dương hoặc âm, cáo gỗc tự đo trong điều kiện áp suất thấp, Sau

đó, các lon được đưa sang bộ phận lách theo khối lượng, Từ các tin hiệu thu

Thánh ior

được, dựa vào khôi lượng ion phân lử, dựa vào đồng vị, dựa vào

phân tử, đựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng đứ liệu các ion và mảnh ion, người ta đình tình và định lượng được chất phân tích một cảch chính xác

Tác giả Sabnm Ssno-Rossi và công sự [23] đã phát triển phương pháp

sắc kỷ khi khối phổ mibutrmmine Hong các mẫu viên nứu, viên nang, trả Lửi

Mẫu được hỏa ong nước, kiểm hỏa bằng Nabi œrborat đến pH —10 Chiết

bang methyl chloride, Lam khé, bốc hời dưng mỏi rỗi phân tích bằng GC-MS

Quả trình tách sắc ký khí được thực hiện trên cột HP-5-MS (30m x 0,25mm),

chương trình nhiệt độ bắt đầu ở 110°C, tăng 10°C/phút đến 280°C! va duy tri trong 3 phút, sử dụng khi mang TTe với tốc độ 0,6 ml⁄phút, phỏ khôi thu được trong khoảng khối lượng 40-400 a.m.u

Đây là một phương pháp phân tích hiện đại, được sử đụng có hiệu quả cao, độ phân giải và độ nhạy cao, tiết kiêm dung môi Tuy nhiên, chỉ phí cho

thiết bị rất lớn, quy trình chiết mẫu phức tạp chưa phổ biển cho các phỏng thì

tại Việt Nam niên việc ứng dụng khó khăn

điện đương hoặc âm, các gốc tự do Sau đỏ, các ton được đưa sàng bộ phật,

tách theo khối lượng, Từ các tín hiệu thủ được, dựa vào khối lượng ion phan

tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mãnh iơn phan tử, dựa vào cơ chế tách và

dựa vào ngân hàng đữ liện các ion và mảnh ion, người 12 định tỉnh và định

lượng được chất phân tich một cách chỉnh xác

Nhớm lúc giả thuộc tường dai hoe Fudan, Thuong Hai [10] đã phát

triển phương pháp sắc ký lông khối phổ iơn hóa phun điện tử (T.O-EST/MS)

để xác định đồng thời sibutramine và các chất chuyển hỏa trong huyết lượng Mẫu được chiết từ huyết tương bằng tert-butyl ether, thêm chất chuẩn nội

propranolol hydroclorid, bay hơi dung môi và hỏa cặn trong pha động, phân

tích trên thiết bị LŒESLMS Diễu kiện sắc ký: cột ODS MS với pha động,

acetonitril chửa 0.1% trifloacetic acid Khoảng tuyển tỉnh cia sibutramine

trong khoang 0,328-32,8 ng/ml trén nên mẫu huyết tương và độ chụm dưới

19,9%, Phương pháp có độ nhạy và độ chụm phủ hợp để ứng dụng trong các

nphiên cứu được động học

Tác giả Sabina Strano-Rossi va céng sự đã phát triển phương pháp sắc

ký lòng khối phê phân giải cao LC-TTRMS để nhận biết và định hrong déng thời các chất kích thích (ephedrines, cafem), các chất giảm cân (phentermine,

phendimetrazie, pherunetrazme, fsnflurarnme, benfluorex, meplhienterrnine,

fencanfamine, sibutramine) va cdc chat cudng dương nhém PDES (sildenafil,

vardenafil, tadalafil) trong thue phẩm chức năng sử dụng phổ khôi Orbitrap Detector khối phổ với khả năng phần giải 100.000 (FWTIM tai m/z 200) hoạt động ở chế độ full scan và chế độ ion hóa phưn điện tử BŠI Các chất phân tích được nhận biết dựa vào thời gian lưu, phố khỏi, và tí lệ tương quan của các đồng vị Giới hạn phát hiện của các chất từ 1-25 ngíp, giới hạn định lượng,

Ja 50ng/e Phương pháp có độ tuyển tính cho tất cá các chất trong khoáng 50-

2000 ng/g voi hé sé tương quan >0,99 Phương pháp có độ chụm tốt, hệ số biển thiên CV % luôn thấp hơn 159, Cúo táo giá đã ứng dụng phương pháp

để phân tích 36 mẫu thực phẩm chức năng, phát hiện sự có mặt của

ephedrine/pseudoephedrine troug 4 mdu, calein rong 8 mau, sildenafil trong

4 mẫu

Nhom tac gid Ying Shi, Chengiun va céng su đã phát triển phương

pháp sdc ky Iémg khối phé ion hỏa phun điện tử (HPLC-ESI-MS/MS) để xác định đổng thời § chất cảm (ephedrine, norpseudoephedrine, fenfluramine, sibutramine, clopamide, emodin, rhein, and chrysophanol) trong thực phẩm chức năng giảm cân Các chất phân tích được chiết ra khói nền mẫu bằng

phương pháp chiết siêu âm với dung dịch 70% methanol, ly tâm vả tiêm vào

hệ thông sắc ký Các chất được tách trên cột sắc ký Hypersil Gold column

(2.1 mm * 150 mm, 5 wm) sit dung chương trình rửa giải gradiont, pha động

gồm hỗn hợp dung dich dm amoni format (pH 3,50) va acid formic 0,02% va

1netlemol, tốc độ dòng 0,25m, nhiệt độ buồng gột 25°C Nhan bidl dink tinh cáo chất dựa vào các lon dic trưng và thời gian lưu sử đụng chế dé SRM Clenbuterol va ibuprofen duge ste dung làm nội chuẩn lần lượt cho chế độ ion đương vả ien âm Hiểu suất thu hỏi cho 3 khoảng nổng độ khác nhau từ 80,2

— 94,5% Giới hạn phát hiện tr 0,03 — 0,66 mg (ngoại trừ clrysoplmol 1,6

mg#g) Phương pháp đã được ứng dựng để xác định chất cảm trong 4 loại

thực phẩm chức năng giảm cân Các kết quả thông ké cho thay sibutramin va

ho&e fenfluramine là thành phân chất cẩm chin trong các sắn phẩm với hàm Tượng lần lượt là 6,1 — 1,3 < 10” mg/kg and 1,9— 9,7 + 10° mg/kg,

Tác giả Ramakrishna va céc cong su, dã phát triển phương pháp sắc ký

lòng 2 lần khối phé LC-MS/MS dé xac dinh sibutramine trong miu huyét tương người Phương pháp có độ chọn lọc và hiệu suất thu héi cao Sử dụng,

chiết lỏng - lóng và chất phân tích tách băng chế độ đẳng dong isocractic trén

cột sắc ký pha đảo Sau đó được phân tích trên thiết bị MS/MS Khoảng tuyến tinh eta sibutramine trong khoang 30 — 6000 pgản] trên nên mẫu huyết tương

người Phương pháp có giới hạn phát hiện là 3O pg/ml với độ lậch chuẩn dưới

4% Thời gian phân tích cho mỗi lẫn là 3,2 phút và có thẻ phân tích hơn 250 mẫu huyết tương người mỗi ngảy Phương pháp đã được thấm định vá được

st dyng phan tich sibutramine trong các mẫu huyết tương người cho ứng dụng trơng việc kết hợp với một chế độ ăn uống để giảm cân

Tae gid La Ding và sông sự đã phốt triển phương pháp sắc ký lỏng khối

phd phun điện tử (LC-BSI-MS) có độ nhạy và đọ chính xúc cao để xác định

sibutramine va 2 cldt chuyển liga N-deenetliyl của nó bong huyết tương

người sử dụng phenoprolamine hydrochloride lam néi chuẩn Sau khi kiểm

hóa với natri biearbonate, các mẫu huyết tương được chiết với cyelohexane và

tiêm vào hệ thống TIPLC, quá trính tách trên cột pha đảo C18 với pha động, đệm acetat 1OmiM (p11 3,5) và methanol (25/75) Các chất phân tích được xác

định sử dụng chế độ iơn hóa phun điên tử trong detector khối phổ ] tử cực

Le-ESI-MS được thực hiện trong chế độ chọn lọc ien (SIM) sử dụng các ion đặc trưng mư>z = 228 cho sibutramime, m⁄z = 266 cho N-mono-

desmethysibutramine (chat chuyén hea 1), m/z = 252 cho N-di- dosmothylsibutramine (chất chuẩn hóa 2) va m/z - 344 cho nội chuẩn Các

đường chuẩn tuyến tỉnh trong khoáng 0,05 20 Hg/L cho sibutramine, 0,02 -

lo chất chuyển hóa 2 Giá

30 Dg/1 cho chất chuyển hóa 1 va 0,1 — 30 pag,

ti độ lắp lại trong ngày nhỏ hơn 7,6% cho sibutramine, 8,9 % cho chat

chuyển hóa 1 và §,5% cho chất chuyển hỏa 2 Giá tị độ lặp lại giữa gác ngày

Ja nhé hon 11,8% cho sibutramine, 12,7% cho chất chuyển hóa 1 và 9.4% cho chat chuyển hóa 2 Hiệu guất chiết cáo mẫu huyết tương lần lượt cho

sibutramine, chat chuyén héa ! và chất chuyển hóa 2 là 90,2%, 90,9% và

91,0% Phương pháp được ứng dụng thành công để nghiên cứn được động,

học của siburamine và các chất chuyển hỏa cho những người tỉnh nguyện

nam ở Trung Quốc

Đây lá phương pháp phản tích hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác

cao Tuy nhiên, đây là một phương pháp khó, thiết bị phức tạp, đất tiền và không phải phòng thí nghiệm nào cũng có điểu kiện để thục hiện phương

phap nay.

1.5.3.5 Phuong phap dign di mao quan (CE)

Đây la phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất

không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một dng mao quản hẹp chứa đây dưng địch đệm, đặt trong điện trường, Do độ linh độ điện di của

các ion khác nhau, chứng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi

nhan

Nhóm tác giả Yang L¡ và các công sự [2§] đã phát triển phương pháp

én di mao quận hiệu năng cao để xác định đồng thời 07 hoạt chất trong mẫu

thực phẩm chức năng là fenfluramin, pseudoephedrine, norpseudoephedrine,

amfepramone sibutramine, sildenafil va strychnine Sit dung hén hop đệm cia natri tetraborate 20 mM, natri dodecyl sulfat 10 mM va acetonitrile 5% (pI1= 9.0) và phân tích được thực hiện tại một bước sóng phát hiện 195 nm đưới một điện áp tach 17 KV 6 25°C, Véi gioi han vi tuyén tinh la 100 mg/l,

với hệ số tương quan R lớn hơn 0,998 Dộ lậch chuẩn tương đổi dao động từ

4,5% và 7,99% (n= 7) Va dé thu hdi trung bình trong khoảng 79,6% -1 12,096 Các giới hạn phát hiện (S/N = 3) nầm trong khoảng 0,16 và 0,65 mạ/1 Phương pháp phân tích tương đổi đơn giản, nhanh chóng, chọn lọc và chính

xác Phương pháp đã được áp dụng thành công cho việo xác định 7 hoạt chất

trong mẫn thực phẩm chite wang

1.3.3.4 Phương pháp sắc kỷ lớp möng hiệu năng cao IIPTLC

Đây là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đă đặt hỗn hợp cáo chất cân tách Pha tĩnh là chất

hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu câư phân tích, được trải thành lớp

mỏng đồng nhất và được cô định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha

động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phân được trộn với nhau theo tỷ

lệ phủ hợp cho từng chất càn phân tích Trong quá trình di chuyển qua lớp

hap phụ, các cầu tử trong hỗn hợp mẫu thử nghiệm được di chuyển trên lớp mỏng, theo hưởng pha động, với những tốc độ khác nhau Két quả, thu được một sắc ký đổ trên lớp mỏng Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bó, trao đổi iơn, săng lọc kích thước phân tử lay sự phối hợp đẳng thời

của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi

pha động

Tác giá Eul Aribumm và công sự đã phát biển phương pháp HPTT.C để xác định sibutramine được bổ sung trái phép trong các sân phẩm giảm cân tự nhiền Sau khi chiết trong hỗn hop Acetonitril va nước, chất phân tích được

tách IIPTLC sử dụng bản móng thủy tỉnh phủ silicagel 60 Fhe, pha déng n-

hexan-aceton-amoniac (10:1:0,1) Quét phổ ở bước sóng 225 nm Nguồn bức

xa la dén deuteri phat ra một quang phô UV liên tục từ 200 nm va 400 nm, téc

độ quét 10 nưn/giây, Đường chuẩn HPTLC tuyến tính trong khoảng 250-2000

ng/spot Phương pháp được thâm định vẻ độ đúng, độ chụm, khoáng tuyên tỉnh, độ thu hỗi và độ ổn định giữa các ngày đạt yêu câu

Mhỏm nghiên cửu tại phòng thí nghiệm của hãng Camag cũng đã

nghiên cửu phát triển phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu nắng cao ghép nối detector khối phổ TTPTLC-MS) để xác định sibutramine cho trai phép vào các sản phẩm giảm cân có nguồn gốc thảo dược Mẫu được chiết với methanol, lic, rung siéu 4m, ly tâm, lọc và chấm sắc kỷ lớp mỏng sứ dụng bản mỏng silieagel 6Ú ŒE;¿; (20x10) Quá trình khai triển sắc ký tự động

trong buồng khai triển ADC2 với pha động toluene-methanol (9:1), bão hòa dung môi 20 phút, độ âm được kiếm soát bằng dung dịch bão hỏa MgCI, thời gian sấy khô 5 phút Quá trình nhận biết và ảnh lượng sắc ký sử dung phd khối Q-trap chế độ ESI ác mảnh phố đặc trưng: 280,2 -> 125,0 và 280,3 —> 139,0

Đây là phương pháp phản tích hiện đại, có độ chính xác cao Tuy nhiên,

phương pháp có sử dụng nhiễu dung mỏi hữu cơ rất độc hại, chỉ phí lớn Hơn nữa, đây là thiết bị không phố biển cho các phòng thị nghiệm tại Viet Nan tiên khó ứng dụng rộng rất

1.3.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nang caw HPLC

Sibutramine hap thu ánh sáng trong vúng tử ngoại Sau khi qua cột tách, nẻ được phát hiện bởi đetector UV, độ hấp thụ tỉ lệ với nêng độ là cơ sở

cho sự định lương

Tác giả Á.P SuThar và cộng sự [23] đã phát triển và thảm định phương,

pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao pha dao để phân tích định hrong sibutramine

hydrochloride monohydrate trong các mẫu viên nang Quá trình tách sắc ký được thục hiện trên cột Phenyl Typersil (C-18, 250 x 4,6 mm, Spm), pha động Acetonitrile: Amonium dihydrogen phosphat pI = 6,0 vdi detector UV

225 am Giới hạn phát hiện của phương phap 1a 0,09 pg/mL, gici han dinh Tượng là 0,26 ng/mL Hiệu suất thu hỏi trong khoảng 99,87-100,45%

Tac gia Btil Ariburnu va cộng sự [7] đã sơ sánh phương pháp HELC và

HPTLC dé xác ảmh sibutramine được bỗ sung trái phép trong các sản phẩm

giảm cân tự nhiên Quả tình tách HPTLƠ được thực hiện trên bản mồng Thủy

th phủ siiengel 60 ys, sử dụng phá động mhexen-acolon-umorae (101:0/1) Quá trình phân tích trêu HPLC sử dụng cét Phenyl ($,0p, 130mm*4,6mm, id), pha déng Acetonitrile: Nude: Acid formic (pH 3,0, 0,19M) (45:55:0,78; v:v:v), đetector huỳnh quang, E, = 316nm, E„ = 225nm

Đường chuẩn HPTLC tuyển tính trong khoảng 250-2000ng/spof!, đường chuẩn TTPLC trong khoảng 5-200ng/ml Cả 2 phương pháp đến được thẩm định về độ đúng, độ chưm, khoảng tuyển tỉnh, độ thu hỏi và độ ôn định giữa các ngày Các phương pháp đều hiệu quá cho phân tích hàng ngày trong các sản phẩm bổ sưng trái phép sibutramine

Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Dược, Bucharest, Rumani [6]

đã phát triển phương pháp HPLC để xác định đồng thời sibutramine va

phenolphtlalem trong các sản phẩm giảm cân có nguồn gốc tháo được Các

điều kiện sắc ký bao gồm: Cột ƠN Nueclcosl (100-5 CN, 125 x 4,6 mm), pha

động Aeetentrile: Kali dihydrogen phosphat HH - 4,0 (35:65, v;v), đeteclor DAD 6 225 nm Nhóm tác giả đã thú đấy hàm lượng trang bù của sibutramine 14 24,71 mg/vién, phenolphthalein 1a 48,20 mg/vién

Tác gid Zhou Yu va cong su [26] dé phit widn muội phương pháp

TIPLC-DAD don giản để xác định đồng thời 4 chất được bổ sưng trái phép

trong thực nhằm chức năng: orlistat, cetilistat, sibutamine và rimenabamr

Các chất phân tích được tách và định lượng bằng IIPLC-DAD tại bước séng

2 nmn Quá trình tách được thực hiện trên cột C18 với chương trình rửa giải

gradient gém acetonitril va acid phosphoric 0,02 mol/L Higu suất thu hồi

trong khoảng 96,1-97,2% Dộ lặp lại trong ngày và độ tái lập giữa các ngày

1% Giới hạn phát hiện là 189 ng‡mL và đường chuẩn tuyến tỉnh với hệ số

tương quan R°›0,999 Phương pháp với nhiêu tru điểm: đơn giản, nhanh, dễ dang áp dụng và có thể sử đụng đề phân tích hàng ngày

Tc gia E.Deconinek và cộng sự đã phát triển và thảm định phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu ning UHPLC để phát hiện và định lượng các chất cắm trong, thực phẩm chức năng giám cản, bao gdm: sibutramine, modafinil,

ephedrine, nor-ephedrine, metformin, theophyllin, caffeine, diethylpropion and orlistat Qua trinh tách sic ky si dung cét Vision HT C18-B (2mm x 100 mưn, 1.5 pm), rửa giỗi gradient với phá động là đệm acetal pH

5,0 và sueterntril Cúc đường chuẩn tuyển tính cho tất cả các chất trong khoảng nghiên cứu Độ chệch và độ lệch chuẩn Lương đổi lần lượt nhỏ hơn 3% và 1,5% cho tất cả các chất

Trong các kỹ thuật phân tích đã được ủng dụng để phần tích

sibutramie, HPLC là kỹ thuật phổ biển nhất, để áp dụng và có độ chính xác

co, Ngoài ra thất bị HPLC được trang Dị rộng rấi tại các phòng thí nghiệm ở

Việt Nam VÌ chúng tôi đã lựa chon phương pháp HPLC được lựa dé

phn tich sibutramine trong thue phẩm chức năng giảm béo

iy,

1.4 Tổng quan về HPLC

Sắc ký lông hiệu năng cao (Tigh performance Liquid Chromatography

—TTFLC) là kỹ thuật tách sắc ký trơng đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lóng va di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tủy thuộc vào

ải lực của chất phân tích với pha động và pha tinh ma các chất di chuyển với

tốc độ khác nhau, do đỏ thứ tự rửa giải khác nhau Thành phan pha động dua chất phản tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp [H

Cột nhỏi (EET

- Nguồn cấp pha động: pha động trong sắc kỷ lỏng thưởng là 2 dung mỗi

hòa tan vào nhau để cỏ khả năng tách với đô phân giải phủ hợp, được chứa

trong bình thủy tính hoặc thép không rỉ

- Bộ phận loại khí (đegasser): trước khi sử dụng cần lọc (mảng lọc 0,45 pm)

và đuôi khí hòa tan trong pha động đề tránh việc khi hòa tan có thể làm biên

đạng pie, giảm hiệu lực cột, làm nhiều đường nên Có thể loại khí hỏa tan

bằng cách: chạy siêu âm, sục khi tro

- Bộ phận trộn pha động (mixer): trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp

suất cao

~ Bơm: về mặt kết câu có 3 loại thường gặp: Bom đây một pittong, bơm làm đầy nhanh và bơm kép đây kéo

b Bộ phận tiêm mẫu:

~ Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thăng vào pha động cáo áp ngay ở đầu

cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mâu Vông chửa mẫu cỏ dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50+20 4L Có vòng

chứa mẫu lớn hơn

~ Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mâu bằng bơm tiêm qua tâm đệm ở đầu cột

Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao Cách tiêm nảy có độ

lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi đúng van tiêm

~ Hiện nay hay ding van tiém mẫu vì có ưu điểm là sẽ đễ dàng tự động hoa,

cột không bị tắc hay bị làm bản bởi các mảnh của vách ngăn, thẻ tích đưa vào

cột hằng định nên độ lặp lại cao

e Cột sắc kỹ

- Cột sắc ký lỏng hiệu nãng cao thường được chế tạo bảng thép không gí, thủy th hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 em, đường kinh trong 4-10 mm

Cột nhi thường, cò hạt cỡ 5-10 Lun Ưu điểm của cột có cột nhỏi có hạt cỡ

nhỏ là chạy tốn Í đụng môi và íL thời gian và số đấa lý thuyết lớn

- Dễ bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bão vệ được đặt trước cột sẵo ký

để loại các chất có mặt trong pha động va trong, mau phân tích lảm giảm tuổi

thọ cột Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhỏi hạt cùng loại nhưng kích

thước hạt lớn hơn

- Sắc ký lỏng phân bồ là 1ÿ thuật sử dựng phổ biến nhất hiện nay Loại pha tĩnh phổ biến nhật được chế tạo từ silic dioxid (silica) Nhém OIT trên bê mặt silica phan tmg với dẫn chất clorosilan tạo ra đẫn chất siloxan

Bé matsilica Dẫn chat clorosilan Déin chat siloxan

Dua vào độ phân cực tương đổi của pha tỉnh và pha đông đã hình thành hai loại sắc ký phân bả là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bổ pha đảo

d Detector

Trong nghiên cửu nảy, để quy trình xây dựng dược cỏ khả năng ứng, dụng rộng, chúng tôi lựa clượn detector PDA, loai detector phd bién trong cấu hình tiêu chuẩn của thiết lị HPT,C hiện tại Về bản chất, đầy là một detector

UV-Vi cho piếp déug thoi ghi nhdn tin bigu hap thu déng thi trên toàn đải phd UV gan va Vis Dai bie xa UV-Vis (thudng cdc detector PDA cé dai bude séng trong khoang 190 — 800 nm) sau khi di qua tế bào đo được đưa đến

một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mang diod quang Mai địođ quang đón nhận một phẩn đải bức xạ trương tng với một khoảng bước song hep Như vậy, mỗi một điod có thể phát hiện một sự hấp thu ở một bước sóng nhất định Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lẫn trong 1 giây bởi bộ

phân vị xử lý Kết quả phế có thể hiện trên man hình máy tính hoặc được lưu trữ để im ra dưới đạng ban phả bằng may in

Uu điểm của đeteetor này là tạo được phỏ UV của các chất phân tich: trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tỉnh khiết của sẵn phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc kỷ với

phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước

e Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Bộ phận lưu trữ dữ liệu của các thiết bi HPLC biện nay thường là các may vi tinh hién dai có khá năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xứ lý các thông

tìn hết sức hiệu quả

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGIIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

-_ áo mẫu thực phẩm chức năng giảm béo với dạng bào chế: Viên nang cứng và viên nang mềm

2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- _ Nghiên cứu các điều kiện tách, xác định sibutamin bằng HPLC,

-_ Dánh giả giá trị sử dụng của phương pháp

~- Phân tích một sổ mẫu thực phẩm chức ning giảm bửo lrên thị

trường Hà Nội;

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Kháo sát lựa chọn các điều kiện tiến hành chạy máy HIPLC trong

phân tích sibuframine

- Khảo sát xây đựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết sibutramine trong thực phẩm chức răng

- Đánh giá quy trình phân tích và xử lý mẫu

+ Tỉnh đặc hiệu vá chọn lọc của phương pháp (SpeeiBility/Seleetivity)

1 Giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD)

+ Giới bạn đụh trong (Lamnit of Qualification — 1.0Q)

+ Khoảng tuyến tỉnh và đường chuẩn (Linearity and Calibration)

+ Dé lip lai (Repeatability)

+ Độ thụ hếi (Recovery)

- Áp dụng quy trình đã xây dựng để xác định chất cắm sibutramine trong một số sản phẩm thực phẩm chức năng giám béo bán trên thị trường lIà

Nội

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lẫy mẫu

- Mẫu thực phẩm chức năng giám béo được lầy ngẫu nhiên trên thị trường

Hà Nội đưới dạng bảo chế viên nang cửng và nang mêm.

2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

Tựa vào khả răng hòa tam của silntramine và tham khảo nhiều bài bảo,

nghiên cứu [23], [7], [16], [26], chúng tôi khảo sả! khá năng chiết gibutrarnine

từ nên mẫu bảng các loại các dung môi sau day: Methanol, ethanol, nude,

aeefonitril, aceton

Quy trình chidt sibubamine trong xuẫn thực phẩm chức wing giảm béo duct dang viên rang cứng và viên trang mềm dự kiến gŠm các bước sau: cho đối hượng phân tích là thực phẩm chức năng giảm béo dang viên nén, viên nang cứng và nang mềm dự kiên gồm các bude sau:

Đông nhất mẫu, xác định khối lượng trung bình viên thuốc Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoáng 0,3 đến 0,5 mg) vào ống ly

tam 50 mL

Thêm khoáng 20 mL dưng môi chiết vào ổng ly tâm,

Tắc xoáy ông ly tâm 5 - 10 phút, sau đỏ lắc siêu âm 15-30 phút ở nhiệt

độ phòng

Ly tam 5 phút, tốc độ 6000 vòng4khúl Găm lây phân dịch, định tuức 25

mÌ, bằng cùng dung midi va loc qua még loc 0,45 jam

Tiêm vào hệ sắc kỷ HPLC (pha loãng nều cân)

+ Sibutramine được chiết ra khối nền mẫu bằng các đụng môi khác nhan

- Quy trình chiết gibutrannine trong nấu thực phẩm chữ năng giảm béo dưới dạng viên nang cứng vả viên nang mềm dự kiến gồm các bước sau: cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng giảm béo đạng viên nén, viên tiăng cứng và nang mềm dự kiên gồm các bước sau:

Bong nhất mẫu, xác định khỏi lượng trung bình viên thuốc Cân chính xác một lượng mẫu sau kiu đồng nhất (cân khoảng O,3 đến 0,5 mg) vào ống ly

tam 50 mL

Thêm khoáng 15 ml dung môi chiết vào ống ly tâm

Tắc xoáy ông ly tâm S - 10 phút, sau đỏ lắc siêu âm 15-30 phút ở nhiệt

độ phòng.

Ty tâm 5 phút, tắc độ 6000 vòng/phút Gạn lấy phẩn dịch, định mức 25ml bằng củng dưng môi va loc qua mang loc 0,45

Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha lofing néu cin)

Cầu mẫu vào ông ly lâm 50 ml

! Dung uns môi Mẫu đã loại chất béo "5 :

+ Dung môi chiết

Ỷ Laie vortex

Tfinh 2.1 Quy trình phân tích mẫu dự kiến

2.3.3 Thâm định phương pháp phân tích

- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp xác định sibutramine trong mẫu

thực phẩm chức năng giãm bẻo tại PTN với các thông số:

a Tính chọn lọc, đặc biệu

Tỉnh chọn lọc nói lên khả nắng xúc định đúng chất phân tích khi cỏ mặt

các tạp chất hoặc các chất khác tiến hành như sau

Để xác định tỉnh đặc hiệu/chọn lọc đổi với sắc ký chúng tôi đã tiên

hành phân tích các mẫu trắng phải không cho tín hiệu phân tích, mẫu trắng cỏ

thêm chất chuẩn

b Khoảng tuyễn tính

hoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích lá khoảng nồng độ ỡ

đó có sự phụ thuộc tuyển lính giữa đại lượng đo được và nỗng độ chất phân

tích Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích lá khoảng nàng độ

giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tương ứng với nông độ chất phân tích có mặt trong nền mẫu

Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuần vả xác

định hệ số tương quan (R”) Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, trùm lên vùng nêng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuân toàn bộ khoảng tuyến tinh Néng dé trong mau không được

vượt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tết nhất phái

nằm ở vững giữa đường chuẩn

Có nhiêu loại đường chuẩn khác nhau tủy thuộc vào các phương pháp

và kỹ thuật khác nhau Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xây

dựng đường chuẩn với chuẩn tính khiết

- Cách xây dựng đường chuẩn trên chuẩn linh khiết rữuz sau:

Chuẩn bị dãy nống độ chuẩn, xác định các giả trị tín hiệu y đo được tương mg vớt nông độ x Nếu sự phụ thuộc là tuyển tỉnh, tá có khảo sát đường biểu diễn là một phương trình đường thẳng: y - äk+b

Trong, đó: a là giá trị độ dốc slope

b la gia tri hé sA chin intercept

e Giới hạn phát nén (LOD), gidi han dink leong (LOQ)

Giới hạn phat hién LOD (Limit of detection) la néng dé thap nhat etia

chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng

được long điều kiện thí nghiệm cụ thể Trong sắc ký TỚPD có thế được xác định là nông độ cúa chất phân tích má tại đó tí lệ giữa tin hiệu của chat phản tích và tín hiệu nên bằng 3 (S/N =3)

Tioặc có thể tính LOD dựa vào độ lệch chuẩn như sau:

Tính giá trị néng độ trung bình xự, độ lệch chuẩn SD (S)

Tổ đánh giá LOD đã tính được ta kiểm tra qua gia ti R= 7 ey

Nếu 4< < 10 thì nềng độ đung dịch đem thử là phủ hợp và giá trị

T,OD tính được là đáng tin cay

Giới hạn định lượng 1.0Q (Limit of quantification) la nding độ tháp

nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt dịnh

lượng với độ đúng và độ chụm nhận được Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nổng độ của chất phân tích mà tại đó tí lệ giữa tin hiệu của chất phần

tich va tin hiéu nén bing 10 (S/M =10) Cé thé tinh LOQ theo LOD theo công

@ Độ lặp lại

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là rnức độ thông, nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp

lại trên cùng một mẫu Dộ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối

RSD Tién hành thí nghiệm lặp lại 6 lần Tính đồ lệch chuẩn tương đối RSD%

của hàm lượng chất phan tích Các công thức tính toán như sau

Tiền lánh thí nghiệm m lần lặp lại

+ Giá trị trung binh

Độ đúng đánh giá sự phú hợp của kết quả thực nghiệm so với giả trị

thực (true value) hoặc được chấp nhận thực (accepted value)

- Phan tích mẫu ohuẩn (vật liệu chuẩn): Mẫu đã biết trước nằng đồ của chất phân tích Két quá tỉnh ra độ chệch:

x

Độ chệch - Š—P.x 100

"

+: kết quả phân tich được

pe gia trị đúng của chất phân tích

Trong trường hợp lưnn giá phân tích các tấu thử nghiệm liên phòng thí nghiệm, có thể đánh giá kết quả thông qua giả trị Zscore Zecore duge tinh nln

sau:

Trong đó: — ola dé Wéch clan than chign

Mến Z„„.|<2: Kết quả được chap nhận

2<|Z„.„.| <3: Kết quả có nghỉ ngờ

Zecore| > 3: Kết quả có sai lệch

£_ Khảo sát độ thu hồi Độ thú hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm

chuẩn Tượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bản sao

cho nỗng độ của chat cân nghiêu cửu sau khủ thêm chuẩn nắm trong

khoảng đã khảo sát Độ thu hôi (R94) được tính như sau:

Trong dé: Crate: Nong độ trong mau thém chuẩn

Ca: Néng 46 trong mau C.: Néng độ chuẩn thêm

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả thủ được trong quá trình tiễn hành nghiên cứu đến được xử 1í bằng các phần mềm có sẵn trong thiét bi HPLC

Sử dụng các phương pháp xử lý thông kê trong, phân tích nhờ các hảm

toán học, thông kế có sẵn long phần mém tin hoe Microsoft Office Excel dé tỉnh toán: kết quả trang bình, độ lệch, độ lệch chuân, phương sai, độ lệch chuẩn tương đổi, hệ số biển tiên, độ thu hỏi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp

2,8 Hón chất, thiết bị

2.5.1 Hóa chất

- Chất đối chiều sibutramine hydroclorid monchydrat (Sigma - Adrich)

(Số kiểm soát: MFCDO4039806; hảm lượng: >98% (IIPLC))

- Chất đổi chiếu fñosemid (Sổ kiểm soát: MECDO0010549, ham

lượng: 9999).

- Chất đối chiếu phenolphthalein (Số kiểm soát: MECD00070132; hàm

lượng: >85% (TLC) )

- Dung méi loai tinh khiét cho IIPLC: Methanol, acetonitril,

tetrahydrofuran (Merck)

- Dung môi loại tĩnh khiết phan tich: Ethanol, aceton (Merck)

- Hóa chất tình khiết phần tich: Kali dihydrophosphat (Merck), amoni

acetat (Merck)

~ Nước cất 2 lâu

- Dung dịch chuẩn sibutramine gốc 300 kgjml: Cân chỉnh xác một

lượng chất đổi chiếu sibutramine hydroclorid monohydrat tuong duong khoảng 50,0 mg sibutramme vao cdc cd mé 50 ml, héa tan bang 20 ml methanol và chuyển vàơ bình định mức 100 mÌ, ding methanol trang cdc, chuyển địch trang cốc vào củng bình định mrưử, thêm metlemol sừa đủ dến vuch, lac kj Bao quản tong tủ lạnh

- Dưng dịch chuẩn lâm việc: lút chỉnh xác 40,0 ml dung địch chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ (dung dich chuẩn làm

2.5.2 Thidt bi, dung cu

- Hệ thông sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD)

trang bi detector PDA

- Cét sic ky Cig Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 jim)

~ Cân kỹ thuật XT1200c

~ Cân phân tích Mettler Toledo có độ chỉnh xác 0.0001 g và 0,00001 g

- Máy đo pH: pH Meter 744

- May lic siéu am Elma

- May ly tam Hermle Z383K

- May lic Vortex IKA

~ Dụng cụ thủy tình các loại: Binh dinh mic 20 ml, 50 ml, cốc có mỏ,

pipet các loại, autopipet 1000 jl, 200 jul

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu các điều kiện tách và xác định Sibutramine bằng HPLC

3.1.1 Lựa chọn bước sóng hấp thụ ánh sáng

Dua vao tính chất của sibutramine hấp thụ ánh sáng trong vùng tử

ngoại, tiên hảnh quét phô băng detector PDA đề chọn bước sóng phủ hợp cho

nghiên cứu Phỏ Sibutramine được quét từ bước sóng 192 nm dén 360 nm thu được sắc đồ như sau:

TB]DmssgmaVe Tay |] Dưmv|ÐE

dùng detector UV dé thay the trong trong hop không có detector PAD

Việc dùng detector PDA không những dùng đẻ định lượng mả trong quá trinh phân tích để khẳng định sự có mặt của chất phân tích chủng ta có thể kết hợp được đồng thời xem dai bước sỏng và xem được hình dang pho của chất phân tích Đặc biệt, trong nhóm các hoạt chat TPCN giảm bẻo có chứa rất nhiều các chất thuộc nhỏm giảm béo có kha nang hap thụ tại bước

song 225 nm, néu chỉ dựa vảo thời gian lưu đề khẳng định chất do là sibutramine có thể đề bị nhầm lần Vì vậy, khi kết hợp giữa thời gian lưu và

hình dạng phỏ hấp thụ cỏ thẻ khẳng định chỉnh xác chất cần phân tích Do đỏ,