Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, dịch tễ học, phương pháp chẩn đoán sớm, phác đồ điều trị hiệu quả và dự phòng bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm A1H1N1, vi rút cúm A và vi rút hợp bào hô hấp ở Việt Nam

Các vi rút gây bệnh viêm phổi cấp thường gặp là: Theo một báo cáo tại Mỹ, viêm đường hô hấp dưới chiếm 40% tổng số trẻ em bị nhiễm trùng lần đầu.ở trẻ từ sơ sinh đến 6 tháng tuổi vi rút

BỘ Y TẾ

BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, DỊCH TỄ HỌC, PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN SỚM, PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ HIỆU QUẢ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP DO VI RÚT CÚM A/H5N1, VI RÚT CÚM A VÀ VI RÚT

HỢP BÀO HÔ HẤP Ở VIỆT NAM

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS NGUYỄN THANH LIÊM

7474

12/8/2009

HÀ NỘI – 2009

Bộ Khoa học vμ Công nghệ –bộ y tế

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài cấp nhà nước

nghiên cứu đặc điểm lâm sμng, dịch tễ

học,phương pháp chẩn đoán sớm, phác đồ điều trị hiệu quả vμ dự phòng bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm h5n1, vi rút cúm a vμ vi

rút hợp bμo hô hấp ở việt nam

Chủ nhiệm đề tài:PGS.TS.Nguyễn Thanh Liêm

Cơ quan chủ trì: Bệnh Viện Nhi Trung Ương

Hà Nội, 10-2006

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài cấp nhà nước:

nghiên cứu đặc điểm lâm sμng, dịch tễ

học,phương pháp chẩn đoán sớm, phác đồ điều trị hiệu quả vμ dự phòng bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm h5n1, vi rút cúm a vμ vi

rút hợp bμo hô hấp ở việt nam

Chủ nhiệm đề tài:PGS.TS.Nguyễn Thanh Liêm

Hà Nội, 10-2006

BKHCN

BVNTƯ

Bộ Khoa học và Công nghệ

Bệnh viện Nhi trung ương

Số 18/879 La Thành- Đống Đa- Hà Nội

Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài cấp nhà nước:

nghiên cứu đặc điểm lâm sμng, dịch tễ

học,phương pháp chẩn đoán sớm, phác đồ điều trị hiệu quả vμ dự phòng bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm h5n1, vi rút cúm a vμ vi

rút hợp bμo hô hấp ở việt nam

Chủ nhiệm đề tài:PGS.TS.Nguyễn Thanh Liêm

Hà Nội, 10-2006

Ampicillin Base pairs Diethylpyrocarbonat Deoxiribonucleotide 5’-triphosphates Ethylen diamin tetraacetic acid

Ethidium bromide Hemagglutinin Kanamycin Kilo base Lauria-Bertani ARN th«ng tin Neuraminidase Optical Density Polymerase Chain Reaction Ribonuclease

Random Fragment Length Polymorphysism Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction Sodium dodecyl sulphate

Solution I, Solution II, Solution III Tris-acetate-EDTA

Polymerase Thermus aquaticus

Tris-EDTA Vßng/ phót 5-Bomo-chlorua-3-indolyl-β-D-galactoside Nucleoprotein

World Health Organization NhiÔm trïng h« hÊp cÊp Viªm ®−êng h« hÊp cÊp

Mục lục

Đặt vấn đề 1

Phần A: Viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm a vμ vi rút cúm a/h5n1 3

Chương 1 Tổng quan 3

1.1 Khái niệm về cúm ở các loài lông vũ (Avian influenza) 3

1.2 Tác nhân gây bệnh 3

1.2.1 Phân loại 3

1.2.2 Nguồn lây nhiễm vi rút cúm A 4

1.2.3 Cấu trúc chung của vi rút cúm 5

1.2.4 Cơ chế tái tổ hợp di truyền để hình thành biến chủng mới 8

1.2.5 Chu trình sống của virut 10

1.3 Tình hình dịch bệnh trên thế giới: 11

1.4 Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam: 13

1.5 Triệu chứng lâm sàng khi bị bệnh cúm A: 15

1.5.1 Đối với gia cầm: 15

1.5.2 Đối với người: 15

1.6 Các phương pháp dùng trong chẩn đoán và giám sát cúm 18

1.6.1 Phân lập virut 18

1.6.2 Phương pháp sinh học phân tử 18

1.6.3 Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học 19

1.7 Điều trị 20

Chương 2: Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu: 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu: 21

Chương 3: Kết quả 35

3.1 Nghiên cứu dịch tễ học 35

3.1.1 Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm DTH của bệnh cúm A(H5N1) ở người: 35

3.1.2 Kết quả nghiên cứu Bệnh-chứng xác định một số yếu tố nguy cơ của bệnh nhân cúm A/H5N1 ở người trong năm 2004 tại Việt Nam : 46

3.1.3 Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm DTH của bệnh VĐHHC nặng do vi rút cúm người týp A: 53

3.2 Nghiên cứu Chẩn đoán vi rút cúm A/H5N1 bằng phương pháp Real- Time PCR 71

3.2.1 Kết quả tách dòng, xác định trình tự gen NP của virut cúm A H5n1 71

3.2.2 Tách dòng và xác định trình tự gen mã hoá HA và NA 87

3.2.3 Kết quả chẩn đoán virut cúm A H5N1 bằng phương pháp Real-time PCR 97

3.3 Nghiên cứu chẩn đoán vi rút cúm A và vi rút cúm A/H5N1 bằng phương pháp RT - PCR 101

3.3.1 Chẩn đoán vi rút cúm A/H5N1 101

3.3.2 Chẩn đoán vi rút cúm A 106

3.4 Nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cúm A/H5N1 108

3.4.1 Tình hình chung: 108

3.4.2 Yếu tố phơi nhiễm: 109

3.4.3 Đặc điểm lâm sàng 109

3.4.4 Đặc điểm xét nghiệm: 110

3.4.5 Điều trị Oseltamivir 111

3.4.6 Kết quả 111

3.4.7 So sánh một số đặc điểm giữa nhóm sống và tử vong 112

3.4.8 Phân tích đa biến một số yếu tố liên quan: 113

3.4.9 Tổn thương giải phẫu bệnh: 113

3.5 Nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cúm A 116

3.5.1 Tình hình chung: 116

3.5.2 Biểu hiện lâm sàng .116

3.5.3 Xét nghiệm: 117

3.5.4 Điều trị: 117

Chương 4: Bμn luận 126

4.1 Nghiên cứu dịch tễ học: 126

4.1.1 Bàn luận về một số đặc điểm DTH của bệnh cúm A(H5N1) ở người: 126

4.1.2 Bàn luận về kết quả nghiên cứu bệnh chứng xác định một số yếu tố nguy cơ chủ yếu của cúm A(H5N1) ở người trong năm 2004 tại Việt Nam: 128

4.1.3 Bàn luận về một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh VĐHHC nặng do vi rút cúm người týp A: .132

4.2 Nghiên cứu Chẩn đoán vi rút cúm A/H5N1 bằng phương pháp Real- Time PCR 133

4.3 Nghiên cứu Chẩn đoán vi rút cúm A/H5N1 bằng phương pháp RT- PCR 134

4.4 Nghiên cứu Chẩn đoán vi rút cúm A bằng phương pháp RT- PCR 136

4.5 Nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cúmA/H5N1 138

4.5.1 Tình hình chung: 138

4.5.2 Lâm sàng: 140

4.5 3 Xét nghiệm: 141

4.5.4 XQ tim phổi: 142

4.5 5 Điều trị: 142

4.5.6 Kết quả: 144

4.6 Nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng cúm A 145

Kết luận 146

Tμi liệu tham khảo 147

Phần b: Viêm đường hô hấp cấp do vi rút hợp bμo hô hấp 151

Chương 1 tổng quan 151

1.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc 151

1.2 Genome của vi rút 151

1.3 Chu trình nhân lên của RSV 153

1.4 Con đường lây truyền 154

1.5 Triệu chứng lâm sàng 154

1.7 Các kỹ thuật chẩn đoán viêm đường hô hấp do virut hợp bào hô hấp 156

1.7.1 Phân lập virut trên tế bào cảm nhiễm: 156

1.7.2 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp: 156

1.7.3 Test nhanh dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch: 157

1.7.4.Kỹ thuật phát hiện Axit Nucleic (RT-PCR): 157

Chương 2 đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu 158

2.1 Đối tượng nghiên cứu: 158

2.2 Phương pháp nghiên cứu: 158

2.2.1 Nghiên cứu xác định căn nguyên: 158

2.2.2 Nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút hợp bào hô hấp: 170

Chương 3 kết quả 172

3.1 Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán vi rút hợp bào hô hấp bằng phương pháp chẩn đoán Real Time PCR 172

3.1.1 Kết quả tách chiết ARN tổng số 172

3.1.2 Kết quả tách dòng và xác định trình tự gen mã hoá Protein dung hợp của virut RSV 172

3.2 Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán vi rút hợp bào hô hấp bằng phương pháp chẩn đoán RT- PCR 181

3.2.1 Thiết kế thí nghiệm thường quy chẩn đoán RSV .181

3.2.2 Kết quả xét nghiệm RSV từ bệnh phẩm lâm sàng tại Bệnh viện Nhi trung ương .183

3.2.3 Kết quả phát hiện vi khuẩn đồng nhiễm với RSV 184

3.3 Nghiên cứu một số yếu tố dịch tễ học của vi rút hợp bào hô hấp: 185

3.3.1 Phân bố theo địa dư: 185

3.3.2 Tần suất bệnh nhân năm 2005: 185

3.3.3 Tuổi và giới: 186

3.3.4 Tháng vào viện: 186

3.3.5 Tỷ lệ bệnh nhân có tiếp xúc với nguồn lây: 186

3.3.6 Bệnh nhân có cân nặng < 2500g : 187 3.4 Nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng viêm đường hô hấp do vi rút hợp bào

3.4.1 Một số đặc điểm dịch tễ của đối tượng nghiên cứu 187

3.4.2 Một số đặc điểm lâm sàng 191

3.4.3 Đặc điểm cận lâm sàng 194

3.4.4 So sánh đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của hai nhóm bệnh nhân được chẩn đoán là VPQP và VTPQ 197

Chương 4 Bμn luận 200

4.1 Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán vi rút hợp bào hô hấp bằng phương pháp chẩn đoán Real Time PCR 200

4.2 Nghiên cứu phương pháp chẩn đoán vi rút hợp bào hô hấp bằng phương pháp chẩn đoán RT- PCR 202

4.3 Nghiên cứu một số yếu tố dịch tễ học của vi rút hợp bào hô hấp: 203

4.4 Nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng viêm đường hô hấp do vi rút hợp bào hô hấp

4.4.1 Một số đặc điểm dịch tễ 204

4.4.2 Lâm sàng khi nhập viện 207

4.4.3 Xét nghiệm cận lâm sàng 209

4.4.4 Chẩn đoán bệnh 210

4.4.5 So sánh triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng giữa hai nhóm bệnh nhân được chẩn đoán VPQP và VTPQ 211

4.4.6 Thời gian điều trị 212

Kết luận 213

Tμi liệu tham khảo 214

Phụ lục

Đặt vấn đề

Nhiễm trùng hô hấp cấp là bệnh thường gặp ở cả trẻ em và người lớn Các bệnh nhiễm trùng hô hấp thường gặp bao gồm: viêm họng, viêm phế quản cấp, viêm phổi mắc phải ở cộng đồng Trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn hô hấp cấp thường gặp, vi rút là nguyên nhân thường gặp nhất

Vi rút cúm A, vi rút hợp bào hô hấp là 2 tác nhân gây bệnh chiếm vị trí hàng

đầu trong số 9 nhóm vi rút gây bệnh viêm đường hô hấp cấp ở người Theo Dingle

và Feller vi rút là thủ phạm của 66% nhiễm trùng hô hấp (Evan 1960)

Các vi rút gây bệnh viêm phổi cấp thường gặp là:

Theo một báo cáo tại Mỹ, viêm đường hô hấp dưới chiếm 40% tổng số trẻ em

bị nhiễm trùng lần đầu.ở trẻ từ sơ sinh đến 6 tháng tuổi vi rút hợp bào hô hấp (RSV)

là tác nhân chủ yếu gây nhiễm trùng hô hấp (75% viêm tiểu phế quản và 39% viêm phổi ở độ tuổi này) Tỷ lệ bị nhiễm RSV ở lứa tuổi 5- 9 tuổi là 20%; 10% ở trẻ từ 15- 19 và 3- 6% ở độ tuổi 20- 50 tuổi và hàng năm vẫn có khoảng 3000- 4000 trường hợp tử vong do vi rút hợp bào hô hấp Sự lan truyền của RSV rất nhanh, nhất

là môi trường tập thể, gia đình và có thể lây thành dịch

Hiện nay, cùng với các bệnh hay gặp do RSV gây ra thì đại dịch cúm đã xuất hiện nhiều nước trên thế giới, thủ phạm đã gây ra khoảng 20.000 ca tử vong hàng năm và gây tổn thất rất lớn về kinh tế

Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm và thủy cầm, đặc biệt là ở gà Dịch bệnh này do các phân týp khác nhau thuộc nhóm virut cúm A, họ

Orthomyxoviridae gây nên [7] Virut cúm gia cầm H5N1đã xuất hiện trên thế giới từ

lâu Ngay từ năm 1988, De BK và cộng sự đã giải mã được gen mã hoá Hemagglutinin (gen H5) của virut cúm H5N1 phân lập ở Scotland (De BK và cs, 1988)

Tuy nhiên, virut cúm gia cầm chỉ được đặc biệt quan tâm khi virut này được phân lập từ một trẻ em ba tuổi bị tử vong ở Hồng Kông năm 1997 (Subbarao K và

cs, 1998) Theo thông báo của WHO, tới cuối năm 1997, đã có 18 trường hợp nhiễm cúm H5N1 ở Hồng Kông, trong đó có sáu ca tử vong Tình hình đặc biệt trở nên nghiêm trọng từ cuối năm 2003 đầu năm 2004, khi dịch cúm gia cầm đã lan rộng ra nhiều nước châu á bao gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Campuchia, Lào, Thái Lan và Indonesia Tại các nước này, hàng triệu gia cầm đã bị chết và bị tiêu hủy do virut cúm H5N1 Tình hình càng trở nên rất đáng lo ngại khi H5N1 có thể nhiễm từ gia cầm sang người với các triệu chứng lâm sàng rất trầm trọng và gây ra nhiều ca tử vong Tính đến nay, virut H5N1 đã vượt ra khỏi phạm vi châu á và lan sang cả các nước châu âu như Rumani, Nga, Thụy Điển, Thổ Nhĩ Kỳ v.v Theo thông báo của WHO, tính đến tháng 11 năm 2005, trên toàn thế giới đã

có tới 117 trường hợp nhiễm cúm H5N1, trong đó có hơn 60 trường hợp tử vong [8]

ở Việt Nam, tới cuối năm 2003, đầu năm 2004, bệnh xuất hiện trên gia cầm với số gia cầm nhiễm bệnh tăng nhanh chóng, số gia cầm chết trong 1 tuần nhiễm bệnh này là khoảng 70.000 gia cầm Vi rút cúm gia cầm (cúm A typ H5N1) được phát hiện trên người thông qua xét nghiệm bệnh phẩm của 3 bệnh nhân tử vong cuối tháng 12 năm 2003 và đầu tháng 1 năm 2004 vì suy hô hấp nặng Sau đó bệnh nhanh chóng được phát hiện ở trên những bệnh nhân khác có liên quan đến dịch cúm A H5N1 trên gia cầm

Trước tình hình cấp bách trong việc phòng chống dịch cúm gia cầm H5N1, Bệnh viện Nhi Trung ương đã được Bộ Khoa học Công nghệ giao chủ trì đề tài độc

lập cấp Nhà Nước “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, dịch tễ học, phương pháp

chẩn đoán sớm, phác đồ điều trị hiệu quả và dự phòng bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút H5N1, vi rút cúm A và vi rút hợp bào hô hấp ở Việt Nam”

Đề tài của chúng tôi nhằm mục đích nghiên cứu:

1 Xác định giá trị chẩn đoán căn nguyên của một số kỹ thuật y sinh học phân tử, đặc điểm dịch tễ học của bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm H5N1, vi rút cúm A và vi rút hợp bào hô hấp

2 Xác định được đặc điểm lâm sàng, xây dựng quy trình chẩn đoán nhanh, chính xác và phác đồ điều trị hiệu quả đối với bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm H5N1, vi rút cúm A và vi rút hợp bào hô hấp

3 Đề xuất được quy trình giám sát và các biện pháp phòng chống đối với bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm H5N1, vi rút cúm A và vi rút hợp bào hô hấp

Phần A: Viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm a vμ vi rút

cúm a/h5n1 Chương 1 Tổng quan 1.1 Khái niệm về cúm ở các loài lông vũ (Avian influenza)

Bệnh cúm ở các loài lông vũ là một bệnh truyền nhiễm cấp tínhở nhiều loài chim, gia cầm và thủy cầm do các phân týp khác nhau thuộc nhóm virut cúm A

(Influenza virut A), họ Orthomyxoviridae gây nên [7] Chúng có khả năng lây

nhiễm cao, có nhiều biến chủng khác nhau và hệ gen của chúng luôn luôn biến đổi

để tạo các biến chủng mới [9,10,11,12] Virut cúm A loại có độc lực cao chủ yếu

được nhân lên ở cơ quan hô hấp, tuy nhiên chúng có thể thích ứng với nhiều cơ quan trong cơ thể Trong số các chủng virut cúm A, H5N1 là chủng có khả năng biến đổi nhanh và gây bệnh trầm trọng ở người Các nhà khoa học lo sợ rằng, khi lây sang người virut H5N1 sẽ biến đổi thành một dạng virut mới có khả năng nhiễm từ người sang người gây ra đại dịch ở người

ở động vật mắc cúm A, mặc dù các kháng thể đặc hiệu kháng HA, NA, M2

có thể được hệ miễn dịch tạo ra nhưng thông thường chúng bị chết rất nhanh trước khi hệ miễn dịch kịp sinh ra kháng thể đặc hiệu Tuy nhiên, chỉ có kháng thể kháng

HA mới có vai trò trung hoà virut cho bảo hộ miễn dịch Các kháng thể khác có tác dụng kìm hãm số lượng virut nhân lên, ví dụ : kháng thể kháng NA ngăn cản sự giải phóng virut; kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng của M2 không cho quá trình bao gói xảy ra

Biến chủng virut cúm gây bệnh ở loài chim được phân chia theo tính gây bệnh với hai mức độ độc lực khác nhau [1,13,14]:

-Loại virut có độc lực cao gọi là HPAI (Highly Pathogenic Avian Influenza) thường gây chết 100% gia cầm bị nhiễm bệnh sau vài giờ đến vài ngày gây nhiễm

Từ 1959 đến 2001, trên toàn thế giới đã có 19 chủng cúm A của loài lông vũ được phân lập có độc lực cao thuộc loại HPAI [1]

-Loại thứ hai gọi là LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza) thường nhiễm ở gia cầm, nhưng không hoặc có rất ít biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ chết cũng rất thấp 1.2 Tác nhân gây bệnh

1.2.1 Phân loại

Họ Orthomyxoviridae bao gồm 4 nhóm virut:

- Nhóm virut cúm A

Cúm gia cầm hay cúm ở các loài chim (avian influenza), do virut cúm typ A

của họ Orthomyxoviridae gây ra Hiện nay có 15 loại kháng nguyên H (H1ặH15)

và 9 loại kháng nguyên N (N1ặN9) đều đã được phát hiện ở virut cúm gây bệnh trên các loài lông vũ Người ta thấy rằng, có ba phân typ HA ( H1, H2, H3) và hai phân typ NA ( N1 và N2) gây đại dịch ở người, ngoài ra còn thêm hai phân typ HA gây bệnh ở người nhưng chưa gây thành đại dịch là H5 và H9 Cho đến nay, chỉ có hai biến chủng virut có cấu trúc kháng nguyên H5 và H7 được coi là những loại có

độc lực cao gây bệnh ở gia cầm, trong đó đã có phân typ H7N7 gây đại dịch cúm gia cầm ở Châu Âu và H5N1 ở Châu á những năm 1997-2005 Trong những năm gần đây, virut cúm A thuộc phân typ H5N1 phân lập từ gà đã gây nên những đại dịch cúm gia cầm rộng khắp và virut này bắt đầu thích ứng gây nhiễm trên người, được chứng minh

là có nguồn gốc sâu xa từ virut H5N1 của ngỗng Quảng Đông, Trung Quốc Guangdong-96), từ đó trải qua nhiều thế hệ tái tổ hợp, tạo nên các nhóm chính gây bệnh cho loài chim và người trong các năm 1997-2006 ở Hồng Kông, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Thái Lan và Việt Nam [15]

(Gooses-1.2.2 Nguồn lây nhiễm vi rút cúm A

Cho đến nay, bằng những kỹ thuật sinh học phân tử, nguồn gốc phả hệ virut cúm A vừa được phân lập ra cho thấy thủy cầm chính là nguồn tàng trữ virut cúm A,

từ đó lây truyền sang các vật chủ khác trong đó có chim, ngựa, lợn, gà, người rồi gây bệnh và gây dịch ở các loài này thậm chí sang cả cá voi và hải cẩu Các loài thủy cầm như vịt, ngan, ngỗng mang virut cúm trong nội tạng của chúng, đặc biệt là trong ruột và chúng bài thải virut ra ngoài môi trường Vì vậy, virut được thải ra ngoài môi trường theo đường nước bọt, nước mũi và phân Do một lượng lớn virut

được tìm thấy trong đường ruột và thải ra ngoài theo đường phân nên đây chính là nguy cơ lớn gây nhiễm nguồn nước, nguồn thức ăn, tạo điều kiện cho sự lan truyền virut trong các quần thể động vật và con người

Các loài gia cầm, thủy cầm và chim khi tiếp xúc với mầm bệnh sẽ nhiễm bệnh, tuy nhiên đường truyền bệnh từ phân tới miệng là phổ biến nhất Virut ở thể

có độc lực thấp khi lây lan và lưu hành trong đàn gia cầm một thời gian sẽ biến đổi thành loại gây bệnh và có độc lực cao (HPAI) gây nên tỉ lệ ốm và chết có thể đến 100% [2] Tiến triển bệnh lý ở loài chim luôn luôn thay đổi, nhiều khi không phát hiện bệnh tích, hoặc bệnh tích giới hạn ở đường hô hấp với mức độ nhẹ Nhiều trường hợp, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích được phát hiện đều khắp các cơ quan

đặc biệt là đối với virut cúm A phân typ H5 và H7, những loại có độc lực cao tuy nhân lên ở cơ quan hô hấp và các cơ quan khác nhưng lại thích ứng với nhiều cơ quan trong cơ thể [16]

Đặc biệt, bệnh cúm lây trực tiếp từ người sang người bằng đường hô hấp, qua các hạt nước bọt nhỏ li ti mang rất nhiều virut Ngày nay, các phương tiện giao thông hiện đại làm cho dịch cúm không những lan tràn nhanh trong phạm vi địa phương mà còn cả trong phạm vi toàn cầu

Mọi người, mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với cúm, đặc biệt là trẻ em, lứa tuổi thanh thiếu niên và phụ nữ mang thai Người già, người có bệnh mãn tính đường hô hấp dễ bị nhiễm cúm nặng, có nhiều biến chứng và tỷ lệ tử vong cao

Hình 1.1 Mối quan hệ lây nhiễm virut cúm A 1.2.3 Cấu trúc chung của vi rút cúm

Đặc tính chung của tất cả bốn nhóm virut trong họ Orthomyxoviridae là hệ

dài 10 đến 15 kilobazơ (tùy loại virut) và phân thành 8 phân đoạn, mỗi phân đoạn mang một gen mã hoá cho một loại protein của virut

Hạt virut (virion) có cấu trúc hình khối, đôi khi có dạng hình khối kéo dài,

đường kính khoảng 80-120nm Nhiều khi virion có dạng hình sợi kéo dài, độ dài đến vài μm Vỏ virut có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một số protein dạng trần không được glycosyl hoá Protein bề mặt có cấu trúc từ các loại glycoprotein, đó là những gai mấu có độ dài 10 - 14 nm, đường kính 4-6 nm Nucleocapsit bao bọc lấy nhân virut

là tập hợp của nhiều phân đoạn protein, cấu trúc đối xứng xoắn, tạo thành vòm ở giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và liên kết với nhau qua các cầu nối peptit tạo vòm không gian [17]

Virut thuộc họ Orthomyxoviridae rất nhạy cảm với nhiệt độ, các dung môi

hoà tan lipit, các hoá chất sát trùng và oxi hoá, formandehyt và các tia phóng xạ Phân tử lượng của một hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton [18]

Hình 1.2 Hình thái các hạt virion của virut cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử

Nhóm virut cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae Một hạt virion cúm A có

khoảng 500 gai nhô ra khỏi lớp vỏ lipit Khoảng 80% các gai này là các protein của virut và được gọi là Haemagglutinin (HA) có vai trò quyết định việc virut có gắn

được với tế bào chủ hay không, 20% gai còn lại cũng là protein của virut được gọi là Neuraminidaza (NA) Protein này là một enzym có chức năng phá vỡ liên kết giữa virut và tế bào chủ để giải phóng virut khỏi tế bào nhiễm Tất cả các nhóm virut cúm

A đều có hệ gen là ARN chứa 8 phân đoạn Trên bề mặt các virut có protein gây

ng−ng kết hồng cầu là HA và một loại protein là enzym NA có chức năng phá hủy thụ thể của tế bào chủ HA là sản phẩm của phân đoạn số 4 và NA là protein do phân đoạn số 6 tổng hợp

Hình 1.3 Cấu tạo hạt virion của virut cúm A với 8 phân đoạn, và

hình thái các thụ thể

Trên cơ sở trình tự gen và sắp xếp gen trong hệ gen, virut cúm A có 8 phân

đoạn, có độ dài tổng số khoảng 13500 cặp bazơ

ắ Phân đoạn 1 đến 3 mã hóa cho protein PB1, PB2 và PA: là các protein có chức năng là enzym polymeraza

ắ Phân đoạn 4 mã hóa cho protein HA HA của virut cúm A là một loại protein gây ng−ng kết hồng cầu, đ−ợc acylat hoá ở vùng giáp ranh với vỏ virut và có

đầu N liên kết glycan ở một số vị trí nhất định

ắ Phân đoạn 5 mã hóa cho nucleoprotein (NP)

ắ Phân đoạn 6 là gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein enzym NA

ắ Phân đoạn 7 mã hóa cho hai tiểu phần protein đệm (matrix protein M1 và M2)

ắ Phân đoạn 8 có độ dài ổn định trong các biến chủng cúm A, mã hóa cho hai tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2

Neuraminidaza (NA) là một trong hai protein liên kết đ−ợc tìm thấy trên bề mặt của hạt virut Nó có chức năng phân cắt phân tử axit sialic (N-acetylneuramic acid), giải phóng hạt virut khỏi bề mặt của tế bào chủ để xâm nhiễm tế bào khác Vì

vậy, nó còn được gọi là lisosomal sialidaza (N-acetyl- alpha-neuraminidaza 1 hay Acetylneuraminyl hydrolaza)

Hình 1.4 NA phân cắt phân tử axit sialic

Có tất cả 9 biến thể gen NA (N1ặ N9) đã được phân lập từ hạt virut cúm A Tuy nhiên chỉ có týp N1 và N2 là được phân lập từ chủng virut gây bệnh cho người Năm 1983, nhờ kỹ thuật X quang tinh thể, các nhà khoa học đã khám phá ra cấu trúc của NA NA bao gồm 4 dưới đơn vị giống nhau có vùng hoạt động ở phần đầu của enzym này Nếu không có NA, HA của một virut mới tạo thành sẽ dính vào axit sialic trên bề mặt của tế bào chủ và bề mặt của các hạt virut mới làm virut bất động

và không còn khả năng xâm nhiễm vào tế bào khác Vì vậy, NA có vai trò quyết

định trong việc virut mới tạo thành có xâm nhập được vào tế bào khác hay không Việc giải trình tự NA có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc định týp và chế tạo vacxin phòng chống các đại dịch do virut cúm gây ra

1.2.4 Cơ chế tái tổ hợp di truyền để hình thành biến chủng mới

Tất cả virut cúm (Orthomyxoviridae) đều có vật liệu di truyền là ARN. Khi ARN tái bản nó có xu hướng tạo ra nhiều đột biến hơn ADN Những đột biến này cung cấp một lượng đột biến lớn cho chọn lọc tự nhiên Điều đó có nghĩa những virut mang vật liệu di truyền là ARN có tỷ lệ đột biến cao nên có khả năng tiến hoá nhanh hơn virut có vật liệu di truyền là ADN Thời gian qua đi, những đột biến này tích tụ lại và làm phát sinh loài mới Quá trình tích lũy của các đột biến riêng biệt

được gọi là sự tích tụ kháng nguyên Hình dạng của kháng nguyên (protein virut) có

chiều hướng thay đổi dần dần trở thành một hình dạng mới ở các thế hệ sau của virut

đó Khả năng tích tụ này làm cho các kháng thể sinh ra chống lại chủng virut ban

đầukhông thể kết hợp được với nó nữa

Đặc biệt, virut cúm A có một quá trình trao đổi hay sắp xếp lại vật liệu di truyền Nếu một tế bào bị nhiễm đồng thời một lúc hai chủng cúm týp A khác nhau, các hạt virion thế hệ sau có thể sẽ là một tổ hợp gen của hai bên bố mẹ Đây là một

điều khá phức tạp, nó tạo cho virut cúm A khả năng tiến hoá nhanh chóng tạo ra các

NA và HA mới Chúng ta biết rằng cúm týp A có 15 loại HA (1ặ15) và 9 loại NA (1ặ9) Tất cả các loại này đều được tạo ra trong quá trình tích tụ kháng nguyên

Thông thường, từ N1ặN3 và H1ặH3 là týp gây bệnh cho người còn lại là gây bệnh cho động vật

thể tổ hợp (H1N7 và H3N1) Những tổ hợp gen mới này rất khác so với chủng bố

mẹ và có thể chưa bao giờ được nhận biết trong hệ miễn dịch (hình 1.5)

Hình thái tiến hóa của virut được gọi là sự thay đổi kháng nguyên (antigenic shift) để phân biệt nó với sự tích tụ kháng nguyên (antigenic drift), tích tụ kháng nguyên xảy ra chậm hơn và không có sự thay đổi về tổ hợp gen Những tổ hợp mới này đã dẫn đến xuất hiện một chủng virut cúm mới mà hệ miễn dịch của chúng ta buộc phải bắt đầu lại quá trình tạo kháng thể để kháng virut mới này

1.2.5 Chu trình sống của virut

Sự xâm nhập của virut vào tế bào liên quan đến chức năng của protein HA qua hiện tượng ẩm bào nhờ cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể Thụ thể liên kết tế bào của virut cúm có bản chất là axit sialic cắm sâu vào glycoprotein hay glycolipit của vỏ virut Sự hợp nhất màng tế bào và virut xảy ra trong khoang ẩm bào khi nồng

độ pH giảm xuống mức thấp Sự hợp nhất này chỉ có thể xảy ra phụ thuộc vào việc cắt rời HA

Sau khi hợp nhất màng nucleocapsit của virut được chuyển vận vào trong nhân tế bào, hệ thống enzym sao chép của virut lập tức tạo ra các ARN thông tin (mRNA) Các mARN của virut được adenyl hoá ở đầu 3’, một số được tổng hợp từng đoạn và có thể nối lại theo lối tái tổ hợp để tạo thành ARN hoàn chỉnh Hầu hết protein của virut được tổng hợp trong nguyên sinh chất của tế bào nhiễm và ở lại trong nguyên sinh chất Số khác được chuyển vận vào nhân để bọc lấy nguyên liệu ARN hệ gen mới tổng hợp rồi lại chuyển vận nhanh trở lại nguyên sinh chất để lắp ráp tạo thành virion mới Cùng với quá trình sao chép ARN và tổng hợp protein là quá trình tổng hợp nguyên liệu di truyền (các sợi ARN mới) Từ sợi âm đơn của virut ban đầu, tạo thành một sợi dương hoàn chỉnh theo cơ chế bổ sung; sợi dương mới này làm khuôn tổng hợp nên sợi ARN âm mới Các sợi ARN âm mới này, một

số được dùng làm nguyên liệu để lắp ráp virion mới, một số dùng làm khuôn tổng hợp ARN theo cơ chế như với sợi ARN của virut đầu tiên Các sợi ARN hệ gen được tạo thành là một sợi hoàn chỉnh về độ dài, không được mũ hoá ở đầu 5’ và không

được adenyl hoá ở đầu 3’ Các sợi ARN âm mới được các protein đệm (NS1, M, NP) bao bọc lại để hình thành ribonucleocapsit trong nhân tế bào nhiễm Hạt virion mới

được tạo thành bằng cách “nẩy chồi” NA phân cắt axit sialic giải phóng virut ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm mới

(1): Trong nhân tế bào nhiễm, sợi ARN âm [ARN(-)] ban đầu chuyển thành sợi ARN(+) để tổng hợp nhiều ARN(-) là nguyên liệu cho các hạt virion

(2): ARN(-) nguyên liệu được bao gói trong protein M1 và NS1

(3): Nucleoprotein được chuyển qua màng nhân ra nguyên sinh chất

(4): Tổ hợp này được chuyển vận đến vị trí mà màng tế bào đã biến đổi đặc hiệu với virut

Hình 1.6 Sự nhân lên của virut cúm A

(5): Các sợi mARN của virut sao chép trong nhân được chuyển ra nguyên sinh chất, tổng hợp protein HA, NA, M2, nhờ sự trợ giúp của riboxom, rồi tất cả

được chuyển qua hệ thống lưới nội chất và hệ Golgi cuối cùng cắm lên màng tế bào nhiễm

(6): Hạt virion mới được tạo thành bằng cách “nảy chồi ”và giải phóng ra ngoài

1.3 Tình hình dịch bệnh trên thế giới:

Dịch cúm lần đầu tiên được ghi nhận xảy ra tháng 12 năm 1173 Theo Hirsch, trong khoảng thời gian từ năm 1173 đến năm 1875 có 299 đợt dịch cúm xảy ra Trong thế kỷ XX, đã có 3 đại dịch cúm xảy ra vào các năm:

- 1918- 1919 " Spanish flu": Dịch cúm bắt đầu xuất hiện ở Tây Ban Nha vào tháng 2/1918, sau đó dịch bệnh lan nhanh ra toàn châu Âu trong tháng 4 và tháng 5/1918 Bệnh lan sang Mỹ tháng 9/1918 Trong thời gian diễn ra dịch bệnh, ước tính khoảng 20 – 40% dân số toàn cầu có biểu hiện bệnh, trong đó khoảng 20 đến 50

triệu người tử vong (khoảng 675.000 người Mỹ) Bệnh gây ra do chủng vi rút cúm A typ H1N1 Các trường hợp tử vong hầu hết có tuổi từ 20 - 50 [ 19, 20, 21]

- Tháng 2 năm 1957, dịch cúm gia cầm xuất hiện ở châu á "Asian flu" Chủng vi rút gây bệnh nhanh chóng được phát hiện – cúm A typ H2N2 Vaccine phòng cúm gia cầm được sản xuất thành công vào cuối tháng 5/1957, nhưng phải đến tháng 8/1957, vaccine được đưa vào sử dụng với số lượng hạn chế, tuy nhiên đã phần nào khống chế được dịch bệnh Đại dịch cúm lần này gây tử vong khoảng 4 triệu người, các trường hợp tử vong hầu hết xảy ra trong khoảng thời gian từ tháng 9/1957 đến tháng 3/1958 Hầu hết các trường hợp tử vong là người già Tháng 12/1957, đại dịch tưởng chừng như đã được khống chế, tuy nhiên 1 đợt bùng phát khác xảy ra vào tháng

1 - 2/1958 Mặc dù số tử vong lần này thấp hơn nhiều so với số tử vong do đại dịch cúm năm 1918, tuy nhiên số trường hợp tử vong ở Mỹ khá cao: 68.900 người [21]

- Dịch cúm năm 1968 xảy ra ở Hồng Kông, bệnh dịch lan sang Mỹ sau đó 1 năm Chủng vi rút được phát hiện lần này là cúm A typ H3N2 Số các trường hợp tử vong xảy ra chủ yếu vào tháng 12/1968 và tháng 1/1969 Chủng vi rút này hiện nay vẫn còn lưu hành [21]

loạt Những năm 1999-2000, cúm gia cầm gây ra 412 vụ dịch ở Italy, gây nhiễm 16 triệu gia cầm Tính từ cuối năm 2003 đến 16/02/2006, trên thế giới đã có 23 nước và vùng lãnh thổ xuất hiện dịch cúm gia cầm do virut H5N1 gồm Azerbaijan, Croatia,

Đức, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Quốc, Đài Loan, Iran, Kazakhstan, Mông Cổ, Malaysia, Nga, Hồng Kông, Pháp, Nigeria, Nga, Slovenia, Bulgaria, Italia, Hy Lạp, Romania, Thổ Nhĩ Kì, Ukraina và Việt Nam ở Thái Lan, trong đợt dịch thứ nhất có 190 ổ dịch ở 89 huyện thuộc 42 tỉnh với số gia cầm bị tiêu hủy khoảng 30 triệu con Đợt dịch thứ hai phát lại từ 3/7/2004 đến 14/02/2005 có 1522 điểm phát dịch tại 777 xã của 264 huyện ở 51 tỉnh trong đó số gia cầm tiêu hủy là hơn 850 ngàn gà, hơn 687 ngàn vịt và khoảng hơn 274 ngàn các loại khác Gần đây dịch vẫn xẩy ra rải rác, ở Hàn Quốc, trong hai tháng đầu năm

2005, dịch cúm gia cầm lại tái phát, số gia cầm bị chết và tiêu hủy lên đến 220.000 con Bên cạnh các dịch cúm gia cầm do virut H5N1 còn có 7 nước và vùng lãnh thổ khác có dịch cúm gia cầm do các chủng khác gây nên đó là các nước: Pakistan, Hoa Kì, Canada, Nam Phi, Ai Cập, Cộng hòa dân chủ nhân dân Triều Tiên và Đài Loan Trong đó, Pakistan xuất hiện dịch cúm do nhóm virut H7N3 và H9N2 gây nhiễm

trên gà tây từ tháng 11/2003 đến tháng 03/2004 làm chết và tiêu hủy 1,7 triệu con Còn ở Canada, xuất hiện 2 ổ dịch H7N3 trên gà vào ngày 9/02/2004 và ngày 09/03/2004

Hình 1.7 Sự phân bố virut cúm gia cầm H5N1 trên thế giới

Dịch cúm gia cầm do virut H5N1 gây ra không chỉ ảnh hưởng đến nền kinh

tế thế giới, thiệt hại lên đến hàng triệu USD mà còn gây thiệt hại về người Nhiều người do tiếp xúc với gia cầm bị nhiễm bệnh hay mầm bệnh cũng đã bị mắc bệnh và

có nhiều trường hợp tử vong Năm 1997, cúm gia cầm H5N1 lây từ gà sang người, gây nhiễm 18 người, trong đó 6 trường hợp tử vong ở Hồng Kông Từ đó đến nay cúm gia cầm đã lan rộng ra nhiều nước, làm chết và tiêu hủy hàng triệu con gia cầm,

số người mắc lên tới hơn 100 và đã có hơn 60 người tử vong

1.4 Tình hình dịch bệnh tại Việt nam:

Đối với nước ta, dịch cúm gia cầm do virut H5N1 xuất hiện lần đầu tiên vào cuối tháng 12/2003 Trong những tháng đầu năm 2004, dịch bệnh đã xuất hiện ở 57 tỉnh trong cả nước với số gia cầm mắc bệnh lên đến 40 triệu con Đại dịch cúm gia cầm gây ra thiệt hại ước tính lên đến 250 triệu USD cho nền kinh tế quốc dân Tính

từ giữa tháng 12 năm 2004 đến ngày 22 tháng 2 năm 2005, trên cả nước ta đã có 21

tỉnh công bố xuất hiện dịch cúm gia cầm tái phát, số gia cầm bị chết và bị tiêu hủy

đã lên đến hơn 324 508 con

Bảng 1.1 Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và bị tiêu hủy từ giữa tháng

12-2004 đến ngày 22-2-2005 Các Tỉnh

Số l−ợng chết (nghìn con)

Số l−ợng tiêu huỷ(nghìn con)

- §Çu, mÆt s−ng, phï quanh m¾t Mµo, tÝch s−ng, xuÊt huyÕt

- M¾t bÞ viªm kÕt m¹c vµ cã thÓ xuÊt huyÕt

- Cã triÖu chøng h« hÊp

- Con vËt m¾c bÖnh th−êng chÕt trong kho¶ng 24-48 giê sau khi xuÊt hiÖn c¸c

triÖu trøng ®Çu tiªn

1.5.2 §èi víi ng−êi:

Thêi gian ñ bÖnh víi nh÷ng bÖnh nh©n nhiÔm cóm gia cÇm th−êng kÐo dµi 2

- 5 ngµy kÓ tõ sau khi tiÕp xóc víi nguån l©y, tuy nhiªn cã nh÷ng bÖnh nh©n cã thÓ

cã thêi gian ñ bÖnh kÐo dµi h¬n tíi 17 ngµy Nguån l©y nhiÔm th−êng gÆp hiÖn nay

lµ gia cÇm nhiÔm bÖnh [22]

1.5.2.1 Triệu chứng toàn thân: bệnh thường khởi phát đột ngột

- Sốt: Sốt thành cơn hay sốt liên tục cả ngày Nhiệt độ có thể lên tới 40- 410

C; có những trường hợp chỉ sốt nhẹ 38- 38,50C, những trường hợp này thường xảy ra ở những bệnh nhân sức đề kháng giảm nhiều như: suy giảm miễn dịch, người già, trẻ nhỏ, có các bệnh mạn tính kèm theo

- Da nóng, đỏ xuất hiện ở những bệnh nhân sốt cao, khi có suy hô hấp có tím môi,

- Ho: Là triệu chứng xuất hiện sớm, ho thành cơn, hoặc ho thúng thắng; thường là

ho khan, một số trường hợp ho có đờm, thường có màu trắng, dính Những trường hợp bệnh nhân có khạc đờm màu vàng hoặc đờm màu xanh thường do nguyên nhân bội nhiễm thêm vi khuẩn

- Đau ngực: đau vùng tổn thương, đau ít hoặc nhiều, tuy nhiên hầu hết các trường hợp không có đau ngực

- Khó thở: những trường hợp viêm phổi nhẹ, bệnh nhân không có khó thở Tuy nhiên hầu hết các trường hợp viêm phổi do vi rút cúm gia cầm đều có diễn biến nặng lên nhanh chóng Bệnh nhân có thở nhanh nông, có thể có co kéo cơ hô hấp

1.5.2.3 Triệu chứng thực thể

- Hô hấp: Tần số thở tăng, có co kéo cơ hô hấp hoặc không Khám phổi có hội chứng đông đặc (rung thanh tăng, rì rào phế nang giảm, gõ đục); ran ẩm, ran nổ vùng tổn thương

- Tim mạch: Mạch nhanh, huyết áp bình thường; trường hợp nặng có sốc: huyết áp thấp, mạch nhỏ khó bắt

- Tiêu hoá: không có gì đặc biệt Có thể có bụng chướng hơi, khi có nhiễm khuẩn huyết có thể thấy gan, lách to, thường chỉ mấp mé bờ sườn

Theo Beigel H.J và cộng sự (2005) khi nghiên cứu đặc điểm lâm sàng của cúm gia cầm năm 1997 ở Hồng Kông, và dịch cúm gia cầm hiện nay ở Thái Lan và Việt Nam nhận thấy các triệu chứng lâm sàng thường gặp như sau:

Bảng 1.2 Các triệu chứng lâm sàng của cúm gia cầm [22 ]

Như vậy có thể nhận thấy, các triệu chứng thường gặp của cúm gia cầm là

sốt cao, ho, khạc đờm, đau họng và thở nhanh Tuy nhiên các triệu chứng có xu

hướng nhẹ hơn ở đợt cúm gia cầm ở Hồng Kông năm 1997, nhưng đến vụ dịch cúm

hiện tại, các triệu chứng có biểu hiện nặng hơn

1.5.2.4 Cận lâm sàng

X quang phổi:

Trên phim X quang phổi thường quy, tổn thương thường gặp ở các bệnh nhân

viêm phổi do vi rút cúm gia cầm thường thấy là các nốt mờ thâm nhiễm rải rác vùng

phổi tổn thương, có thể thấy các dạng tổn thương khác như đám mờ hình tam giác,

tổn thương dạng lưới nốt hoặc hình ảnh kính mờ

Tổn thương trên X quang phổi tiến triển nhanh theo từng ngày, trường hợp

nặng có thể xuất hiện mờ cả 2 trường phổi

Theo Beigel H.J và cộng sự (2005) nhận thấy 17/18 bệnh nhân cúm gia cầm

đượcphát hiện ở Hồng Kông năm 1997 có tổn thương thâm nhiễm phổi, trong khi đó

17/17 bệnh nhân cúm gia cầm phát hiện ở Thái Lan năm 2004; 10/10 bệnh nhân

cúm gia cầm phát hiện ở Việt Nam năm 2004 và 4/4 bệnh nhân cúm gia cầm phát

hiện ở Cambodia đều có tổn thương thâm nhiễm trên phim chụp X quang phổi [22]

Khí máu: những bệnh nhân cúm gia cầm có biểu hiện suy hô hấp thông

thường có tình trạng giảm PaO2 và giảm đồng thời cả PaCO2 Trong trường hợp suy

hô hấp nặng về sau, xuất hiện tình trạng bloc phế nang - mao mạch khi đó xuất hiện

Bạch cầu máu: số lượng bạch cầu bình thường hoặc giảm Trường hợp có bội

nhiễm vi khuẩn có thể gặp bạch cầu máu tăng

1.6 Các phương pháp dùng trong chẩn đoán và giám sát cúm 1.6.1 Phân lập virut

Phân lập virut có thể được coi là phương pháp quan trọng nhất trong giám sát cúm, vì khi đã bắt được thủ phạm thì việc nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, sự biến đổi di truyền và tính chất kháng nguyên của tác nhân gây bệnh sẽ cung cấp các thông tin hêt sức cần thiết cho các biện pháp phòng chống kế cả việc khuyến cáo có nên sử dụng chủng mới phân lập để phát triển thành chủng sản xuất vắc xin thay thế chủng đang dùng Tuy nhiên, phương pháp phân lập bao giờ cũng là phương pháp tốn kém nhất, đòi hỏi các trang thiết bị, phòng thí nghiệm đặc thù và cũng đòi hỏi nhiều thời gian Vì vậy, cùng với phương pháp phân lập, người ta tiến hành các phương pháp khác là các phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử để sớm đưa ra các dự báo phục vụ công tác phòng chống kịp thời

1.6.2 Phương pháp sinh học phân tử

1.6.2.1 Kỹ thuật PCR phiên mã ngược:

Đây là phương pháp có khả năng xác định nhanh sự nhiễm virut thông qua xác định vật liệu di truyền của virut bằng sự tổng hợp 1 đoạn gen đặc hiệu của virut thông qua phản ứng chuỗi dưới tác động của men polymerase Đây là một phương pháp nhanh, nhạy, có độ đặc hiệu cao, đơn giản và chính xác khi được kiểm soát tốt Phương pháp này có khả năng phát hiện đoạn ARN hoặc ADN của virut trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng với nồng độ thấp và không phụ thuộc nhiều vào yếu tố bảo quản bệnh phẩm Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp phụ thuộc rất nhiều vào cấu tạo của hệ thống mồi ( primer) áp dụng trong phản ứng và điều kiện tiến hành phản ứng PCR Nhược điểm của phương pháp này là giá thành cao, khả năng dễ bị lây nhiễm bởi tác nhân ngoại lai

1.6.2.2 Kỹ thuật Real time PCR phiên mã ngược:

Kỹ thuật Real-time PCR nhanh nhạy hơn kỹ thuật PCR truyền thống, nó có khả năng xác định chính xác số bản sao ban đầu và số lượng bản sao qua mỗi chu kỳ khuếch đại nhờ tín hiệu huỳnh quang Với những ưu điểm như vậy người ta có thể ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR để định lượng ADN, ARN, đánh giá sự biểu hiện của gen, phát hiện đột biến, chuẩn đoán bệnh Kỹ thuật Real-time PCR cũng đã được ứng dụng khá phổ biến trong chuẩn đoán các virut gây bệnh như H5N1 và RSV….vv

1.6.3 Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học

1.6.3.1 Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI):

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) được tiến hành theo qui trình mà Dowdle và các cộng tác viên đã mô tả năm 1979 Nguyên lý của phương pháp là kháng thể kháng virut có khả năng ức chế quá trình ngưng kết hồng cầu Phản ứng

HI được tiến hành trên phiến nhựa hình chữ U Huyết thanh đã pha loãng trong PBS theo bậc 2 bắt đầu từ độ pha loãng 1/10 đến 1/1280 Tiếp theo cho dung dịch kháng nguyên vào các giếng Nếu có kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên thì kháng nguyên sẽ không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu Dựa vào độ pha loãng của huyết thanh có thể xác định hiệu giá kháng thể HI ở động vật hay người bị nhiễm cúm hoặc được tiêm chủng vacxin [23]

Phản ứng HI có thuận lợi là tương đối đơn giản, kinh tế và nó cũng đáp ứng

được hầu hết các yêu cầu của một phương pháp lý tưởng Đối với phần lớn các trường hợp, kháng thể kháng HA đều được phát hiện bằng phản ứng HI, vì vậy đây

là phản ứng đặc hiệu phân týp đối với chẩn đoán huyết thanh học của cúm Tuy nhiên phản ứng HI cũng có những bất lợi ở chỗ cần phải bất hoạt các tác nhân ức chế không đặc hiệu có trong huyết thanh và độ nhạy của phản ứng có thể bị giảm do

ái lực của kháng thể đối với các chủng cúm trội hơn

1.6.3.2 Phản ứng kết hợp bổ thể (CF)

Phản ứng kết hợp bổ thể được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán huyết thanh học của cúm Phản ứng được tiến hành theo qui trình của Lief (1963) Nguyên lý của phương pháp là khi kháng nguyên (KN) phản ứng được với kháng thể (KT) thì phải kết hợp được với bổ thể Nếu không phản ứng được với KT thì bổ thể ở dạng tự

do Dù phản ứng KN-KT-Bổ thể xảy ra nhưng không thể nhìn thấy được bằng mắt thường, do vậy cần bổ sung thêm một hệ thống thứ hai để chỉ thị Hệ thống này bao gồm hồng cầu cừu và KT kháng hồng cầu cừu Nếu ở hệ thống thứ nhất KN không phản ứng với KT thì bổ thể ở trạng thái tự do sẽ kết hợp với hệ thống thứ hai (hồng cầu cừu+ KT kháng hồng cầu cừu+bổ thể) Hồng cầu cừu sẽ bị bổ thể làm tan- phản ứng âm tính, còn nếu hồng cầu cừu không bị tan- phản ứng dương tính [3,4]

1.6.3.3 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

Kỹ thuật này được tiến hành theo Mc Quillin và cộng tác viên (1985) KN hoặc KT được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Kỹ thuật này dựa trên tính chất của thuốc nhuộm khi được kích thích bởi bức xạ có bước sóng tử ngoại sẽ phát

thuật nhạy, đáng tin cậy và được dùng nhiều trong chuẩn đoán nhanh các virut gây bệnh đường hô hấp và các virut khác Sử dụng tế bào đã nhiễm virut cúm đựơc nuôi trong môi trường phù hợp chứa 10% huyết thanh kháng virut cúm ở 37° C làm tiêu bản cho phản ứng miễn dịch huỳnh quang Tiếp theo ta bổ sung kháng huyết thanh kháng cúm đã đánh dấu bằng fluorescein isotiocyanat Tế bào bị nhiễm sẽ phát màu lá mạ dưới kính hiển vi huỳnh quang [5]

1.6.3.4 Kỹ thuật miễn dịch enzym hấp phụ trên giá rắn (Elisa)

Elisa là kỹ thuật được sử dụng phổ biến để phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể đặc hiệu Kỹ thuật cho phép xác định KT ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml) Nguyên lý của phương pháp này là KT được đánh dấu bằng cách gắn với enzym Khi thêm cơ chất thích hợp enzym sẽ phân giải cơ chất cho sản phẩm có màu Đo cường độ màu để biết mức độ phản ứng xảy ra

Hai kỹ thuật ELISA được dùng nhiều là kỹ thuật trực tiếp và kỹ thuật gián tiếp (hay kỹ thuật “sandwich”- bánh kẹp)

+ Kỹ thuật “bánh kẹp”dùng để xác định và đo nồng độ kháng nguyên còn kỹ thuật ELISA trực tiếp thường được dùng để định lượng kháng thể [3,6]

1.7 Điều trị

Ngoài các biện pháp hỗ trợ, các thuốc kháng vi rút được nhiều tác giả quan tâm, cho đến nay Oseltamivir (Tamiflu) là thuốc lựa chọn đầu tiên để tránh những tác hại không mong muốn của các thuốc khác như Amantidin, Rimantadin làm tăng khả năng kháng thuốc của vi rút Ribavirin chuyển hoá chủ yếu ở gan, lợi ích lâm sàng không nhiều và gây thiếu máu ở một số bệnh nhân Các tác giả khuyến cáo Tamiflu phải được dùng sớm trong vòng 48 giờ kể từ khi bệnh khởi phát mới có tác dụng Ngoài thuốc kháng vi rút, vấn đề điều trị suy hô hấp hiện nay còn nhiều khó khăn, đặc biệt là những bệnh nhân phải sử dụng phương pháp hỗ trợ hô hấp bằng máy thở

- Thở máy với áp lực thấp

- Tỷ lệ I/E: 1/1

- PEEP cao

Được nhiều tác giả ưa dùng

Có ý kiến cho rằng máy thở tần số cao tỏ ra có hiệu quả hơn, tăng khả năng trao đổi oxy, giảm biến chứng Ngoài ra kháng sinh cũng được quan tâm để đề

phòng và điều trị chống bội nhiễm

Chương 2: Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Bệnh nhân nghiên cứu được chọn tại 4 bệnh viện:

- Bệnh viện Nhi trung ương

- Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới

- Bệnh viện các bệnh nhiệt đới Hồ Chí Minh

- Khoa hô hấp Bệnh viện Bạch Mai

Bệnh nhân nghi ngờ viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm A H5N1, vi rút cúm A

được lựa chọn vào nghiên cứu dựa theo tiêu chuẩn sau:

- Diễn biến cấp tính trong vòng 48 giờ

- Sốt trên 38o C

- Biểu hiện hô hấp: chảy nước mũi, ho, khò khè, khó thở

- Không có tiền sử nằm viện trước đó 6 ngày

Các trường hợp viêm phổi nặng nghi do vi rút được định nghĩa:

2.2.1 Nghiên cứu dịch tễ học

2.2.1.1 Nghiên cứu một số đặc điểm DTH của bệnh cúm A(H5N1) trên người:

Nghiên cứu hồi cứu kết hợp với nghiên cứu tiếp theo các trường hợp mắc bệnh cúm A(H5N1), xác định một số đặc điểm DTH chủ yếu của bệnh cúm A(H5N1) trên người qua các đợt dịch từ 12/2003 đến 8/2006:

- Lập phiếu điều tra theo mẫu in sẵn các trường hợp mắc bệnh cúm A(H5N1)

- Sử dụng các kết quả điều tra vụ dịch, giám sát dịch tại các tỉnh/TP phía Bắc, các xét nghiệm chẩn đoán vi sinh, huyết thanh để bổ sung và làm rõ một số khía cạnh DTH của bệnh

- Nghiên cứu phân tích kết quả, tìm hiểu các đặc điểm DTH của bệnh dịch cúm A(H5N1) trên người

Nghiên cứu một số yếu tố nguy cơ liên quan đến phương thức lây truyền của

- Thiết kế nghiên cứu hồi cứu bệnh - chứng đối với các ca mắc bệnh cúm A(H5N1) trong năm 2004

- Chọn nhóm bệnh và nhóm chứng theo tiêu chuẩn chẩn đoán xác định ca bệnh cúm A(H5N1) và ghép cặp theo tỉ lệ 1 ca bệnh chọn 4 đối chứng

- Lấy mẫu xét nghiệm để lựa chọn các đối tượng tham gia nghiên cứu

- Phỏng vấn theo bộ câu hỏi nghiên cứu in sẵn

- Sử dụng phần mềm Epi-Info trong phân tích thống kê, ghép cặp đơn biến Phân tích đa biến bằng phần mềm SPSS (conditional logistic regression) Kết quả được trình bày dưới dạng các tỷ lệ, tỷ suất chênh (OR) và khoảng tin cậy

đối với mỗi biến số Các test thống kê được áp dụng bao gồm Mantel Haenszel, Yate corrected, Fisher exact test,

- Từ kết quả phân tích xác định một số yếu tố nguy cơ chủ yếu có liên quan

đến phương thức lây truyền của bệnh cúm A(H5N1) trên người

2.2.1.2 Nghiên cứu một số đặc điểm DTH lâm sàng của bệnh VĐHHC nặng do vi rút cúm người týp A:

Nghiên cứu hồi cứu kết hợp với nghiên cứu tiếp theo các trường hợp mắc bệnh

do vi rút cúm típ A vào điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương và Viện YHLSCBNĐ từ 1/2004 đến 7/2006:

- Lập phiếu điều tra các trường hợp mắc bệnh theo mẫu in sẵn

- Sử dụng các kết quả xét nghiệm, điều tra dịch tại các tỉnh/TP phía Bắc để bổ sung dữ liệu mô tả các đặc trưng dịch tễ học của bệnh

- Nghiên cứu phân tích kết quả, mô tả một số đặc trưng DTH trong sự lưu hành của bệnh do vi rút cúm típ A ở các tỉnh/TP phía Bắc qua các trường hợp mắc bệnh vào điều trị tại 2 bệnh viện Trung ương

2.2.1.3 Từ các kết quả nghiên cứu trên bước đầu xây dựng: quy trình giám sát, xử

lý ổ dịch đối với bệnh cúm A (H5N1) và quy trình xử lý ổ dịch cúm do vi rút cúm típ A trong trường hợp có đại dịch ở Việt Nam

2.2.2 Nghiên cứu xác định căn nguyên vi rút cúm H5N1, vi rút cúm A ở bệnh viêm

đường hô hấp cấp do vi rút:

- Thiết lập phương pháp chẩn đoán nhanh vi rút cúm A bằng phương pháp Real time PCR

- Triển khai, phát triển và hoàn thiện phương pháp RT- PCR để phát hiện sớm

vi rút cúm A và vi rút cúm A/H5N1 gây bệnh viêm đường hô hấp cấp

- Nghiên cứu chuyển giao kỹ thuật chẩn đoán cho một bệnh viện tuyến trung

Để tinh sạch vectơ tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit do hãng Invitrogen cung cấp

Phản ứng giải trình tự ADN được tiến hành nhờ bộ Kit giải trình tự của Hãng Applied Biosystems

Và để thực hiện phản ứng Real-time PCR trong chẩn đoán nhanh virut cúm

và RSV, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm LightCycler FatStar DNA masterplus SYBR Green I của Roche

Hoá chất

Cao nấm men, Trypton, Agar, Ampicilin, X-gal, EDTA, MgCl2, Chloroform,

Acetat natri, Ethanol 70%và 100%, TAE, Sol I, Sol II, Sol III, maker ADN…

2.2.2.1.2 Quy trình thực hiện

2.2.2.1.2.1 Tách chiết ARN tổng số

Các phân tử ARN không bền, dễ bị phân huỷ bởi RNaza có mặt khắp mọi nơi, ngay cả trên mồ hôi tay của người thao tác Phân tử RNaza có hoạt tính rất cao và rất bền vững với các tác nhân làm mất hoạt tính của chúng Vì vậy việc tách chiết ARN

đòi hỏi phải thận trọng để tránh mọi sự tạp nhiễm RNaza từ môi trường Thao tác phải trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hoá chất đều được xử lý DEPC trước khi

đem khử trùng bằng áp lực hơi nước

Có rất nhiều phương pháp được sử dụng để tách chiết ARN của virut cúm và RSV, trong đề tài này chúng tôi sử dụng phương pháp hoá học của Chomezynski và Sachi, Anal, Biochem (1987), 156-159

Các bước tiến hành:

ống Eppendorf, đảo đều Virut trong dịch tị hầu sẽ được bất hoạt ngay bởi dung dịch Trizol

được bất hoạt trong Trizol, đảo đều trong thời gian 15 giây

- Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C

Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút ở 40C để thu tủa ARN

- Rửa tủa lại bằng 1ml ethanol 70%, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 40C

có RNaza

2.2.2.1.2.2 Kiểm tra ARN tổng số bằng quang phổ kế

Để có thể xác định tương đối nồng độ của ARN tổng số tách từ mẫu, chúng tôi dùng phương pháp quang phổ kế Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các bzazơ purin và pirimidin Tiến hành như sau:

dụng dịch ARN trong 95 μl nước)

của máy quang phổ Shimadzu và do ở bước sóng 260 nm

CARN = A260 x 40 x d, với CARN là nồng độ ARN tính bằng μg/ml, A260 chỉ số

hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm, d là độ pha loãng của mẫu cần đo

2.2.2.1.2.3 Phương pháp tạo cDNA từ ARN

Để tạo được cDNA từ ARN của virut, giai đoạn này cần có enzyme phiên mã

ngược (enzym reverse transcriptase) và mồi ngẫu nhiên (Random primer)

Phương pháp:

- Chuẩn bị hỗn hợp ARN và mồi trong một ống 0,5 ml vô trùng với các thành phần như sau:

ARN tổng số (30-50 ng) : 5 àl Mồi ngẫu nhiên (50 ng/μl) : 3 àl

dNTP (10 mM) : 1 àl

H2O không có RNaza : 1 àl

Tổng thể tích : 10 àl Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp thì ủ ở 650C trong 5 phút và đặt trên đá ít nhất

1 phút Trong thời gian chờ sẽ chuẩn bị tiếp các thành phần khác để bổ sung vào phản ứng

- Bổ sung 9 àl hỗn hợp thành phần trên vào mỗi ống chứa ARN và mồi đã xử

lý 650C trong 5 phút, đảo nhẹ, ly tâm 3000 v/p trong 30s

- ủ phản ứng ở 250C trong 2 phút

- Bổ sung 1 àl (50 units) SuperScriptTMII RT vào mỗi phản ứng, đảo đều sau

đó ủ tiếp chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:

250C trong 10 phút

420C trong 50 phút

700C trong 15 phút Bảo quản ở 40C

- Bổ sung 1 àl RNaza vào mỗi ống và ủ ở 370C trong 20 phút để loại bỏ toàn

bộ ARN còn dư thừa trong mẫu Mẫu bây giờ chỉ còn chứa các sợi cDNA có kích thước khác nhau và cDNA sẽ được dùng làm khuôn để tổng hợp nên những đoạn AND đặc hiệu bằng phương pháp PCR

2.2.2.1.2.4 Khuếch đại các gen của virut cúm bằng phương pháp PCR

Phản ứng trong giai đoạn này cần có sự góp mặt của taq polymeraza và hệ thống mồi đặc hiệu cho gen mã hoá gen NP, gen NA của virut cúm Các gen này

được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu:

Tên

mồi

Kích thước sản phẩm PCR (bp)

Kiểm tra ADN bằng điện di

- Chuẩn bị gel agaroza: cho 1g agaroza vào dung dịch đệm TAE 1X Đun

trong lò vi sóng cho agaroza tan hoàn toàn Để nguội xuống khoảng 500C rồi đổ

dung dịch agaroza vào khay điện di có cài sẵn lược Sau khoảng 1h, khi gel đã đông,

gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di Đổ đệm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập

cách mặt gel 2 mm

- Tra mẫu ADN: Lấy mẫu chứa khoảng 1-2 àl ADN pha trong 16 àl đệm TAE

rồi trộn với 4 àl đệm màu 5X (chất này vừa có tác dụng tạo màu để quan sát, vừa có

tác dụng giúp cho mẫu ADN lắng xuống giếng trước khi chạy điện di) và tra vào các

giếng nhỏ trong gel Một lượng ADN tương ứng đã được cắt phối hợp bằng Hind III

và EcoR I cũng được tra vào gel để làm chỉ thị phân tử

- Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 100V, với thời gian 25-30 phút ADN di chuyển từ cực âm đến cực dương Quan sát sự di chuyển của màu bromphenol blue để biết khi nào cần ngừng điện di

- Nhuộm ADN bằng EtBr: Gel agaroza sau khi chạy điện di được nhuộm bằng dung dịch EtBr (2 μg/ml) trong thời gian khoảng 10 phút Sau đó lấy bản gel ra tráng nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel

2.2.2.1.2.5 Phương pháp tạo dòng

Tách dòng đoạn ADN thuộc gen fusion protein được tiến hành bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR 2.1 với việc sử dụng bộ sinh phẩm tách dòng của hãng Invitrogen Sau khi gắn, sản phẩm được biến nạp vào tế bào

E.coli chủng INVαF’ Các khuẩn lạc E.coli chứa vectơ pCR 2.1 tái tổ hợp mang sản

phẩm PCR được chọn lọc trên môi trường LB chứa ampicilin, và X-gal

Phản ứng gắn có các thành phần:

H2O: 4 àl, dung dịch đệm cho T4 ligaza: 1 àl , sản phẩm RT-PCR: 2 àl , vectơ pCR 2.1: 2 àl, T4 ligza: 1 àl

Biến nạp vào tế bào E.coli chủng INVαF’

Biến nạp là quá trình chuyển ADN plasmit trực tiếp vàp tế bào thể nhận Cơ chế biến nạp bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để ADN plasmit dễ dàng chui vào tế bào thể nhận Những tế bào có khả năng tiếp nhận ADN plasmit ngoại lai được gọi là tế bào khả biến Quá trình biến nạp ADN plasmit vào

tế bào E.coli chủng INVαF’ như sau:

- Lấy ống tế bào khả biến đặt trên đá 30 phút

- Trộn 4 àl vectơ tái tổ hợp vào ống tế bào khả biến, sau đó cắm trên đá 30 phút

- Sốc nhiệt ở 42oC, thời gian 30s, sau đó chuyển ống tế bào đó trên đá và để 2 phút

- Bổ sung 250 àl môi trường LB lỏng, sau đó nuôi lắc tốc độ 200v/p, ở 370C trong 1 giờ

- Cấy trải 150 àl trên môi trường thạch LB đặc có amp và X-gal

- ủ đĩa trong tủ ấm 370C qua đêm

Tách chiết ADN plasmit

Nhặt 15 khuẩn lạc trắng và 1 khuẩn lạc xanh, cấy mỗi khuẩn lạc vào 2 ml môi trường LB lỏng cùng với chất kháng sinh Amp (nồng độ 100 àl /ml) Lắc qua

đêm ở nhiệt độ 370C, 200 v/p

- Lấy 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf Ly tâm 5000 v/p trong 10 phút để thu cặn tế bào

- Bổ sung 150 àl dung dịch Sol I, trộn đều bằng máy vortex

- Bổ sung 150 àl dung dịch Sol II,đảo nhẹ bằng tay khoảng 3 lần

- Bổ sung 150 àl dung dịch Sol III, đảo nhẹ bằng tay khoảng 3 lần

- Thêm 450 àl chloroform:isoamyacohol (24:1), đảo nhẹ

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút

- Dùng pipet hút khoảng 400 àl dịch nổi chuyển sang ống Eppendorf mới, bổ sung thêm 40 àl NaOAc 3M, pH 5,2và 1ml ethanol 100% Để ADN plasmit tủa

200C ít nhất trong 1giờ

- Ly tâm 13000 v/p trong 20 phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào

- Rửa cặn ADN bằng 500 àl cồn 70%

- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút, thu tủa

- Làm khô cặn ADN plasmit bằng máy Speed Vac trong 3 phút

- Hoà cặn ADN trong 40 àl TE có RNaza

- ủ ở bể ổn nhiệt 370C trong 1h để loại ARN

Tinh sạch vectơ tái tổ hợp

Để tinh sạch vectơ tái tổ hợp phục vụ cho mục đích đọc trình tự, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit do hãng Invitrogen cung cấp Trình tự

đ−ợc tiến hành nh− sau:

- Ly tâm từ 1,2 ml dịch nuôi cấy qua đêm để thu xác tế bào

- Xác tế bào đ−ợc hoà lại trong 150 àl Resuspension Buffer nhờ vortex

- Bổ sung 150 àl Lyis Buffer và đảo nhẹ từ 5-6 lần, ủ ở nhiệt độ phòng trong

3 phút

- Thêm 150 àl Precipitation Salt và đảo nhẹ 6-8 lần

- Ly tâm tại nhiệt độ phòng 13000v/p trong 5 phút Trong lúc đợi ly tâm đặt cột S.N.A.PTM miniprep (A) vào trong ống (B)

- Thu dịch nổi vào trong ống Eppendorf vô trùng

- Thêm vào 600 àl Binding Buffer và đảo nhẹ 5-6 lần Cho toàn bộ dung dịch qua hệ thống A/B

- Ly tâm hệ thống A/B tại nhiệt độ phòng 2000v/p trong 30s

- Bỏ dịch chảy qua

- Bổ sung vào cột 500 àl Wash Buffer

- Ly tâm cột A/B tại nhiệt độ phòng từ 2000v/p trong 30s

- Thêm vào 900 àl Final Wash 1X và ly tâm 2000v/p trong 30s

- Ly tâm hệ thống tại nhiệt độ phòng tại tốc độ tối đa trong 1 phút

- Chuyển cột A vào một ống Eppendorf vô trùng, thêm vào 30 àl nước vô

trùng và ủ tại nhiệt độ phòng

- Ly tâm cột ở nhiệt độ phòng tốc độ tối đa trong vòng 1 phút

Xác định trình tự gen bằng máy tự động

Nguyên tắc:

Dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger có sử dụng các dideoxynucleotit

Trong kĩ thuật xác định trình tự bằng máy tự động, người ta không đánh dấu

bằng đồng vị phóng xạ mà bằng hoá chất huỳnh quang Mỗi loại dideoxynucleotit

được đánh dấu bằng một chất huỳnh quang có mầu khác nhau Như vậy tất cả các

oligonucleotit cùng chấm dứt tại một dideoxynucleotit sẽ có cùng một màu

Phản ứng xác định trình tự về cơ bản có các thành phần tham gia giống như

phản ứng PCR nhưng cố một số khác biệt:

Khi làm phản ứng xác định trình tự ta có thể sử dụng 2 mồi đó là M13F và

M13R nhưng chỉ có một mồi tham gia phản ứng, mồi đơn này sẽ bám vào vùng bổ

sung đã được thiết kế có sẵn trong vectơ

- Bé kÝt t¸ch chiÕt RNA tõ bÖnh phÈm l©m sµng ( Qiagen- Mü)

- Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n one-step RT-PCR (Qiagen- Mü); bé sinh phÈm

Real –time PCR (Invitrogen- Mü ), sequencing (ABI- Mü )

- Phần mền phân tích vật liệu di truyền DNAsis- Nhật bản

- Các dụng cụ trang thiết bị cần thiết khác

2.2.2.2.2 Quy trình thực hiện

2.2.2.2.2.1 Tách chiết RNA:

Sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết RNA của hãng Qiagen – Mỹ để thu thập RNA của virut cúm A từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng (dịch họng) Quy trình tách chiết thực hiện theo hướng dẫn của bộ sinh phẩm

độ phòng trong 10 phút

8000rpm/phút x 1 phút Loại bỏ dịch thu được, giữ cột tách chiết Tiếp tục chuyển 630 ul hỗn dịch còn lại vào cột tách chiết, lặp lại quá trình ly tâm

+ Rửa cột tách chiết 2 lần bằng đệm AW và ly tâm 8000rpm/phút x1 phút

8000rpm/phút x 1 phút RNA được bảo quản tại –800C cho tới khi sử dụng

2.2.2.2.2.3 Phân tích trình tự chuỗi nucleotid (sequencing)

Phản ứng phân tích trình tự chuỗi nucleotid được thực hiện theo thường quy trên máy phân tích trình tự chuỗi ABI 3100( Mỹ), sử dụng bộ sinh phẩm Bigdye của ABI- Mỹ cùng với các sinh phẩm, kít tinh lọc phụ trợ của Qiagen- Mỹ Kết quả

được phân tích dựa trên phần mềm DNAsis- Nhật bản

2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm và điều trị bệnh viêm đường hô hấp cấp do vi rút cúm A H5N1, vi rút cúm A và vi rút hợp bào hô hấp:

Bệnh nhân được tiến hành nghiên cứu hồi cứu và tiến cứu theo một mẫu bệnh án thống nhất với nội dung: