Luận văn xác Định một số Đoạn mã vạch adn cho một số loài trà hoa vàng Ở vườn quốc gia tam Đảo

Với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, một phương pháp phân loại dựa trên kỹ thuật phân tích ADN đã được nghiên cứu và phát triển sử đựng các đoạn mã vạch ADN đặc trưn

DATTIOC QUOC GIA TIẢ NỘI

TRUONG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG MINH TRANG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN MÃ VẠCH ADN

CHO MỘT SỐ LOÀI TRÀ HOA VÀNG 6 VUON QUOC GIA TAM DAO

LUAN VAN THAC Si KHOA HOC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI

'TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KIOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1.PGS.TS Hà Văn Huân

2.PGS.TS Nguyễn Trung Thành

Ha Nội - 2016

LOLCAM DOAN

Tôi xin cam doan dây là công trình nghiền cửu cửa tôi, dưới sự hướng dân

*khoa học của PGS.TS, Ila Van Huan và PÖS.TS Nguyễn Trưng Thành Các nội dụng

nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bổ đưới tiất kỷ hình thức nảo

Luan văn cũng sử dụng thông tin, số hiệu từ các bài báo và nguồn tải liệu cửa các tắc giá khác đếu có trích dẫn và chủ thích nguồn góc day di

Nếu có bắt kỳ sự gian lận nảo tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung,

luận văn,

Học viên

Hoàng Minh Trang

LOL CAM ON

Tôi xia gửi lời cắm ơn chân thành dên các thấy cô giáo khoa Sinh học, trường, Dai học Khoa học Tự nhiên — Dại học Quốc gia 11a Nội đã trang bị kiến thức cho tôi

trong suết quả trinh học tập

Đặc biệt, tôi xin bay tố lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hà Văn Huân— Viện

CNSH Lam nghiệp — Đại học Lâm nghiệp và PGS.TS Nguyễn Trung Thành — Khoa Sinh học Đạihọc Khoahoe Tự nhiên IĐHQGHN dãtận tình chí báo vá hướng dẫn

tôi trong suốt quá trinh nghiên cứu đề tài vả hoàn chỉnh ban Luan van Thạc sĩ này

Xin được cảm ơn dễ tải nghién ctru khoa học cấp Nhà nước “Xây dựng cơ sở dữ liệu

xuã vạch ADN (DNA barcode) cho một số loài cây làm nghiệp gỗ lớn, lâm sản ngoải

26 cé gid tri kinh té” do PGS TS 11a Văn Tuân chủ nhiệm đã hẾ trợ tôi về mọi phương,

điện dễ thực hiện nghiên cứu này

Téi xin cam on cdc cán bộ Viên Công nghệ Sinh học Tâm nghiệp — Đại học

Lam nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành để tài nghiên cửu Xin được cảm ơn Ban Quan ly VQG Tam Đảo đã che phép thu thập mẫu vật lam nguồn vật liệu cha dé

tài, sâm ơn chuyên gia thực vật học 1ê Thành Cương đố giúp tôi hú thập và nhận

dạng các loài Trà hoa vàng trong nghiên cửu này

Cuối cùng, tôi xin chân thành cầm ơn gia đình, bạn bè và dòng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cá vật chất và tĩnh thân trong suốt quá trình học

tập và nghiên cứu

Xin chén thành cảm on!

Tà Nội, ngày — tháng - năm

THọc viên

1.1 Tổng quan về Trà hoa vàng ở Vườn Quốc gia Tam Pao 3 1.1.1 Điểu kiện tự nhiện và đa đang thực vật ở Vườn Quốc gia Tam Đão 3

1.1.2 Lược sử nghiên cứu Trà hoa vàng VQG Tam Đảo seed

1.1.3 Đặc điểm hình thái vẻ phân bố một số loài Trả hoa vang VOG Tam

1.2.2 Một số đoạn mã vạch ADN được sử dụng 12 1.2.3 Các yêu tổ ảnh hưởng đến khả năng phân biệt của các mã vạch ADN

1.2.5 Một số nghiên cửu về mã vạch ADN ở các loài Trà - 22

2.1.2 Nội dung nghiên cứu sec ¬ - 2.2 Phương pháp nghiên cứu ”— -

2.2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng dụ o2 Seo

2.2.2 Phương pháp nghiên cửu "—

Chương 3 KỬT QUÁ - THẢO LƯẬN e o6 ¬——- 3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số các mẫu trả hoa vàng 29)

3.3 Giải trình tự và phân tích trình tự các đoạn mã vạch ADN 32

3.3.2 Khoảng cách di truyền trong và giữa cáo loại - - 58

2 Kiến nghị

+ 66

DANH MUC BANG

Bang 2.1 Trinh tự các cặp mồi sử dụng - - - 26

Bang 3.6 Mức đô tương dòng đoạn matK cac loai Tra nghiên cửa với một số loài

Bang 3.7 So sanh trinh tự doan rbcl giữa các toa Trà họa vàng, 39

Bảng 3.8 So sánh trình tự r6ef, giữa các loài Trả hoa vàng nghiền cứu 41 Bang 3.9 Múc độ tương đồng đoạn rêcE, các loài Trà nghiên cứu với một số loài

Bang 3.10 So sảnh trình tự đoạn trnH-psbA giữa các loái Trả hoa vàng, 44

Tăng 3.11 3o sánh trình tự øzử7-pab.4 giữa các loài Trà hoa vàng nghiên cứu 45

Bang 3.12 Mức độ Lương đồng đoạn #rfi-psb4 các loài Trả nghiên cứu với một số

loài khác co 46 Bảng 3.13 3o sánh trình tự đoạn ycf1b giữa oác loài Trả hoa vàng, 49 Bảng 3.14 8o sánh tình tự yợ/?b giữa các loài Trả hoa vàng nghiên cứu 31 Bang 3.15 Mite d6 tuong déng doan yefTb cdc loài Trả nghiên cửa với một số loài

TBảng 3.16 8o sánh tình tự đoạn TT§2 giữa các loài Trả hoa vàng, 34

Bằng 3.17, Bo sánh trình tự 1182 giữa các loài Trả hoa váng nghiên cứu

Bảng 3.18 Mức độ trơng đồng đoạn TT82 các loài Trả nghiên cứu với một số loài ¬- Dáng 3.19, Khoảng cách di truyền cúa từng đoạn mã vạch riêng rẽ và khi kết hợp

Hé gon lue lap mat s6 loai the chi Camedlies [94]

Chu trình nhiệt nhân ban doan ma vach ADN

Kết quả điện di sẵn phẩm tách chiết ADN tổng số các mẫu Trà hoa vàng,

kết quả điện di sản phẩm PCR các đoạn mã vạch ADN

Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên tình tự đoạn gen maiK Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự doạn gon rbel

Cây phân loại sinh bọc xây dựng dựa trên trình tự đoạn #/-psb/1

Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự đoạn vợ/7b

Cây phân loại sinh học xây dựng dựa trên trình tự doạn /752

Khoảng cách di truyền các đoạn rnã vạch

Cây phân loại sinh học dựa trên sự kết hợp một vải trình tự mã vạch

DANH MUC CHU VIET TAT

1 DNA —_| Deoxyriborucleic acid ADN

3 rts Internal transcribed spacer | Ve dém gitta các vừng phiên mã

5 Nepr | National Center for Trung lam Thing tin Cong

Biotechnology Information _| nghé sinh học Quốc gia

6 PCR Polymerase Chain Reaction | Phân ứng chuỗi polimer hóa

Tiêu đơn vị lớn enzyme

7 rhe Rubwlose 1 5 bisphosphate ribulose-1 5-bisphosphute

yiase 1aTBe 8 carboxylase

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

MỞ ĐÂU Trà hoa vàng thuộc chỉ Trà Cameiiia (họ Theaceae, bộ Ericales) có hoa màu

vàng, dược phát hiện lân đầu tiên ỡ Việt Nam vào những năm dau thé ki XX Cho

đến nay các nhà khoa học đã phát hiện ra khoảng trên 30 loài Trà hoa vàng, trang đó

có 38 loài được tìm thấy ở Tnmg Quốc và 24 loai tim thay ở Việt Na [2] Các loài trả hoa vàng, có giá trị lớn vẻ mặt được liệu, được biết đến với tác dụng kiểm ché sinh trưởng khối u, ngăn ngửa ung thu, giém long cholesterol va lipoprotein trong mau

do có các nguyên tổ vị lượng như đormaniun (Ge), 8clerium (Se), Mangan (Mn)

Ngoài ra trả hoa váng còn cò giả trị thậm mỹ cao, dược trồng lam cây cảnh do có họa

lớn màu vàng đặc trưng [5]

Ở Việt Nam, Trả hoa vàng được phát hiện chủ yêu ở một số địa phương như

VQG Tam Đảo (Vinh Phúc), VQG Cúc Phương (Ninh Bình), Phước Lộc (Lâm

Đồng) [21, 65, 67], trong đỏ ở VQG Tam Đảo phát hiện ra 8 loài với một số loài

đặc hữu của Việt Nam như Camellia tamdaoensis, Camellia crassiphylla, Camellia

neteloni [63, 65] Đây là nguỗn gen vô cùng quý hiểm cho hệ thực vật ở Tam Đảo nói riêng và Việt Nam nói chung, cần được bão vệ và phân loại để đưa ra biện pháp

thích hep cho việc bảo tồn nguồn gen, đa đạng sinh học Tuy nhiên, hiện nay Trả hoa vàng ô Tam Đâo đang bị đe đọa nghiêm trọng đo việc khai thác quá tức từ phia

người dân, đồng thời việc bảo tồn và nghiên et con chua được chú ý nhiều ]65|

Cho dến nay, việc phân loại thực vật nòi chung và các loài thuộc chỉ Trả nói

riêng chủ yêu dựa vào các đặc điểm hình thái, câu tạo giải phẩu bên trong [94] Việc phân loại này rong một số trường hợp gặp nhiều khó khăn đo một số loài Tra hoa vàng có đặc điểm hình thái tương đối giống nhau Với sự phát triển của sinh học phân

tử và công nghệ gen, một phương pháp phân loại dựa trên kỹ thuật phân tích ADN đã

được nghiên cứu và phát triển sử đựng các đoạn mã vạch ADN đặc trưng cho loài

(DNA barcode) [17] Phương pháp này trở thánh công cụ đắc lực cho các nhà khoa học trong việc phát hiện loài mới, phản loại, đánh giá đa đạng đi truyền và quan hệ

đi truyền các lưài Mỗi đoạn mã vạch ADN có đặc ưng riêng và có khả năng phân

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

biệt sinh vật ở các mức dộ khác nhau (chi, loài, đười loài Một số doạn Mã vạch

ADN được sử dụng phổ biến ở thực vật có thể kế đến như znz/K, zbeE,„ trml7-psbA,

rpoR, rpoC1, pshl-psbK, atpF-atpH, tnL-trnF [40, 47, 94]

Với mục xây đụng cơ sở đừ liệu phân tử cho các loài Trà hoa vàng ở VQG Tam Đảo, cụ thể là 5 loài Hải dường vàng (Cemellia tienii Ninh), Tra vang Hakoda (Camellia hakoda Ninh, Tx), Trà vàng là day (Camellia crassiphylia Ninh et Hakoda), Tra vang Tam Dao (Camellia lamdaoesis Hakoda el Ninh), Tra vang Petelo

(Camellia petelotii (Mer.} Scaly), dé xuat ma vach thich hop dic trig cho ac loai trả này thông qua việc xác định và phân tích trinh tự của một số đoạn mã vạch, tác giả tiến hành đề tải “Xác định mội số đoạn mã vạch ADN cho một số loài Trả hoa vang ử Vườn Quốc gia Tam Đảo” với dối tượng phản tích là năm vùng trình tự

rbeL, matK, yofTb, trửT — psb4 và TTS2 Kết quả thu được sẽ đóng góp vào Ngân

hang gen Quốc tế để giám định các loài Trà hoa vàng, xác định mỗi quan hệ đi truyền

piỮa các loài Trả hoa vàng với nhau vá với các loái trong, chi tra Camellia, nâng, cao

thiệu quả bảo tổn và phát triển các loài Trà hoa vàng quý hiểm ở không chỉ ở Việt

Nam ma còn lrên loãn thế giới

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

Chuong 1 TONG QUAN

11 Tổng quan về Trả hoa vàng ở Vườn Quốc gia Tam Đảo

1.LL1 Điễu kiện tự nhiên và đa dang thực vật ở Vườn Quốc gia Tam Dảo

Vườn Quốc gia (VQG) Tam Đão có vị Irí địa lý nằm ở phía bắc đồng bằng,

khác biệt Khí hậu VQG Tam Bao nam trong vùng khí hậu ẩm nhiệt đới, hai sườn

đông tây ngăn cách củng với sự thay đổi về lượng mưa hàng năm đã tao nên sự da dạng về các tiểu vùng khí hậu cho khu vực này Phong phủ về dang dia hinh, chia vùng khí hậu và đa dang về mặt thổ nhướng là nguyên nhân chỉnh đã tạo ra sự đa dạng vẻ các hệ sinh thái rừng, các quân xã sinh học và da dạng về loài của rừng Tam Tảo Dựa trên cơ sở các cuộc điều tra, khảo sát đã thông kê được cho đến năm 2005,

VQG Tam Đảo có 1436 loài huge 741 ch

số đỏ, ngành Mộc lan (Magnoliophyta) có số loài nhiều nhất (1149 loái), ngành Có tháp bút (7qnisetophyta) có số loài ít nhất (L loài) Trong số các loài thực vật ở VQG

219 ho, 6 ngành thực vật bậo cao Trong

Tam đảo, có 68 loại đặc hữu và 58 loài quý hiểm được glú vào sách đỏ Việt Nam hay

theo tiêu chuẩn của Liên minh báo tổn thiên nhiên Quốc tế IUỢN [102] cân được bao

tôn như Lan hài tam đảo (2aphianedilim gratvixianum), Tra vàng tam đáo (Camellia

tamdavensis), Tra ving potclo (Camellia peleloni), Kim giao (Nugeia fleuryii) Trong số đỏ, da dạng về các loài trả nói chung vá Trả hoa vắng nói riêng nhận được

nhiều sự quan tâm cửa các nhà nghiên cứu không chỉ trong nước ma cỏn mỏ rộng ra

phạm ví quốc lế |5]

1.12 Lược sử nghiên cứu Trả hoa vàng VQG Tam Đảo

Trả hoa vàng nói riêng, vả các loái thuộc chỉ tra Cơmellia nới chung ta khí hậu tióng âm, thường mọc ở nơi đất tơi xếp bên bờ suối có bóng râm, thoát nước tốt Với

khí hậu nhiệt đổi âm giỏ múa vùng nói cao, dia hinh phan hoa marih va da dang lao

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

nên các thung Hìng âm ưới, VQG Tam Đảo ở thành khu bảo tôn có số lượng loài trả phong phú nhất ở Việt Nam Cho đến nay đã tìm ra 16 loài và 1 thứ thuộc chỉ trà được tim thay ở đây, trong đó có 8 loài trà hoa vàng phân bẻ rãi rác trong day ni Tam Bao

[65]

Loài Trả họa vàng dầu tiên được tìm thay 6 VQG Tam Dao [a loai tr vàng, petelo Camellia petelotii bdi thay thuc người Pháp Alfred Petelot vào nim 1923 Trong những năm của nữa đầu thế kỹ 20, rưiễu cuộc khảo sát và tu thập đã được

tiến hành trong đó có các loài thuộc chỉ Cømeiiia |5] Tháng Ô{ năm 1998 trong dợt khảo sát sự đa dạng sinh học chỉ Cømeilia ở VQG Tam Dáo, PGB.L8 Trần Ninh cũng với 8 Hakoda Naotoshi trường đại hoe Tokyo (Nhột Bản) đã công bố 3 loài Irả mới trong đỏ có loài trà vang la day Camellia crassiphyila Ninh et Hakoda Cáo loài mớt

này được công bổ trong tạp chí Trà quốc tế (International Camellia Joumal)

{64][1011 Dựa trên các tải liệu tham khâo và nghiên cứu của tác giả, năm 2002

PGS.TS Trần Ninh đã công, bố trên tạp chí Trả quốc tế 50 loài trà ghi nhận có mặt ở Vist Nam Trong số 50 loài đá có 12 loài trà gặp ở VQG Tam Dảo Trong nhiều năm tiếp theo PGS.TS Trần Ninh đã tiên hành nhiều đợi khảo sái ở các địa điểm khác nhau

của VQG Tam Đáo Năm 2007 trong tạp chí khoa học trưởng DHQG LIả Nội, ông cho công bê 2 loài trả hoa vàng mới 46 1A Camellia hakoda Ninh va Camellia tamdavensis Ninh ot Hakoda Nim 2008 PGS.TS Trần Ninh cũng đồng nghiệp đã thu thập được thêm 3 loài ở VQG Tam Đảo, trong đó có 2 loài Trả hoa vàng lần dẫu tiên duoc tim thay & day 1A Camellia hirsuta Hakoda et Ninh, Camellia phanii Hakoda et Ninh |5] Cho đến nay, 8 loái Trả hoa vàng đã được phái hiện ð VQG Tam Đảo là

các loài:

© Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda (Tra vang lá đây)

«Camellia gilberti (A Chev.) Sealy (‘Ira vang ginbec)

© Camellia hakodae Ninh (‘'ra vang hakoda)

© Camellia hirsuta Hakoda ct Ninh (Tra vang nhigu King)

© Camellia petelotii (Merv) Sealy (Trả vàng petelo)

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

© Cameilia phanii Hakoda et Ninh (Trà vàng phan)

«+ Camellia kamdaoensis llakoda et Ninb (1rd vang tam do)

© Cumeilia tienii Xinh, Tr (Hin dong, vang) 165 |

Trong số đó có một số loài dặc hữu của Việt Nam như Camellia crassiphylla, Camellia hakodae, Camellia tamdaoensis Tuy da dang về loài nhưng phần bé cia

các loài trả họa vàng ở VQG Tam Pao lai kha hep tris loa1 Camellia gilberti Hai loài Camellia tamdaoensis va Camellia tienii phan bỗ ở sườn dốc phia Tây Nam dãy núi Tam Dão, ở độ cao 200 — 600m Trong khi đó, các loài Cameilia hakodae, Cameilia hirsuta, Camellia phanii lai thuemg được tim thấy ð phía đông nam Đặc biệt, loài 'Trả vàng petelo (Camellia peteloti) - loài đặc hữu của VQG Tam Đáo là loại trả hoa

vàng duy nhất ở Băc Việt Nam phân bỗ ở độ cao trên 900m Hiện nay, với hệ thống,

báo vệ còn lỏng lêo và chưa được quan Lâm đúng múc, số lượng cá thể của các loài

trả hoa vàng sụt giám đảng kế do việc khai thác quá mute ti phia người dân do các

loài trả này có giá trị kinh tế rất lớn [65]

1.13 Đặc điểm hình thái và phân bố một số loài Tra hoa vàng VQG Tam Đảo

1.1.3.1 Camellia crassiphylia Ninh et Hakoda (Tra vang 1a day)

Cây gỗ nhỏ: cao 3-5 mm Lá có cuồng dài, không lông, phiển lá hình bầu dục

rộng, hoặc bầu dục, xanh đậm và láng ở mặt trên, xanh sảng ớ mặt đưới, có nhiều

điểm tuyển màu đen, lá dày, gốc lá tròn hoặc tim nõng, chớp lá tù, mép lá có răng cưa

lôm nông, gân bên 8-9 cặp, Hoa màu vàng, mọc ở dâu cảnh hoặc nách lá, dường kính khí nở khoáng 4-4,3 em Lá đải 5, có lông Tràng hoa gồm 9-10 cảnh, cáo cảnh bên ngoài có lông mịn ở mặt lưng, các cánh bên trong hình bầu đục thuôn, có lông mịn

Quả hình cầu dẹp, khia 3 rãnh Quả 3 ö, 1-3 hạt trong mỗi 6, vỏ quả dày 2

Mùa ra hoa: Mùa đồng đến đầu xuân

Sinh thái: Mọc rải rắc trong thung lũng rừng thường xanh ở độ cao 500-600 m

15, 65]

-3 mm

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

1.1.3.2 Camellia hakodae Ninh (Tra vang hakoda)

Cây gỗ nhỏ, cao 3-4 m Cành non màu nâu nhạt, nhẫn Phiên lá hình bầu duc,

‘bau đục rộng hoặc thuôn, xanh đậm vả láng ở mặt trên, xanh sang ở mặt đưới với nhiều điểm tuyển máu đen, cả hai mặt đều không lông, mép lá có rãng cưa nhỏ cách:

đều nhan, hệ gân lãm ở mặt trên và nỗi rõ ở mặt đưới TToa màu vàng, mọc ở đầu cành

hoặc nách lá, đường kính khi nở khoảng 6-8 cmn T,á đài 5, hình vay đến gan tron, mép

và mặt trong có lông, Tràng hoa gồm 16-17 cánh, gần tròn dẫn bảu dục, có lông ở mặt trong và thưa đản ở các cánh bên trong Quả gần dang cần, 3-4 hạt trong mỗi ô,

vỗ quả dày 4,5-6,5 mụn Hạt đài 2,2 cm, có lông,

Mua ra hea: Bau mua đông tới dầu xuân

Điều kiện sinh thái: Mọc trong thung lững của rừng thường xanh ở độ cao 150-

500 m

Phân bố: Loài này được thu thập đầu tiên ở VQG Tam Đáo tỉnh Vĩnh Phúc từ

tháng 12 nấm 1998 Dây là loài đặc hữu của VQG Tam Dáo Loài này còn số hượng

cả thể rất it và khu phân bố khả họp, hơn nữa sự tái sinh không nhiều nên cân có biện

pháp báo vệ [5, 65]

1.1.3.3 Camellia petelotii (Merr.) Sealy (Trả vàng petelo)

Cay bui hoặc cây gỗ nhỏ, cao 3-5 m, cảnh non màu xám nhạt, nhẫn Lá có

cuống, hình bầu dục thuôn, đôi khi hình bầu đục hoặc thuôn, mặt trên phiến lá tàu

xanh dậm, mặt đưởi xanh sáng với nhiều điểm tuyến màu nâu nhạt, nhần, gốc là hình

xiêm hoặc nêm rộng, chóp lá có mũi nhọn mép lá có răng cưa nhọn nhưng cách nhau

không đều Hoa màu vàng, mọc đơn độc ở đầu gác cảnh nón, đường kinh khi nỗ khoảng 4,7 em Cuống hoa to, là dài 5, hình trừng rộng ngược Cảnh hoa gồm 14 cảnh, hình trứng rộng ngược, bâu dục Cánh hoa bên ngoài có lông mịn mâu trắng ở mặt ngoài, tất cã hợp với nhau và với bộ nhị khoảng 8 mm ở gốc Quả hình cau det

Lat dai 1-2 em, có lồng,

‘Mia ra hoa: Mùa đông tới đầu mùa xuân năm sau

Sinh thái: Mọc trong rừng thường xanh ở độ cao 950-1100 m

Phân bổ: Vĩnh Phúc, VQG Tam Dáo Loài đặc hữu của Việt Nam [5, 65]

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

1.1.3.4 Carmellia tamdaoensiz Haleoda et Ninh ( Lrà vàng tam dio)

Cây bại hoặc cây gỗ nhỏ, cao 2 - 4 m, cảnh non màu nâu nhạt, có lông mịn,

cảnh giả nhẫn lá cô cuống nhẫn phiên lá hình bau đục thuôn hoặc bau duc rang, dải, mặt trên phiến lá mảu xanh đậm, láng, không lông, mặt dưới máu xanh tia đố,

không lồng, có nhiều điểm tuyến mau nau đen TIoa mảu vàng, mọc ở đầu cành hoặc

xách lá, đường kinh khi nở khoảng 3,5-4 em Cuống họa dài 5-7 mm, Tá bắo 5 Tá

đài 5, hình mỏng hay gần trỏn, có lông ở mặt trong và mép Cánh hoa gỏm 11-12

cảnh, gần tròn, trứng ngược hoặc bầu đục Quả hình cầu đẹt, khia 3 rãnh, đường kính

4 em, cao 2,3 cui Qua 3 6, 3 hal trong mai 4, v6 qué day 2 man Hạt có dạng bán cầu hay nêm, vỏ hạt nhãn

Mùa ra hoa: Mùa đông

Điều kiện sinh thái: mọc rong những thung lũng din uot trong rừng nhiệt dới

ð độ cao 300-400 mụ

Phan bé: Vĩnh Phúc (VQG Tam Dáo) Dây là loài đặc hữu của Việt Nam [5, 65]

1.1.3.5 Camellia tienh Ninh, Tr (Hài đường vàng)

Cây gỗ nhỏ, thân máu trắng nhợt, cao 2,5 m Canh va 14 non mau tim, không

lông Lá cá cuồng gân tromx, không lỏng, lá dạng đa, đày, phiên lá thuồn, cả hai mặt

đều không có lông, mặt trên lăng, mặt dưới cỏ nhiễ mau den Hoa mau ving,

moe 6 nach 1a, kich thuse 5-6 em Lá đài 5 hình vây đến gần trẻn, cao 3-7 mm, rộng

8-10 mơn, có lông ở mép Cảnh hoa 14, các cánh ngoài phủ nhiều lông, các cảnh còn

lại có lông thua, mặt trong của tất cã gác cánh dổu không lông, lính dạng cánh hoa

thay đổi từ ngoài vào, các cánh tit gn trén, bau duc hay bau đục thuôn

TMủa ra họa: Mùa đông tới đầu xuân

Điều kiên sinh thai: Moc ven suỗi trong rùng thường xanh núi thấp ở dỗ cao

250m

Phân bố: Vườn Quốc gia Tam Đảo [5, 65]

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

1.1.4 Tra hoa vàng và giá trị sử dụng

Từ xa xưa các loài trả đã được can người khai thác làm đồ uống có tác dung

thanh nhiệt, giải độc Tuy nhiên, công dụng của các loài trà hoa vàng không đừng lại

ở đó, Ngày nay, đời sống của con người được nâng cao củng với sự tiên bộ của khoa

học kỹ thuật, ngày cảng có nhiều công đựng của trà hoa vàng được tìm ra và tận dụng,

triệt để nguồn lài nguyên quý bán này

1.1.4.1 Đồ uống từ lá, hoa trà

Đây là một giá trí đáng kế và phố biến không chỉ với trà hoa vàng má còn đốt

với các loài thuộc chỉ Trả Cameilia nói chung Từ những năm trước Công nguyên,

uười Trung Quốc đã sử dựng trả như một thử nước uống và tả được phố biến ở nhiều nước châu A sau đó Với một số dất nước như Nhật Bản, Trung Quốc, thức tống tử trả đã trở thành một nét văn hỏa đặc trung, Ở Việt Nam cây trả cũng được trắng từ khả lâu, hâu nh tĩnh nào cũng có cây trà Tuy nhiên, phố biến hiện nay vẫn

là các loài Trả xanh, Trả hoa vàng côn chưa được biết đến nhiều Một tru điểm sơ với trả xanh thông thường đó là chiết suất từ lá Trả hoa vàng không chứa caffein vền là xnột chất chiếm tý lệ đáng kế ỏ trà xanh [S]

1.1.4.2 Tách dấu từ hạt trà

TIạt của các loài trà có thể ding để chưng cất đầu Ở Trưng quắc và Nhật Bản, đầu ăn chiết từ hạt trả khá phố biển Dầu của hơn 200 loài thuộc chủ trả đã được sử dụng làm thực phẩm và dung cho các ngành công nghiệp khác Ngoài ra, một số hợp

chất trong lá và quả trã như acid tanio, oleio acid là những thành phan quan trọng

duce sit dung trong công nghiệp dược phim [5]

1.1.4.3 Giá mị được liệu của trà hoa vàng,

Giá trị dược liệu là giá tri đáng quý nhất của cây Trả hoa vàng Ngây nay, các

công trinh khoa học đã chỉ ra ngày cảng nhiều công dụng của cây trả Riêng đối với

tra hoa vàng, cáo nghiên cứu đã cho thây trà hoa vàng có khả năng kiểm chế sự sinh

trưởng của các khối u dến 33,8%, Ngoài ra né cén giúp giãm dến 35% ham lượng,

cholesterol, 36,1% long lipoprotein trong mau, cao hơn 10% so với các biện pháp

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

sử dụng tây dược hiện nay Các chế phẩm tử trả hoa vàng có khá năng làm giảm biểu thiện triệu chứng xơ vữa động mạch, điều hòa huyết áp lên cạnh đó, một số bệnh về đường hô hập, bài tiết đêu có thể sử đụng thức nắng nay như một phương pháp chữa trị đơn giản và sớm mang lại kết quả

PAt nước Trung Quốc từ lâu dã khai thác tiêm năng to lớn từ giá trị được liệu của cây trả hoa vàng Họ đã xây dựng nên Vướn Camellia Quốc tế, trồng nhân tạo ving Trả hoa vàng nguyên liệu, nghiên cửu và sản xuất (hành công các chế phẩm tir

trả hoa vàng như Golden Camellia, Superior tea 1a nbiing mat hang cd gia ti va

đem lại nguồn lợi nhuận không lễ hàng năm Việt Nam cũng lá một trong số các nước

co

ễ loài trà hoa vãng phong phủ bậc nhất trên thế giới, Luy nhiên việc nghiên cứu

từng dụng và khai thác giá trị được liệu cúa các loại nảy con chưa dược chủ trọng

Công tác bảo tên chưa được tốt, lượng cả thể tự nhiên hàng năm suy giảm đảng kề là một thực trạng đáng buồn vả đe đọa trực tiếp đến nguồn gen quý giá này [5]

1.1.4.4 Giá trị thâm mỹ - làm cây cảnh

Cli Irả 1á chỉ có hoa lớn, đẹp, nhiều mâu sắc, ruột số loài hoa nỡ đúng vào địp

Tết Nguyên đán nên thường được sử dụng để chơi như cây cảnh Việc lai tạo, phối

hợp các màu hoa cfnp, như thu hút sự chủ ý của các nhà lai tạo, lắm tăng giả trị của

cây trả lên nhiều lần niểu có thể tạo ra giống trả có mẫu hoa hiểm và độc đáo [5]

1⁄2 Tổng quan về mã vạch ADN

12.1 Giới thiệu về mã vạch ATN (DNA harende)

Phản loại thực vật từ lầu đã chứng mình được vai trò quan trọng trong việc

lam nên lắng cho các nghiên cứu về xinh thái, tiến hóa và đa dạng thực vật Phương,

pháp phân loại truyền thông được xây dựng và phát triển xưa nay là phương pháp

phân loại dựa trên đặc điểm bình thái các loài thục vật Phương pháp phân loại này chủ yêu đựa vào sự khác biệt hình thái của các cơ quan thực vật, đặc biệt 1a ca quan

sinh sản Tuy nhiên, thực tế đã cho thấy đây chưa phái là phương pháp tối ưu trong,

việc nhân loại các mẫu dang trang giai đoạn phát triển, các mẫu có đặc điểm giống

Than đo hiện tượng liền hóa đẳng quy, các mẫu không có đủ các bộ phận [3] Ngoài

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

za, phương pháp phân loại hình thải thường chỉ dược thực hiện bởi các chuyên gia

tình thái học, việc phân loại đôi khi tốn nhiều thời gian và công sức [31] Khắc phục

những hạn chế của phương pháp phân loại hình thải, từ giữa những năm 1990, một phương pháp loại mới dựa trên lĩnh vực sinh học phân tử đã được hinh thành Phương,

'pháp này dựa trên các đữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân (AIDN) hoặc

sản phẩm của chứng (rotein) Tùy raục đích hoặc đối Lượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen |83| Trong phương,

pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được ứng đụng để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây phát sinh chũng loại

cũng như giúp nhận dạng dến cấp phân loại loài hoặc chỉ Một số kỹ thuật có thể kế đến được sử đụng phố biến trên thể giới như RFLP (đa hình độ đài đoạn cắt hạn chế), VNTR (36 lượng thay đổi các chuỗi lặp lại liên kể), DNA barcodc (mã vạch

ADN) [41, 421

Năm 2003, nhà nghiên cửu tại đại học Guelph, Canada Paul Hebert - da dé

xuất một phương pháp xác định loài dựa trên mã vạch ADN (DNA barcoáe) [31] Mã

vạch ADN là trình tự nucleoHide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguền gốc tổ

tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng báo thú) và vùng thay đổi theo quả trình

tiên hóa [31, 46] Ngoài ra việc lựa chọn một vùng trình tự làm mã vach ADN còn

cần phâi mang những đặc điểm sau: cô độ dài thích hợp (không quá ngắn đề có độ đa hình về trình tự giữa các taxon, không quá đải dễ có thể giải trình tự theo cách thông,

thường, thâm chí cả khi trong điều kiện chưa được tôi ưa); không phải vừng đị hợp

để

thể nhân bản trực tiếp trình bự mà không cần tách dòng, thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị tri khác biệt các base và không có đoạn trình tự chưa chắc chắn như một vài đoạn lặp mierosatellire làm giãm chật lượng trình tự [36] Dựa vào xuức độ thay dồi trong trình tự ADN này dễ đánh giá sự sai khác đi truyền giữa các

sinh vật, tương tự như máy quét mã vạch trong siêu thị [60] Liai mầu vật của hai loài

có thể có hình thái bên ngoài rất giống nhau, song chúng có thể được phân biệt bằng,

cách sử dụng mã vạch ADN Với ưu thể đó, mã vạch ADN có thể dược sử dụng cho

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

ai mục dịch chỉnh: nhận đạng về mặt phân tứ cho các loài đã dược mô tã [90] và tìm

ra các loài mới chưa được mô tả [33]

Mã vạch ADN là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu vẻ phân

loại, giám định sinh vật, gẻm câ động vật, thực vật, nằm, vi sinh vật và virus [29, 34,

50, 79] Việc xác định loài bằng mã vạch ADN có hiệu quả cao trong việc phân biệt

các loài sinh vật khi những, quan sát hình thái, sinh trưởng vá phát triển chưa đủ co

sở đề định danh hoặc phân biệt loài [15, 81]

'Việc giải mã toàn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiêu khỏ khăn, tốn kém nhiều

công sức và kinh phí nên không phải phòng thí nghiệm nảo cũng có thể thực hiện được Thay vào đó, việc xáo định một đoạn DNA đã biết, đặc trung cho loái (thậm

chi c4 thé) để làm căn cứ phân biệt cá thể này với cá thể khác, loài này với loài khác

là giải pháp hiệu quả trong phân tích, dành giá da dạng di truyền nguồn gen, xác dịnh nguồn gốc, xuất xứ của sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học Vì vậy, hướng nghiên cứu mã vạch ADN đang được phát triển mạnh mẽ và được ứng đụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cửu về đa dạng sinh vật, giảm định loài, giảm

định mẫu vật, xét nghiệm bệnh, bản quyển sản phẩm (giéng cây trồng, vật rmôi, sản

phẩm nông - lâm - thủy san, [43]

Việc sử dựng mã vạch ADN để nhận dạng các loài trên quy mô toản câu có ý ngbia ngay cảng lớn Cho đến nay, sau hơn 1Ô nữm nghiên cứu đã có trên 6000 công trinh khoa học được công bồ với khoảng 5 triệu trình tự Mã vạch ADN 6 eae loai sinh

vật theo số liệu của BOI,D [98] Đề chuẩn hỏa ở mức độ quốc lễ về việc sử dụng mã vạch ADN, công déng khoa học dã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vủng trình tự ADN lam mã vạch có thẻ phân biệt đồng thời nhiều loài [39, 54, 97]

Một mã vạch AIDN điển hình phải đáp ứng được các yêu câu sau:

Có tỉnh phổ biến cao (để đàng nhân bản và giải trình tự)

Trình bự cô tỉnh đặc hiệu cao

-_ Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [39]

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

Mỗi doạn mã vạch cỏ những dặc trưng riêng vả có khả năng, phân biệt sinh vật

ở các mức độ khác nhau: chỉ, họ, loài hay đưới loài Cáo đoạn mã vạch ADN có thể

là những đoạn năm trong hệ gen nhân (18S, 5.85, 26S, ITS )[8, 18, 19, 78], hệ gen

ty thé (Cub, COL )[8, 12, 34], bé gen lạc lạp (mafK, rbeL, trail psbA ) 136, 38,

$58, 85] Tuy nhiên, chưa có đoạn ADN náo được sử đựng lam mã vạch chưng cho tit

cả các loài sinh vật, thay vào đó cần lựa chọn những đoạn ADN đặc trưng và việc phối hợp các đoạn mã vạch ADN sẽ dem lại hiệu quả cao hơn |25, 27[ Tùy vào đối

tượng giám định mà các đoạn mã vạch ADN sẽ được sử đụng một cách hợp lý [16,

39, S1Ị

1.2.2 Một số đoạn mã vạch ADN được sử đụng

sự sai kháe trong loài, tuy nhiên phải dủ nhanh dễ có thẻ phân biệt những cá thẻ khác

loài [31, 3⁄71 Ở động vật, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thế là vửng gen có trú thể hơn

quan tam [84, 89]

Hồng Minh Trang — K23 QH2014

Cytochrome e oxidase là một họ protein xuyên mảng lớn dược tin thấy ở ty thê, là chất nhận điện tử cuối củng trong chuỗi hỗ hấp [92] Protein này bao gồm một vải tiễn đơn vị cĩ nguồn gốc từ nhân và 3 tiểu đơn vị được tổng hợp từ ty thể Các tiểu đơn vị ở ty thể dược biết đến lá các tiểu đơn vị [, 11, IHI, trong, đỏ tiểu đơn vị COI

chủ yêu được gẵn trên màng của mào ty thế [68, 89] Các nueleotide của gen mã hĩa

cho tiểu đơn vị này cĩ sự biến đổi đồ để phân biệt giữa các lồi Ngược lại, sự biến dỗi trong lồi thường thấp hơn 10% so với quan sát ở các lồi khác nhau |34| Cùng

với việc đột biên mắt đoạn hay thêm đoạn ít khi xảy ra, đoạn trình tự COI là sự lựa chọn phù hợp và được sử đụng rộng rãi để làm mã vạch ADN ở động vật ]89]

Đo cĩ sự khác biết lớn ở hệ gen ty thể giữa các lồi nên cặp mỗi được thiết kê

dẻ sử dụng nhân băn đoạn CĨ7 ở từng lồi cũng khác nhau [S6, 87] Tuy nhiễn khi

cặp mỗi được thiết kế phủ hợp với trình tự, hiệu quả sử dung gene COI dé phân biệt nhiều mẫu động vật cĩ củng tả tiên được phi nhận tốt, thậm chỉ hiệu suật sử đụng cao ngay với các mẫu đã được lưu giữ qua thời gian dài Nhiều nghiên cứu đã được thứ

nghiệm và đưa ra hiệu quả của mã vạch CƠ/ trong phân loại các nhĩm động vật đa

đạng, phân bồ trên đất hền cũng như dưới biển, từ các vùng cực đến các vũng nhiệt

đới, giúp phân biệt được khống 98% các lồi với nhau Trong phản cịn lại, nĩ xác định hẹp đến cáo cặp hoặc bộ nhỏ của các lồi cĩ mỗi quan hệ gân gũi, các lồi chỉ vữa mới tách ra hoặc cúc lồi lai thường xuyên [32, 34, 89] Õ động vật ngồi lòus gen COZ con cĩ một vài doạn trình tự khác cũng dược sử dụng làm Mã vạch ADN nhu doan Cyfh (cytochrome b}, doan gene ma héa ARN ribosome 12S, 16S Day đều là những đoạn trình tự thuộc hệ gen ty thể và cĩ mức độ sai khác lớn giữa các

lồi, từ đỏ cĩ thể cùng ven doan CO/ dem lại khả năng giảm dinh và nhận diện các

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

phân biết tốt ở các loái thực vật và nghiên cứu phát sinh loài [11, 36, 66] Hệ gen lục

lạp được phát hiện lần đầu tiên vàa năm 1962 Lượng ADN ở hệ gen lục lạp tương đổi lớn, chiếm khoảng 15% tổng lượng ADN của tế bảo Phân lớn các hệ gen ở lục

lạp lả một phân tử (ADN dạng mạch vỏng, đái khoáng 120000-170000bp với khoáng,

100 gen mã héa protein và các gen mã hóa tRNA và rRNA [20, 80] Một đặc điểm

của hệ gen lục lạp đó là có các trình tr lap dao ngược với chiều đài có thể lên lới

25000bp |45] Ngoai trừ một vài trường hợp ngoại lệ, hệ gen lục lạp thường bao gồm hai trình tự lặp đảo ngược như hai tắm gương phản chiếu lẫn nhau Hai vùng trình tự xây được ngắn nách bởi vùng trình tự đơn bản lớn và nhồ Nghiên cứu thực nghiêm

đã cho thấy tỷ lệ nueleotide thay thế ở vùng đơn bản thường cao gấp 2,3 lần so với vũng lặp lại đảo ngược, đo đó phân lớn các nghiên cứu về mã vạch AIDN thường tận

trung ở vùng trình lự dơn bản |80| Các gen thuộc cpDNA có lính bão lồn cao và có

thé được chia thanh 3 nhóm như sau: Nhóm 1 là các gen mã hóa những vếu tố thuộc

hệ thông quang hop nhu phytosystem (psa4, psaB, psb4, psbB ), cytochrome b6f

(pet, petB ), ATP synthase (afpd, atpB ), Rubisco (rbeL) va NAD(P)H dehydrogenease (nah, ndhi3 ), Nhom 2 là các gen mã hóa cho các rRNA (1ó,

rrnŠ ), ứnA (HH, tế ), NNA polymerase (rpa4, rpoB ), các gen tiêu phần

ribosome (rps2,rps3 ), va nhom 3 gồm các khung dọc mỡ ORE gọi là yợ (chưa rõ chức năng) và các gen ma héa protein nhu matK, cemd Moi doan ma vach ADN cé

những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhan Ví

dụ, các đoạn ADN như: 18S, 168, 5,68 có khã năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chỉ, các đoạn ADN, như: 268, räcL, nến, arpB oó khả năng phân biệt ở mức chỉ và loài, các đoạn ADN, như ITS, mai, cy(h, 5S spacer có khả năng phần biệt ở múc

loài và dưới loài |99] Cho đến nay đã có 7 dầu chuẩn gen lục lap dược sử dụng rộng,

rãi làm Mã vạch ADN cho thực vật, bao gém 44 đoạn trình tự mã hóa là a#K, röeL,

xpoB, rpaC1 và 3 đoạn không mũ hỏa là aipF-atpH, trnl-psb4, psbK-psbf [29, 36, 39] Ngoài các đoạn mã vạch trong hệ gen lục lạp, một doạn trinh tự khác trong hệ

gen nhân cũng được sử dụng rộng rãi làm dâu chuẩn nhận biết ở thực vật đó là đoạn

ITS, Day là đoạn trình tự cho thấy mức độ khác biệt tương dối km giữa cáo loài bên

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

cạnh các trình tự trong hệ gen lục lạp [38, 39] Mỗi doạn mã vạch đều có ưu diễm va nhược điểm riêng, do đó tùy vào từng trường hợp để có thê lựa chọn đoạn Mã vạch

ADN cho phủ hợp hoặc kết hợp nhiên đoạn mã vạch với nhau nhằm nâng cao hiệu

qua trong việc giám định và nghiên cửa phát sinh loài ở thực vật [48, 53]

Đoạn trình tự ma là một trong những đoạn trình Lự liểm năng nhất được sử

dụng làm Mã vạch ADN ở thực vật [48] Đoạn zaf có độ dài xắp xí 1570bp và mã

‘hoa cho protein matirase K Trình tự mày rằm bến trong doan intron của doan gen trnK ở lục lạp và năm trên vùng trình tự đơn bản lớn |97] Ở loài cây mô hình

Arabidopsis thaliana doan ma vach matK co 46 dai 801bp, nim ở vị trì 205-1046 của

doan gen [39] Với mức độ tiến hóa cao, đoạn ma được sử dựng đỗ xây dựng nên

kệ thống, phát sinh của những taxon bậc cao như bộ vả họ, một vài trường, hợp ở những bậc thấp hơn là chỉ và loài [97] Ưu điểm của đoạn trình ty matK 1a có khả năng phân biệt tết, tuy nhiên nhược điểm của đoạn trình tự này đó là khó khuếch đại,

đặc biệt là khi đối tượng nghiên cửu không phải là thực vat hat kin [29, 36, 39]

Để khắc phục nhược điểm trên của trình tự zna#, nhóm nghiên cửa CBOI, đã

để xuất một mã vạch cốt lõi bao gềm hai vừng trinh tự trong hệ gen lục lạp là

matK i rbcI [29] Doan tinh ty rbeZ, ma héa cho enzyme Rubisco tham gia vao qua

trình nố định carbon ở thục vật, có chiêu dài 599bp ở dầu 5” của gơn trong hé gen fue

Jap cia loai Arabidopsis thaliana [39] Wu diém oda đoạn trình tự này là đễ khuếch đại phần lớn thực vật và được biết đến như một locus chuẩn trong nghiên cửu hệ

thống phát sinh loài bởi nó dưa ra mét vị tri dang tin cy cho taxon trong eae ho hay chỉ thực vật [46] Mặc dù tiên hóa chậm vá khá năng phân biệt khiêm tồn, nhưng khi

kết hợp với đoạn trình tự maớc, bộ đổi rel ~maiK d& cho thay uu thé uh mét ma

vạch cót lõi dựa trên sự khuếch đại dơn giản của doan rbcf va kha ning phân biệt

cao của đoạn ma#E [14, 29]

Một đoạn mã vạch khác nằm trong hệ gen lục lạp được sử dụng rộng rãi ở các

loài thựo vật có hoa là đoạn trình tự không mã hóa ##1-psb4 [10, 36] Đây là đoạn

trình tự có chiều đài thay đổi ở các loài khác nhau, khoảng 286-504bp [88] Vei ưu

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

diém 1a dé dang nhân lên bằng một cặp mỗi 6 95% các loài, đoạn trình tự này cho thấy được ưu thế so với maiK khi cùng với trình tự TTS là hai vừng có khả năng phân biệt tốt nhất [46 69] Tuy nhiên, việc sử đụng đoạn mã vạch øz//-psb⁄4 như một mã vạch tiêu chuẩn gặp phải khó khăn khi đọc trình tự do thường xuyên có những đơn

nucleotide lip lại dẫn đến việc đọc bị đùng lại sớm Nhằm hạn chế nhược điểm đó, các thứ nghiệm sử dụng các enzyue polymerzse mới đá được nghiên cứu và đem lại

liệu quả đáng kế khi có thể chạy dược doạn trình tự dai 13 den nucleotide lap lai

[39]

Doan trinh tu lign gen atpi*-atp/-va psbK-psbl được đề xuất làm mã vạch cho

thục vật ở hội thảo quốc 16 Barcode of Híc lần thứ lai [S1] Cá hai đoạn đền nằm:

trong vung trinh tự dơn bán lớn của hệ gen lục lạp Hai doạn gen afpÈ' và atpH mã

“hóa cho hai tiểu đơn vị tổng hợp ATP là CFO I va CTO II, trong khi đó hai gen psbK

và psbŸ mã hóa cha hai polypeptide cé khdi lượng phân tử thập là K và I của hệ thẳng, quang hỏa 1L [49] Giống như #w#1-psb4, bai đoạn trình tự liên gen này cũng có chiều đài thay đổi giữa các loài, khoảng 579-622bp với doan atpl’-aipll va 185-576bp đốt

với pbK-psbl [S8] Hai trình tự này ước đó không được sử dụng rộng rãi trong hệ

thông học và phân loại học thực vật, do vậy không có nhiều kết quả được công bố

Theo nghiên cửu của nhóm nghiên cứu thực vật CBƠI, øsb#-ps7 cho kết quả phân

tiệt tốt, song chất lượng trình tự và tỉnh phổ biến không cao, trong khi dé alpF-aipH cho kết quả khiém tổn nhất wong việc phân biệt các loài và mức độ phổ biến cũng, như chất lượng trình tự chỉ ở ngưỡng trung bình [29, 39] Một số nghiên cứu gắn đây

đã cung cấp những kết quả khả quan cho cả hai đoạn aipF-aipH |62, 88] đối với các

loài thuộc chỉ Carafozamia cùng, một số loài trong họ 1emnaceae, và psbK-psbl déi

với các loài thuộc chỉ Dioon va Zamia (>50%) [61] Két quã này cíng được báo cáo trong các nghiên cứu về thực vật có hoa ở Hản Quốc (Ki-Toong Kim),

Hai đoạn trình tự côn lại trong số 7 đoạn trình tự lục lạp được sử dụng phố

biển là lảm mã vạch ADN là zpoÖ và rpoC1 [24, 39, 71] Hai gen này đều thuộc họ gen RPO bao gồm rpod, zpoB, rpaC1 và rpoC2, mã hỏa cho các tiêu đơn vị khác

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

nhau cúa RNA polymerase Jap thé (Cac gen trong hệ thống quang hợp của tực vat

‘ac cao déu được phiên mã bởi ít nhất hai RNA polymerase) Tuy được sử dụng tương,

đổi phổ biển như đoạn mã vạch ADN ở thực vật, song độ phân biệt loài cũa hai đoạn

gen này không cao [54] Trong nghiên cứu về loài trầm hương của Shiou Yih Lee va

cộng sự, hai đoạn trình tu này không có khả năng phân biệt giữa các loài tram [52]

Nghiên cứu của nhóm CBOI trên 397 tấu thực vật cũng đã chỉ ra được mức độ phân

biệt các loài của 7 đoạn trình tự trong hệ gen lục lạp lần lượt từ thập dến cao như sau:

rpoCl< rpoB< atpF-atpH< rbcL< maiK< psbK-psbl< traH-psbA Trong đó, đoạn

trinh fz 7poC? e6 kha nding phin biél 43% Todi, ryo lh 49%, atpF-aipHT 55%, rbel

va matk lin lượt là 61% va 66%, psbK-psbl va trnHt-psb la 68% 1a 69% [29]

Hệ gen lục lạp ngoài 7 doạn trình tự kế trên còn có một số đoạn trinh tự dũng,

được sử dụng làm mã vạch ADN ở thực vật như frnZ-rrửP, các đoạn gen của họ gen yofl [23, 39, 77, 85] Vùng liên gen mE-nF nằm trong vùng tình tự đơn bản lớn của hệ gen lục lạp ở thục vật, ngăn cách vùng exon của đoạn gen /z và exon của gen truF”, bao gồm các đoạn lặp của gen ¿rrữ" Các đoạn lặp này có chiêu dải 94-260

‘bp gay ra sự biến đỗi vẻ chiều đài đăng kế ở vùng lên gen đo sự khác nhau về số

doan copy cla gen gid [72-74] Doan intron tral duge stt dung rong rii trong hé théng học và phân loại học thực vật từ trước những năm 1990 Vùng trinh tự này nhìn chưng

tương đối để đọc, mặc đù đôi khi cáo trình tr đơn nucleotide lp Jai co thé gay ảnh thưởng, ở một số taxon [39] Ưu điểm của đoạn trình tự này là có thể dược nhân bởi một cặp mỗi vả trình tự cặp mỗi này đã được thiết kế từ khoảng hơn 15 năm trước, sau đỏ đã được sử dụng rộng rãi Đây là vùng trình Lự duy nhất nằm trong nhóm T intron ở lục lạp thực vật, cỏ nghĩa là có câu trúc bậc hai với cau vùng thay thế và báo tôn xen kế nhau Phan lớn chiều đài đoạn intren œz, dùng dé phan biệt các loài là một cấu trúc thản vòng (stem-loop) nhỏ cỏ tên P6 [85] Đoạn minibareodc rất ngắn nay đã cho thây tỉnh khá dụng cao trong nghiên cứu về DNA suy biến của các nha

sinh thái học, đồng thời giúp đánh giá sự đa đạng của các phức mẫu trong mỗi trường,

J3I

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

Nghiên cửu mới dây của Wenpan Dong và cộng sự dã cho thấy một doan gen lục lạp khác có tiêm năng rất lớn trong việc phân loại và giám định các loài thực vật

bậc cao - đoạn yợƒƒ [23, 53, 70] Là đoạn gen lớn thử 2 trong hệ gen lục lap yof? ma

khóa cho proteim có độ dài xắp xí 1800 amino acid Gen y@#7 kéo dài từ vùng trình tự

đơn bản nhỏ sang vùng lặp trong hệ gen lục lạp, tuy nhiên đoạn năm trong vùng lặp

có chiều đài lương đối ngắu (đưới 1 kh) và là vững bảo tổn Ngược lại, đoạn nằm: trong, vùng trình tự dơn bản nhỏ là đoạn có trình tự biến dỗi Sự biển dỗi này dược cho là hon doan gen maiK ở phần lớn taxon với khả năng phân biệt khoảng 75% các loài,

đo đó có thể được sử dụng để giám định cho các taxon bậc thấp Đoạn gen bao gồm

bai vùng là yeffa và yefTb, được sự doán là có mức độ da dạng nueleotide lớn nhất ớ cập độ loài trong hé gen Inc lạp ở thục vật hat kin [23]

Ngoài hệ gen lục lạp, một vùng trình tự trong nhân cũng được sử dụng phổ biển đề làm mã vạch ADN ở thực vật đó lá vùng TTS (internal transcribed spacers) từ

ving DNA ribosome [6, 30, 78] Déi với một vài loài thực vật kí sinh, đoạn trình bự

nay có thể là đoạn mã vạch có ý nghĩa đuy nhất (mặc đủ đoạn matK c6 thê vẫn còn

trong một số loài Lự dưỡng hoàn toàn) [57] Đặc điểm vượt trội của đoạn TT8 so với

các đoạn trình tự của lục lạp đó là có khả năng xây dựng hệ thông học phản tử rất tốt

Tuy nhiên, có ba lý do cơ bản dẫn đến việc đoạn ITS không phải đoạn Mã vạch ADN

(rong điểm Thứ nhái, sự tiến hóa chưa hoàn toàn có thể đẫn đến sự phân chúa ra cáo

‘ban sao paralog trong mét cd thé |7, 9 Cac ban sao nay yéu cau xac dịnh tính thông,

nhật và cụ thể của vị trí các base đa hình (khó khăn trong trường hợp các đoạn mã vạch cao nũng và khó để tải bản trong điều kiện phòng thí nghiệm) hay thậm chí là

chúng có khả năng ngăn cản việc đọc trình tự thu được Thêm vào đó, sự biến đối

khác nhau có thế do nguyên nhân là các phương pháp khuếch đại, primer được sử

dụng hay hiệu suất PCR dẫn dến sư sai khác ngay trong loài |59| Lý do thứ hai được quan tâm đó là sự nhiểm nắm, đặc biệt trong trường hợp mẫu thực vật thu được có

ám hội sinh Việc này có thế dẫn đến khuẻch đại một hay nhiều đoạn trình tự không,

đặc hiệu khác |7 Lý đo cuối cũng, đó là mặc đừ primer nhân bản doạn IT8 đã dược

tim ra, xong việc nhân bản vả giải trình tự có thể gặp khó khăn Nghiên cứu của

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

Gonzalez va cộng sự da cho thay chi 41% trong số 285 loài cây nhiệt dời dược nghiên

cứu có khả năng nhân bản và giải trình tự đoạn mã vạch này [28, 39]

Tuy vậy, không thể phủ nhận lưiệu quả phân biệt của đoạn trình tự ITS khi nó giúp làm tăng hiệu quả phân biệt các loài từ 50-62% khu chỉ sử dụng 3 đoạn mã vạch trong Hệ gen lục lạp là röcf„ mafE, tni1-psbA lên 77-8296 khi kết hợp cùng các đoạn

xã vạch đỏ [38] Đoạn trình tự 115 ở thực vật bao gốm 3 phin ITS] 5,88 IT§2

Trên thục tế, một số nghiên cứu đã sử dịmg đoạn TT82 với trình tự ngắn han thay thé

cho trình tự IT8 Việc sử dụng doạn IT§2 do đó là sự dánh dỗi giữa việc dùng một

đoạn trình tự ngắn hơn để có thẻ đễ đàng nhân bán và giải trình tự với việc chấp nhận

sẽ có ÍL đoạn biển đối hơn [18, 39] Kết quả cho thấy tuy trình tự ngắn hơn và íL đoạn biển đối hơn, song doạn [T2 vẫn có khả năng phân biệt loài dàng kể vả lá doạn trinh

tự được sử dụng rộng rãi làm raã vạch ADN ở thực vật bên cạnh cáo đoạn trinh tự ở

hé gen luc lap [18, 19]

Trên thực tế, trong các nghiên cứu về hệ thẳng họe và phân loại học thực vật

dựa trên đâu chuẩn về mặt phân tữ, các nhà nghiên cứu thường kết hợp các đoạn mã vạch ADN với nhau để mang lại hiệu quả phân biệt cao nhất Mỗi một đoạn trình tự

lại có ưu nhược điểm khác nhau, đo vậy có thế bố sung cho các khiếm khuyết của uhan: rpoR, rpoC? va rbef, có trình lự bảo thủ, dễ đàng nhân bân và so sảnh trình hự

nhưng độ đa hình không cao, matK có khá năng phân biệt tốt nhưng lại khó để khuếch

dai, onH-psbA, alpF-alpH va psbK-psb† có tốc độ tiên hóa nhanh song lại có độ đái

thay di giữa các taxon, 179 và 1752 có khả năng phân biệt tốt song dễ gắp phải các vấn đề bên ngoài như nhiễm nắm [36] Mức độ phỏ biển (khả năng nhân bản vá

giải trình tự) của các mã vạch ADN ở đối tượng thực vậi trên cạn như sau: rpoC7 (100%), rbeL (97%), trnft-psbA (79%), rpoB/matK (65%), psbK-pabi (5096), aipF~

aipïT (19%) [36], 178 (11%) [39], khả năng nhân bản bởi một cặp môi phổ biến nhật của các đoạn rpoC1, #nH-pebA, rbcl., psbK-psbl, atpF-atpH, rpoB va matK Yan luot

la 100%, 79%, 78%, 50%, 49%, 32% va 27% [36].

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

Nhom nghiên cứu vẻ mã vạch AIDN ở thực vật đã công bó kết quả về việc sử dụng kết hợp các mã vạch trên Theo đó, việc kết hợp 2 mã vạch có thẻ đem là hiệu quê phân biệt từ khoảng 59 - 75% (kết hợp zpoB+rpaC1 đem lại hiệu quả thấp nhật

59%, psbK-psbl+rbcl, ~75%, matK +rbel -72%), sử dụng kết hợp 3 mã vạch là 6S- 16% (atpl-atpIT: rpoB | rpoC] 65%, rpoC 1 | psbK-pshl | rbcL 76%) Nhém các đoạn

xá vạch phái huy tối đa chúc răng khi kết hợp voi cac tinh tu khác bao gam rel,

psbK-psbl, matK va traH-psbA Khi sit dung két hop ea 7 doan mii vach trong hé gen Ine lap nói trên, hiệu quả phân biệt đạt 73% [29] Trong một nghiền cứu khác của Kiloong Kim và cộng sự [S1], việc kết hợp các trình tự at tatpFeatpFT+psbK-psBl mang lại hiệu quả phân biệt các loái vào khoảng 69%, trong khi dó rpoB+rpoC I ~marK 1à khoảng 61% [16] Tuy nhiên, so sánh khả năng phân biệt khi kết hợp ba doan mã vạch và hai đoạn mã vạch không có sự khác nhau nhiều, do vậy

nhỏm nghiên cửu mã vạch thực vật đã khuyên nghị nên dùng, kết hợp bai đoạn trình

tự nhằm tiết kiệm chỉ phí và giảm thiểu các rủi ro khi nhân bản vả giải trình tự [29]

1.2.3 Các yếu tổ ảnh hưởng đến khả năng phân biệt của các mã vạch AIDN thực

vật

Cáo yêu bổ sinh học có khả năng ảnh hướng đến mức độ thành công của ủng

dụng công nghệ mã vạch ADN thực vật Khả năng phân biệt và nhận điện các loài có

thê sẽ không còn chuẩn xác khủ gặp phải một trong các trường hợp sau đây:

-_ Cách biệt địa lý: khi các quản thể trong loài bị cách li sẽ tạo ra sự sai khác

trong hệ gen, hoặc ngược lại khi hai loài có quan hệ họ bàng gân nhau khi sẳng,

trong cùng một khu vực có thể xây ra hiện tượng lai giữa các loài

~_ Cáu loài mới hình thánh: rong cũng một nhóm khí mới hình thánh loài mới,

hoặc tý lệ đột biển lá rất chậm, các trinh tự mã vạch có thể chung giữa các loài

có môi quan hệ gần nhau

-_ Cáo laài đa bội: Sự hình thành các loài đa bội có thê dẫn đến trình tự mã vạch không phù hợp với những đặc điểm của laxon [26] Khi nhiều loài đi đa bội

có củng loài bỏ mẹ, chủng có thẻ có trình tự gen lục lạp giống hệt nhau

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

-_ Cáo nhóm chưa được phân loại rõ ràng: khi đó, giới hạn các loài thường rất bạn hẹp, việc nhận điện chính xác các loài sử dụng rnã vạch là không phủ hợp

do hiện tượng hồi quy trong sinh thái của các taxon, hoặc các loài xuất hiện bằng một vải phương pháp như chuyển bội thế, hình thành loài lai hoặc tiếp

hợp vô linh [39]

1.2.4 ng dụng của mã vạch ADN

1.2.4.1 Ung dung chung của mã vạch ADN

TỨng dụng của mã vạch ADN không chỉ đùng lại ở việc nhận điện nhanh các xuẫu mà còn mỡ rộng nghiên cửu sắp xếp theo rhón những loài côn mơ hệ hoặc phức tạp rong, hệ sinh thải, mã vạch ADN phát huy tỉnh hữu dung trong việc tìm môi

quan hệ giữa các mẫu vật dủ chúng có thể không giống nhau về mặt hình thái Ngoài

ra, trong đời sống, mã vạch ADN cũng hỗ trợ xác định nguồn gốc của sinh vật sống,

“hoặc hảng nhập khâu do tính chất nhận dang được cả với lượng mẫu nhỏ, bị biển dang

113] Các ứng dựng nói bật có thể kế đến của mã vạch ADN là kiếm soát các tác nhân

ba

gay hai trong néng nghiép, nhận điện cáo lác nhân gây bệnh, bảo lồn nguồn tải nguyên

thiên nhiên, bảo vệ các loài nguy cấp, quản lý chất lượng mrước, xác định các sản phẩm

tất che sức khỏe từ tự nhiên, nhận biết các cây được liệu [43]

Việt Nam là một trong số các quốc gia có tỉnh đa dạng sinh học rất oao với

Trhiều loài nguồn thực vật, đông vật, nắm có giá tị kinh tế kém Việc quản lý khai thác nguồn gen quý hiểm này dã dược Chính phú quan tâm từ những năm 2010 thông qua việc hình thành Quỹ gene cấp Quốc gia để định bướng, nghiên củu, khai thác, ứng

dung và bão tổn các nguồn gen sinh vật quý hiểm Việc ứng dụng mã vạch ADN dễ nhận dạng các mẫu sinh vật trước khi tiến hành các công tac nghiền cứu sấu hơn là

điều kiện tiên quyết dé dam bao tính chuận mục và thành công của các nghiên cứu

khai thác bảo tên nguồn gen [1]

1.2.4.2 Ứng dụng của mã vạch AIDN thực vật

Ngày nay, nghiên cửu về mã vạch ADN ö thực vật thực chất là nghiên cứu sơ

sánh sự khác biệt của các đoạn trình tụ, từ đó ứng đụng ra thực tiễn với các mục đích.

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

khảo nhau Những ứng dụng này có thể chia ra làm hai hướng chính Thử nhất, cung, cấp cái nhìn sâu hơn về phân loại học ở cấp độ loài và đóng góp vào tiền trinh phân

định rõ đặc điểm và ranh giới các loài Ứng dụng thứ hai, cứng là ứng đụng chính, đó

là hề trợ quả trinh nhận điện các mẫu vật chưa biết vào các loài đã biết hoặc xác định

loài mới [39]

Mã vạch AIDN ở thực vật cung cấp cái nhìn sâu vào phần loại học ở cấp độ loài đối với những nhóm có hành thải đơn giân, nhóm có phân bồ rộng, nhóm có kích

thước nhỏ hoặc những nhóm đã dược phân loại nhưng không dây đủ, chưa tương

xứng với đặc điểm đa dạng của chúng (vi dụ như trong trường hợp phân loại dựa trên

Tinh Outi học gặp khỏ khăn hoặc chưa được phân loại triệt để) Một nhỏ thực vậi diễn hình dược nghiên cửu với mục đích này dó là ngành rẻa nhóm không phân hóa

thiểu về đặc điểm hinh thai [55, 58] Ma

tìm hiểu giới hạn loài cho nhóm thực vật có hạt, thông qua việc đáng góp tìm ra các

vạch ADN cũng được sử dụng rộng rãi nhằm

loài ấn danh hoặc làm căn cứ đẻ phân biệt các nhỏm loái đã biết [39]

Có rải nhiền ngành nghệ liên quan đến mã vạch ADN hiện nay, bao gồm nhận

dang va ứng dụng nhận đạng các loài thực vật như phân loại học, sinh thái học, bảo

tổn thiên nhiên, nông lâm nghiệp, khoa học pháp y, kiểm dịch [37] Khi sử dựng

Tnã vạch AIDN dễ nhận dạng các loài thục vậi, cần thiết phải nắm vững kỹ thuật nảy

‘Trong nhiều trường hợp, các mã vạch ADN thu được cho kết quả nhận dang của một

nhóm loài thay vì mội loài Tuy nhiên, với mội số ứng dụng, thậm chỉ ngay cô khi mã

vạch ADN có khả năng phân biệt khiêm tên nhất cũng có thể hữu ích (đối với các trường hợp nghiên cứu tập trung vào khác biệt địa lý, phân biệt loài mục tiểu với các

loài khác lrong thương mại hay thu hẹp giới hạm nhận dạng các loài hoàn loan xa la)

1391,

1.2.5 Một số nghiên cứu về mã vạch ADN ở các loài Trà

Cho đến nay trên thể giới đã có nhiều công trinh nghiên cứu về các loài thuộc

chỉ Trả, chia thành nhiều hưởng nghiên cứu khác nhau nhu tìm kiểm và phân loại các

loài trả đựa trên đặc điểm hình thái, nghiền cứu phân tích thành phẩu hợp chất trong

22

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

lá và hoa trả, nghiên cửa nhân giống và bảo tôn các loài trà và phân tich cơ sở dữ liệu 'tphân tử phục vụ cho phân loại và giám định Trong số đỏ, các công trình nghiên cứu

về dì truyền phân tử nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học Một vải công trình nghiên cứu tiêu biểu có thể kê đến như nghiên cứu của Singh và cộng sự

sử dụng kỹ thuật lai Southern, phân biệt loài trà Camefiia sinensis ở Trung Quốc với

cùng loài này ở Ân Độ và Campuchia đựa trên sự biến đổi của doan lap 58 TNA

I81|, nghiên cứu của Yanglơng và cộng sự với đoạn mã vạch 1TS trên đối tượng 11

mẫu trả nghiên cửu

Một vải nghiên cửu gân đây với sự trợ giúp của các công cụ tin sinh đã thu được những kết quả đảng kế trong việc nghiên cửu các đâu chuận phân tử ở chỉ Trà Điển

hình là nghiên cửu của Yang và cộng sự [94] đã xây đựng dược mỏ hình hoàn chính

hệ gen lạc lạp ở bảy loài trả (hình I1), rong đó đề xuất 11 vũng trình tự lục lap tiém năng để phân tích môi quan hệ di truyền cho các loái tra bao gdm: aecD-psal, atpF-

aipHl, ccs4-nsll2, clnP-psbb, ndhC-trnl', nđhÈ-rpl32, pel2-rpo/l, psbHH-petl, rp|32-

trai, trnG intron, nS-tnG Kết qua nghiên cứu của Iluang và cộng sự trên đổi tượng 13 loài trà cũng đã đề xuất 15 trình tự thích hợp để nghiên cửu đi truyền phân

tử đối với các loài chỉ Cameilia, bỗ sung thêm các trình tự pshK-psbl, trall-psbd,

taiT-triT, truS-psb2, pabA-vef3, traP-psaJ, ydf15-tnlL, so với nghiên cứu trước đây

của Yang và công sự [40] Kết quả nghiên cúu của cã Ti công trình này đều cho thay các vùng trình tự thích hợp dễ phân tích dị truyền phan tử chủ yếu năm ở vùng trinh

tụ không mã hóa và vùng gen đơn bản (Single copy region) của hệ gen lục lạp các

loài trả

Việt Nam là quốc gia đứng thứ hai trên thế giới về số lượng các loài ira hoa

vàng (sau Trung Quốc) cùng với da dạng chỉ Trẻ phong phú, các công trinh nghiên

cửu vẻ trả hoa vàng nói riêng và chỉ trà nói chung tương đổi nhiều nhưng tập trưng chủ yếu theo hướng phát hiện loài mới và nhãn giống bão tên các loài trả quý hiếm này Một vài công trình nghiên cửu về mã vạch AIDN trên đổi tượng trà hoa vàng có

thê kể đến như nhân bản đoạn gen 5,85 rRNA ở Jodi trả vàng Petelo (Camellia

Hoàng Minh Trang - K23 QH2014

Petelotii) của tác giả Nguyễn Thị Nga vả công sự (2003) [4], nhân ban doan matK loài trà vàng Tam đảo của tác giả Hả Văn Huân và cộng sự [2] Tuy nhiên những

công trình nghiên cửu nảy chưa mạng lại nhiều kết quả trong việc xây dung co sé dit liệu di truyền cho các loài trả hoa vang, can có những nghiên cứu sâu vả rộng hơn, làm tiên đẻ cho việc giảm định các loài trả hoa vàng dựa trên phương pháp phần tử

Camellia chioroplast genome 156,576 - 156,975 bp

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

Chương 2 VẶT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vậtliệu nghiền cứu

21.1

2.1.1

2.12

BR lượng nghiên cứu

Camelia crassiphylla Ninh ct Hakoda (Trả vàng lá day)

Camellia hakodae Ninh (Tra vang hakoda)

Camellia petelotii (Merv.) Sealy (Tra vans petelo)

Camellia tamdaoensis Uakoda et Ninh (Trà vàng tam đào)

Camellia tienti Ninh, Tr (IIần đường vàng)

2 Métsé doạn mã vạch dược xác định cho các loài 1rả họa vàng

Nội dung nghiên cứu

Bao gêm các nội dung chính sau đây:

Tach chiết ADN tổng số từ mẫu lá cáo loại trả hoa vàng 6 VQG Tam Daa thu

được, 3 mẫu/loái x 5 loài

Nhân bản các đoạn mã vạch AT quan tâm bằng phương pháp PCR

Thân tích và xác định trình bự eac doan mii vach ADN thú dược

Xác định mỗi quan hệ di truyền giữa các loài trà hoa vàng nghiên cứu và với các loài khác trong chủ tra Camellia duta trên các trình tự thu được

Xác định doạn mã vạch đặc trưng cho các loài trả hoa vàng ở VQG Tam Dao.

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

2.2 Phương nhấp nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ mên Công nghệ Gen va

Ti truyền phân tử - Viện CNSH Tâm nghiệp, Trường Đại họu Lâm nghiệp, sử dụng,

các máy móc, thiết bị chuyên môn đạt tiêu chuẩn Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

được lẫy từ nguôn để tài nghiên cứu khoa học cp Nhà nước “Xây đựng cơ sở đứ liệu

mã vạch ADN (DNA barcode) cho một số loài cây lâm nghiệp gỗ lớn, làm sẵn ngoải

Bỗ có giá trị kinh tế” bao gồm bộ KIT tách chiết ADN thực vật “Plant/Fungi DNA

Taolation KIT” - Norgen, Canada; hóa chal, PCR: Master mix 2X, nude PCR, mdi

nhân gen, bộ KIT tinh sach sin phim PCR “PCR Purification KIT” Norgen,

Canada, ha chat dién di: Agarose; dém ‘TAL!, Redsafe solution, Dung cu va thiét bi thí nghiệm bao gầm găng lay, khẩu trang, pipetlc các loại, cối chày sử Máy móc

sử dụng gồm có máy PCR, cân phân tích, máy ly tâm, máy do nano drop, tủ lạnh -

80°, bộ điện đi, máy chụp ảnh bản gøÌ

Méi được sử dụng đề nhân các đoạn trình tự được thiết kế đựa trên các tải liệu

Hồng Minh Trang — K23 QH2014

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thu mẫu lựa chọn mẫu l4 bánh tẻ khơng bị sâu bệnh nắm mốc, lẫy 3 mẫu/lội

% 5 lồi từ các cá thế độc lập Sau khi thu, mẫu được bảo quản trong ti niÌon cĩ chứa hat silica gel hut dm, ghi diy đủ thơng tin mẫu và được giữ & -80°C để tách chiết

ADN phục vụ nghiên cứu Phương pháp tách chiết ADN tếng số từ các mẫn lá của 5

lồi Hải đường vang (Camellia tien Ninh), Trà vàng Hakoda (Camellia hakoda Ninh, Tr), Trả vàng lá dày (Camellia erassiphylla Ninh et Hakoda), Trà vàng Tam Dao (Camellia tamdaoesis Hakoda et Ninh), Tra vang Petelo (Camellia petelotii (Mem-) Sealy) theo hướng dẫn của KíL (Plan/Fungi DNA Taolalion Ki) Xác định

nơng độ và dộ tình sạch của dung dịch ADN tổng số bằng máy do nano drop Nhân

‘ban doan gen matK, rbel., irnH-psba, ITS2 va vdfTb từ các mẫu ADN tổng số tách

chiết dược bằng kỹ thuật PCR trên máy PCR 9700 Themmal Cyekr Applicd

Biosystems (Mỹ), mỗi phản ứng PCR được thực hiện trong tổng thể tích 20 ul, bao

gềm: II2O deion (7 pl), 2x PCR Master mix Solution (10 nƯ), 10 pmol/ HÌ mỗi xuơi (1,0 wl), 10 pmol pl méi nguge (1,0 pl) và 50 ngJụ ADN khuơn (1g Chương, trinh phan img PCR: 94°C trong 3 phut; (94°C: 30 giây, 55°C : 30 giây, 72°C : 1 phút)

lặp lại 40 chu kỳ; 72°C trong 5 phút, bảo quản sản phâm PCR ở 4°C Nhiệt độ gắn mỗi các phần ime khac nhau phụ thuộc vả cặp mỗi sử dụng Mỗi phan img PCR lập

lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 1,0 %, quan sát kết quả đưới đẻn cực tim (UV) va chụp ãnh bằng hê thống

Dolphin - Doc Image system cila hing Weallec (My) San phd PCR duoc tinh sach

theo hướng dẫn của kit tỉnh sạch sản phẩm PCR (PCR Purification Kit) của Norgen,

Canada Sau khi lĩnh sạch sân phẩm PCR được gũi cho phịng thí nghiệm si Base 6

Malaysia dễ giải trình tự Trình tự nuelcotide của doan ADN được xác dịnh tại bằng,

xnáy giải trình tự, sử dung bé Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Trinh

fur muzleotide eda doan ADIN duoc phân ich bing cac phan mém chuyén dung nh

_DNAClub, Bioedit, Mesa6, Trình ty nucleotide cũa các doạn mã vạch ADN sau khí phân tích được đăng ký trong ngàn hàng cơ sở dữ liệu ADN của Việt Nam (www.dnabank vu)

bà >

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

00:30

1 <———_ 40 chm ew ———+

Fink 2.1 Chu trinh nhiét nhan ban doan mi vach ADN

(*): nhiệt dộ gắn môi phụ thuộc vào cặp môi sử dụng, cụ thể

matk — 5?°C, rbeL — 52%C; trml1-psbA — S0°C, vefIb — 485, 1TS2 — 50°C

Trình tự ADN sau khi được giải trình tự sẽ dược so sánh và sắp xếp thẳng hàng

sử đụng thuật toán MUSCLUB [100] Kết quả sắp xếp thắng hang sẽ được sử đụng sau

đó để tính khoảng cách đi truyền, sử dung phan mém MEGA6 trén cơ sở phương

pháp tính Kimura 2-parameter |44|, xây dựng cây phản loại theo phương pháp Maximum Likebhood trong MEG A6 Cây phân loại xây dựng theo mồ hình Kimura

2-parameder, gia tri bootstrap 1000, tất cả các vị trì bao gồm cáo gap và dữ Nêu trắng déu dược sử dụng dẻ phân tích

Hoàng Minh Trang - K23 QH2014

Chuong 3 KET QUA - THAO LU!

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số các mẫu trả hoa vàng

Mau sau khi duoc thu thập sẽ được lưu trữ ở -80°C trong phòng thi nghiệm va

được sử dụng đề tiền hành tách chiết ADN tổng số

Bảng 3.1 Mẫu vật nghiên cứu

Camellia tamdaoensis Hakoda et

4 | Trả vàng tam đảo Ninh

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

Kết quả diện di ADN tổng số các mẫu trả hoa vàng cho thay các băng ADN tổng số tương đồ sắc nét, sáng rõ chứng tỏ ADN tổng số thu được khá nguyên vẹn,

it dint gay

Bang 3.2 Nông độ và độ tỉnh sạch của các mẫu ADN tong sé (pha loang 10 Lin}

Tiên hành pha loãng 10 lần ADN tổng số thu được và do néng độ cũng như

độ tĩnh sạch cho kết quả như bang 3.2 Kết quả lu được cho thay ADM ting sé thu được với hàm lượng tương déi lon, dé tinh sach kha cao, phủ hợp dễ sử dụng cho

phan img PCR ở bước sau

3.2 Kết quá PCR các doạn mã vạch ADN

Từ L5 mẫu ADN tổng số đã tách được ( 5 loài x 3 mẫu/1 loài), sử dụng cặp

mỗi đặc hiệu cho từng doan dễ tiên hành PCR nhân bản các đoạn ADN Mẫu ADN

tổng sẽ được pha loãng 10 lần Chu trình nhiệt vả trinh tự các cặp mỗi sứ dụng như

đã miêu tả ở mục 2.2.2 Kết quả PCR được kiếm tra bằng cách điện di trên gel Agarose

19 và được chụp lại bằng máy chụp ảnh gól, thu được như sau:

Morcer TAQ1 THRTASS TAOT TSE? TSY TOLL TIC 7901 Tội [ T912 T613 T92 T2 TẾT Gà CD

Hoàng Minh Trang — K23 QH2014

Welir T88 1 T882 T484 T99 {TA92 T391 T601 T902 T901 7911 T3 2 T913 T921 T912 T993 đi