Luận văn nghiên cứu xác Định Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường tới quá trình sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nấm Đã phân lập Được từ khu vực quảng trường ba Đình

Nghiên cứu xác định các giá trị hoạt độ nước mới trường nuôi cấy ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collapenase của các chúng vị nằm: 2.3.5.4.. Kết quả nghiên cứu xác định các g

Hoang Anh Thing

NGHIEN CUU XAC DINH 4NH HUONG CUA MOT 80 YEU TO MOL

TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TONG HOP VA HOAT TÍNH

COLLAGENASE CUA CAC CHUNG VINAM BDA PHAN LAP

'ĐƯỢC TỪ KHU VỰC QUẢNG TRƯỜNG BA DIN,

LUAN VAN THAC Si KHOA HOC

TIả Nội - Nam 2014

ĐẠI HỘC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Tlvang Anh Thang

NGHIÊN CUU XAC BINH ANH HUONG CUA MOT 86 YEU TO MOL

TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TỎNG HỢP VẢ HOẠT TÍNH

COLLAGENASE CUA CAC CHUNG VI NAM DA PHAN LAP

pUQC TU KHU VUC QUANG TRUONG BA DINH

Chuyên ngành _ : Vi sinh vậthọc

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KIIOA HỌC: T8 Lại Văn Hòa

PGS TS Bui Thi Viet 114

TIả Nội - Năm 2014

LOT CAM ON

True hét, t6i xin bay (6 lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới

TS Lại Văn Hòa, PGS TS Bui TÌị Việt Ha, đã chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn tôi

trong suỐt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành

khóa luận tốt nghiệp, cũng như đã chỉ bão cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quỷ

bảu trong cuộc sống

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cỗ và các cán bộ trong bộ môn Vĩ sinh vội học; các thấp cô, cán bộ trong Khoa Sink hoc, trường Đại học Khoa học Nhiên dã nhiệt tình giáng dạy, hướng dẫn và tạo mọi diễu kiện giúp dỡ tôi trong

suốt những năm học vừa qua

Tôi cũng xit gửi lòi cảm ơn đến The Phùng Công Thuông và các đồng chi

thuộc Khoa Ù¡ sinh vật & Môi trường, Viện 69 đã luân cñủa sẽ, giúp đỡ và tạo điều kiện rất lớn dễ tôi có thể hoàn thành đề tài

Cuỗi cùng, tôi xin gửi lời câm ơn tới gia dình và bạn bè, những người dã

luôn ð bên tôi, động viên và giúp đỡ tôi cá về mặt vật chất lẫn tình thần trong suốt thời gừm vừa qua

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2014

Hoe viên

Hoang Anh Thang

Chương 1

Chương2

MỤC LỤC NỘI DUNG

ĐẶT VĂN ĐÈ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 So luge vé eo chit collagen 1.2 Sơ lược về vỉ nằm và quá trình sản sinh các enzyme ngoại bảo 1.3 Nghiên cứu vẻ các yếu tố ảnh hưởng tới sự phân hủy collagen của vi nằm

1.3.1 Quá trình sinh tổng hợp và hoạt tỉnh collagenase vi nâm 1.3.2 Nghiên cứu vẻ sinh tng hop va hoal tinh collagenase

cua vi nam

1.33 Nghiên cứu về sinh tổng hợp và hoạt tính collapsnase,

protease cia vi nim trong công tác bảo quân lâu dải thi thể ướp 1.4 Bộ sưu tập vi nấm phân hủy các cơ chất sinh học tại Viện 69

DOT TCONG, VAT LIEU VA PHUONG PHÁP NGHIÊN CÚU

2.1 Đôi tượng nghiên cứu

2.2 Vật liệu nghiên củ 2.2.1 Dung cu, trang bị

2.2.2 Môi trường nuôi cấy, cơ chất, hóa chất

3.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phục hội, lựa chọn các ching vi nam

nghiên cửa

2.3.2 Phương pháp kiếm tra mức độ thuần khiết các chúng vỉ tấm sau phục hồi lrên kính hiển vĩ quang học

2.3.3 Phương pháp làm mẫu nằm nghiên cửu trên kinh

biển vi điện tử quét (SEM) JSM-S410LV

2.3.4 Tiên hành xác định khả nồng sinh tổng hợp và hoạt tính

sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nằm

2.3 5.2 Nghiên cứn xác định các giá trị nhiệt đô môi trường

úc chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt lính collagerase của các chủng vị nẫm

2.3.5.3 Nghiên cứu xác định các giá trị hoạt độ nước mới

trường nuôi cấy ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collapenase của các chúng vị nằm:

2.3.5.4 Nghiên cứu xác định cáo giá trị độ âm không khí ức

chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tỉnh collagcnasc của các chúng vị nằm

2.3.5.5 Nghiên cứu xác định tổ hợp các điều kiện mỗi trường tức chế khả năng sinh tổng, hợp vả hoạt tỉnh collagenase của

cáo chủng vi nấm

2.3.6 Phuong pháp thông kê, xử lý số liệu

KẾT QUÁ VẢ BÀẰNT,UẬN 3.1 Kết quả phục hếi và ha chọn các chủng nâm sợi nghiên củu

3.2 Kết quả nghiên cứu xác định các giả trị pH ức chế khả rin

sinh téng hop va hoat tinh collagenase cia cic ching vi nắm 3.2.1 Két qua nghiên cửu xác định ở giá trị pH8

3.2.2 Kết quả nghiên của xác định ổ giá tri pH8,5

3.2.3 Kết quả nghiền cửu xác định ở giá trị pH9 3.2.4 Xác định mồi tương quan giữa điều kiện pII môi trường,

các chúng vi năm nghiên cứu

3.3 Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị nhiệt độ môi

trường ức chế kha nang sinh tong hap va hoat tinh collagenase

của các chúng vi nắm

3.3 1 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị nhiệt độ 14°C:

3.3.2 Kết quả nghiên cứu xác định 6 gia trị nhiệt độ 16°C

3.3.3 Kết quả nghiên cửa xác định ở giá trị nhiệt dộ Í 8°C

3.3.4 Xác định môi tương quan giữa ba điều kiện nhiệt độ môi

trường nuôi cấy với khả năng sinh tổng hợp và hoại tính

collagenase của 15 chúng vi nằm

3.4 Kết quả nghiên cứu xác định các giá trị hoạt độ nước môi

trường nuôi cấy ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

3.5 Kết quã nghiên cứu xác định các giá trị độ ấm không khí

ức chế khả năng sinh tổng hợp va hoal tinh collagenase eda

cáo chủng vi nằm

3.51 Kết quã nghiên cứu xác định ở giá trị độ âm môi trường 60%:

3.5.2 Kết quả nghiên cửu xác định ở giá trí độ âm môi trường 70%

3.5.3 Kết quả nghiên cứu xác định ở giá trị độ ắm môi trường 80%

3.5 4 Xác định môi tương quan giữa ba điều kiện độ âm mdi

trường không khí với khả năng sinh tổng hợp vả hoạt tính

collagenase của 15 ching vi nim

3.6 Kết quả nghiên cứu xác định tổ hợp các điểu kiện môi

trường ức chế khả năng sinh tổng hep va hoat tinh collagenase

của các chủng vi nấm

'TÀI LIỆU THAM KHẢO

PIT LUC ANE VI NAM PIIAN ITTY CG CHAT

PHU LUC 80 LIEUNGHTEN CUU

MUC LUC HINH VA BANG

NOIDUNG

Link 1.1 Céng thie cdu tao ctia hydroxyproline

Hinh 1.2 Trink tu sap xép cde avid amin trong phân tử Collagen

Hình 13 Nghiên cứu hoạt tỉnh collagenase của 12 chứng Coceidioides tmmitis trên thạch Csapek có 0,35% collagen gan bo type T

Hinh 3.1 Aspergillus clavato - nanica Batista (138)

Hinh 3.2 Aspergillus silvaticus Fennell and Raper (T65)

Tlinh 3.3 Aspergillus asperescens Stolk (T116)

Hinh 3.4 Aspergillus ustux Thom and Church (D45}

Llink 3.5 Acremonium achraceum Gams (T104)

Hinh 3.6 Cladospornan cladosporioides(itres.) de Vries (144)

Hinh 3.7 Didymostilbe sp (D132)

Tình 3.8 Gloeasporium sp (D160)

Hinh 3.9 Nectria inventa Dethybridge (D94)

Hinh 3.10 Penicillium cyanea - fulvm Biourge (TT2)

Hình 3.11 Penicillium chrysogenum Thom (T142)

Hình 3.12 Penicillium casei Staub (D71)

Hình 3.13 Penicillium italicum Wchmer (D100)

Llink 3.14 Penicillium citrinum Thom (D148)

Hình 3.15 Seapulariapsis chariarwmn Morton and Smith (D162)

Bảng 1.1 Các loại collagen và các gen cầu trúc

"Bảng 1.2 So sánh thành phân các aciÄ mi trong collagen và các loại prolein khác Bảng 1.3 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide

Hảng 3.1 12anh sách 15 chủng vi nấm lựa chọn nghiên cúu

Bảng 3.2 Két quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase 13 chủng vi ndm & pH8

Bảng 3.3 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tinh

collagenase 15 ching ví nấm ở pHS,5

Bảng 3.4 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính

collagenase 13 chủng vi nằm ở pH?

Bang 3.5 Méi tương quan giữa pH ứ vùng kiểm với khả nẵng sinh tông hợp

và hoạt tính collagenase của 15 chủng vi nằm

Bảng 3.6 KắI guả nghiên cứu xúc định khả năng sinh tông hợp và hoại tính

collagenase 15 chủng vi nắm ở diễu kiện 12C

Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh iéng hop va hoại tính

collagenase 15 chimg vì nấm ở điều kiện 16%

Bảng 3.8 Kết guá nghiên cửu xác dịnh khả năng sinh tông bợp và hoat tinh

collagenase 15 ching vi nằm ở điều kiện 2C

Bảng 3.9 Mỗi tương quan giữa ba diều kiện nhiệt độ môi trường nuôi cấu

với khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của 15 chủng vì nấm

Bang 3.10 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng sinh tổng hợn và hoạt tinh

collagenase Ì5 chủng vi nấm ở diều kiện hoạt độ nước môi trường 0,6aw

Bang 3.11 Kết quả nghiên cửa xác định khá năng sinh tổng hợp và hoạt tính

eollagenase Ì Š chủng vi nÂm ở điều kiện hoạt độ nước môi trường 0,63am'

Bang 3.12, Két guả nghiên cửa xác dịnh khả năng sinh tong hop va hoạt tính

collagenase 15 ching vi ndm ở Âiều kiện hoạt Âộ nước môi trường (,7aw

Bảng 3.13 Kết quả nghiên củu xác Ãịnh khả năng sinh tổng hop và hoạt

tink collagenase 15 ching vi nam ở diều kiện độ ẫm môi trường 6094

Bảng 3.14 Kết quả nghiên cúu xác định khả năng sinh tổng hợp và hoạt

tính collagenase 13 chùng vi nắm ở điều kiện độ Âm môi trường 70%

Bang 3.15 Kết quả nghiên cứu xác dịnh khả năng sinh tổng bợp và hoạt

tink collagenase 15 ching vi nằm ở điều kiện độ Âm môi trường 80%

Bảng 3.16 MỖt tương quan giữa ba điều kiện d6 dm không khí môi trường

nuôi cấy với khã năng sinh tông hợp và hoạt tính collagenase của 15 chúng

tinh collagenase 15 chiing vi nd S KTH

Bảng 3.18 Giá trị hệ số phân gidi collagen cia 15 ching vi nẫm ở các điều 66

kiện độc lập tương ứng với ĐKTH

Hệ số phân giải của vĩ nằm ở diều kiện pH 8,5

Hệ số phân giải của vĩ nằm ở điêu kiên pH 9,0

Hệ số phân giải ũn vĩ nấm ở điều kiên nhiệt độ 14G 1Iệ số phân giải của vĩ nằm ở điều kiện nhiệt độ 162C

dân giải của vĩ nắm ở điều kiện nhiệt độ 189G

Hệ số phần giải của vỉ nắm ở điều kiệu hoại độ rước xuôi trường nuôi

DAT VAN DE

Vi nâm trong tự nhiên rắt phong phú đa đạng Chúng có khả năng thích nghỉ

Tranh mê với diễu kiện sống, có thể tổn tại và phát triển trong điều kiện môi trường,

khác nghiệt, nghèo chất định đường, có các chat c chả, đưới các điều kiện nhiệt độ,

độ âm, pH khác nhau Có được khả năng đó là do vĩ nằm có khả năng thích nghi, từ

đó có thể sinh tông hợp các cnzyme ngoại bào giúp chúng phan huỷ các cơ chất sinh học, sử dụng để tên tại, phát triển, sinh sắn Trong các cơ chất sinh học có collagen,

là một loại protein của động vật

Collagen chiếm tới 25% lượng protein ở động vật có vú Nó baa gầm 29 loại

khác nhau vả là thánh phân chủ yếu của mô liên kết ở dộng vật có vú, giúp cho các

cơ quan có được bộ khung của mình, đồng thời tạo độ bản đản hỏi cho mé, co quan

tế chức Collagen là thành phan co bản của da và cững có ở các tế chức như gan,

sụn, xương [20]

Cáo nghiên cứu về khả năng sinh lông hợp và loại tỉnh các cnzyane phân huỹ

cáo cơ chất sinh học của vi nằm nói chàng cũng như phân hủy collagen cho thay,

tỉnh chất này của chúng có thê thay đổi theo các điều kiện mỗi trường như: rửuệt độ,

độ âm, pH, hoạt độ nước cơ chất, |14-17

Kết quả nghiền cứu tại Viện 69 chơ thấy vẫn tỏn tại loài vị nấm có khả năng, phat trién va gay hu hong một sở vật liệu đã được xử lý bằng hóa chất bảo quan

nghiên cứu khác tại Viện 69 cũng, cho thây khả năng sinh tổng hợp và hoạt tỉnh các

enzyme phan hoy co chat sinh hoc phu thuộc vào các điều kiện mối trường như,

nhiệt độ, độ ấm không khí, pLI, hoạt độ nước cơ chất [1,2,8,3,11].

Tuy nhiên, chưa có những nghiên cứu có tỉnh chất hệ thóng về các diều kiện znôi trường (nhiệt độ, độ âm môi trường, pIL hoạt độ nước cơ chất) có tác động ảnh

thưởng ức chế khá năng sinh tổng hợp và hoạt tinh collagenase cac ching loai vi

nấm liên quan bao quán thi thể ướp

Trong thời gian qua, Viên 69 hiện đã lưu giữ dược nhiều chủng vị nằm có

khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính enzyme phân hủy cao cơ chất khác nhau, trong,

đó có những chủng có khả năng sinh tng hop và hoạt tính collagenase Đây là

nguồn chúng vi nắm phục vụ cho các nghiên cửu vẻ tác hại của vi sinh vật dỗi với thị thể ướp bảo quản cũng như nghiên cứu tìm ra các biện pháp ngăn ngừa tác hại

của chúng,

Chính vỉ vậy, chúng lôi tiễn hành để tài nghiên cửu này với mục liều:

- Xác định được thông số các yêu tổ pH, hoạt độ nước cơ chất, nhiệt độ, độ Ấm môi trường gây ức chế quá trinh sinh tổng hợp và hoạt tínla collagenase của 15 chủng vi

nấm đã phân lập được trong mỗi trường lchrt vực quảng trường Ta Dình.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Phục hổi, lựa chọn 15 chủng vì nấm đại chu có khả nẵng sinh

collagenase va hoat tinh enzyme tết nhất từ bộ sưu tập tại Viện 68

2 Xác định các yêu tổ ảnh hưởng tới quả trình phát triển, sinh tổng hợp vả

thoạt tinh collagenase của 15 chủng ví năm ở các điều kiện:

- Độ pH môi trường nuôi cấy: 8.0, 8.5, 9.0 (Hoạt độ nước — 0,99 L 0,1; độ

ẩm không khi — 99% + 19%; nhiệt độ — 259C + 2°C),

- Nhiệt độ: L4°C, 16%C, 18°C (Hoạt độ nước = 0,99 + 0,1; pH = 7,0 = 0,2, độ

âm không khi = 99% + 1%)

3 Xác định lô hep didu kiện môi trường (duệt độ 16°C, RH 70%, pH

8,5, aw = 0,65) ánh hướng đến khá năng phát triển, sinh tổng hợp và hoạt tỉnh

collagenase của 15 chủng vi nằm

4 Từ đó xác định được các điều kiện tối nu gây ức chẻ quá trình phát triển,

sinh tổng hợp và hoạt tính collagcnasc của vi nắm

Chương 1

'TỎNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cơ cht collagen

Collagen là một nhóm protein chính trong người và động vật, chiếm khoảng

25% lượng protein của toàn bộ cơ thể, Collagen tập trung chủ yêu ở mô liên kết vả

là thành phần chính của đa, gần, xương, đây ching, sun va ring Collagen đảm nhận

tính co giãn của da, vi thế khi bị thoái hóa đo quá trình lão hóa, do tác động bởi các

yêu tổ lý, hóa, sinh học thì cơ thể xuất hiện các đầu hiệu trên da như tăng nếp nhăn, nhão da, kém săn chắc, [20]

Với da người, collagen có vai trò đặc biệt quan trọng Collagen chiếm 759% trọng lượng khô của da, là thánh phân chính trong cấu trúc đa Collagen củng với elastin tạo nên cấu trúc bên vững và dẻo đai cho đa, nhờ đó mà đa người có thế đàn hỏi, săn chắc và giữ được hình đáng cơ thé Theo lửa tuối, hàm lượng cau tric collagen bị thay đối do khả năng tổng hợp của cơ thế giâm củng với sự thoái hóa tự nhiên của collagen trong đa Từ sau tuổi 25, mỗi năm collagen của cơ thẻ giâm di khoảng 1% về khải lượng và câu trúc, độ đây, độ chặt chế giảm dân Chính vì thể

ma da khé dân, nhắn nheo, các nếp nhăn mới xuất hiện, nếp nhăn cú sâu thêm,

chủng xuống, hình đáng co thé thay đối Đỏ là hậu quả của sự lão hóa, thiếu hụt collagen từ đa Cũng từ đây người ta đá nghiên cứu chế tạo các loại sản phẩm bổ sung collagen cho cơ thế bằng các đường nống và đừng ngoai [20]

Tã có nhiều nghiên cửu cơ bản, sâu về collagen ở mức độ tổng quát cũng

như ở cắp độ phân tử Liiện nay người ta đã tỉm ra 29 loại (type) colagen và cũng đã xác định được các gen quy định từng loại collagen nay (Bang 1.1) Cac collagen typ

I, IL, IL, IV chiém tới hơn 90% tổng số collagen trong co thé Collagen typ I có trong da, gan, mach mau, cdc cơ quan, xương (thành phần chính của xương) Collagen typ II cé trong sụn xương, là thành phản chính của sụn Collagen typ HT có trong cơ Collagen typ IV là thành phần chính câu tạo mảng tế bào [20]

Collagen có kết cầu rất phức tạp Phân tử collagen (hay Tropocollagen) 1a

một sợi dải khoáng 300 nm có đường kính 1,5 nm, được tạo thành bởi ba chuỗi

polypeptit (chuỗi anpha), các chuỗi xoản với nhau tạo nên câu trúc xoắn của

collagen, cac chudi polypeptit lién két voi nhau trong chudi bei lién két hydro Các chudi polypeptit duoc téng hep tương tự nh các protein khac [20]

Bảng 1.1: Các loại collagen và các gen cấu trúc của nó [20]

I COLEAL , COLIA2 XVI COLI6AI

GOL4AI, COL4A4

IV COLAAS, COL4A6 XTX COL19A1

COTAA2, COI.4A3 COLSAl, COLSA2

VIH COI8AI, COIL8A2 KX COL23A1

COL9AI, COLSA2

COL9A3

xX COLIQAL XXV COL25A1

XI COI.12A1 XXVIT COL27A1

xO COLI3AI XXVII COL28A1 XIV COLI4AI XOUX COL29A1

XV COI.1SA1 XXVIT COL27A1

Thành phan protein trong collagen cỏ gần đây đủ cac loai acid amin, bao pdm tit cA

20 loai acid amin (Schrieber va Gareis,2007) Thanh phan acid amin có thế thay đổi tủy theo nguồn gốc của collagen, nhưng, vẫn tổn tại một vài tính chất chung và duy

nhất chơ tất cä collagen

Trong thành phần collagen không chữa cystein và trytophan, nhưng chứa

một lượng lớn giycine (Gly) chiếm khoảng 33% và proline (Pro) chiếm tỉ lệ 12% và ydroxyproline (Hyp) chiếm tỉ lệ 22% (Theo Balian và Bơwas 1977) Collagen là mét trong số ít những protein có chữa hydroxylysine (yl), ngoai ra trong thanh

phan collagen còn chứa khoảng chiếm tï lệ 1%

Bang 1.2 Šo sánh thành phân ote acid amin trong collagen và cáo loại prolem khác J 19/

(Số gốc/1000 gốc)

Proline va Ilydroxyproline li8n quan tdi cu tric bac 2 ctia collagen Nhimg amino

aoid này giúp giới hạn sự quay của bộ khung palypeptide, do đó góp phân tạo nên

sự bên vững cho cầu trúc xoắn ác bậc 3 Nhóm hydroxy1 của hydroxylproline đóng vai trò quan trọng trong sự bổn vững câu trúc xoắn ốc bậc 4 của collagen Polypeptide của collagen mà thiểu hyđroxyÏpreline sẽ tạo nên câu trúc gấp khúc ở nhiệt độ thập và sẽ không bên vững ở nhiệt độ thân nhiệt

1lyđroxyproline là một acid amin đặc trung của collagen mà các loại protein khác không có Hydroxyproline được hình thành sau quá tình diều chỉnh proline

khi dược kết hợp vào vị trí Y trong chuối Gly-X-Y, Hydroxyproline có công thức phan tử là CạIlạNO¿, khác với proline, trong công thức câu tạo của Hyp có gắn nhóm OH năm ở vi tri cachon gamma, acid amin nay cé vai trỏ quan trợng trong sir

én dinh cấu trúc của collagen, là dẫn xuất của proline trong quả trình hình thành

chuỗi collagen có sự xúc tác của enzyme hydroxylase preline và sự có mặt của

Vilamiu Œ để giúp bố sung thêm Oxy, thiểu vitamin C sẽ làm châm quá trình tổng: hợp lydroxvproline, ảnh hưởng dến quả trình xây dựng câu trúc protein gây ra những rối loạn trong cơ thể

NH

HO

a

HO Hinh 1.1 Céng thie edu tao cha hydroxyproline

Phan tit collagen bao gém 3 chudi xoắn lại với nhau tạo thánh collagen

triple-helix tao thanh câu trúc 3D- một mê hình lý trưởng cho các liên kết hydro giữa

các chuỗi [27] Mỗi chuỗi trong triple-helx quay theo chiéu kim déng hồ Triple- helix đái xấp xi 300nm va chuỗi có khối lượng phân tứ khoảng 105 kDa [25] Triple-helix duoc én định bởi liên kết hyđro nội giữa các chuối Trong câu trúc

phân tử collagen, do tương tác giúa các mạch polypeptide lam cho phan (i eb những vùng ky nước và vũng phần cực mang điện tích sẽ tạo nên khá nắng hảo

trước làm trương nở collagen Sự biển tính collagen làm cho các cần nối bị tách một phan hoặc hoàu toàn gây mên sự lách rồi các chuối do phá hủy các liên kết hydro,

chính điều này làm mất đi cấu trúc triple-helx Mô hình ° Triple-hehce” của

collagen dire trêu những nghiên cứu về hiện tượng nhiễu xa sợi Chuỗi nhiễu xe sợi

thể hiện trên mức trung binh của toàn bộ phản tử collagen, và mỏ hình dặc trưng thể tiện dó là sự sắp xếp lặp di lặp lại của các chuối polypepiid, thông thường lá Gly- Pro- IIyp

Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino

acid trong môi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này Mỗi sợi collagen này

được cầu tạo từ ba chuỗi polypeptid nổi với nhau giếng như sợi dây thừng Câu trúc

của collagen tương tự như hình xoắn óc, mỗi một chuỗi polypeptid trong collagen

được câu tạo từ các acid amin theo một trật tự, thong thudng la Gly - Pro - Y, hoặc

Gly - X - Hyp

Hình 1.2 Trình tự sắp xếp các acid amin trong phân tứ Collagen

Trong đó X, Y là những đơn vị aminoacid khác nhau, cỏ thẻ là proline (Pro) vả

hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1⁄6 chiều đải chuối Glycine chiem gan 1/3 trong tổng số các amino acid và nó được phân bồ một cách déu đặn tại vị trí mỗi 1/3

xuyên suốt trong phân tử collagen Do gÌycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nỏ cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chế với nhau hình thảnh nên một đường xoắn óc với khoảng trồng nhỏ ở phân lõi Tổng cộng chỉ riêng

proline, hydroxyproline va glycine đã chiếm 1⁄2 chuỗi Collagen Các aeid amin còn

lại chiêm 1

Bảng 1.3 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide [19]

Triple helix Ty 18 so với tổng bộ ba (%)

chưa được hiểu biết đây đú, nhưng ánh hướng của chúng trong việc gắn kết phần

bên phản lử collageu hình thành nên sợi và bán kính của sợi đăng đuợc nghiền gứu

Ngoài ra, trong phân tử collagen cỏ những vủng gồm khoáng 9-26 amino acid tai cde điểm đâu mút amino hay carboxyl của chuỗi Các vùng này không sát nhập với cấu trúc xoắn ốc và được gọi lả telopeptide

1.2 Sơ lược về ví nấm và quá trình sản sinh các enzyme ngoại bảo

Nam (fungi) Ja mét nhom rất lớn, rất đa đạng trong sinh giới Hiện nay, đã có

8.000 chi và 80.000 loài được mnô tả và công nhận Tuy nhiên, còn nhiều loài ở khắp

noi trên thê giới chua được phát hiện Theo ước tính gan đây, con số này vào

khoảng 1,5 triệu loài [20]

Vĩ nằm có khả năng phát triển & han hat cde dang sinh thdi, có thể sử dụng hấu hết các sân phẩm tự nhiên và các sản phẩm đo con người làm ra Chúng, là sinh vật dầu tiên và lý tưởng sinh trưởng 6 vung hoang đã, vi chứng có khả năng thay đổi mạnh

mẽ để thích nghỉ với điêu kiên sống Sự đa dạng của vi nâm không chỉ ở sự khác biệt vẻ hình thải mã cón ở các đặc diệm sinh lý, sinh hoá của chúng, Vi du, cdc lodi của chỉ 4ureabastdiiem có thể sinh trường ở nơi nhiệt độ thấp (vùng Antarctica) trên

cae hon đã ở nhiệt độ từ -100G đến -20°Ơ, có thể chống chịu ở nhiệt độ tháp lừ -

20°C đến -80°C Nhưng chỉ nảy cũng cỏ những loài cỏ thể sinh trướng ở vùng nhiệt

đới Phân lớn cáo vị nằm là hiểu khí và sinh trưởng ở hoạt độ nước cao.

Nương người ta đã phát hiện được vi năm ky khi ở dạ cỏ của cửu và cũng đã phat hiện được nhiều loài sinh trưởng được ở các cơ chất có hoạt độ nước thấp (aw

<0.85) Người ta có thể phân lập được nằm sống ký sinh, cộng sinh hoặc gây bệnh

cho tảo, rêu, các thực vật và các loài nắm khác (bao gồm cá địa y), các động vật

chân đốt, các động vật không xương sống và có xương sống Các cơ chất như không

khí, đất, nước, phân, thức ăn, e; a phẩm thực vật, dâu khí và các sản phẩm dược

học cũng là nguồn phân lập được vì nằm |3,5|

Sở đĩ vị nắm có thể thích nghỉ mạnh mẽ, phát triển ở nhiều diễu kiện môi trường khắc nghiệt là bởi chúng có cầu tạo đơn giản với thành tế bào vững chắc giúp cho chịu đựng và ổn định câu trúc nội bào, đẳng thời có đặc điểm sinh học (chuyén hda, sinh sắn, ) đặc biệt, có thể thay đôi để sử dụng các cơ chất võ cơ hay

hi cơ phục vụ cho sự phát triển, sinh sản của chúng Vị nâm tiết ra cac amylase,

protease, lipase, exydase (cnzyme oxy hoả), các acid amin, cae enzyme pectin,

catalase, cellalase Tổ hợp enzyme của vi nắm phong phủ hơn so với các vi sinh

phân loại quốc tế

thể có những biến đổi về hình thải để tăng bề mặt hập thu các chất và tĩng cường răng lực hấp thu chất dinh dưỡng bằng cách khải động các gen tiểm ân hoặc đóng các gen gây tiêu hao năng lượng, tạo các hướng chiyển hóa mới Sinh tổng hợp nên

các protcase ngoại bào của các vị nấm trong dỏ có collagcuase là ruột đặc điểm giúp

chúng có thể phân hủy các xảc động vật trong chu trinh phản hủy của tự nhiên, sử

dụng các proleim làm nguồn carbon và nắng lượng để sinh trưởng phát triển Các

protease sé thiy phan các protein và polypeptit thành acid amin; acid amin van

chuyển vào tế bảo vá được phân giải [3,5]

Whiéu điều kiện tự nhiên như nhiệt độ, độ âm, hoạt độ nước cơ chất, pII môi

trường nêng độ cơ chất, áp suất, nổng độ khí muỗi, bức xạ, có thể tác động tới

khả năng phát triển, thích nghỉ cũng nlưư khả năng sinh enzyme phan biy co chất

10

nói chung va collagen noi riéng Du cé kha nang thich nghi cao nhưng với vi nấm thay với các vị sinh vật kháo cũng chỉ có thể sinh trưởng trang những diéu kiện tới

hạn nhất định Trong nghiên cứu của các tác giả C Casals, T Vinas, R Torres, C Griera and J Usall (2008) đã chí ra giới hạn về nhiệt độ, hoạt độ nước của 3 loái vĩ nấm nghiên cứu Cả 3 loài A4omilimia laxa, Monlima fructicola va Monilinia

fructigena déu khong thể phát triển ở nhiệt độ 38°Œ và hoại độ nước cơ chải — 0,87 trong 30 ngày nuôi cấy Ở nhiệt độ 0°C, cả 3 loài đều phát triển được tại các hoạt độ

nước 0,98 0,27; 0,95 nhưng lại không phát triển được ở hoạt độ nước từ 0,90 trở

xuống Ổ cùng một điển kiện nhiệt độ và hoại độ nước, sự phát triển của 3 loài là không giống nhau [15]

Đề nghiên cửu xác định vi nằm có khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase hay khéng, người ta sử dung collagen làm cơ chất nuôi cây (hình 1 3) trên môi trường dic, Collagen có thể dược sử dụng để thay thế một phản nguồn cacbon (Sacarose) của môi trường Czapek hoặc chỉ cần thêm vào môi trường nảy

Trường hợp thay thể nguồn cacbon thì không cân phải sử dụng thuốc thử để phát Tiện vòng phân giải collagen va ngược lại khi thêm vào thì phải sử đụng thuốc thử clorua thủy ngân (LIgCl;) [4]

Có tác giả nghiên cứu sâu về hóa sinh vị sinh vật đã thực hiện nuôi cây trên

mỗi trường lồng cỏ cơ chất collagen Khi đỏ collasenase của vi nấm được phát hiện

trong địch cấy và thủ gơm bằng các phương pháp sinh hớa khác nhau [24,26]

11

Hình 1.3 Nghiên cứu hoạt tỉnh collagenase của 12 chủng Coeeidioides

immitis trén thach Czapek có 0,5 collagen gân bo type I (David M Lupan, 1986)

1.3 Nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp vả hoạt tính collagenase vi nam

1.3.1 Qúa trình sinh tông hợp va hoat tinh collagenase vi nam

Vi nam là sinh vật dị dưỡng, cỏ kha nang đồng hỏa các chất hữu cơ lam

nguồn các bon vả năng lượng [Š]

Vi sinh vat noi chung và vi nắm nói riêng đêu có khả năng sinh tổng hop

enzyme va phan giai co chat nhờ hệ thong enzyme của chúng Bình thường quả trình sinh tổng hợp một enzyme ngoại bảo của vi sinh vật phụ thuộc vào nhiều yêu

tổ: nông độ cơ chất, pH, nhiệt độ nuôi cấy, độ àm, Đề định tính quá trình nảy

người ta có thể sử dụng các phương pháp hóa sinh vi sinh vật Phương pháp nảy

thường sử dụng tính chất hóa sinh của enzyme tạo ra, có thê tác dụng với các chất

khác nhau trong môi trường nuôi cây, lảm thay đổi mau sắc của môi trường, hoặc môi trường cỏ đặc điểm đặc biệt để nhận ra như sinh khí, tạo váng, Các chất chỉ

thị mảu có thể được đưa vào môi trường nuôi cây lỏng hoặc đặc đẻ phát hiện xem

enzyme đặc hiệu có được sinh ra không Với mỗi loại enzyme thì cỏ những phương,

pháp phát hiện khác nhau Đề thu héi va tinh chế enzyme, người ta dùng phương pháp, sinh hóa như sắc ký, gây tủa, lọc, để có thể thu được enzyane ở dạng tỉnh khiết [4]

12

Hoat tinh enzyme 14 kha ning phân bủy co chat dặc hiệu do hoạt dộng của

enzyme Qué trinh phân hủy cơ chất này có thể là độc lập với quá trình sinh enzyme cia vi nam, nhung thường có môi liên hệ mật thiết, do đây là hận quả của khả năng thích nghĩ của vi nấm Trong quả trình bắp thụ dinh đường, của vi nấm, không chỉ

mt ma nhiéu enzyme, nhiều chất chuyến hóa được sinh ra, tạo chuối các phan tmg

giúp cho phần giải và sử đụng được cơ chal Hoal tinh enzyme cha vì nằm với một

cơ chất cụ thẻ mạnh hay yếu, có hay không là một quả trình tương tác của nhiều yếu

tế nội tại cũng như điều kiện cụ thể của môi trường Chúng vi nâm có thẻ sinh tống hop ra ml enzyme ma khéng co hoạt tính ensyrme ấy, nếu rửu: điểu kiện mỗi

trường không chơ phép enzvrae dỏ hoạt dộng [4,5]

Đề xác đính hoạt tính enzyme cũng có nhiễu phương pháp Tuy nhiên, nguyén lic chung cia các phương pháp lả dựa trên số lượng cơ chất đã bị phân hãy

dé đảnh gia lượng, enzyme đã sử đụng trong quả trình phân hủy cơ chất Lượng cơ

chất bị phân hủy nhiều tức là hoạt tính enzyme mạnh, phân hủy it là hoạt tình yếu hơn Trong trường hợp vi sinh vật được nuôi cây trên môi trường lồng, người ta xác

định khá năng sinh tổng hợp vả hoạt tính enzvme đơn gián bằng cách chiết lây dịch thô và ứng dụng kỹ thuật đục lố trên thạch để xác định véng phân giải cơ chất ở đĩa thạch Khi vi sinh vật nuôi cấy trên môi trường dặc, xác dịnh vòng phân giải cơ chất

trực tiếp bởi khuẩn lạc vi khuẩn tạo ra [4]

Sinh tống hợp và hoat tinh collagenase cia vi nam cing gidng nhu các enzyme khác và là một quá trình tổng hợp bao gồm từ khâu sẵn sinh ra collageriase

tới hoạt động phân giải cơ chất collagen Quá trình nảy có thể được xác định thông qua các kỹ thuật vì sinh vật, phát liện khả năng phân giải cơ chat cia collagenase trong đĩa thạch dặc

1.3.2 Nghiên cứu về sinh tẵng hợp và hoại tính collagenase cia vindm

Sinh lỗng hợp và hoạt tính collagertasc đã được nhiều tác giã nghiên cửu và

thấy rằng, có nhiều yêu tó ảnh hưởng tới sự phát triển của vị nằm cũng ảnh hướng, tới sinh tổng hop v4 hoat tinh collagenase vi nấm Các yếu tổ đó là nhiệt độ, pH,

hoại độ nước cơ chất, độ âm mời trường không kHủ, các an có trong môi trường,

13

Nam 1992 Chantal Barthomeuf nghiên cứu đặc diễm collagenase ctia ching A.mger LCF 9 thay nhiat 46 tai um cho hoat tinh enzyme 1a 6 45°C, pII tối ưu là 7.2,

có một số chất gây ức chế hoạt động của enzyme như EDTA, PMSF [16]

Năm 1980 Sehenck 8., đã nghiên cứu với Arthrobotrys amerospora, là loài

vi nam ky sinh trên gi dita Tac gia thay rắng loài này có khả năng phân huỷ

collagen và cho biết hoạt tỉnh collagrenase của vì nấm phụ thuộc vào pH O pH bic 2,6 dến 10, hoạt tính enzyme này thể hiện rõ, trong đỏ tối ưu ở pH; còn ở pH11 thi hoat tinh enzyme bi tre ché Collagenase ciia loai nay có thế hoạt động ở đải nhiệt

độ khả rộng từ 25 đến 60°C [26]

Năm 1986 David M Lupan va Pasipanodya Nziramasanga đã nghiên cửu

hoạt tính phân giải collagen của 12 chúng thuộc loai Coccidioides immitis, thay 1ầng khả năng sinh lông hợp và hoạt link enzyme cia Coccidivides immitis hoal động tốt trong giới bạn nhiệt độ từ 25 - 37'C và pH từ 5,5 - 8,0 Các chúng này

không phân giải được collagen không hoà tan [18]

Năm 1994 Dahot MU nghiên cửu đặc diễm sinh protcasc của Penieffifaơn

expansum, thấy nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme 14 6 35°C và pll là 10,5,

ở pH9 hoạt tính enzyme giảm di 50%, 4 pH8 còn 40%, ở pH7 còn 5%, RH đưới 7

và trên 11 mắt hoàn toàn, Ở 25'C hoạt tính enzyme con 60%, ở 40C cỏ hoạt tỉnh

cao nhất là 80%, ở 45°C la 60%, & 55°C la 45%, trén 60°C thi hoat tinh enzyme mat

hoàn toàn [17]

Năm 2007 Andrea Astor

nginén cit anh hưởng cửa hoạt độ nước, ruột dé

đổi tới sự phát triển của 7 chủng vi nằm thuộc các loai Aspergillus niger, A

awamori va A carbonarias phân lập từ các cơ chất khác nhau thay rang, bau hết các chủng nắm sợi phát triển tôi ưu hoạt dộ nước (aw) — 0,97 và ở nhiệt độ 30°C, chỉ có

1 chủng phát triển tôi ưu ở 25°C Hoạt độ nước tôi thiểu cho các chủng vi nằm phát

triển là ở 0,85 (với nhiệt độ tôi ưu), Ở 15ẴƠ (aw 0,95 va 0,97) có 2 chủng mọc

dược Tuy nhiên, tới 21 ngay nudi edy & aw = 0,87 va 30°C khéng thay các chủng vĩ nam phat trién [13]

14

Theo Lương Đức Phẩm, Hồ Sướng (1987) protease của nắm mốc cỏ khoảng, 'ÐHl hoạt động rộng hơn protease của động vật và vi khuân Protease của vi khuẩn hoạt déng 6 ving pH 7 - 8 Protease của nắm mốc 4 oryzae hoạt động trong khoang ti 3,5 - 9, tdi uu & pH 7 Dựa vào khoảng pH hoạt động ngudi ta chia

protease lam 3 loai: loai axit hoat déng 4 ving pII 2,5 - 3, loại trung tỉnh hoạt động

ð pH 6- 7,5; loại kiểm hoạt động trong khoảng pH 8 - 11[10]

Theo Nguyễn Làn Dũng, Nguyễn Đình Quyền (1996) có nhiều loại vị khuẩn,

vi nằm tham gia vào quá trình phân giãi protein trong sự thôi rửa của xác động vật

Mỗi loài vĩ nắm thường có một trị sẽ hoại độ nước (aw) lối ưu và một trị số aw lối

thiểu Điều này cũng hoản toàn phủ hợp với nghiên cửu của một số tác giả như J 1

Ti và I H B Chistian Các yếu tô khác như pH, nhiệt đô, nỗng độ oxy, áp suất,

cũng ảnh hưởng lới sự sinh trưởng và quá trình sinh tổng hợp và hoạt tính cnzyie

phân giải cơ chất Ở mỗi yếu tổ đều có những, giả trị thấp nhất @nininum), tốt nhất

(optimum), va cao nhất đổi với sự sinh trưởng cững như sinh tổng hẹp và hoạt tính

enzyme cua vi nam | 5,23]

1.3.3 Nghiên cứu về sinh tông hợp và hoat tinh collagenase, protease ctla vi nắm trong công tac bao quản lâu đài thí thế ướp

Cáo nghiên cửu về khả năng sinh tổng, hợp và hoat tinh collagenase ctia vi

nấm phục vụ công tác bảo quản lâu dài thì thẻ ướp chưa thấy có nơi nào công bề, kế

cã trong và ngoài nước

Viện 69 đã có những nghiên cứu về sinh tổng hop collagenase, protea:

sinh vật phục vụ nhiệm vụ được giao

Năm 1990, Doãn Huy Nghỉ và cộng sự đã khảo sát nắm sợi trong môi ưrường

không khí, dẳng thời tiến hành nghiên cứu khả nắng sinh tổng hợp và hoạt tính protease của các chủng vi nắm nảy trong các điều kiện vẻ nhiệt độ, độ 4m khác han, Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khả rững sống cũng rhư khả nắng sinh tổng hợp enzyvme của các chúng loài nằm sợi phụ thuộc vào nhiệt dộ và dé âm Ở nhiệt độ L6”C tỷ lệ các chủng nằm sợi có khả năng phân giải proteim thắp hơn nhiều

so với ở diễu kiện nhiệt độ 289C (cùng điều kiện độ âm 759) [11

15

Trong dé tai cap nha nước của Viện 69, năm 2000, khi nghiền cửu 19 chủng, nam sợi phân lập được từ môi trường khu vực Làng, thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme phan buy các cơ chất sinh học của các chủng nằm sợi phụ thuộc vào nhiệt

độ và hoạt độ nước môi trường nuôi cấy Một số chủng nắm sợi có biểu hiện hoạt

tinh enzyme 6 30°C nhung 6 16°C thì lại mắt khả năng đó Khi hoạt độ nước thâp

đưới 0,8aw thì các chẳng vì năm nghiên cứu mắt khả năng phân giải các cơ chal

sinh học |2|

Đổ tài cấp bộ năm 2002 tại Viện 69, đã nghiên cửu khả năng phân giải các cơ chat gelatin va protein cơ ướp của các loài vĩ năm ở các điều kiện khác nhan Hai

thang nhiệt độ 28°C và 16°C, bén hoạt dộ nước cơ chất law, 0,9aw, 0,#aw, Ú,7aw,

bón độ ấm không khí 100%, 90%, 80% và 70% được thiết lập Để tài đã xác định được điểu kiện độ âm và hoạt dé nude ue chế sự phát triển, khả nẵng sinh tổng hợp

và hoạt tỉnh gelatinase của vi nấm là RH < 70% va aw < 0,8 Tuy nhiên, đề tài không nghiên cứu với cơ chat collagen, điều kiện pÏT môi trường chưa được nghiên

sứu |9|

'Irong để tải cấp nhà nước năm 2003 tại Viện 69, cáo tác giá cho biết, khi

hoạt độ nước nhỏ hơn 0,9 thì các loài nắm sợi tra khô nghiên cứu mật khả năng sinh enzyme phan huy co chat gelatine [8]

‘Nam 2005, trong dé tai cắp bộ, cáo tác giả ở Viện 69 da tiến hành nghiên cửu

sự phát triển, khả năng sinh tống hợp và hoạt tính lipase, gelatinase của các chủng

vi nấm ở điều kiện rửiệt độ 28'C, với dãi hoạt độ nước từ 0,65 - 0,9 Tuy nhiên,

nhiên cửa vẻ khả nắng sinh tổng hẹp và hoạt tính collagenase cia vi nắm ở các điều kiên môi trường đã chưa có điều kiên để thực luện [1]

1.4 Bộ sưu tập vi nấm phân hủy các cư chất sinh học tại Viện 69

Từ nhiều năm nay, nghiên cứu về vi nằm và phương pháp phòng cl

tác lại của chúng lả một nhiệm vụ quan trọng của Viện 69 Đơn vị đá tham gia

nhiều dễ tải nghiên cửu cấp Bộ, cấp Nhả nước vẻ nắm sợi Năm 2006-2009, thực

thiện đề tài “Nghiên củu phân lập, phân loại, bảo quản một số chủng nắm sợi có hoạt

tỉnh œrsyne gặp trong môi trưởng khu vực Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh”, Viện 69

l6

đã tạo được bộ sưu tập gồm 135 chung vị nằm cỏ khá năng sinh enzyine phân lúy 5

loại cơ chất: tỉnh bột, xenllulo, gelatin, collagen, iipit Trong đó cỏ 67 chủng cỏ khả

nang sinh téng hợp và hoạt tỉnh collagenase [6] Các chủng vi nằm trong bộ sim tập hiện đang được bão quản bằng hai phương pháp, trong glycerol lạnh và trên

silieageL

Do tính chất, yêu cầu nhiệm vụ nên công trình Lăng Chủ tịch Hỗ Chí Minh

đã dược thiết ké và sử dụng các công nghệ hiện đại dé chống sự xâm nhập của vi sinh vật nói chung và vi nằm nói riêng Tuy nhiên, đo là hệ môi trường mở nên các

vị sin vật trong khu vực luôn được bỏ sưng Hơn nữa, với khả năng thích nghỉ

u rõ và dánh giá

mạnh mẽ vả biển dị của vị sinh vật thì công tác nghiền cứu dễ h

chỉnh xác mức độ gây hai, du báo nguy cơ và để xuất thêm các biện pháp phòng chống tác hai của chúng là không thể thiếu

Bộ sưu tập tại Viện 69, là nguồn chúng ví nắm có hoạt tính sinh học cho

'phép các nghiên cứu sâu vẻ các đặc điểm sinh học của vị nảm, kế cả các nghiên cứu

vẻ thích nghị, biển dị, khả năng chịu dựng các yếu tổ ức chế, tiêu diệt chủng, mà trước đây chua có điều kiện để tiến hành Nghiên cửu về khá năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nằm dưới ảnh hưởng của các điều kiện môi trường là

một trong những nghiên cửu dỏ,

17

Chương 2

NG, VAT LIEU, PHUONG PHAP NGHIÊN CỨU

2.1 Đỗi tượng nghiên cứu

15 chủng vị nằm có khả năng phân hủy collagen phân lập dược từ khu vực

quảng trường l3a Dinh Dây là các chủng vi nấm đại điện trong số 67 chủng dang

bão quản bằng phương pháp bảo quản trong glycerol 10% và đề ở nhiệt độ -20°C Các chủng này dược phân lập, bảo quản năm 2006, bảo quân lại nắm 2009

2.2 Vật liệu nghiên cứu

~ Dụng cụ, trang bị nuôi cây: Kinh hiển vì quang học, lủ âm nuôi

vật, tủ vi khi hậu, cân vật tư hỏa chất, máy do pH, máy khuấy từ, đĩa petri, ông,

nghiệm

2.2.2 Môi trường nuôi cây, cơ chất, bóa chất

- Mỗi trường nuôi cấy, phục hải vi nằm: Malt extract agar (Merck - Disc)

- Mỗi trường xác định khả năng sinh tầng hợp và hoạt tính collap.enase ota vi

xâm: Nuiriert agar 0.1% co chal collagen

- Cñu hỏa chất khác: Glyxedu, clorua thủy ngân - HgCl, „ nahi liểroxit -

NaOH, axit clohidric - HC] dam đặc (các hóa chất, môi trường nuôi cấy, cơ chất déu

của Merck-Dwe)

2.3, Phuong pháp nghiên cửu

2.3.1 Phương pháp phục hội, lựa chọn các chủng vi nằm nghiên cứ

18

- Phục hổi 67 chủng vi nấm cỏ khá năng sinh enzyme phân huý cơ chất

collagen đang bảo quản lạnh sầu theo phương pháp của Smif & Onions (1994) [7]

Tam tan bang nhanh và cây vào méi trong Malt extract agar

- Danb giá đố phục hồi cũa vi nấm theo phương pháp F-P.Simione, M.S &

EM Brown, B.8.1991): có 6 mức độ phục hỏi là rất tốt, tốt, khá, trung bình, yếu,

Cáo đặc điểm hình thái đặc trưng cần quan sát:

- Dặc điểm của sợi nấm: Miàu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngần

- Đặc điểm của cơ quan sinh săn: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ

quan sinh san

- Dặc điểm của bảo tử: Hình đạng, cầu tạo, cách sắp xếp

Cáo bước thực hiện xác định đặc điểm hình thái vi nằm gồm: lâm tiêu bản,

quan sát trên kính hiển vị; vẽ hình và nhận xét vẻ hình dạng chung của sợi nằm, đựa

vào khóa phân loại xác định tên loài

* Lâm tiêu bản

- Làm tiêu bản không nhuộm: Lấy một it sợi nắm và cơ quan sinh sắn trên mặt thạch bằng que cay, dit 1én lam kinh đã hơ nóng làm sạch đầu Đậy lamen ép nhe cho n định sợi nắm

~ Lâm tiêu bên nhuộm xanh mnelyler: Tâm tượng tự lrên, khi dậy bamen trước

khi ép thi nhỏ 1-2 giọt xanh maetylen vào góc lam kinh cho thẩm vào sợi nấm, ép

19

she lamen Lay xanh metylen thừa bằng giấy thắm Có thẻ nhỏ thuốc nhuộm trước, lẫy sợi nắm và cơ quan sinh săn sau

* Quan sát trên kính hiển vỉ

- Dưa tiêu bản vào vị trí, quan sát lần lượt ở các vật kính như trong quy trinh

sử dụng kính hiển vị

- Xác định các đặc điểm của sợi năm, co quan sinh sax, baa i Siz dung,

thước do trong kính dễ xác định kích thước các cơ quan sinh sâu, bảo tử

* Vẽ hình và nhận xét về hình dạng chung tủa sợi năm

Một số đặc điểm cân lưu ý ghí chớp, vẽ hình làm cơ sở cho phân loại vì nấm đựa trên các khóa phân loại về hình thái:

- Bảo tử: vị trí, hình dạng, kích thước, cách sắp xép

Đặc diễm hình dang của bào tử có khi rất đặc biệt: slip, cảu, đải, giống hạt hay quả nào đó, nhiều loại hình đạng thay đổi khi bào tử con non tdi khi gia: bé mặt

Đảo tử gó rãnh, rồnh nông hay sâu, vị trí rãnh ở trung tầm lay lệch; phẳng hay có

gai, gai day hay thưa, đêu bay không đều, gai nhọn bay tu, bet dang vay

Đặc điểm sắp xếp của bảo tứ: rời rạc hay nỏi tiếp; nối tiếp nhau thành chuối,

đài, ngăn, giữa các bảo tử kê tiếp có tạo dé hay khóp nẻi không, khớp nỗi dang gi,

có gì liên kết giữa các bảo tử

đặc điểm khác của bào Ui

Kich thước các chiêu ngang, đài, kích thước

(nêu cản)

- Cuéng sinh bảo tứ: Sinh ra từ dâu, thân sợi nắm hay dau khi sinh, có tạo

‘bong không hình đạng ra sao, kích thước, mâu sắc, thành trơn hay xử xì

- Thể binh: [inh dang cé 1a thé hinh trụ, trái xoan, chép, thot

đãi, rộng bao rêu; số lượng day hay thưa; tạo vòng hay tạo cụ

Ngoai ghi chép oie die diễm vi thể, cần ghỉ các đặc diễm của khuẩn lạc: hình dang, mau

điêu kiên, xác định các đặc điểm siêu vi thể của bào tử, thể bình, cuồng sinh bào tử,

„ tác độ phát triển, có tạo hạch nằm, thể quả, chất tiết không Nếu có

sợi nấm để định danh thêm clainh xác, rõ ràng,

3.3.3 Phương phúp làm mẫu nắm nghiên cứu trên kinh hiển vì điện tử

quét (SEM) JSM-S410LV

* Chuẩn bi:

- Chuẩn bị mẫu: mẫu dã dược muôi cấy trên dĩa thạch hoặc trong ông nghiệm thời gian 7-10 ngày, bê mặt mẫu cần khê thoáng, tránh 4m ướt

- Chuẩn bị dụng cụ và hóa chải:

+ Đề làm mẫu: sử dụng, để hình trụ tròn (chuyên dụng với kinh SEHM) đường, kính § mm, cao 1 om, một đầu dan đăng dính cacbơn 2 mặt và cắt viễn băng đính

cho vừa văn bể mặt dễ, một đâu ghi kí hiệu hoặc tên mẫu bằng bút đạ

+ Một cóc thủy tĩnh thể tích 50 ml

1 Một đĩa petri, đán băng đính 2 mặt kích thước khoảng 4x4 em lên chính

giữa mặt trong đĩa

* Tiên hành:

- Dinh mẫu lền mặt băng đính cacbon:

+ Tay trái câm dia petri bằng 5 ngón tay, một đĩa song song lòng bảu tay, mặt

thạch có mẫu hướng ra ngoài, tay phải cảm để, mặt băng đỉnh các bơn hưởng ra

ngoài

+ Ấn mặt để băng dinh cacbon vào bể raặt mâu trên đĩa thạch, một lục vừa

đủ đễ có thẻ thu được câu trúc nằm cân soi (n quá mạnh thì bào tử hoặc sợi nâm sẽ

tị dập nát hoặc cấu trúc năm chồng lên nhau gây khó quan sat)

- Có dịnh mẫu bằng hơi Osmic:

+ Dinh mặt để không có băng dính cacbon lên băng đính 2 mat trén dia petri

đỉnh nhiệt

(vd tl é trong mol lân)

+ Dũng pipet bút khoảng 2 ml đụng địch osmic 2% trong mước cho vào cóc

Thủy tính.

+ Up đĩa peui có dinh mẫu lên cốc thúy tinh cé osmic, sau dé dé trong tủ hút

cho osmie bay hơi, thời gian 2 giò

~ Ma phủ mẫu: bằng mảy mạ phủ vàng JFC 1200 của hãng JEOL, thời gian

mạ 6Ú giây

- Soi mẫu: bằng kính ITVDT quét TSM-5410LV ota hang JEOL, chụp ảnh / link bing phén mém Sem Afore

2.3.4 Tiên hành xác định khả năng sinh lỗng hợp và koat tinh collagenase

theo phương pháp của Laster Hankin, 8 Anagnistakis,(1975) voi cdc ching séng sét [7]:

- Chuan bị các đĩa méi truémg Nutrien agar (Meork) có 0,19% collagen (hoạt

độnước 0.99 0,1; dé âm không khí 99% 41%; mbididd 25°C 42°C; pH 7/0

+ 0,2,

- Cay vi nấm trên đĩa môi trường đặc thanh 3 điểm, Để đĩa môi trường ở

25°C/5 neay trong tủ nuôi cẩy vi sinh vat Binder (Dức) Mỗi chủng ví nằm cấy 3 dia (3 lin)

- Thát hiện vòng phân giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thử HgGl; Tỉnh hệ số

phân giải cơ chất với từng chủng vị nắm theo công thức: I— R„”/Rịˆ

Trong đó: — R; là bán kính vòng phân giải, nun

Ry là bán kính kinh khuẩn lạc, mm

Hệ số phân giải 1 thể hiện klrả năng sinh tổng hợp và hoạt tỉnh enzyme của ví xiấm Hệ sỏ Ï càng cao thì khả nàng sinh tổng hợp va hoat tinh collagenase cang 1én

- Căn cứ vào thành phân, số lượng các chỉ, loài vi nắm sống sót để lựa chọn

15 chúng vi nằm đại điện, có khã năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase tốt

nhất,

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu xác định một số điều kiện môi trường ức chế khả năng sinh tổng hợp va hoat tinh collagenase ctia cde ching vi ndm

2.3.3.1 Nghiên cứu xác dinh cdc gid tri pH te ché kha nang sinh tổng hợp

và hoạt tính collagenase của các chững ví nấm

Nghiên cứu các giá trị pII: 8,0; 8,5; 9,0 ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng,

hep va hoat tinh collagenase của các chủng vị nằm (hoại độ nước — 0.99 + 0,1; độ

âm không khi ~ 99% + 1%; nhiệt độ — 25°C + 2°C) Các bước tiền hành:

Tạo các dĩa môi trường nuôi cấy có các giá trị pH khác nhau: môi trường,

Nưtriemt agar (Mecrk), collagen Ø,1%, pL1 điều chỉnh bằng NaOII LM và HƠI 1M

Cây các chúng vi nắm nghiên cứu trên các đĩa môi trường có giá trị pLL khác

nhau ở trên Nuôi cấy ở 25°C trong tủ nuôi cấy vỉ sinh vật Binder (Đức)

- Xác định pH ức chê khả nàng phát triến, khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của các chủng vi nắm nghiên cứu

+ Theo đối và đo dường kinh khuẩn lạc vì nằm sau 3, Š ngày Nến vi nằm không phát triển, nuồi cây thêm tới ngày thứ 30, vẫn không có khuẩn lạc vi nấm

xuất hiện, kết luận pH ức chế vĩ rắm nhọc tới ngáy thir 30

1 Phát hiện vòng phâu giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thứ HgŒI; Tính hệ số phân giải cơ chất (pH) Nếu không có vòng phản giải, có thể kết luận ở pH dé dé

tức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm

2.3.5.2 Nghiên cứu xác định các giá trị nhiệt độ môi trường ức chế khá năng sinh tong hợp và hoại tính collagenase của các chủng vi nằm

Nghiên cứu các giá trị nhiệt độ: 14°C, 16*C, 18°C ảnh hưởng đến khả năng,

sinh tổng hợp và hoại lính collagenase của vị nấm (hoạt độ nước 0,99 + 0,1, pH

3,0= 0,2; độ âm không khí = 99% + 1%) Các bước tiên hành:

- Tạo các đĩa môi trường nuổi cấy: môi trường Nutient agar (Mecrk), có collagen 0.1% hấp vô trùng ở 121C/15 phút

y các chủng vỉ nấu nghiên củu lrên đĩa môi trường đặc Nuôi cây ở tô vĩ

khi hậu RCMED (Đức) với các dai nhiệt độ nghiên cứu

- Xác dịnh nhiét dé ue ché kha ning sinh téng hgp va hoat tinh collagenase của các chủng vi nắm nghiên cứu:

+ Theo dõi và đo đường kinh khuẩn lạc vi năm sau 3, 5 ngày Nếu vì nấm không phát triển, nuôi cấy thêm lới ngày thứ 30, vẫn không co khuẩn lac vi nam xuất hiện, kết luận nhiệt độ ức chế vị nắm rnoc tới ngày thứ 30

+ Phát hiện vòng phân giải ở ngày thử 5 bằng thuếc thử HạCh, Tính hệ số phân giải cơ chất (In) Nếu không có vỏng phân giái, có thể kết luận ở nhiệt độ đó

đã ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt lính collegensse của vĩ nấm

2.3.5.3 Aighiên cứu xác định các giá trị hoạt độ nước môi trưởng nuôi cấy ức

chế khả năng sinh tông hợp và hoạ tính collagenase của các chủng vì nắm

Nghiên cứu các giá trị hoạt độ nước mồi trường nuôi cấy: 0,60aw; 0,65aw,

,70aw ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase của vi nấm

25*C ¡ 22C) Các bước

(pH = 7,0 10,3; độ ấm không khi = 99% L 1%: nhiệt độ

- Cây các chẳng ví nằm nghiên cứu trên đĩa mỗi rường đặc Nuôi cây 6 25°C

trong tu mudi cay vi sinh vat Binder

- Xac dinh hoat dộ nước ức chế khả năng sinh tong hop và hoạt tỉnh collagenase ctia các chủng vi nắm nghiên cứu:

+ Theo đối và đo đường kinh khuẩn lạc vi nằm sau 3, 5 ngày Nếu vì nắm kháng phát triển, nuôi cấy thêm tới ngày thứ 30, vẫn không có khuẩn lạc xuất hiện, kết luận hoạt độ nước ức chế vĩ nắm moe Lới ngày thứ 30

+ Phát hiện vòng phân giải ở ngày thử 5 bằng thuốc thử HạCh, Tính hệ số phân giải cơ chất (Lhd) Néu không có vòng phân giải, có thể kết luận hoạt độ nước

đó đã We ché kha ning sinh léng hợp và hoạt tinh collagenase cba vi nam

24

2.3.5.4 Nghiên cứu xác dịnh các siá trị độ âm không khi ức chế kha nang sinh tổng hợp và hoạt tinh collagenase cita các chủng vi nấm

Nghiên cửu các giá trị độ ẩm môi trường không khí: RII = 60%, 70%; 80%

- Cấy các chúng vi nằm nghiên cửu trên dia mnôi trường đặc Nuôi cây ở

25°C, trong tủ vi khi hậu RUMED (Đức), điều chỉnh các độ ẩm môi trường không,

khi nghiên cứu theo quy trình vận hãnh máy

- Xác định độ âm không khi ức chế khả nắng sinh lòng hợp và hoạt tính

collagenase của cáo chứng vi nắm nghiên cứu

+ ‘Theo dõi và đo đường kinh khuân lạc ví nắm sau 3, 5 ngày Nếu vĩ nấm

không phát triển, nuôi cấy thêm tới tggày thứ 30, vẫn không có khuẩn lạc xuất hiện, kết luân dộ âm không khí ức chế vi nằm mọc tới ngày thứ 30

+ Phát hiện vòng phân giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thử HạCl; Tính hệ số

phan giai co chat (Ida)

kkhi đó đã ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính oollagenase của ví nắm

Su không có vòng phân giải, có thể kết luận độ âm không

2.3.3.5 Nghiên cứu xác định lỗ hợp các điều kiện môi trường ức chế khả năng sinh tổng hợp và boạt tính collagenase của các chững vi nắm

Nghiên cứu với tổ hợp các điểu kiện sau: nhiệt độ - 16°C 4 0.2°C: RH

10% + 39, pH = 8,5 + 0,1; aw = 0,65 + 0,01

Các bước tiên hành:

- 'Tạo môi trường nuối cấy: mỏi trưởng nutiert agar (Merek) có collagen

0,1%, được chỉnh pIT = 8,5 bằng NaOH và HC], chỉnh aw = 0,65 theo phương pháp

25

Dallyn-Fox (1980), hap v6 tring 6 121°C/15 phut Do va chỉnh lại pH = 8,5 sau hap

vô trùng trong tủ an toản sinh học

- Cay các chủng vi nấm nghiên cứu trên đĩa môi trường đặc Nuôi cấy ở 16°C, trong tủ vi khí hâu RUMED (Đức), điều chỉnh độ âm môi trường không khí

70% theo quy trình vận hảnh máy

~ Xác định khả năng ức chế sinh tổng hợp vả hoạt tính collagenase của các

chủng vi nắm nghiên cứu:

+ Theo dõi vả đo đường kính khuẩn lạc vi nắm sau 3, 5 ngảy Nếu vi nam

không phát triển, nuôi cấy thêm tới ngảy thứ 30, vẫn không có khuẩn lạc xuất hiện,

kết luân tô hợp các điều kiện môi trường đã ức chế vi nắm mọc tới ngày thứ 30

+ Phát hiện vòng phân giải ở ngày thứ 5 bằng thuốc thử HgCl; Tỉnh hệ số

phan giai co chat (Ith) Néu khong có vòng phân giải, có thê kết luận tổ hợp điều

kiên môi trường đã ức chế khả năng sinh tổng hợp và hoạt tính collagenase ctia vi

nắm

3.3.6 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu

Tổng hợp và xử lý số liêu theo phương pháp thông kê (sử dụng Excel 2003

trong tỉnh toản, phần tích)

Công thức tính hệ số tương quan r:

26

Chương 3

KET QUẢ NGHIÊN CỨU VẢ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả phục hồi, lựa chọn các chang vi nắm nghiên cứu

Trong bộ sưu tập vi nam tại Viện 69, có 67 chúng vĩ năm thuộc 14 chỉ 48 loài có khả ning sinh téng hop collagenase đang được bảo quản bằng hai phương, pháp: trong glyccrol lạnh và trên silicagen Với ưu điểm của phương pháp bão quản trong giyoerol lạnh là có thẻ bảo quản nhiều chủng loại vi nấm (sinh bào tử và không sih bảo tử), chúng tôi dã chọn các chủng vi nấm dược bão quản trong

glycerol lanh để hỏi phục, nhằm mục đích có được số vi nằm sống sót cao hơn so

với phương pháp bảo quân trên silieagel (thích hợp với các chũng vị nấm sinh bào

tử) Kết quả phục hỏi cụ thể được thể hiện ở Phụ lục 1

Trong số 67 chủng vi nắm có khả năng sinh tổng hợp collagenase, chứng tôi

đã phục hỏi được 47 chủng, dạt tỷ lê 70,1% Các chủng vị nắm sống sót này thuộc 9

chỉ, 32 loài Kết quả phục hồi 47 chủng vi nằm này như sau: Phục hỏi rất tốt có 9

chủng (1994), Phục Hỏi lót cỏ 28 chúng (60%), Phục hồi khả có 10 chủng (21%) Kết quả này cho thấy, với thời gian bão quản 4-5 năm, tỷ lệ sống sót của các ching

vị nêm có khả năng ginh tổng hợp collagenase giảm khá mạnh

Từ 47 ching vi nam duoc hoại hóa ở trên, 30 chimg vi nam thuộc 9 chi, 27 loài đã được lựa chọn va tiến hành xác định hệ số phân giải Kết quả chỉ tiết thê tiện ở Phụ lục 2 Các lựa chọn nay đảm bão nguyên tắc: đa đạng tối đa các chỉ, loài

vi nấm

Trong số 30 chủng vi nắm này, chủng tôi lựa chọn tiếp 15 chủng đại điện, có

hé số phân giải cao để tiến hành nghiên cứu Danh sách cdc ching vi nam voi khả năng sinh tổng hợp vả hoạt tính collagenase của chúng thé hién 6 Lang 3.1

Bang 3.1: Danh sich 15 ching vi ném yea chon nghiền cửu

4 D45 | 4 ustus Thom and Chureh 53

Cladosporium | 6 T44 |C.cladosperioides(Ires.) de Vries L7

Quá Bằng 3.1 cho thấy, các chủng vĩ nấm thude 8 chi, 15 loai Trong 44 chi

Aspergilus có 4 chúng chiếm 27%, chỉ Pemeiliưm cô 5 chủng chiêm 339%, các chỉ còn lại mãi chỉ có 1 chứng chiếm 7% Tỷ lẻ này cững khá tương đồng với cơ câu của 67 chủng vi năm ban dầu Bo la, hai chi Aspergillus va chi Penicillium là các chỉ vi nằm chủ yêu, chiếm tỷ lệ sẻ chủng lần lượt lã 32% và 37%

Cáo chủng cũng, dược xác định lại dặc điểm hình thái, để đánh giá lại chính

xác tên loài trước và sau khi phục hồi các chứng phục vụ cho nghiên cứu Dặc điểm

từnh thái cụ thể như sau:

1 Ching Aspergillus clavato-nanica Batista (T38)

Hinh 3.1 Aspergillus clavato - nanica: (A) Mat phải khuẩn lạc (C2); (B) mặt trái

khuẩn lac (CZ), (C) tế bào sinh bào tử trần X1000; (D) bào tử trần (SEM) X 10000

Khuẩn lạc phát triển khá nhanh trên môi trường Czapek, kích thước đạt 4- Sem trong 2 tuần ở nhiệt độ phỏng Mặt phải khuẩn lạc ban dau co mau vàng sau chuyên nhanh sang mau olive Mat trai mau vàng nhạt Không có giọt tiết, đâu sinh

bao tt tran nhỏ kích thước 100-150ym Bọng hình trủy hoặc thon dài kích thước

20-30x13-20um The binh 2 tang, the binh so cap kich thude 7,5-9»3,3-4,4jum, thé

bình thứ cấp 5.5-7,5x2,5-3,3gim Bảo tử trần nhẫn, hình trứng tới elip kích thước 3-

3,50m

29