Luận văn tối Ưu hóa các Điều kiện Định lượng một số anthocyanidin trong rau củ quả bằng phương pháp sắc kí

Hién nay, trén thé gidi cac nghién ovu dinh hzqug anthocyanidin dang, dược quan tâm bởi các công trình công bố trước đây thường chỉ đừng lại ở tìm điều kiện tối ưu dễ chiết anthocvanin

ĐẠI HỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CHU TI THANH

TO] UU HOA CAC DIEU KIỆN ĐỊNH LƯỢNG MỘT SÓ

ANTHOCYANIDIN TRONG RAU CU QUA BANG PHUONG

PITAP SAC Ki

LUẬN VĂN THAC Si KHOA HOC

1à Nội — 2017

ĐẠI LIỌC QUỐC GIÁ HÀ NỘI

TRƯỞNG ĐẠI HỌC KHGA HỌC TỰ NHIÊN

CHU THỊ THANH

TOLUU HOA CAC DIEU KLEN ĐỊNH LƯỢNG MỘT SÓ

ANTHOCYANIDIN TRONG RAUL CU QUA BANG

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ

Chuyên ngành: Hóa học phâu tích

Mã sẽ: 604110118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyén Xuan ‘Trung

Ha Nội - 2017

- LỜI CẢM ƠN - -

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy PGS.LS Nguyễn Xuân Trưng đã tận tình hướng din, giao dé tai, dang gdp những ý kiến quý báu, tạo mọi điều kiên giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện để tài

lim xin gửi lời cảm on chân thành tới Thị, Vũ Thị Trang, người đã trực tiếp hướng đẫn, chỉ bảo và động viên em trong suốt quá trình lảm để tài và sảm ơn các anh chi dang lam việc, nghiên cửu tại Khoa chất lượng phụ gia và hỗ trợ chế biển thực phẩm, Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia

Em xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện kiếm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia tạo mới điều kiện cho em dược Huze hiện dễ tài tại dây

tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng day tại khoa IToá học,

Tim xin bày

đặc biệt là cáu thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích đã cho em những kiến thức quý

gid, tao diều kiện chơ em được học tập và nghiên cửu trong môi trường hiện dại

Em xin trân trọng cảm ơn ban Giám Đắc, Ban chủ nhiệm khoa Môi Trường,

Bộ môn Hóa Học, Học việu Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho cú: được học tập để nâng cao trình dộ

Cuédi cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,

chia sé mot kho khan cimg em

Tà Nội, ngàp tháng nấm 2017

Táo giả luận văn

Chu Thi Thanh

1.1 Tổng quan vé anthocyanin va anthocyani

1.1.1 Gidi thigu vé anthocyanin

1.2.1 Phương pháp điện di mao quắn kereireeef

1.2.2 Phương pháp phỏ hấp thụ phân tử UV - VIS

3.4 Đánh giá kết quả phương pháp phân tích

3.1 Khảo sắt các diều kiện tách và xác dịnh anthocyanidin trên HPLC 30

3.1.4 Khảo sát chương trình gradient - - 33

3.1.5 Khảo sát nồng độ axit trong pha động - 36

3.2 Tối ưu húa quy trình xữ lý mẫu theo nhương phản mặt mục tiêu 38

3.2.2 Khảo sắt đồng thời các yêu tổ theo phương pháp RSM - 40

3.2.4 Kết luận về điều kiện Lỗi uu dé định lượng anthecyanidin 56

3.3.1 Đánh giá độ dặc hiệu chọn lọc của phương pháp 58 3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tỉnh lập đường chuẩn a 60 3.3.3 Giới bạn phát] hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của stan

3.3.4 D6 lip lại của "phương hip "” Ð

Bang 3 5 Dộ phân giải và hệ sẽ đối xứng p pic 34 Bang 3 6 Anh hướng tốc độ dòng dén diện tích pc vá độ phân giải các

Bảng 3 12 Bảng sai số giữa kết quả thực nghiệm vá kết quả theo mồ hình 45

Bang 3.13 Hàm lượng anthocyanidim trong đổ đen tại điểu kiên tối ưu 48

Bing 3 14 Bang phan tích phương sai eyanidin sau khu bỏ yêu tb không có nghĩn50

Bing 3 15 Sai số giữa kết quả thực nghiệm và mô hình hàm lượng cyanidin $1

Bằng 3 17 Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính của các scan 60 Bang 3, 18 Gidi han phat hién va gidt han dinh lugng cde anthocyanin 60

Bảng 3 22 Độ lập lại malvidin ò persevere 62

Bảng 3 24 Độ lập lại gyanidin ceeeeeeeirrrrerreeeoooo.8

ĐANH MỤC HÌNH

Hình 1.3 Câu trúc hóa học của 6 anthoeyanidin 5 Hình 1.4 Sự thay đổi câu trúc hóa học của anthacyaniđin theo pH - 7

Tlinh 2.1 Sơ đổ xương cá tính độ không đăm bảo đo - - 28

Hình 3 1 Phd hap thy phan wt cia 6 anthooyanidin „u31 Hùnh 3 2 hua hỗn hợp 6 antiocyamidin Mist dung gradient 1 32 Hinh 3.3 hudn hén hop 6 anthocyanidin khi sit dung gradient 2 33 Hình 3 4 ô chuẩn hỗn hợp 6 anthoeyanidim khi sử đụng gradicnl 3 34 Hình 3 5 Sắc đỏ chuẩn hỗn hợp 6 anthoeyaniđin khi sit dung gradient 4 35 Hình 3 6 Ảnh hướng của nêng độ axit TEA đến tống diện tích pic anthoeyanidin36

Tlinh 3 7 Sắc đỗ chuẩn hỗn hop 6 anthocyanidin téc độ đòng 1 ml/phút 38

Hinh 3 8 Ảnh hướng khỏi lượng cân đến hàm lượng anthocyanidin 39

Linh 3 9 Mize độ ánh hướng các nhân tổ khão sat dén ham lượng anthoeyanidin 43

-Hinh 3 10 Tương quan giữa tliực nghiệm và mồ hình của làm lượng,

Hinh 3 dD Hith 3 60

ĐANH MỤC BANG VIET TAT

"Tên tiếng Anh

Axetonitrile

Assoviation of Official Analytical Community

Centre composite design

Cappillary clectrophoresis

CetyHrimethylammonium

bromide

Cyanidin Cappillary zone cloetrophoresis Delphinidin

Iligh-performance liquid chromatography

Ligh-Performance Liquid

Chromatography with

Ubraviolet -visible

Iligh-Performance Liquid

Chromatography with Photo

Diode Array detecter Liquid chromatography—mass

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ki lỏng, hiệu năng với detector tit ngoai — Kha

kiến

Sắc ký lông hiệu năng cao

với detector diod quang

Sắc ký lỏng ghép nồi khối

phố

Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng,

Malvidin

Petunidin

Độ lệch chuẩn tương, dói Thương pháp mắt mục tiêu

Độ lệch chuẩn Natri dodexyl sunphat

Axit Trifluoroaxetic

Sac ky long siêu hiệu năng

Phương pháp phố hấp thụ phân tử

ĐẶT VẤN ĐỂ Anthocyanin 1a mét ho chất màu tự nhiên thuộc nhóm flavonoid có hoạt tính chồng oxy hóa mạnh Anthocyanin có màu đỏ, xanh, tim chứa trong rau, cũ, quả, hoa

và là của thực vật bậc cao Anthocyanin được tìm thấy trong tự nhiên ở dạng aglyeon (anthocyanidin) liên kết với gốc đường (glycoside) [19] Dễ xác định chính xác từng, anthocyatrin gặp rất nhiêu khó khăn vì thiếu chất chuẩn do có trên 600 anthocyanin khác nhau dã được phát hiện, trong khi đỏ chỉ có 6 anthocyanidin phố biến |9| Do vậy, để đình lượng chính xác các anthocyanin cân phải có tác nhân cắt mạch gốc duémg chuyén tir dang anthocyanin thanh anthoeyanidin

Hién nay, trén thé gidi cac nghién ovu dinh hzqug anthocyanidin dang, dược

quan tâm bởi các công trình công bố trước đây thường chỉ đừng lại ở tìm điều kiện tối ưu dễ chiết anthocvanin ra khỏi mẫu, khủ tách các anlhocyarin trên sắc kí gặp nhiều khó khăn, cản thời gian phân tích dải và cũng, chí giới hạn trong việc định lượng,

mét sé anthocyanin phé biến Số lượng công trinh xáo định anthocyanidin rất hạn

chế, do quá trình thủy phân cất mạch góc đường, có nhiều yêu tổ ảnh hưởng, và cân tim được điều kiện tối ưu quả trình thủy phân để sự chuyển hóa hoan toan từ anthocyanin thành anthocyanidin mà khâng bị phân hủy Để tôi tru điểu kiện thủy phan các nghiền cứu thưởng khảo sát ảnh lưỡng dồng thời các yếu tổ ánh hướng dễn

*khả năng chiết cho hiệu quả cao[25][28]

Ở Việt Nam, các công trình đã công bỏ chủ yêu xác định anthocyanin dang tổng số bằng phương pháp UV-VIS |2| |3 Xác định anthocyanidin bằng phương

'pháp sắc ki còn hạn chế, các nghiên cứu tìm điêu kiện tối ưu cho quá trình thủy phân được tiến hành theo hướng đơn biến [6].[4] Với mục tiêu nghiên cứu của để lài là

tách và xác định đồng thời 6 anthocyanidin trong mẫu rau củ quả Việt Nam, chúng

tôi thục hiện đề tài: “Tối ưu hóa các điều kiện định lượng một số anthocyanidin irong

rau cũ quả bằng phương pháp sắc kệ” vũi nội dụng nghiền cứu như sau

- Khiio sát các yếu tố ảnh hưởng dên quả trình tách và xác dịnh các anthocyanidin trên TIPLC.

Tết ưu hỏa điều kiện thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin theo

phương pháp mặt mục tiêu

Ung dung quy trình đề định hượng các anthocyanidin trong mẫu ran cti qua tại Việt Nam.

CHƯƠNG 1- TỎNG QUAN 1.1 Tổng quan về anthocyanin va anthocyanidin

1.1.1 Giới thiệu về anthocyanin

Anthocyanin thuéc nhém chat mau tự nhiên tồn tại trong thực vật bậc cao

Anthocyanin được sử dụng làm chat màu tự nhiên trong thực phẩm tao mau sac dep

mắt đồng thời chứa nhiều giả trị quý do có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chồng oxy hóa mạnh giúp ngăn chặn và tiêu diệt các gốc tự do, giúp con người ngăn chặn

các bệnh lý về thản kinh, tìm mạch, tiểu đường và đây lủi sự phát triển của tế bảo ung

tha [9],{23]

Trong tự nhiên, anthoeyanin cỏ trong thực vật nhằm tạo những mau sae dic

trưng từ màu đồ, hồng, xanh, tím, cam, đen Do vậy, con người có thể chiết các chất

mảu từ thực vật để nhuộm mảu cho thực phẩm rất an toản và cỏ giá trị dinh dưỡng,

cao

Anthoeyanin là những glyeosides do gốc đường glucose, galactose, rutinose

kết hợp với gốc aglycon có màu (anthocyanidin) Các anthoeyanin khi mất hết nhóm

đường được gọi lả anthoeyanidin hay aglyeon Mỗi anthoeyanidin có thể bị glycosyl

hóa acylat bởi các loại đường và các axit khác tại các vị trí khác nhau Do đỏ, số

lượng anthocyanin lớn hơn từ 15-20 lân so với anthocyanidim Cầu trúc cơ bản của anthocyanin duge m6 ta 6 hinh 1.1 Các góc đường cỏ thẻ gắn vao các vị trí 3,5,7 trong đó chủ yếu là vị trí 3 hoặc 5, vị trí 7 rất ít Sự đa dạng của anthocyanin 1a do su

gắn các nhóm H, OH, OCH; vả các nhóm đường vảo các vị trí khác nhau

Hình 1 1 Cầu trúc cơ bản của anthoeyanin

1.1.2 Câu trúc hóa học của anthocyanidlin

Anthocyaniđins (aglyoons) có dang cau tric co ban cia anthocyanin, cau tric thỏa học chứa vòng thơm A liên kết với đị vòng C chứa oxy và được liên kết bởi liên kết cacbon _ cacbon với vòng thơm B [21] Anthocyanidin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid có khả năng tan trong đưng môi phản cực rỉhw nước, rnetanol, sthanol là dạng hợp chất polyhidroxyÏ và polymethoxy của 2 - pheny]benzopyrylium hoặc muối flavylran |19|

Tiện nay, có khoảng 17 anthocyanidin khác nhau đã được xác định nhưng chỉ

có 6 anthooyanidin phổ biến trong tự nhiên là cyanidin (Cya), delphinidin (Del), xmalvidin (Mal), petunidin (Petu), pelarsomidin (Pelar) và peonidim (Peo) Trong, tự thiên, các anthocyanidin thường liên kết với các gốc đường khác nhau như glueose (Glu), galactose (Gal), arabinose (Ara), rulinose (Rul), rhanmose (Rhum), xylose (Xyl) dudi dang mono -, di - hode tri - glycoside [29] tao thanl 600 anthocyanin Dạng liên kết với gồc đường phd biến nhất là 3 - monoside, 3 - bioside, 3,5 - điglucoside và 3,5 - địg lucoside, Dân xuất 3 - giueoside thường lớn hơn 2,5 lần dạng, diplucoside, trong đó phổ biến nhất là cyanin - 3 - glucoside [9]

Câu trúc cơ bản của anthocvanidin được mồ tả trong hình 1.2 Sự khác nhau của các anthocyanidin do sy thay đổi nhỏm H, OH va OCHs gan vào vị trí Rì, Ra trong véng thom B

rau, cú và quả của cyanidm chiếm 50%, delphinidin 12%, pelargonidin 12%,

petunidin 7%, peonidin 12% va malvidin 7% [19]

Cac anthocyanidin tén tai dui dang cation flavylium có cấu trúc được mô tâ

Cease?

CÔ

Malvidin 3,5,7,4 tetrahydroxy 3

sfierathency Mlawy lures

4313HasCbrt Hình 1.3 Cau tric hoa hoc eta 6 anthocyanidin

1.1.3 Tính chất của anthucyanidin

Anthocyanidin la hop chất cỏ cầu trúc phần cực nên có khả năng fan tốt trong,

các đụng mồi phân cực như rnrớc, metanol, etanol, không tan trong các đìmg mỗi

không phân cực Dung mỗi chiết antầocyanidin được sử dụng phổ biển lá metanol

"hoặc etanol và đề tăng tính bên màu của anthocyanidin, người ta thường bỏ sung một

vào dụng mỗi chiết |25| Do đỏ, hệ dung môi chiết thường ding 1A CHsOH HCI, CzH;OH - HCL Nhóm nghiên cứu Steven W Lloyd và công sự [20] đã so sánh khả

wing chiết mthoeyarin bằng hồn hợp hệ dụng môi của motanol được thêm các axil axetic, axit focmic, axit chlorhydric, axit photphoric cho thay khi chiét bang dung môi CH:OH - TC có hiệu suất cao nhất

Tại Việt Nam, tác giả Nguyễn Thị Lan {3| cùng cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng và độ màu cúa anthocyanin Các dung môi nghiên cứu gồm metanol - nước - TIC] (t lệ 1: 1,1% TIC, etanol - nước - ICI (tỉ lệ 1:1,1% HCU, nước - axit clorhydrie (1%), nude - axit foomic (5%), nude - axit axctic (59) trên đốt tượng mẫu qué dau 116i An thi hé dung méi etanol - nude - LICL cho hàm lượng tng anthocyanin 1.046%, véi dung méi chiết metanol - nước - HCI là 0,949%, Khả năng chiết bằng dung môi etanol - HCl vả metanol - HƠI cho hiệu quả

chiết là cao nhất

Mâu sắc của anthocyanidin thay đổi phụ thuộc vào pH môi trường, nhiệt độ, câu trúc hỏa học, nẵng độ, dưng rồi Trong dõ cấu trúc hỏn học bị thay dỗi mạnh

khi thay đối pII dẫn tới sự thay đối màu của anthocyanidin

Tại môi trường pH thập khoảng pH — 3 anthocyanimdin tồn lại dưới dang cation flavylium có mau dé hoặc cam đậm Khi tăng pH cơ chế cạnh tranh xây ra giữa phản ứng hydrat hóa của cation flavylium vả phản ứng chuyển địch proton trang nhóm hydroxyl, do đó phân ứng lao carbinol gia lam mat mau eda anthovyanindin tsi

pH = 4- 5 Sau đó, phần ứng làm chuyển về dạng quinon co miu tim tại pH = 6 - 7

va dang cộng hưởng anion quinon có mau xanh tai plI = 7 - 8 Sự thay đổi màu sắc của anthocyanidin theo pH được thể hiện như bình 1.3

Tình 1.4 Sự thay đổi cầu trúc hóa học của anthocyanidin theo pIT

“Theo nghiên cứu A Castaneta — Ovando và công; sự [9] khi thay đổi các dụng, dich (axctonitril : nuée, ctanol, propilen - glycol, dioxane va 2 - butanone) mau ty

nhién cia anthocyanindin bi thay đổi phụ thuộc vào néng dé dang mudi flavylium

Trong dụng môi phân cục có mẫu đỗ nhưng trong đụng môi íL phân cực tổn tại đựng, mâu váng là do sự mono hỏa hoặc dine hỏa Do đó, khi nông d6 mudi tang mau dé

là mâu nỗi bật Trạng thái bên của anthocyanidin bị ảnh hưởng bởi sự xuât hiện thêm các nhóm ƠH hoặc OCH: gắn vào vòng thơm làm giảm tỉnh bên của aglycon trưng,

„môi tường trung hỏa, vị thế Pelareonidin lá anthocyanindm bền nhất ví chỉ có † nhỏm OIL Ngược lại, dạng anthocyanin có gắn các gốc đường monoglycoside và diglycoside la nbimg dẫn xuất bón trong diễu kiện trung tính Ngoài ra, nrức dộ mety] hóa các nhóm _ ƠLI của vỏng benzen cảng cao thì màu cảng đỏ

Do kha năng phản ứng mạnh và để bị phân hủy, nên đề bảo vệ độ bên màn và

tỉnh chất của antsoeyanidin, chúng phải được bão quản lạnh ở nhuệt độ 2 - 4°C va tránh ánh sảng, Sự phân húy và mắt máu tăng nhanh khi đun nóng ở nhiệt độ cao 65

- 90°C trong vai giờ làm giảm 50% cường độ mâu [35]

Cáo amtiocyamidim có kh nắng hấp thụ ảnh sáng trong vùng khả kiến, cực đạt thấp thụ trong khoảng bước sóng 510mm — 540nm Anthocvanidin được chiết trang, môi trường øxiL mạnh có màn đồ, cường độ màu phụ thuộc vào nông độ và pH Nẵng

độ của anthocyanidin cảng lớn dộ hập thụ quang cảng cao, dung dịch cỏ máu do sim

do đó cực đại hấp thụ thường được thiết lập ở bước sóng 320nm

1.1.4 Tác dụng của anthacyanin

“Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng, khuẩn, kháng nâm giúp thực vật

tránh được một số bệnh nắm ở cây, đo cá màu sắc sặc sỡ thu hút động vat, chim va

cdn tring nén thie day qua tink thu phan va phat tan phan hoa Ngoai ra, anthocyanin

có khả năng, hấp thụ mạnh tia tử ngoại nên có thể bảo vệ tế bảo trong quá trình quang, tổng hợp, giúp bảo về bộ gen của thực vật

Anthovyanin được chiết xuất từ tự nhiên được sử dựng làm các chải màu bễ sung vào thực phim va dé udng tao nén mau dep mat cho san phim déng thoi mang lại nhiều giá trị đính dưỡng và các hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe

Antliocyanin có nhiều hoạt tỉnh sinh học quý như

«_ Khả năng chống oxy hóa cao nên được sử đụng làm chật chẳng oxy hóa trong trực phẩm Các anthocyanidin được sử dụng đễ bảo quân thực phảm làm bên

chất béo, chẳng nắm mốc, kháng khuẩn, chẳng viêm [35]

« Kh năng chống oxy hóa lon hon vitamin E, vitamin C va Ð - caroten nên được

sử dụng làm chất chồng lão hóa, chống lại sự suy giãm miễn dịch, suy giám sức đề kháng [23]

« _ Anthocyanin được sử dụng rộng rãi trong y học do có khả năng, giảm tỉnh thắm thành mạch và tế bảo nên có khả năng chống chây máu

«Do có khả năng bắt các điện tử tự đo nên anthocyanidin cd kha nang chẳng lại

các tia bức xa và các gốc tự do -OH, ROO- nên có khả năng ngắn cần sự phát triển của một số tế bảo ung thư, chỗng lại sự húy hoại tế bao khi tiếp xúc với môi trường bức xạ [9]

«- Đối với hệ thân kinh: hoạt tính của pelargonidin giúp ngăn chăn quá trình nitro hóa của tyrosin nên bảo vệ hệ thống thần kinh, chẳng xơ cúng động mạch

«_ Anthocyanin có thế ngần cản quá trình xơ vữa động mạch, ngăn căn quá trình oxi hóa của lipoprotein mật độ thấp (low densily ipoprotein, LDL, một loại

protein chửa cholesterol và chất béo trung tính trong huyết tương), giúp báo

vệ tim mạch và chống stress oxy hóa

« Neoaira, anthocyanin dong vai tré quan trong giup phóng và diều trị các bệnh

về mắt, câi thiên khả năng nhìn trong bóng tôi, các bệnh về phối và tiểu đường 1.1.5 Sự phân bỗ cửa anthocyanin trong thực vật

‘Trong ty nhién, anthocyanin được tỉ thấy chủ yêu trong, thực vật bậc cao, tuy

hiên có một hượng nhỏ được tìm thầy trong thực vật bậc thắp trong rêu và đương xỉ

Anthocyanin tổn tại trong các bộ phận lá, hoa, quả làm cho thực vật cỏ mâu sặc số, trong dé 80% duge tim thay tong 14 co mau, 69% trong quá, 50% trong hoa lá dẫn xuất glucoside của cyaniđin, đelphinidin, pelargonidin [9]

Trong các chất máu dược sử dụng trong thực phẩm thi anthocyanin la chat râu được sử dụng phô bién Chat mau anthocyanin được chiết từ ruột số rau, củ, quả,

lá, hạt và hoa của một số loài nh: quả họ berri, họ cherry, quả nho, quả nhiệt đới, qua man, đỗ den, cả chua tím, bắp cãi Lim, ca Lim, dau (ay, 14 lia 6, ngd, cả rỐt tím, khoai tây, thanh mai [âm lượng anthocyanin trong rau, củ, quả từ 0,19% - 1,0% tính theo khéi lượng chất khô

1.2 Phương pháp xác dịnh anthocyanidin

Anthocyaniđin có nhiều hoạt tính sinh học quí nên được các nhà nghiên cứu ð

Việt Nam và thế giới quan lâm Định lượng các anthocysnidin trong thực phẩm, rau

ctu, qua bằng nhiễu phương pháp khác nhau Dưới dây là một sở phương pháp phổ biến đã được nghiên cứu đề định lượng anthocyanidin

1.2.1 Phương pháp điện di mao quan

Nguyên tắc phương, pháp điện di mao quắn: các chất phần tích được đặt trong,

ống mao quản hẹp trong điện trường, đo sự linh động điện di của cáo ian khác nhau

nên các chất di chuyển với tốc dé khác nhau và tách ra khỏi nhau Ưu điểm của phương pháp lả độ phản giải cao, lượng mẫu tiêu tên ít nên lượng dung môi thải ít,

do đó chỉ phí thấp.

é phan tich cae anthocyanin, miu dược dua vào mao quản phia anot va pha động sẽ làm đi chuyên các câu tử của mẫu hướng về phia catct trong khi các cần tử

khác được giữ lại tại anot

Phương pháp điện di mao quán thường sử dụng dé tach anthocyanin, su di

chuyển của các chất phụ thuộc vào tỉ lệ điện tích và kích thước, thời gian đi chuyển

của các hạt điện tích dương và kích thuốc nhô nhiều hơn phân tử có điện tích nhô kích thước lớn

T Bridle [26] đã xác định 6 anthocynin bằng phương pháp điện đi mao quan ving (CZF) Wi malvidin - 3,5 - diglucoside, pelargonidin - 3 - glucoside, malvidin -

3 - glucoside, cyanidin - 3 - rutinoside, cyanidin - 3 - glucoside, delphinidin - 3 - gucoside Anthocyanin được hòa tan trong hin hop 4ém phosphat pH = 2.5 va iuelanol (3:1) Dung dich duge bom vao mao quan silica dai 50cm duong kink 75yan tại nhiệt độ 25°C mới trường đệm natri tetraborat ] 50uM có pH = 8 sit dung detector diode — array tại bước sóng S80nm và áp điện thể cao 25KV các anthocynin được tách trong thời gian 1Ô phút

Phương pháp điện di mao quản vùng (C12) được thực hiện trong môi trường

‘azo lam cho cáo anthocyanin kém bên vì vậy để tăng độ bên của chất phân tích cần chuyển sang môi trường axit cho anthocyanin tổn tại dưới dạng cation flavyliun

Trong môi trường axit antfhocyanin sẽ di chuyển về anot ngược với đông điện di

Caboni va Patrizia Comandini [13] da xac dinh ba anthocyanin pelargonidin -

3 ~ glucoside, polargonidin - 3 - rutinoside va cyaridin - 3 - glucoside trong dich chiết

Điều kiên đo: điện thể 23 kV, nhiệt đả mao quản 25°C, chiều dai mao quan ‘Sem,

thời gian phản tích nhanh 22 phút rả ba chất lách nhau hoàn Loàn, lượng mẫu liễu tốn

it Phương phap sic ki ling (HPLC) st dung detector mang diod dit bude song do 520nm có thời gian phân tích 60 phút Tuy nhiên, phương pháp điện đi có giới hạn 'phát hiện và giới han định lương cao hơn 10 lần so với phương pháp sắc kí Phương,

pháp diện di mao quán vúng (C2H) có giới hạn phát hiện (LOD) vá giới hạn dịnh lượng (LOQ) của pelargonidin - 3- glucoside lan lượt là 2,06 và 6,87mg/L trong khi

phương pháp sắc kí lông có LOD và 1.0Q Jan luot la 0,04 và 0.1 3mg/1, Kết quả phân tích mẫu dâu tây bằng hai phương pháp cho thấy hảm lượng pelargonidim - 3 -

giaeoside theo phương pháp điện đi là 11,1Lmg/L, phương pháp sắc kí là 11,37mg/L

Một số nghiên cứu khác [3Š] tác giả sử dụng chất hoạt động bề mặt cation

cetyltrimethylammoniun bromide (CTAB) hodc sodium dodecyl sulfate (SDS) tong, xôi trường đệm phosphate hoặc đệm phosphate — borate để xác định anthocyanidin theo phuong phap dign di digu déng hoc micel (MEKC) vai detector UV - VIS

1.2.2 Phương pháp phô hấp thụ phân tir UV - VIS

Nguyên lí của phương pháp dựa trên sự thay đối độ mâu của anthoeyanin tại

các pH khảo nhau Tại pH 1,0 các anthocyarin tổn lại ở trạng thái oxomium hoặc

flavylium cd mau đỏ và cường độ màu lá cực đại, tại pH = 4,5 chủng chuyển cầu trúc

và tồn tại đưới dạng carbinol không màu Từ sự khác nhau vẻ độ hập thụ quang tại

bude séng 520nm tai pH ~ 1 và pH — 4,5 tỉnh dược nồng độ của anthocyanin trong,

Nhóm nghiên cúu của Kguyễn Thị Tiiễn [2] và cộng sự đã nghiên củu chiết

chat mau anthocyanin rong đài bụp giãm bằng phương pháp so mâu và phương pháp

pH vi sai, tim được điều kiên tối ưu quả trình chiết chất màu là đang môi cthanol:nước

tử lệ 50:50 được axit hóa HƠI 1%, tỉ lệ dưng môi/nguyên liệu là 11ml/1g, thời gian

chiết 6 ngày, ở nhiệt độ phòng Chất màu thé anthocyanin (ir dich chiél dai bup giém

và xác định bảm lượng chất màu trong nguyên liệu khô là 15,2%, trong nguyên liệu

tươi là 1,06%

Nhóm nghiền cứu Huỳnh Thị Kim Cúc [1] và cộng sự đã xác định hàm lượng anthocyanin tổng trong một số nguyên liệu rau, quả (quả dâu, bắp oái tím, lá tía tô, trả đô, vô quả nho, vô quả cà tim) bằng phương pháp pH vi sai Hàm lượng anthocyanin tong qua dau la 1,188%, bap cai tim 0,909%, lá tía tô 0,397, trả đó 0.335%, vd qua nho 0,564%,v6 cA tim 0.441%

Tac gid Nguyén Thi Lan [3] va cdng su di khdo sat hé dung mdi chiét axil formic, axit acetic và axit hydrochloric trong metanol hodc ethanol va tim duge dung,

môi tôi ưu để chiết là ethanol: nước tỉ lệ 1:1 (với 1% HCl) dé tach chat mau

anthocyanin tir qué dau Hội Ai Hàm lượng amhocyanin thổ được xác định bằng

phương pháp pH vi sai do dộ hập thụ quang cực dại của mẫu ở pH = 1 vả pH = 4,5 tại bước sóng có độ hâp thụ cực đại 51 Snm và so với đệ hấp thụ tại bước sóng 700nm

(độ dục của xấu), Hàm lượng anthocyanin Lau due trong quả dâu là 1,047%,

1.2.3 Phương pháp sắc kí lỏng HPLC

Phương pháp sắc kí lỏng được sử đụng phế biển để xác định amhocyanin hoặc

amthoeyanidin với detcctor UV, PDA, DAD hoặc dâu dò khối phé MS

ằng phương pháp sắc kỉ láng LIPLC với detector PDA Vũ Thị Trang [4] và cộng sự đã tách và xác định được 3 anthoeyanidin là đelphimidm, cyanidin vả

pelargonidin trong 9 mau rau củ quá trên địa bàn Hà Nội Phương pháp cỏ giới han

phát hiện từ 0,10 — 0,24 ng#nL, giỏi hạn định lượng từ 0,30 — 0,7L ng/mL, Mẫu được thủy phân trong dung mỗi CH:OH - HCI 2N (tỉ lệ 85: 15), thời gian thủy phân 120

phút ö nhiệt dé 80°C Kai qui phan tích một số mẫu thực bắp cải tim có cả 3

anthocyanidin, mẫu bắp cải ở chợ Liêm có hàm lượng delphinidin 0,22mg/100p,

cyaniđin 58,79mg/100g, pelargonidm 3,92mg/100g, mẫu bắp cõi chợ Long Biên có làm lượng delphmidim 0,2lmg/100g, cyanidin 27/65mg/100g, pelargonidin 1,87mg/100g Khoai lang tim có hàm lượng cyanidin 3,.44img/100g và pelargonidin 013mg/100g với mmấu mua tại chợ Hôm, tại chợ Long Biển hàn lượng oyanidin

3,05mg/100g và pelargonidin 0,111ng/100g, Trong củ rên đó vả rau dén dễ không,

phat hign anthocyanidin.

Tại Việt Nam, nhóm nghiên cửu Vũ Thị Trang [6] vả cộng sự dã xác dịnh đồng thời 5 anthocyanidin phê biến là cyamidin, delphinidin, pelargonidin, malvidin

và peonidin bằng phương pháp sắc kí lỏng ghép nổi khôi phố hai lần (UPT.C/MS/MS)

thời gian phản tích sắc ki 13 phút Mẫu được thủy phân trong hỗn hợp MeOH/HCI

2,7M ủ 80% trong 2 giờ Iiệu suất thủy phân đạt 95% và độ chum RSD < 4% Thương pháp được áp dụng phản tích mẫu trên ứn trường cho hàm lượng anthocyanidin từ SOmg/100g

Steven W Lloyd [20] và cộng sự đã cải tiến phương pháp phân tích anthocyarridin trong quê việt quất bằng phương pháp mặt mục tiêu để lim điều kiện tối ưu của quá trình thủy phan anthocyanin thành anthocyanidin Thí nghiệm dược thiết kế theo mô hình bậc hai tâm xoay (central composite đesign CCD) đựa trên ba yêu tổ có ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân là nhiệt dộ thủy phân, thời gian thủy phân và nỗng độ axit trong metanol Đề tìm được điều kiện biên cho quá trình tối ưu

hóa thục nghiệm, nhóm nghiên cứu đã khảo sát đơn biên các yêu tô bao gồm: phương,

pháp thủy phân, loại axit trong dung môi chiết, thời gian thủy phân Kết quả khảo sát phương pháp thủy phân trong bình kín và phương pháp chưng cất hổi lưu cho ham lượng anthocyanidim khác nhau không có ÿ nghĩa Trong 4 axit được khảo sát là axit acetic, axit formic, axit hydrochloric va axit photphoric cho thay axit hydrochlorie

cho hiệu suất thủy phân là lớn nhất Khi khảo sái thời gian thủy phân, nêu thủy phân

trên 100 phút xuất hiện hiện tượng giảm diện tích pic của Mavidin trong nước ép quả

việt quất Qua thống kê kế quả báo cáo của 25 bài báo về điều kiện thủy phân

anthocyanidin trong rau, quả và nước nống, từ đỏ nhóm nghiên cứu đưa ra mô hình thục nghiệm khảo sát đồng thời sụ phụ thuộc cửa nhiệt độ lừ 8O — 1 20%C, thời gian

30 — 60 phút và nẵng độ HCI từ 1 — 3M, cánh tay dòn œ — 1,68 Với 32 thí nghiệm

được thiết kế và thục nghiệm thee mê hình kết quả tỏi ưu điều kiện chiết mẫu ở nỗng

độ axiL HƠI 3,7M trong 1nelanol, nhiệt độ thủy phân 6 99°C Irong thời gian 6,4 phút

Những yếu tế ảnh hướng dền hiệu suất thủy phân bao gồm ảnh hướng bậc nhất của

thời gian, nông độ axit và ảnh hưởng bậc hai của nêng độ axit, nhiệt độ, ảnh hưởng

tượng hỗ của nhiệt độ với thời gian, nhiệt độ với néng độ axit Mẫu sau thủy phân

dược phân tích trên UPLC voi detector UV hap thy bude song cue dai 525nm, pha động axit photphoric 3% va acetonitril cé 5 anthocyanidin Ia delphinidin, cyanidin, penanidin, peonidin và malvidin được phát hiện trong quâ barry

AN Annika Nyman [25] d xác định 6 anthocyanidin phổ biến có trong rượu

vang đỏ và quả họ berri như đâu tây, quả việt quất rừng, quả lí chua đen Quá trình

thủy phân cắt các gốc đường của anthocyanin được thực hiện Irong axit HƠI 2M trong xuetanol ở nhiệt độ 90°C trong 50 phút, sau dó phân tích trên HPLC/DAD dã xác định được hiệu suit thiy phan dang aglycon tir 95 -102% va 69 — 104% tir dang glucoside Ham luong anthocyanidin 66 chita long qué dau ty 23,8 + 0,4 mg/100g, quả lí chua den 135,0 = 3,0 mp/100g, quá việt quất rimg 360,04:3,0 mg/1 00g, rượu vang cabernet 26,1 + 0,1 mg/100mT,

Carina Pinho 128] va cdng sự đã tối ưu hóa điều kiện thủy phân rượu vang đô bằng phương pháp mặt mục tiêu Dạng aglycon của anthocyanins được định lượng

bằng IIPLC/DAD Ba biến ảnh hưởng là nông, độ IICI, nhiệt độ và thời gian thủy

phan dược thiết kế thí nghiệm theo mỏ hình bậc hai tâm xoay gồm 20 thí nghiệm Diễu kiện tối ưu quá trình thủy phân tìm được ở nhiệt độ 166,2"C, dưng môi thủy phân 9,§mL, HCI 32% trong metanol với thời gian thủy phân 46,6 phút Ảnh hưởng đáng kể của bậc nhất các yêu tổ, ãnh hưởng bặc hai của nhiệt dộ, thời gian và ánh: thưởng tương hỗ của nhiệt độ với thời gian đến quá trình thủy phân các anthoeyanin thành anthocyanidin Trong miu rượu vang đỏ phát hiện 5 anthoeyanidin là delphinidin 23,4 + 0,9mg/L., cyanidin 35,9 + 2,ling/1., potunidin 21,8 = 08mg/L, peonidin 29,0 + 1,1mg/1, và malvidin 112,8 + 2,1mng/L Dộ thu hỏi của phương pháp

từ 86 — 959,

Jeremy § Bames }11 | và cộng sự dã chiết và định lượng anthocyanin tir qua việt quật bằng phương pháp sắc kí lỏng khỏi phỏ chê độ phun điện tử theo thời gian bay (HPLC — ESI —TT —TOE — M8) và HPLC — UV Mẫu được chiết trong dụng môi netanol ; nước : Trifluoroaxetic axit (70:30:1, v/v/v) và xác dịnh ham lượng bằng, phương pháp IIPLC detector UV tai bude séng 520mm, Anthocyanin được rủa giải theo hai phương pháp, phương pháp 1 đùng dung môi pha động kênh A gồm hễn hợp

nước: THE:LEA (98:2:0,1, v/v/v) kênh B là acetonitril trong 55 phút Phương pháp 2 pha động kênh A là axit formie 10%, kênh I3 acetanitril thời gian phân tích 90 phút

đã xác định tổng 26 anthocyanin trong quả việt quất Nhỏm nghiên cứn xác nhận các amthoeyanin không cân sử dụng chuẩn bằng phương pháp HPLC ESL IT TOF

MS dựa trên khỏi lượng các mảnh được bắn phá m⁄z đã xác nhận được 26 anfhacyanin

“khác nhau có trong quả việt quất

Gongjian Fan |15| và cộng, sự dã tôi ưu diễu kiện chiét anthocyanin tir khoai tây tìm theo phương pháp mặt mục tiêu sử đụng dưng môi chiết axit HCI trong, cllumol Khao sat ãnh hướng của nhiệt độ từ 40 — 80°C, thời gian chiết 60 — 120 phút

và tỉ lệ chất khổ từ 1:15 1:35 Khảo sát ảnh hưởng dòng thời các yêu tổ theo mô tình Box — Behnken với 17 thí nghiệm đạt hiệu suất cao nhật 1 58mg/1 00g tại 80%C, thời gian chiết 60 phút tỉ lệ chất khô 1:32 Bằng phương pháp mặt mục tiêu nhận thầy

có sự ảnh hướng tương hỗ của nhiệt độ chiết và tí lệ chất khô,

1.3 Qui hoạch hóa thực nghiệm fim diều kiện tối ưu quả trinh thủy phân

Anthiocyanin bao gồm mL cation [lavylium (anthocyaradin) liên kết với một hoặc nhiều phân tử đường khác nhau Gần 600 anthocyanin đã được ghi nhận nên

việc phân tích sắc kí tạa ra số hượng lớn các pic và khó đề định lượng riêng từng anthocyanin, Để đơn giãn hóa, người ta thường thủy phan các anthocyanin thank

anthocyanidin và phân tích 6 anthocyamidin phô biến (gẻm: cyanidin, đelphimdim,

petunidin, peonidin, pelargonidin va malvidin)

Tiện nay, ở nước tạ các công trình đã công bố thường tìm điểu kiện Lỗi ưu để thủy phân anthocyanin thành arthoeyanidin theo phương pháp đơn biến Nhược điểm của phương pháp là chỉ biến đối một biên trong khi giữ cổ định giá trị các biển còn lại nên số thí nghiệm cẩn thực hiện nhiều, trong nhiều trường Hợp không phân ảnh đúng thực nghiệm khi có sự tương tác giữa các biển

Các công trình nghiên cứu đá công bó về điều kiện thiy phan anthocyanin thành anthocyanidin trong rau, hoa, quả và đỗ uống được thực hiện theo hai phương, 'phảp là gia nhiệt hồi lưu hoặc gia nhiệt trong bệ kín Trong đó có ba yêu tố chỉnh ảnh hưởng đến hiện suất thủy phân là nhiệt đồ, thời gian và nổng độ axit Điều kiện tôi

tưu của quả trình thủy phân dược công bố rất khác nhau: nhiệt độ thủy phân trong, khoảng 75 — 166°C, thời gian thủy phân từ 30 phút — 5 giờ, nông độ axit trong khoảng

1.1N — 3N Bang 1.1 trinh bày các điêu kiện khác nhau đề thủy phan anthocyanin

trong một số đổi tượng,

Bang 1 1 Một số điều kiện tùy phân anthocyanin

ap [4 CC} (hin

Gao and Mazza [16] Quả việt quất 2 100 60

yếu sử dụng phương pháp mặt mục tiêu (RSM) dễ mô hình hóa, tìm điều kiện tối ưu

và đánh giá ảnh hướng các yếu tổ Phương pháp mặt mục tiêu có tu điểm: đánh giả

ức độ ảnh hướng từng, yếu tô khảo sát, dành gia sự ảnh hướng tương hỗ giữa các yếu tố, đẳng thời cho phép đự đoán kết quả đựa trên phương trình hải qui

Theo kết quả nghiên cứu của Pinho [28] Khi sử dụng mặt mục tiêu để tôi ưu quả trình thủy phân rượu vang đó theo phương pháp chưng cát hỏi lưu nhận thây ánh

hưởng đáng kế của bậc nhất các yêu tả là nhiệt độ, thời gian và nâng độ axit, ảnh

độ vả nông độ axit

Trong tự nhiên các anthocyanidin thường liên kết với các gốc đường khác nhau

tạo thành hơn 600 anthocyanin, để tách và định lượng được các anthocyani là rất khó khăn do thiểu chất chuẩn vá trùng thời gian lưu Dễ đơn gián quả trinh phân tích, chúng tôi tiền hành thủy phân đề cắt toàn bộ góc đường chuyên thành 6 anthoeyanidin

cơ bản bao gồm (delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, peonidm va

malvidin) Do vậy, quá trình thủy phân mẫu phải đạt hiệu suất chuyển hóa tỏi đa,

chat phân tích không bị phân hủy hoặc chuyến hóa khổng hoàn toàn

Nhằm mục đích khảo sát đẳng thời ảnh hưởng 3 yếu tố là nhiệt độ, thời gian

và nắng độ axit trong metanol khi tiên hành thủy phân các anthocyanin trong hé kin,

chúng tôi sử dụng phương pháp ruặt mục tiêu theo mô hình bậc hai lâm xoay để tìm điểu kiên tối ưu và đánh giá ảnh lrưởng các yêu tổ khảo sắt

CHUONG 2- THUC NGHIEM 2.1 Thiét bj, dung cu và hóa chất

Thiết bị quang phố hap thu phan tt UV — VIS Shimadzu

Cột sắc kí Xiridge® BEH C¡s (100 mưn x 4,6 mm x 2,6 an) và liển cội Lương

ug

Cột sắc kỉ Sun Fire hãng Waters Cịs (250mm x 4.6mm * Sym) va tién cét tuong ứng

Cân phản tích Mettier Toleda AL204 có độ chỉnh xác d = + 0,0001 ạ,

Máy đo gÏI: pII Meter 744

Máy lắc vortex VELP

Máy xay Philips 600W,

‘May cất quay chân khéng EYELA, Nhat Bản

‘May rung siéu am ELMA

Binh dinh mite loai A SmL, 10 mL, 50 mL, 2000mL,

Các chia độ 50 — S00mE,

Phpet thủy tink, pipet pasieur, pipelman 200 p., 1000 pL, 5000 pl va ddu can Tương ứng

Ông nghiệm ly tâm 15m,

“Mang loc dung môi 0,45m

Mang lọc mẫu 0,2um

Ong dong 100m1, —1000m1

Vial 2ml

2.1.2 Hóa chất

+ Chất chuẩn anthacyamidin

Delphinidin chloride > 95%, Cyanidin chloride > 95%, Pelargonidin chloride > 97%, Peonidin chloride > 97%, Malvidin chloride >95% dugc cung cấp bởi hãng Sigma - Aldrich Petmidin chloride > 95% được cũng cấp từ Chromadex

s# Chất chuẩn anthacyanin

Pelargonicdin - 3 - Q - glucoside > 95%, Cyanidin - 3 - O - glucoside > 97%, Peonidin - 3 - 0 - glucoside > 97% va Malvidin - 3 - © - glucoside > 97% duge cung cfp tit hang Sigma - Aldrich

+* Cách pha dụng dich chuin anthoeyanidin

Dung dich chat chuẩn gốc delphimdin chloride: 1mg, chit chuan Delphinidin chioriđe được hòa tan trong ding môi HCI 0,1%/ MeOH rồi chuyển toàn bộ vào tình dịnh mức 10,00 mĨ sau đó thêm dụng môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu được dung, dịch chuẩn Delphinidin 100ppm và báo quần ở điêu kiên lạnh (-20%C): trong bóng tối

Dụng dịch chất chuẩn gốc cyanidin chloride: Img chat chuan Cyanidin chloride được hỏa tan trong dung méi LIC! 0,1%/ MeOL1 réi chuyển toan bộ vao binh dinh mite 10,00 ml sau dé thém dong môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu dược dung dịch chuẩn Cyanidin 100ppm và bão quản ở diều,

kiện lạnh (-20°C); trong bỏng tôi

Dưng dịch chất chuẩn gốc pehmiẩin chloride Img chat chuan petunidin chioride dược hỏa tan trong dụng môi HƠI 0,19/ MeOH rồi chuyên toàn bộ vào bình định mức 10,00 mĨ sau đó thêm dang môi trên tới vạch ở nhiệt độ phông, lắc kỹ thu được đúng dịch chuan petunidin 100ppm va bao quan 6 điều kiện lạnh (-20°C), trong, bóng tôi

Dung dich chat chudn gde pelarganidin chloride: Smg chat chudn pelargonidin chloride dizgc hoa tan trong dung méi FIC] 0,1%/ McGH rai chuydn toan bd vào bình dịnh mie 50,00 ml sau dé thém dang mỗi trên tối vạch ở nhiệt dộ phòng, lắc kỹ thu được đung địch chuân pelargonidin 100ppm và bảo quản ở điêu kiên lạnh (-20%C): trong bóng tối.

Dung dich chất chuẩn gốc peonldin chioride: Img chat chuẩn peomidim chloride duoc hda tan trong dung mới TICI 0,19%/ MeOTI rồi chuyên toàn bộ vào bình định mức 10.00 mĨ sau đó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ thu được dung dich chuân peonidm 100ppm và báo quản ở điều, kiện lạnh (-20°C), trong bóng tôi

Dung dich chất chuẩn gốc malvidim cñloriäe 1mg chải chuẩn malvidin chloride được hỏa tan trong dung, môi HCI 0,1%/ MeOH rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10.00 m sau đó thêm đung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phông, lắc kỹ thu được dung địch chuận malvidin 100ppm và bão quần ở điều kiện lạnh (-20°C), trong, bỏng tôi

* Tha đung dịch chuẩn anthocyanin

Mẫu chuẩn cyanidin - 3 - O - glucoside: Img chất chuẩn cyanidin - 3 - O - glucoside được hỏa tan trong dung môi MeOH rồi chuyển toàn bộ vảo bình

định mức 10,00 ml sau đó thêm đưng môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc

kỹ thu được dung địch chuẩn eyanidin - 3 - O - glucoside 100ppm va bio quan

ở điều kiện lạnh (-20°C), trong bỏng tối

Mdu chuan pelargonidin - 3 - O - glucoside: Img chat chuan pelargonidin - 3

- O - glucoside dược hòa tan trong dung mdi MeOH réi chuyển toàn bộ vào tình định mức 10,00 mÌ sau đỏ thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lac kỹ thu được dưng dịch chuẩn pelargonidin - 3 - © - glucoside 100ppm và bảo quản ở điều kiện lạnh (-20°C); trong bang tối

Mẫu chuẩn peonidin - 3 - O - glucoside: Img chất chuân neonidi - 3 - O -

gÌucoside được hỏa tan rong dụng môi MeOH rồi chuyển Loàn bộ vào bình định mức 10,00 mÍ sau dó thêm dung môi trên tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc

ky thu duoc dung dich chuẩn peonidin - 3 - O - glueosiđe 100ppm và bảo quản điều kiêu lạnh (-20%C); trong bóng tối

Mau chuẩn malvidit - 3 - © - glucoside: 1g, chat chuin malyidin - 3 - O - glucoside được hỏa tan trong dung môi MeOIT rồi chuyển toàn bộ vào bình định múức 10,00 ml sau đó thêm dưng môi trên tới vạch & nhiệt độ phòng, lắc

kỹ thu được dung dich chuan malvidin - 3 - © - glucoside 100ppm vả báo quan

ở điền kiện lạnh (-20°C); trong bóng tối

$% Hóa chất dụng môi khác

Axit clorhidric (HƠU Merck, Đức

Axit formic (FA) Merck, Dire

Axil trifluaroaxelic (TFA) Merck, Dac

- Metano! (MeOH) Merck, Ditc

Axetonitril (ACN) Merck, Dire

Cae dung dich pha dong axit formic 0,05%, 0,1%

-_ Dung dịch pha động axit triểuoroacetic 0,05%, 0,1%, 0,159

-_ Axit triluoroaxetie (LIVA) 0,05%: LLút chính xác 505gL, axit trifuoroacetie nông

độ 99% đỉnh mức thành 1L bằng nước cất hai lần, đây nắp và đảo đếu dung dich

~_ Asittrifluoroaxetie (FEA) 0,1%: Hút chính xác TmL axit trifuoroacetic néng độ

99% định mức thành 1L bằng nước cất hai lần, đậy nắp và đảo đều dung dich

- Axit wifluoroaxetic (TFA) 0,15%: Hut chinh xác 758L, axit trifuoroacetic néng

độ 99% định nie Drath S00mT bing nude cat hai lin, day nip va dio déu dung dich

~_ Các dụng dịch phá động sau khi pha được lọc qua ràng lọc đụng môi kích thước 0,2um va rung siểu âm để loại bợt khi

2.2 Mẫu nhân tích

Đối tượng mẫu phân tích là các loại rau, củ, quê được mu trên địa bản Hà Nội, Đà Lạt, Bắc Giang (bắp cãi tim, dỗ den, dậu bắp tún, ngõ tim, bụp giấm, khoai lang tím, hành tây tím, rau chua, nho tím, nho đen ) Mẫu được lấy theo phương phap ngẫu nhiên khối lượng từ 100 — 500g/ mẫu Mẫu phân tích được đồng nhật bằng,

cach cất nhỏ và xay, nghiền mịn bằng, máy xay Mẫu sau khi dồng, nhất dược bão

quản trong túi đựng mẫu ở nhiệt độ - 20°C

"Mẫu chuẩn: mẫn chuẫn anthocyanin được cung cấp bởi hãng Sigma — Aldrich

Mẫu thêm chuẩn: Để đánh giả hiệu suất thu hồi của phương pháp phần tích, tién hanh

†hêm chuẩn các anthocyanin vào nền mẫu thực và thủy phân mẫu tại điền kiện tối tà

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội đung nghiên cứu

Với mục tiêu tách và xác định đồng thời 6 anthocyanidin trong mẫu rau củ quả ở Việt Nam, chứng tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:

~ Khảo sát các yêu tô ảnh hướng đến quá trình tach va xac dink anthocyanidin trén

hệ thống sắc kí lông, HPLC với detector PDA

- Nghiên cứu tìm điều kiện tổi ưu của quy trình thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin tit ran, ci, qua bang khảo sát ảnh hướng đẳng thời các yếu tế: nhiệt

độ, thời gian và nông độ axit HCI trong, metanol

- Dánh giá hàm lượng anthocyanidin trong một số mẫu rau, củ, quả ở Việt Nam

2.3.2 Phương pháp nghiÊn cúu

Dễ thực biện nội dựng của để tài, chủng tôi lựa chọn phương pháp sắc ki lỏng

HPLC với đetectar PDA để tách và xác định 6 anthocyanidin

Phương pháp sắc kí lỏng cho phép tách và định lượng riêng từng chất dựa vào

thời gian lưu và bước sóng hip thy Day là phương pháp phân tích đồng thời, có độ chọn lọc, độ chính xác cao, chỉ phi thấp hơn rắt nhiều so với phương pháp sắc kí làng khối phổ, độ nhạy dap ứng phan tich cde anthocyanidin

% Khảo sát khả nang tach cdc anthocyanidin bằng phương pháp IIPLC

Kha ning tach cac anthocyaridin bằng HPLC phụ thuộc vào nhiều yêu lồ như loại cột tách, chương trình gradient, loại pha dộng và nông độ dung mỗi pha dộng, tốc độ dóng, Vị vậy chúng tôi lần lượt khảo sát các yếu tế trên khi giữ có định nhiệt

độ lò cột 401C

- Loại cột tách: do các anthocyanidi là các chất phản cực trung bình do vậy cột tách được lựa chọn là cột ít phân cực Cis Với điều kiện phỏng thí nghiệm hiện

c@ hai cot Sun Fire hiing Waters Cis (250mm * 4,6mm x 5pm) va cdt tách Xbridge® BUI hang Waters Crs (LOO mm x 4,6 mm ~ 2,6 jum)

~ Thành phần pha động: thành phân pha động là yếu tố quan trọng để rửa giải

và tách các anthocyanidin ra khỏi nhau, đẳng thời ảnh hướng đền độ nhạy của tin hiệu phân tích Dung môi pha động là cáo chất phân cực, có định kênh T3 acetonitril,

“khảo sảI phá động kênh À là axiL formic 0,1% hoặc axiL Iriluoroaxelie 0,1% trong

nước, Điều kiện sắc kí cố dịnh tốc độ dòng 1m/phút, cột sắc kí Sun Eire hing Waters Cig (250mm » 4,6mm x Spm)

~ Khảo sát chương Irình građienL: do các chất trong rhúm anthocyanidm có độ phân cực khảe nhau khi rửa giải theo ¡soeractic các chất tách khỏi nhau nhưng, các tíc bị tủ, tín hiệu píc thấp nên để tách riêng các chất và tăng đô nhạy tín hiệu cần thay đổi tĩ lê hai kênh tại các móc thời gian theo chuong tinh gradient,

- Kháo sát nẵng độ set trong, pha động: ziữ tí lệ kênh E tại các mốc thời gian theo chương trình građient tir 0 — 20 phut ting tr £7 — 20% ACN, tir 20.01 — 30 phút giữ 179 ACN, tốc dé dòng 1ml phút, thay đổi néng độ axit trifuoroaxctic từ 0,059

- 0,15%,

- Khảo sát tốc độ đông: giữ cả định nông độ axit triflueroaxetic 0,1%, theo chuong trinh gradient tz 0 20 phút tăng từl7 20% ACN, tir 20,01 30 phútgiữ

12% ACN, thay đổi tốc độ đòng từ 0,8 — 1,2 ml’phut

+ Tối trà hóa điều kiện thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin theo phương, pháp mặt mục tiêu (RSM)

Phương pháp mặt mục tiêu là tập hợp các kĩ thuật toản học và thông kê sử đụng mô hình hóa và phân tích khi hâm raục tiêu chịu ảnh hưởng của nhiều biến độc lập Trong phương pháp này, mỗi quan hệ giữa hàm mục tiêu và biến độc lập chưa xác định trước, vì vậy bước đâu là xác định mỗi quan hệ gân đúng giữa hàm mục tiêu

và cáo biển theo mô hình Từ phương Irình hồi quy tìm được sử dụng phương pháp dao ham theo timg bién va cho bang 0 dé tim diễu kiện tôi tru

Trên thế giới phương pháp mặt mục tiêu đã được sử đụng để tìm điều kiện tối

tu cho quá trình chiết anthocyanidin trong qua anh dao dai [30], quả đũng đỉnh [14],

khoai tây từm [15] Các điều kiện tôi ưu dã được công bỏ rất khác nhau nhưng có ba yếu tổ ảnh hướng chính là nhiệt độ, thời gian và nẵng độ axit TCI dung môi MeOTI Qua tham khảo các tài liệu [4], [6], [20] [28] chúng tôi xác định giới hạn và mức cơ

sở các yếu tổ ảnh hướng đến quả trình thủy phân như Bang 2.1

Băng 3.1 Mức cơ sở các yếu lô ảnh hưởng

Số thí nghiệm của ma trận bậc 2 tâm xoay được tính theo công thức:

NoONye + N* = Ny Trong đó:

ÁN*: là số thực nghiệm ở diém *,N*=2n Ns: lả số thực nghiệm ở tâm, Nạ> 1 Ngéc: là số thực nghiệm ð điểm gốc, Ng¿ 24

(m số yêu tổ, q: số yếu tổ rút gọn)

Tổng sở thực nghiệm sẽ được tiên hãnh: N — 20 thí nghiệm, voi 6 thi nghiém lặp lại ở tâm Khoảng cách từ tâm đến điểm * la d = 26°" = 1,682

Quan hệ giữa hàm rục liêu Ý và các yếu tố ảnh hưởng được mô tả theo phương trinh bậc 2 tâm xoay

Y= bot bixa + boxe + baxs + bre? + bại? + bu g2 + bị Ki,Xe + bay Xó X:

by.XL-X3

Sử dụng phân mềm Minitab 17 dễ xảy dựng ma trận thực nghiệm, xác dịnh giá trị hâm mục tiêu CÝi) và (Y2), tìm phương trình hồi qui và đánh giá mức độ ảnh thưởng các yếu tổ khão sát đến hàm lượng anthocyanidin Sau khi có phương trình hồi qui, đựa vào ham nay dé tim điều kiện tôi ưu quả trình thủy phân bằng cách lấy đạo

ham theo từng biển va ham cho bang 0

+ Hiệu suất thủy phan anthocyanin thanh anthocyanidin

Hiệu suất thủy phân là thông sé dé danh gid mie d6 chuyén héa anthocyanin thành anthocyanidin Quá trinh thủy phân cẩn đạt hiệu suất tối đa, cac anthocyanin được chuyển hỏa hoàn toàn thành các anthocyamidm lương ứng, Bằng cách thủy phân hiến hợp mẫu chuẩn anthocyanin bao gém: (eyanidin - 3 - O - glucoside, pelargondin

- 3-0 - glucoside va malvidin - 3 - © - glucoside) néng d6 3ppm 6 diéu kién téi im Sau dỏ xác dịnh các amthoeyaridini én HPLC, hiệu suất thủy phân tính theo công, thức (2.1)

H= © 100% (21)

"Trong đỏ: II là hiệu suất thủy phân

Ci: nông độ anthocyanmidin thử ï tìm được sau thủy phân

Ce: nỗng độ anthocyanidin tính theo lí thuyết từ anthocyanin

2.4 Đánh giả kết quả phương pháp phân tịch

2.4.1 Xây dựng khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định hrợng

-_ Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Tùng dịch chuẩn gốc là đưng địch chuẩn của fmg anthocyaniđin và

anthocyarimn nắng độ 100ppm

Tung địch chuẩn làm việc: hứt chính xác thể tích dưng dich chuẩn gốc vả thêm dung méi axit HC 0,1% trong MeOH vào vial 2ml để thành dung dịch chuẩn hỗn hyp 6 anlhocyanindin 6 néng độ 0,1 — 20pprm

- X&y dựng dường chuẩn, khoảng tuyển tinlx

Dé xay dựng đường chuẩn lần lượt bơm vào hệ thông sắc kí các điểm néng độ 10,1 —20(ugénT.) Tirndng độ và điện tích pịc của các chát, xây dụng dường chuẩn

biểu diễn sự phụ thưộc của diện tích pic vào nỏng độ các chất theo phương trình hồi quy y= ax+b với y là điện tích pic amhocyanidin, x là nêng độ chất phân tích

-_ Xác đỉnh giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (1.OQ) cña phương,

pháp

1OD là nỗng độ tối thiếu của chất phần tích mà ở đó pc có tín hiện bằng 3 lần

nhiều đường rên (S/N — 3) LOQ là nỗng độ chất phân tích cho tín hiệu lớn gap 10

10), do đó LOQ = 3,3LOD Thêm các dưng, dịch chuẩn

có nông độ nhỏ đân vào địch chiết nấu trắng và phân tích trên HPLC cho đến khi thụ

được tĩ lộ S⁄N khoảng 3 là LOD và SN khoáng 10 là LOQ

3 - 4 lần trên nền mẫu thực: đỗ đen, khoai lang tìm, bắp cải tim, ngo tim, dau tay

Giá trị trung bình của n lần do

¢ Danh gid tinh cé nghia cua hé sé trong phương trình hỏi quy bậc hai tâm xoay

Chuan Student duoc sit dung đề đánh giá tính có nghĩa của các hệ số hồi quy

Nếu tám > toàn (P, Ð thì hệ số hồi quy mới có nghĩa hay trị số Pvaue < 0,05 thị hệ số

hội quy mới có nghĩa Bằng phan mém MINITAB 17 dé xir li so liệu tìm được mức

độ ảnh hưởng các yếu tố khảo sát đến hàm mục tiên Những yếu tế có trị số P < 0,05

là yếu tổ ảnh hưởng có nghĩa [5]

s$ Hiệu suất thu hồi

Tiệu suất thu héi (độ thu hếi) là một trang các thông số đề đánh giá độ chính

xác của phương pháp được xác định bằng cách thêm chuẩn vào nền mẫn thực Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức (2.6),

m —m Ban Me 00 2.6)

mi,

H,(%)

‘Trong, dé: Hit%) la higu suat thu hỏi

me pt: ham long anthocyanidin trong mẫu thêm chuẩn

Cys: bam lugng anthocyanidin trong mẫu

Ce: ham lượng chuẩn anthocyamidim thêm vào mẫu

* Đánh giá tính phù hợp của mồ hình qua chuẩn Eisher

;

n Nau Fin < Hoang (P, fp, fo) thi mô hình thông kế mô tá đúng thực nghiệm

Trong đó

55, là phương sai của thí nghiệm lặp lại ở điều kiện tôi ưu

s¿ là phương sai của thí nghiệm: lặp lại ở tâm: của mmô hình f2» bậc tự đo của phương sai phủ hợp

Íq bậc tự do của thí nghiệm lắp lại ở tâm

* X4c dinh ham hrong anthocyanidin

Cân chính xác khoảng 1g mẫu sau khi đồng nhất vào bình thủy tỉnh chịu nhiệt, thêm 35ml dung môi thủy phản (axit HƠI trong MeOH với nông dỏ từ 0,32 — 3,68M) Day kin nip va thủy phân mẫu ở điểu kiện nhiệt độ ở 33 1172C trong thời gian 39

— 140 phút Lam nguội và chuyền định lượng vào bình định mức 50ml, định mức bằng, đụng môi thủy phân Lọc qua giấy lọc băng, xanh vẻ mảng lọc 0,3m trước khí

phan tich trên LIP1,C — PDA.

Sau khi thu được sắc đồ, tỉnh nông độ các anthocyanidin theo phương pháp

đường chuẩn dựa trên diện tích pic từng chất Từ nông độ sử dụng công thức sau đẻ

tinh ham hong anthocyanidin:

A-b ` VxKx 60.1<H

Trong đỏ

A: Diện tích pie của chất phântích — V: thể tích dung môi định mức (50ml)

a, b là các hệ số trong phương trình hỏi quy

m: khối lượng mẫu cân (g) K: hệ số pha loãng,

= ax + b của đường chuẩn

1H: hệ số hiệu chỉnh nông độ thực anthoeyanidin

s Độ không đảm bảo đo

Các nguồn chính gây ra sai số trong quả trình phân tích: cân phân tích, quả

trình chuân bị mẫu, bình định mức, độ tính khiết hóa chất, độ tính khiết chất chuẩn,

độ lặp lại, đường chuan được thể hiện theo sơ đỏ xương cá hình 2.1 [33]

Hệ số pha loãng f

No đây ĐI tat ie

Nông đô chất phân tích Độ lặp lại

Hình 2.1 Sơ đồ xương cá tính độ không đảm bảo đo

28

Cân phân tích có khả năng dọc trong khoảng + 0,0001g với mức dộ tin cậy 95%, Từ bảng phân bố Gauss, độ không đảm bảo đo của cên là:

thể tich mẫu là u€V.) = 0,06/¥6

Cáo chuẩn anthocyanidin có độ tình khiết từ P= 95 97%, độ không đảm báo

do của dunng dịch chuẩn w(P) — TT —^

w

11iệu suất thủy phần cở độ không đảm báo do up

Tiiệu suất thu hồi tú,

Độ lắp lại có tp 8

7 7W m,

Độ không đấm bao do ue nw, = Walled, Wire | More

Dé khang dim bao do mé réng U= 2

Giá trị do ham hong anthocyanidin W = WU.

CHƯƠNG 3 - KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát các điều kiện tách và xác định authocyanidin trên HPLC

3.1.1 Lira chon cật tách sắc kí

Cột tách sắc kí có vai trò quan trọng đề các chất trong nhóm anthoeyanidin có thể tách ra khỏi nhau Do các anthoeyanidin có độ phân cục trung binh nên chủng tôi lựa chọu cội Ca của hãng Waters phủ hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và phú hợp với tỉnh chất của chất phản tích Cột tách có thông số cột như sau

- Céttach Sun Fire hang Waters Cie (250mm * 4.6mm x Suữn) và tiên cột tương, ứng

-_ Cột tách Xbridge@® BEH hing Waters Cis (100 mm x 4,6 mun « 2,6 pum) va tiền cột tương ứng

Do cột tách Xbridge® BEH hing Waters Cis co chiéu dai ng’in va duong kinh hat rit nhé có khá năng chịu áp suất cao nhưng tốc độ dòng nhỏ khoảng 0,4ml/ phút xiên khả năng tách các chất trên TIPLC gặp khó khăn, hai chất peoniđin và malviđin

có pic chập hoàn toàn Cột tách nảy phủ hợp với diễu kiện sắc kí lồng khỏi phổ có khả năng chịu áp suất cao và không cần tách hoàn toàn các chất, J2o vậy, cột dài Sun

Fire Cig (250mm x 4,6mm x Sim) được lựa chọn để khả sát tìm điền kiện tôi ưu

phan tich 6 anthocyanidin bing, phuong phap sac ki ling

3.1.2 Chọn bước sông phát hiện

Đề lựa chọn được bước sóng thích hợp, tiền hành quét phố đối với chất chuẩn cia 6 anlhocyanidin phổ biển bao gôm delphinidin (Del), eyanidin (Cya), pelumidin (Pet), pelargonidin (Pelar), peonidin (Peo) va malvidin (Mal) bing detector PDA dai phổ từ 190— 800mn Bước sóng cuc dai hap thu cia mai chat thu dee nl hinh 3.1

78 s0

28 0.0

Hình 3 1 Phổ hấp thụ phân tử của 6 anthocyanidin

Phổ hấp thụ của 6 anthoeyanidin có một đỉnh hp thụ cực đại trong khoảng

bước sóng từ 509 — 53lnm và một đỉnh phụ ở 267 - 275nm Do đỏ, để đảm bảo độ

nhạy của phương pháp khi phân tich đồng thời cả 6 anthoeyanidin và hạn chế anh

hưởng của dung môi, tạp chát, chất đồng mảu bước sóng 520nm được lựa chọn dé

phát hiện và định lượng các anthocyanidin

31