Khóa luận tốt nghiệp Nuôi trồng thủy sản: Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasiannodon hypophthalmus)

ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACCINE THỬ NGHIỆM PHÒNG BỆNHGAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus Tac gia PANG KHOA NGUYEN Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOAN CUA VACCINE THU NGHIEM

PHONG BENH GAN THAN MU TREN CA TRA

ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA VACCINE THỬ NGHIỆM PHÒNG BỆNH

GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus)

Tac gia

PANG KHOA NGUYEN

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sưngành Nuôi Trồng Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dân:

TS NGUYÊN HỮU THỊNH

Tháng 9 năm 2009

1

CẢM TẠ

Tôi xin cảm ơn:

Gia đình và những người thân đã luôn ủng hộ và động viên tôi cả về vật chất vàtỉnh thần trong suốt quá trình học tập

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM.

Ban chủ nhiệm khoa thủy sản cùng toàn thé quý thầy cô đã giảng dạy và cungcấp kiến thức cho tôi trong quá trình học tập

Và đặc biệt là thầy Nguyễn Hữu Thịnh người đã cung cấp kiến thức và trực tiếphướng dẫn dé tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Thầy Trần Hữu Lộc, anh Nguyễn Viết Phương và bạn Vũ Thị Mộng Huyềnnhững người đã giúp tôi hoàn thành đề tài

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp DH05NY và các bạn khóa 31

đã động viên và giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Dù đã cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian cũng như về mặt kiến thức nênluận văn này không tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được những ý kiếnđóng góp của quý thầy cô và các bạn để luận văn được hoàn chỉnh hơn

il

TÓM TẮT

Đề tài “Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ

trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện từ ngày 10/04/2009

-10/08/2009 tại trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản và phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy

Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

Đề tài được thực hiện đề đánh giá độ an toàn cua vaccine thử nghiệm đối với cátra bột và cá tra giống bằng phương pháp ngâm ở các nồng độ khác nhau kết hợp vớicho ăn và đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch đối với bệnh gan thận mủ trên cá traChúng tôi đã tiến hành thử nghiệm 2 lần

Lần 1: để xác định nồng độ an toàn của vaccine thử nghiệm đối với cá bột 4

và 5 ngày tuôi Cá tra bột 4 và 5 ngày tudi sẽ được ngâm vaccine pha loãng trong nướcvới tỉ lệ 1:9 ở mỗi nghiệm thức có 300 cá tra bột và được lập lại 3 lần Cá ở nghiệmthức cấp vaccine sẽ được ngâm vaccine trong 3 giờ, theo dõi và quan sát biểu hiện của

cá thử nghiệm liên tục trong 3 giờ và ghi nhận kết quả và so sánh với cá ở nghiệm thứcđối chứng Kết qua cho thấy ngâm ở tỉ lệ 1 : 9 trong 3 giờ vaccine thử nghiệm có ảnhhưởng tới cá bột 4 và 5 ngày tuổi với tỉ lệ chết cao 86,5% và 93,8 % trong khi ởnghiệm thức đối chứng tỉ lệ chết là 0,9% và 0% trong cùng điều kiện

Lần 2: xác định độ an toàn của vacccine thử nghiệm trên cá tra giống 5g

Cá tra giống 5g sẽ được ngâm vaccine pha loãng trong nước với tỉ lệ 1 : 90 ở mỗinghiệm thức có 100 con với 3 lần lập lại Cá được ngâm trong 15 phút và thực hiện

liên tục trong 3 ngày Sau đó cá ở các nghiệm thức ngâm vaccine sé được cho ăn thức

ăn có trộn vaccine thử nghiệm dạng cho ăn liên tục trong 4 tuần rồi ngưng trộnvaccine, cho cá ăn thức ăn bình thường thêm 2 tuần Tiến hành gây bệnh dé đánh giákha năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm Kết quả cho thay vaccine thửnghiệm hoàn toàn an toàn với cá 5g và khả năng bảo hộ miễn dịch trung bình là

45,7%.

11

Danh sach Cac Dang eee ẦẦỐẦồ.ồ.a.Ã+Ý x

Danhistch ede: Hit hicscsusssnnssmernncwaseneeiianem nines damcinerenwtencouantenarnemamminenrencnn XI

Danh: sánh sức sơ HỒ vũ đỗ THĨ suesssessoasennnldirtnosnditroieioggnfokig001-00000100180800 n0ieiingi xiiCHƯƠNG 1 MO DAU cssccssssssssssssssesscessnsssccessnsssccesssnssecessnnseseeesnnesceesnaesecs |

OO, , luyygngonnnrgoippipspV0geNEDESTE70/30/2800001240100174200542309121170005E! |

ÏÃ TK TRENLEDI Í cca sec ce a 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN 55: 25cc 2 ttttrrrirtrrrrrrrrrrrrriee 32.1 Tổng quan về việc sử dung vaccine trong nuôi trồng thủy sản 32.1.1 Định nghĩa về vaccine ¿22 2 x+SE£+EE£EEt2EEEEEEEE121121221121 21222 32.1.2 Lich sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản -.- 3

2:11! PHAM OAL VACCINE sess cenccsscevsnceucmspesnnarecnunicstanpancwasdnenualnseaentxaserwcaseunaseiveesccunee 4

2.1.3.1 Vaccine võ hoat (Inactivated) sss csussasemavacnnennaceexn cxmrmneasvaneeans 4

Ee ee 42.1.3.3 Vaccine sống (Live Attenuated) 0 ccccescssseesessesseessessessessesseessesseesesseees 42.1.3.4 Vaccine tiểu phần (recombinan) - 2-2: 5+ + x££E2E££E£2E2EEerEezrxeree 4

IV

204 369: DIN AY VACCINE, sanauingikndiirntiscttl0804LiBuiiuidiSistrrikigiili3iBsdgfuB,SorgititsbeddlauilissSipldgoigbaitylitueEaduảA 5

2.1.4 Phương pháp sử dung VaCCIT€ - Á + +1 23 9 9 nh HH nghi 5

2.1.4.1 Phương pháp ngâm - - - S- 3231231121 251 1511111111111 8111111 5

2.1.4.2 Phương pháp tiÊm - 2 2c 22222211211 351 1231151121111 11111011111 11111 xe 6

2.14.3 Phương pPhấp Cho ah sessenossesasoissekisD oAE1AEA0190.04001101D1R66040088002/0065 6

2zl.1:4 PhữơHữ phap HHÙTD susenaroandeaitialtiES0513S01035814350SEGRGR8WBiSESSESS1380I%99330039380188 6

2AAS BOM CAO AD suansdngninisdicokgbietssg19d56650S613038075GSEASISLRSEENEEGSGGĐ53E-30/958S88S88005804008 6

2.1.4.6 Bom vao ái on 6

2.1.5 Vai trò của việc sử dung vaccine trong nuôi trồng thủy sản 72.1.6 Các yếu tô ảnh hưởng đến hiệu quả cua vaccine dùng trong thủy sản 82.1.6.1 Yếu tố đi truyn oeccececcecceccesccsecscsseseessesscssessesucssssuesscsecsessssecssssssssseeaveess 8

2.1.6.2 Tình trạng của đối tượng được cấp VACCINE buuxx0g11146114001013111611445901L4025384 8

2.1.6.3 Các yếu tổ môi trườngg -:¿- + k+2E++Ek9EEEEEE2E1211211711213110212 E270 8

2.1.6.4 Trình độ kỹ thuật của người sử dụng oo eee ee cece eeteeteeeteeteeeseeeeeseeseeeaes 8

2.1.7 Nguyên tắc sử dụng vaccine - c5 se 2x2 E1 E171211211111 11111 re 8

2.1.8 Đánh giá hiệu quả của sử dụng VACCINE -.- Gà S2 ni, 9

2.2 Bệnh Gan Thận Mu Trên Cá TTra - G E22 21111E6E223 1E E££E25EEEEEErzzeee 9

2.2.1 Lich sử bệnh do Edwardsiella iCfdÏUFÌ 5 52c 1 332313 ++EE+seeeszeeesss 10

2.9.2) DAGIHHAP7D 3W WON Tisguungsnoiinddtibiiitritsgtsslisglsdi4lilssspqhdbeRqasdgisdtlNdGiôtgyepissstosldusdia 10

Dade, Phat lOal nung gunn 08010 11g 018812558158661335086g3881418315183933008831348861831580138319380135808 10

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella ietaluri 11322.3 Wipe A tie sâu EAD oc eusianrscenasvionesonenniccnavrnoronnininsicuniniesamaineenstetieaynnessarso 112.2.3 Đường lây truyền của E iCtaluri ccececcecseescssseessessesseessessessessesssessessesseeesees 122.2.4 Chan đoán ::-22++2E2+vt2E2 22221112 111 ro 12

2.2.9: HCW CHỮ Hỗ susssnesesnninbnoatiidiTEE00010013363003385558SL900B1A43833060184854000038100886 12

0,20) PC HE LÍ ee ee 13

2.2.7 Phong va tri o0 13

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨCU 143.1 Thời Gian va Địa Điểm Thực Hiện - - + s+E+EE+E+E£EE+E+EEEE+EeExzErrerrsre 14

8.2, Vat Liệu Ne HIGH CUO senssneeabinndiae t0 0YESDSISSINGGAIGSHDHGSEBGRGASIRORNNESESDNNGUEG 14

Suốn| DUNS 'Ế Han noi E01 t2 d033IDDA5 0003G3880-38394012EESSS11423S0N83501)8S018S01345i0101858300130/ 0808 14

3.2.2 Hóa chất và môi trường 2-2 ©-++2+£+2+++EE+£EE+2EE222122212221222122212 xe 143.3 Đối Tượng Nghiên Cứu ¿- 2 5¿+E++EE22EE2EEEEEE2E1221121121121111 21.1 14

6/0 0ii0i 202 01 15

3.3.3 Vi khuẩn thí nghiệm - 2 2-© £+S++SE+2EE£EE£EEE2E19211221271211221212222 xe 15

3:4 Phương Pháp Nghiền CỮU sesssssaasoindiaiiatidtittsgtiit4aSE8116 0358539088980318198059399485350 15

3.4.1Phương pháp chuẩn bị dé đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm 153.4.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuân - 2 s2 sz+sezcse2 163.4.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống - L73.4.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm 2 ¿+ 22 ++x+£+zxzxczxe2 173.4.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm -2- 22 52 2+s5522 183.4.6 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn từ cá bệnh - 2-2 5z s2 se 183.4.7 Phương pháp cấy thuầNn 2 ¿S2 2E2E2EE2E1211211211211211211211 21 xe 19

3:4.8 Phương pháp định da ‹s:::sscssiseseccebn ng dán 0116154 014416014463146185434 844 19

3.4.8.1 Phương phấp nhuộm ÔiTATs:s¿sscccssscpstt021S0500106 10146 K56% 561145606 1à 250055: 0738088:a 20

3.4.8.2 Thử nghiệm về khả năng di động của vi khuan bằng cách xem trực tiếp

Hới tiaiH THÔN VĨ se seesmeoexseooiimeoeaperthdimigAggt0fnt-Hig90.Dg00.7.130770002210010 10 21

3.4.8.3 Thur nghiém nc in 21

SABA LHỤTEHTIGHI.CDX TS sinsgbiobingirddDtoiiliIGN0000008310930:0083510S802NS8SR38HDIAIMBH.G08009008184804308 21

3.4.8.5 Thử nghiệm LDC và di động bang kit định danh IDS 14 GNR 213.4.9 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng của cá -: -¿©sz5-s+2z+csce2 22.

3.4.10 Phương pháp thí nghiệm 0.0 cece ceeeeseeeeeeceeseeeeeeseeeeenseeseeeseeneeneeeaeenes 23

3.4.10.1 Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm - : 5: 23

3.4.10.2 Đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm đối với

vi khuẩn Edwardsiela icfaluri - + +©5++c+E+E‡EESEESEEEErEerkerrerxee 253.4.11 Phương pháp xử lí số liệu 2- 2 2©E2+EE+EE2EE+EEtEEE2EEeEErrkrrseee 26CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN c 5s css©ssecsscsse 27

4.1 Cac chi tiGu M61 truOng 1077 27

4.1.1 Đối với cá bột -:¿-22+++222+vtt22E 2111.1111 ro 274.1.2 Đối với cá 5g -.-¿- ¿2222 122211221121121122112112112111111111211121112 ca 284.2 Kết quả kiểm tra dé đánh giá độ an của vaccine thử nghiệm 294.2.1 Kết quả kiểm tra sức khỏe cá nuôi trong quá trình thí nghiệm 294.2.2 Kết quả tỷ lệ sống của cá trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm 31

EN ee 31ch) 5 ec, 334.2.3 Kết quả kiểm tra tăng trọng ¿- 2© ¿+S++Ex£2E2EE£EE22E1221211221212221 e2 344.2.4 Kết quả kiểm tra về lượng thức ăn 2 +2222E++EE+2E+2EEeEEzrxerseee 344.3 Kết quả đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm đối với

bệnh ean thai mu tren C4 Dầu nasdeoibttrgtbidthLiGLGR GHAINGSS.BDHAJR(ASGASS.SiSNRtfGSoio 35

4.3.1 Số lượng vi khuan có trong bình tăng sinh gốc và lượng vi khuân sống

có trong dung dich gây nhiễm cho cá +2 2 2 +S+S£+E+£x+E+szzxers 354.3.2 Kết qua quá trình phân lập và định danh vi khuẩn - 354.3.3 Tỷ lệ cá chết ở các nghiệm thức -¿- 2 2 2+ ++E++E+E2E2EE2E2Ezrerrree 37

vil

4.3.4 Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm ở các lô

nghiệm thỨC 6 cành TT Họ Tho nh TH Hàn HH nưệp 42

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, . -°-scssccsessscsee 44

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

BHIA Brain Heart Infusion Agar

BHIB Brain Heart Infusion Broth

CFU Colony forming unit

ctv Cộng tác viên

DO Dissolve Oxygen

FAO Food and Agriculture Organization

FKC Formaline Killed Cell

Ig Immunoglobulin

ImP Immersion protein

LDC Lysin decarboxylase

NTTS Nuôi trồng thủy sản

ONPG O-Nitrophenyl B — D Galactopyrannoside

OrP Oral protein

PAD Phenyl Alanin Deaminnase

PCA plate count Agar

RPS Relative Percent Survival

VP Voges — Poskauer

1X

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng

Bảng 3.1: Số thứ tự các đĩa giấy trong các giếng - scxcsrerxerrerree 20Bang 4.1: Các chỉ tiêu môi trường trong bể ương 2 2 2+sz+s++sz+sz+sez 27

Bang 4.2: Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình nuôi thí nghiệm 28

Bảng 4.3: Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình gây bệnh thực nghiệm trong

TPHÒH HH ba na ngbinanisbsidid bisbioiooiötersblslriptlsgDinhù thiG4Sg3NISSNiGigsxassiizfiuiittisuiisbasit 29

Bang 4.4: Bảng kiểm tra sức khỏe cá nuôi trong suốt quá trình thí nghiém .30Bảng 4.5: Số lượng và tỉ lệ cá chết trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm ở

cá bột 4 ngày tuổi .-¿- ¿- 5+2 2 Ek221122122112111112111111111111 211 11x re 31Bang 4.6: Số lượng và tỉ lệ cá chết trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm ở

cá bột 5 ngày tuôi -5- 5c c2 2E21221211211111111211211 11121 11e re 31Bảng 4.7 Số lượng cá chết trung bình trong quá trình cấp vaccine thử nghiệm

(CLAN GHTOTđ1fssssiangzrtosvag0xi5estidbockbsdibsikeb ktEtbiókiRjSiboltjsusoxàfs801/000630u0340g090:0.42010.43.00g0ei 33

Bảng 4.8 Trọng lượng trung bình của cá trước và sau khi tiến hành

Bang 4.9: Luong thức ăn trung bình của cá ở các lô nghiệm thức

và đối chứng -¿ ¿- + s1 E2E121121121121121121111121111111121111111 11111 c0 34Bảng 4.10: Kết quả các phan ứng sinh hóa của E ictaluri -: -:- 52+ 37Bảng 4.11: Ty lệ chết trung bình của các lô thí nghiệm khi gây nhiém 41Bảng 4.12: Khả năng bao hộ miễn dich RPS (%) của các nghiệm thức khi

geil TYh anuatgbig0GS00G0 B00 001 0GUNGDREIRGENGOHNIEIGNGEENGHSEMAUOf0SS/ENiĐ0G00E8 43

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình

Hình 3.1: Đếm số lượng cá bột cho vào các vẻO -¿- 2 ¿+2 s+£x+x+zcxez 16Hình 3.2: Số lượng khuan lac trên dia cay phù hop ở độ pha loãng 107° 17Hình 3.3: Gây bệnh cho cá bằng phương pháp ngâm - 2-52 + z2 18Hình 3.4: Vèo chứa cá bột 4 ngày tuôi -2- 2 52+S2+EEt2E2EEE2E2EEExcrrrrrxee 24Hình 3.5: Cá được bó trí để chuẩn bị gây bệnh 2-2 522 s+£xe+xz+cxeẻ 26

Hình 4.1: Quá trình ngâm cá bột trong phòng lạnh - ¿+5 ++-+++s<++2 27

Hình 4.2: Hệ thống bể composite bố tri thí nghiệm - 2 2z 522 +2 28

Hình 4.3: San lá đơn chủ kí sinh trên mang cá - ¿+52 +++++s£+£+x+xs+2 29

Hình 4.4: Cá bột 4 ngày tuổi đang ngâm trong vaccine -z s22 32Hình 4.5: Cấp vaccine thử nghiệm dạng ngâm cho cá 5g 2: 33Hình 4.6: Số lượng khuẩn lạc ở độ pha loãng 10” -2- 2 5z ++cxz+x+zcszez 35Hình 4.7: Khuan lạc Edwardsiella ictaluri trên môi trường BHIA sau 48 giờ

Hình 4.10: Thận, gan của cá tra thí nghiệm bị hoại tử vào ngày thứ 7 ở

lỗi NH2: oncbinginDNE 0 EEL611E-SG18318 E0: 3SE8GiLẺ130ĐEASGIENDHDGữBRRSSSNTuSSSGEIIDNGISRIIEGGESEIIGSSRIEIIEGEER 40

Hình 4.11: Gan, thận, lách và tụy tạng cá tra bi hoại tử nặng vào ngày thứ 8 ở

lỗ ĐC 2n ennibnnseiirnloatindfxtgtatilidiopasdbtoiclGxptgiliöooogltgsgsfiatutisfypoopiGftpspsii 41

XI

năm 2008.

Bên cạnh sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi ven biển và nghề nuôi biển thi

nghề nuôi cá nước ngọt vẫn khẳng định được vai trò của mình Với lịch sử lâu đời của

nghề nuôi cá nước ngọt và những đối tượng nuôi có giá trị cao và nhu cầu lớn trên thịtrường như cá tra và basa, nghề nuôi thủy sản nước ngọt vẫn là một trong những nghề

mũi nhọn của NTTS tại Việt Nam.

Cùng với sự phát triển của nhiều hình thức nuôi thì vấn đề dịch bệnh đã trở thànhmột trong những trở ngại chính cho sự phát triển bền vững của NTTS nước ngọt Việt

Nam Ví dụ như bệnh gan thận mủ trên cá tra và basa đã gây thiệt hại không nhỏ cho

sự phát triển của đối tượng này Hiện nay việc phòng trị bệnh trên cá nước ngọt ở nước

ta vẫn chủ yếu dựa vào sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất Hiện chưa có một loại

vaccine phòng bệnh cho ca được đưa vào sử dụng tại Việt Nam Việc phòng tri bệnh

phụ thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và hóa chất gần đây đã khiến cho việc xuất

khẩu thủy sản của Việt Nam gặp nhiều khó khăn Ví dụ cụ thé đó là việc cắm sử dụng

chloramphenicol, flomequine và xanh malachite đã ảnh hưởng lớn cho nghề xuất khâu

cá tra và basa của Việt Nam Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển các phương pháp

phòng bệnh có hiệu quả như sử dụng các loại thảo dược va vaccine cho cá nước ngọt

là cần thiết nhằm đảm bảo cho sự phát triển bền vững của nghề

Vì cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng có sản lượng lớn nên

đã thu hút được nhiêu công ty sản xuất vaccine trên thế giới đầu tư nghiên cứu vàolĩnh vực này Nhưng ngoài việc đánh giá hiểu quả bảo hộ miễn dịch thì vaccine cầnđược đánh giá mức độ an toàn khi sử dụng Do đó chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên

cứu “Đánh gia độ an toàn của vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan thận mủ trên

cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” dé phát triển và ứng dụng trong sản xuất.1.2 Mục Tiêu Đề Tài

Đánh giá độ an toàn cua vaccine thử nghiệm phòng bệnh gan than mủ trên cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus).

Chương 2

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng Quan Về Việc Sử Dung Vaccine Trong Nuôi Trồng Thủy Sản

2.1.1 Định nghĩa về vaccine

“Vaccine là những chế phâm kháng nguyên có nguồn gốc từ mầm bệnh, đã đượcchuyền thành vô hại bằng nhiều cách khác nhau, có tác dụng kích hoạt hệ miễn dịchsao cho tính kháng bệnh tốt hơn khi tiếp xúc với mầm bệnh lần sau.” (Ellis, 1988).2.1.2 Lịch sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản

1936, Nybelin đã công bố nghiên cứu của mình về đáp ứng miễn dịch của cá đốivới vi khuân Vibrio angullarum Đến năm 1939, ông nghiên cứu đáp ứng miễn dich

của cá đôi với Pseudomonas punctada.

1940, Smith công bô nghiên cứu của mình về đáp ứng miền dịch của cá đôi với

Bacterium salmonicida (Aeromonas salmonicida).

1942, Duff chứng minh một cách rõ ràng cá có thé tạo ra kháng thé chống lại vi

khuân Bacterium salmonicida.

Từ 1942 — 1946, các công trình nghiên cứu nay bị gián đoạn bởi sự bùng nỗ củachiến tranh thê giới

1966, khi nền công nghiệp nuôi cá hồi phát triển mạnh nhưng cá nuôi thường bịbệnh đỏ miệng do vi khuan Vibrio anugillarum và V ordalli gây ra nên đã kích thích

sự phát triển vaccine phòng bệnh Và vaccine phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sảnđược bắt đầu nghiên cứu và phát triển mạnh từ năm 1973 nhưng mãi đến cuối nhữngnăm 1987 mới được đưa vào sử dụng (Newman, 1993) Cho đến tháng 7 năm 2005, đã

có 35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vaccine phòng bệnh vi rút được đăng

ký ban quyền và sử dụng cho 6 đối tượng nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giớibao gồm cá hồi, cá chẽm châu âu, cá chẽm châu á, cá rô phi và cá bơn đuôi vàng

(Hastain và ctc, 2005).

2.1.3 Phân loại vaccine

2.1.3.1 Vaccine vô hoạt (Inactivated)

Vaccine vô hoạt là vaccine được sản xuất trực tiếp từ chủng vi khuẩn gây bệnh,sau khi nuôi cấy tăng sinh và diệt vi khuẩn bằng nhiệt hoặc hóa chất (formalin,glutaraldehyde) Loại vaccine này rẻ, công nghệ sản xuất đơn giản và có thể sản xuấtvới quy mô lớn phù hợp với điều kiện Việt Nam Tuy nhiên trong một số trường hợphiệu quả của vaccine vô hoạt thấp nên các loại vaccine khác được phát triển và ứngdụng vào sản suất

2.1.3.2 Vaccine hỗn hợp

Vaccine hỗn hợp là loại vaccine có chứa nhiều hơn một chủng vi khuẩn gây bệnh

đã được bất hoạt nhằm gia tăng khả năng phòng cho một hoặc nhiều bệnh khác nhau.2.1.3.3 Vaccine sống (Live Attenuated)

Vaccine sống là loại vaccine được sản xuất dựa vào biến đôi gene của chủng vikhuẩn gây bệnh Công việc quan trọng nhất của việc sản xuất được loại vaccine này làxác định được gen độc lực và loại bỏ gene độc lực trước khi sử dụng vi khuẩn vẫn cònsông Đây là loại vaccine đòi hỏi công nghệ cao để sản xuất và nguy cơ vi khuẩnkhông độc lực trở thành chủng gây bệnh do biến đổi gen hoặc thu nhập gen độc từchúng vi khuẩn gây bệnh

2.1.3.4 Vaccine tiểu phần (recombinant)

Là loại vaccine được sản xuất từ tiéu phần kháng nguyên của tác nhân gây bệnh.Thông thường tiêu phần kháng nguyên của vi khuân chiếm tỉ lệ rất nhỏ trong cấu trúc

tế bào như thành tế bào ở vi khuẩn hoặc một phần vỏ, protein, nội hoặc ngoại bao cua

vi khuẩn cũng như vi rút

Vaccine có thê được sản suất theo 3 phương pháp dưới đây

Sản xuất vaccine tiểu phần bằng cách tách chiết trực tiếp tiểu phần khángnguyên từ vi khuẩn sau khi nuôi cấy tăng sinh như làm vỡ tế bào, tách lọc protein nộihoặc ngoại bào tùy vào thành phần của kháng nguyên

Vaccine tiểu phần có thé sản xuất được bằng cách xác định gene độc lực của vikhuẩn sau đó đưa gene độc lực vào plasmid hoặc bacteriophage, trước khi đưa vào vikhuẩn E.coli và nuôi cấy vi khuẩn này trong điều kiện đặc biệt nhằm sản suất ra tiểuphần kháng nguyên cần thiết Sau đó tách lọc kháng nguyên và sử dụng như vaccinetiểu phan

Sau khi xác định được gene độc lực của chúng ta có thé tổng hợp proteinnhân tạo bằng phương pháp phòng thí nghiệm Việc nghiên cứu và sản xuất loạivaccine này rất tốn kém, giá thành cao nên ít loại vaccine tiêu phần được sử dụng

trong NTTS.

2.1.3.5 DNA vaccine

Là loại vaccine có thành phần chính là gen độc lực của chủng vi khuân gây bệnhđược tông hợp và đưa trực tiếp vào cơ thể cá hoặc được nhân lên trong vi sinh vậtmang nước trước khi đưa vào cơ thể cần được bảo vệ Đây là công nghệ sản xuấtvaccine mới nhất và thường được áp dụng trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh dovirut gây ra Một nhược điểm lớn nhất của loại vaccine này đó là chi phí sản xuất ratcao vì vậy ít được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản

2.1.4 Phương pháp sử dụng vaccine.

Việc sử dụng vaccine trong thủy sản cũng có nhiều phương pháp khác nhau

Tuy từng loại vaccine khác nhau mà phương pháp sử dụng cũng khác nhau Vi vậy tùy

từng loại vaccine và kha năng áp dụng mà chúng ta có thé sử dung bằng các phương

pháp dưới đây.

2.1.4.1 Phương pháp ngâm

Sử dụng vaccine theo phương pháp này bằng cách ngâm cá trực tiếp trongvaccine Nong độ và thời gian xử lý phụ thuộc vào loại vaccine và dùng theo chỉ dancủa nhà sản xuất Tuy nhiên để tăng hiệu quả sử dụng của vaccine thì tùy từng đốitượng nuôi và kích thước cá mà ta có thé thay đổi nồng độ ngâm nhằm gia tăng hiệuquả của vaccine Đây là phương pháp dé áp dụng và có chi phí thấp

2.1.4.2 Phương pháp tiêm

Vaccine có thé được tiêm vào trong xoang bụng hay tiêm vào cơ Kích thước cá

và liều sử dụng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Đây là phương pháp sử dụng cho hiệu quả vaccine cao nhất Tuy nhiên chỉ phí sửdụng và thời gian sử dụng là tốn kém nhất

2.1.4.3 Phương pháp cho ăn

Đây là phương pháp sử dụng vaccine đơn giản nhất và có chỉ phí sử dụng thấpnhất Tuy nhiên chỉ có vaccine tiểu phần mới áp dụng theo phương pháp này vì cácloại vaccine khác khi sử dụng theo phương pháp này có hiệu quả rất thấp

Ngoài ra còn có thé cấp vaccine theo các cách sau như:

2.1.4.4 Phương pháp nhúng

Đây là phương pháp sử dụng vaccine với nồng độ cao và ngâm trực tiếp cá vàotrong vaccine Đây là phương pháp sử dụng đơn giản và thời gian xử lý ngắn nhưnghiệu quả hạn chế và tốn nhiều vaccine

2.1.4.5 Bơm cao áp

Đây là phương pháp sử dụng vaccine giống với phương pháp tiêm, tuy nhiênchúng ta không sử dụng mũi kim thông thường mà sử dụng xilanh có áp xuất cao déđưa vaccine vào vật chủ mà không gây ra vết thương bên ngoài Chi phí sử dụngvaccine cao phương pháp này cũng rất cao và đòi hỏi có trang thiết bị chuyên dụng

2.1.4.6 Bơm vào đường ruột

Tương tự với việc sử dụng vaccine bằng phương pháp tiêm nhưng thay vì tiêm

cơ hoặc tiêm xoang bụng phương pháp này sử dụng bằng cách tiêm vào đường ruột

thông qua hậu môn Mặc dù việc sử dung vaccine theo phương pháp nay có hiệu qua

tốt và không gây thương tốn cho cá tuy nhiên chi phí cao vì tốn nhiều công lao động.2.1.5 Vai trò của việc sử dung vaccine trong nuôi trồng thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản một khi bệnh đã xảy ra thường gây hậu quả rấtnghiêm trọng nên phòng bệnh bao giờ cũng tốt hơn chữa bệnh

Một trong những lợi thê lớn khác của việc sử dụng vaccine trong nuôi trong thủy

sản đó là làm giảm thiêu việc sử dụng thuôc kháng sinh và hóa chât, vừa tiêt kiệm

được tiên của vừa không làm ảnh hưởng xâu dén môi trường ao nuôi, vừa tang năng

suất cá nuôi nhưng vẫn đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm

Ta có thé lay một ví dụ điển hình là ngành công nghiệp nuôi cá hồi trên thégiới Ngành công nghiệp nuôi cá hồi mới phát triển đầu những năm 1980 đến năm

2003 sản lượng trên thế giới đạt khoảng 700.000 tấn Tuy nhiên bệnh do vi khuẩn là

một trong những trở ngại cho ngành công nghiệp này Lượng kháng sinh sử dụng

trong nghề nuôi cá hồi tăng dan từ 0,3 - 0,9 kg/tan sản phẩm vào năm 1987 (FAO,2006) Sau đó lượng kháng sinh sử dụng giảm dần từ khi xuất hiện các loại vaccine cóhiệu quả trong việc phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên đối tượng này từ những năm

90 của thế kỷ trước và cho đến nay hầu như không còn sử dụng kháng sinh trong nghềnuôi cá hồi thương phẩm Việc sử dụng vaccine không chỉ thay thế thuốc kháng sinhtrong nghề nuôi cá hồi mà còn làm giảm chỉ phí sản xuất cá hồi trên thế giới Theo sốliệu thống kê của FAO vào năm 2006 thì chi phí dé sản xuất ra 1 kg cá hồi năm 1987

là 7 Euro, đến năm 2003 đã giảm xuống còn dưới 2 Euro/kg Có nhiều nguyên nhângiúp cho chi phí sản xuất cá hồi giảm như: cải tiến công nghệ nuôi, hoàn thiện thức ăncông nghiệp và đặc biệt là tăng tỉ lệ sống của cá nhờ vào việc sử dụng các loại vaccinephòng bệnh vi khuẩn trên đối tượng này Cũng theo FAO cho đến năm 2005 có đến95% tông số cá được tiêm vaccine trước khi đưa vào nuôi thương phẩm và tỉ lệ sốngcủa cá nuôi thương phâm dat trên 90%

Một ưu điểm khác của việc sử dụng vaccine là giúp tránh được tình trạng khángthuốc của vi khuẩn Đây là một trong những van đề đáng lo ngại

2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine dùng trong thủy sản

2.1.6.1 Yếu tố di truyền

Day là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của vaccine

vì mỗi loài cá khác nhau sẽ có khả năng đáp ứng miễn dịch khác nhau Do đó trước khitiến hành sản xuất một loại vaccine nào đó cần nghiên cứu thật kỹ kha năng đáp ứng

miền dịch của đôi tượng đó.

2.1.6.2 Tình trạng của đối tượng được cấp vaccine

Cỡ cá (cá lớn sẽ có sức đề kháng tốt hơn cá nhỏ) Cá khỏe mạnh sẽ cho đáp ứngmiễn dịch tốt hơn cá yêu Cá có điều kiện đinh dưỡng tốt sẽ cho đáp ứng miễn dịch tốthơn những cá được nuôi trong điều kiện dinh dưỡng kém

2.1.6.3 Các yếu tố môi trường

Cá được nuôi trong điều kiện môi trường nước tốt, có các chỉ tiêu môi trườngnhư pH, nhiệt độ, ôxy hòa tan, NH; trong khoảng thích hợp sẽ cho đáp ứng tốt so với

cá sống trong môi trường bắt lợi

2.1.6.4 Trình độ kỹ thuật của người sử dụng

Các thao tác trong quá trình cấp vaccine cần phải được chuẩn bị tốt, thao tác phảichính xác và đúng Tránh gây shock cho cá nuôi Phải có kiến thức trong việc bảo

quan vaccine.

Việc sử dung các loại thuốc và hóa chất khác: các loại thuốc và kháng sinh sẽảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của cá từ đó sẽ ảnh hưởng đến hiệu quảcủa vaccine Khi tiêm hồng cầu thỏ vào cơ của cá chép, đáp ứng miễn dịch dịch thểthứ phát có thể được phát hiện vào ngày thứ 9 Tuy nhiên nếu xử lí cá thí nghiệm vớiOxytetracycline bằng cách tiêm (3 ngày tiêm một lần, trong 15 ngày trước khi tiêmhồng cầu thỏ hoặc cho ăn trong suốt thời gian thí nghiệm thì mức độ đáp ứng miễndịch dịch thể của cá sẽ bị sụt giảm 90% so với cá đối chứng (Rijkers, 1980)

2.1.7 Nguyên tắc sử dụng vaccine

Chỉ sử dụng vaccine theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Sẽ đạt được hiệu quả bảo hộ cao nếu ta cấp vaccine nhiều lần

Nên cấp vaccine cho cá trước khi sử dụng con giống nuôi thương phẩm

Chỉ nên cấp vaccine vào những khoảng thời gian có nhiệt độ, thời tiết ít thay đối.Không cấp vaccine khi cá đang bệnh

Tránh gây stress cho cá khi tiêm vaccine (3 tuần sau khi vận chuyên phân cỡ cá

mới nên tiêm vaccine).

Những người có kỹ thuật và được huấn luyện mới đủ khả năng cấp vaccine cho

cả.

Khi đang cấp vaccine mà cá chết thì ngưng ngay

Chỉ nên sử dụng vaccine có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng

2.1.8 Đánh giá hiệu quả sử dụng vaccine

Muốn đánh giá hiệu quả của một loại vaccine người ta thường bố trí gây nhiễmtrên hai nhóm cá Nhóm cá được gây miễn dịch bằng loại vaccine cần xác định vànhóm cá đối chứng không được gây miễn dịch rồi theo dõi tỉ lệ sống của các nhóm cátrong một khoảng thời gian định trước Thường là 14 ngày hoặc theo dõi cho đến khikhông còn cá chết Đòi hỏi có một số tiêu chuẩn cơ bản như: mỗi nhóm phải có tốithiểu 25 cá thé với độ lặp lại tối thiểu là 2 Việc gây nhiễm với tác nhân gây bệnh phảiđạt được tỉ lệ chết hoặc mắc bệnh trên 50% nhưng nhỏ hơn 90% đối với nhóm cá đốichứng Nguyên nhân tử vong của mọi cá thé trong thí nghiệm phải được xác minh với

số cá chết do nguyên nhân khác ngoài tác nhân gây bệnh không được vượt quá 10%đối với tat cả các nhóm

Khi đó hiệu quả bảo hộ RPS (Relative Percent Survival) sẽ được tính theo công

1976 bệnh được ghi nhận trên ca da nheo (/cfalurus punctatus) là một loại ca da

trơn của Mỹ 1979 bệnh bắt đầu được mô tả

1981 lần đầu tiên mô tả nguyên nhân do vi khuẩn gây bệnh và được định danh vớitên bệnh là bệnh nhiễm trùng huyết và viêm ruột (Enteric Septicemia of catfish: ECS)

Tên gọi khác: bệnh lỗ đầu (hole in the head disease) vì sau khi sống sót cá chuyên

sang mãn tính và trên dau có một vết loét.

Là một trong những bệnh nguy hiểm nhất ảnh hưởng ảnh đến công nghiệp nuôi cá

da trơn tại Mỹ Tại khu vực Đông Nam Á bệnh được phát hiện trên cá da trơn Thái Lanvào năm 1987 Bệnh xuất hiện trên cá Tra và Ba Sa nuôi ao bè ở Việt Nam vào năm

1992 đến năm 2001 thì bệnh được gọi là bệnh mủ gan và bệnh bắt đầu được lưu ý khinghề nuôi cá tra và basa phát triển Năm 2002 bệnh được định danh chính xác là do

Edwardsiella ictaluri gầy bệnh trên cá tra nuôi tại Việt Nam Bệnh xảy ra trên mô hình

nuôi cá bè, ao đất, bé xi măng và ké cả cá nuôi trên bé kính

Những khu vực bị ảnh hưởng chủ yếu là những vùng có nghề nuôi cá tra pháttriển mạnh, mang tính chất công nghiệp như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và VĩnhLong, sau đó lây lan sang các vùng lân cận Đặc biệt những năm gần đây bệnh nàycũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nghề nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và

Sóc Trăng (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).

Loài: Edwardsiella ictaluri (Bùi Quang Té, 2006).

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

+ Edwardsiella ictaluri thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, là trực khuẩngram âm kích thước 1 x 2 — 3 um, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy nghị,

phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không oxy hoá, lên men trong môi

trường glucose E ictaluri có từ 1 - 3 plasmid (Speyerer va Boyle 1987, Newton va

ctv, 1988) Chức năng của chúng van chưa được làm rõ, nhưng có giả thuyết cho rằng

10

chúng quan trọng trong việc nâng cao tính kháng đối với khang sinh của E ictaluri Vikhuẩn phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy, cần mất 36 - 48 giờ để hình thànhnhững khuẩn lạc nhỏ li ti trên thạch BHIA tại 28 — 30°C (Valerie và ctv, 1994), pháttriển yếu hoặc không phát triển ở 37°C Khi trong môi trường nuôi cấy có sự hiện diệncủa một loài vi khuẩn phát triển nhanh hơn # ictaluri (như Aeromonas) thì khi đóchúng sẽ ức chế hoặc làm cho E ictaluri phát triển rất chậm (Shotts và Walman,

1990).

2.2.2.3 Đặc điểm gây bệnh

Vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh bắt buộc, chỉ tồn tại trong nước đượctrong một thời gian ngắn khoảng 8 ngày (Hawke, 1979), tuy nhiên chúng có thể tồn tạitrong bùn đến 95 ngày ở 25°C (Plumb và Quinlan, 1986)

Vi khuẩn có khả năng ton tại trong gan, thận, não vai tháng sau khi ca khỏi bệnh

Vi cá luôn ở trạng thái mang trùng và bài thải vi khuẩn ra môi trường nước nên có thé

sẽ gây bệnh cho các cá khác ở điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vikhuẩn Vi khuẩn có thể xâm nhập trực tiếp từ ruột, mũi, mang vào cơ thể cá Vi khuẩntrong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và dichuyền vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não (Miyazaki và Plumb, 1985; Shott

và ctv, 1986) E ictaluri cũng có thé theo thức ăn vào bên trong cơ thể cá qua niêmmạc ruột vào máu gây nhiễm trùng máu (Shott va ctv, 1986) Bằng đường này thì vikhuẩn vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố da Vi khuẩn được bài

thải từ phân xác cá chêt vào nước.

Bệnh bộc phát mạnh ở nhiệt độ 20-28°C đặc biệt trong khoảng 24-28°C vi khuẩn

có độc lực mạnh nhất Khi nhiệt độ trên 30°C tỉ lệ cá chết giảm dần

2.2.3 Đường lây truyền của E ictaluri

Bệnh do Edwardsiella ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỉ lệ chết cao bệnh

có thê lây lan trực tiếp từ cá này sang cá khác trong môi trường nước qua chất thải như

phân cá bệnh hoặc do cá khỏe ăn cá bệnh chết.

II

Chim và các dụng cụ như: lưới, vợt dùng chung cho các ao có thể làm lây lanmam bệnh Tuy nhiên dụng cụ dùng chung giữa các ao nếu được khử trùng hoặc phơinẵng thì có thê giết được vi khuẩn.

2.2.4 Chan đoán

Khó quan sát duéi kính hiển vi quang học vì vi khuẩn là trực khuẩn

Vi khuẩn được phân lập ở gan, thận, lách vi khuẩn gây bệnh với độc lực mạnh

nhất ở 20-28°C gây chết cap tính chết nhanh và nhiều Nên lấy mẫu cá lúc này dé địnhdanh vi khuẩn được chính xác

Phân lập nên sử dụng môi trường thạch không nên sử dụng môi trường canh vì

vi khuân khác sẽ phát triển lan at vi khuẩn mục tiêu Sử dụng môi trường BHIA là tốtnhất hoặc TSA+5% máu

Dia cấy nên giữ ở nhiệt độ 28-30°C trong 48 giờ Có thé dùng kit API 20E déđịnh danh vi khuẩn

Chuẩn đoán bằng miễn dịch: phản ứng ngưng kết trên phiết kính (slideaglutination), phản ứng ELISA cho kết quả nhanh chính xác

Kỹ thuật PCR ít được sử dung vi doi hỏi kỹ thuật cao, may móc phức tạp cũng

như tay nghề cao

2.2.5 Triệu chứng

Cá bệnh có biéu hiện bỏ ăn, boi lờ đờ trên mặt nước sau khi bị nhiễm khuẩn Cáthường treo lơ lửng cơ thể ở trên mặt nước và tụ tập thành một dam do ca yếu Cá bệnhcũng xuất hiện triệu chứng thần kinh thường là nhào lộn và bơi xoay tròn Khi bệnhnặng cá không phản ứng với tiếng động

Cá bệnh thường thấy xuất huyết quanh hậu môn, miệng, bụng, vây và gốc vây.

Cá có thể xuất huyết điểm trên thân hoặc xuất huyết toàn than Cá bị nhiễm E ictaluri

thường bị phù đầu do tích dịch ở dưới da vùng sọ Khi dich quá nhiều sẽ chảy xuốnghốc mắt gây lồi mắt Quan sát mang cá thấy màu sắc nhợt nhạt do E ictaluri có khảnăng gây dung huyết làm mất máu

12

2.2.6 Bệnh tích

Gan và thận cá bệnh sưng rất to có hiện tượng nhtn biểu hiện rõ nhất là ở thận,lách sưng ít hơn Cá bệnh trên gan thận lách xuất hiện mảng trắng hoại tử Khi bệnhnặng, chúng phát triển thành đốm trắng tròn có chứa dịch hơi đặc (mủ), những đốmtrắng xuất hiện trên khắp bề mặt và cả bên trong gan, thận, lách Các đốm trang này có

đường kính khoảng 1-3mm.

Cá bị bệnh thường tích dịch viêm ở xoang bụng có màu hơi vàng và có thé lẫnmáu Cá nhiễm Edwardsiella ictaluri thường bỏ ăn do đó bên trong ruột cá bệnh trốngkhông chứa thức ăn, lòng ruột có chứa dịch lẫn máu Đồng thời còn thấy cá bị xuất

huyết điểm trên ruột, cơ và mô mỡ.

2.2.7 Phòng và trị bệnh

Khó phòng bệnh vì bệnh lưu hành thường xuyên trên cá tra nuôi công nghiệp.

Bệnh xảy ra hầu như suốt năm Nguồn nước lấy vào ao nuôi thường trực tiếp từ sôngnên việc ngăn chặn mầm bệnh vào ao hầu như là không thé Vì vậy biện pháp ngănchặn tốt nhất là nâng cao sức khỏe của cá tránh cá bị stress do mật độ nuôi cao và môi

trường chất lượng nước kém.

Không sử dụng các loại hóa chất diệt kí sinh trùng trong thời gian nhiệt độ nướcthích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn, trong quá trình cải tạo đáy ao cần phơi đáyhút bỏ bùn đáy ao, sát trùng đáy ao vì vi khuẩn tôn tại rat lâu trong bùn

Cá thải vi khuẩn vào môi trường nước theo phân nên khi thấy ao có bệnh nênngưng cho ăn dé giảm khả năng lây lan đồng thời vớt bỏ cá bệnh cá yếu

Dụng cụ cần được tiệt trùng và dung riêng cho mỗi ao nên phơi nắng sau khi sử

dụng.

Chọn con giống khỏe mạnh, không nhiễm bệnh

13

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Diém Thực Hiện

Đề tài được thực hiện từ ngày 10/04 - 10/08/2009 tại trại thực nghiệm Khoa

Thủy Sản và phòng thí nghiệm Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học

Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu

3.2.2 Hóa chất và môi trường

Môi trường canh Brain Heart Infusion Broth (BHIB) dùng tăng sinh vi khuẩn.Môi trường thạch Brain Heart Infusion Agar (BHIA) cấy và phân lập vi khuẩnMôi trường PCA dùng dé cấy trang đếm số lượng khuẩn lạc

Hóa chất nhuộm gram: crystal violet, fuchsin, lugol, dung dịch tây màu, nướccất, dầu soi kính

Hóa chất nhuộm mẫu mô phết: giemsa, cồn 70°

3.3 Đối Tượng Nghiên Cứu

3.3.1 Chế phẩm

Vaccine thử nghiệm dạng ngâm: liều ding 1L/90L nước ngâm trong 15 phút đối

VỚI Cá 5g.

14

Liều ding 1L/9L nước đối với cá bột được 4 và 5 ngày tuổi.

Vaccine thử nghiệm dang cho ăn : liều dùng ImL/100g thức ăn

3.3.2 Cá thí nghiệm

Cá bột vừa mới nở được đưa từ trại giống ở Đồng Tháp về ương tại trại thựcnghiệm Cá được cho vào các bề composite có thé tích 600 lit đã được chuẩn bị sẵn hệthống sục khí và gây màu Sau khi tiêu hết noãn hoàn cá được cho ăn moina và thức ăntomboy số 0 đến khi cá bột được 3 ngày tuổi sẽ đếm và cho vào các vèo có kích thước45*45*45 cm với số lượng 300 con mỗi véo Chuan bị các chậu có thé tích 2 lít dé tiền

hành thí nghiệm.

Cá tra giống khỏe mạnh sạch bệnh, trọng lượng từ 4-5g, sau khi đưa về cá đượctrữ trong các véo cắm ở ao Mỗi ngày cho cá ăn 2 lần, cho cá ăn ở mức tối đa Mộtngày trước khi tiến hành chuyền cá ta không cho cá ăn Cá được chuyên vào các bểcomposite có thê tích 600 lít trước 3-4 ngày đề thích ứng với các điều kiện môi trường

Cá được ngâm trong nước muối với nồng độ 15-20ppt trong 10 phút dé diệt bớt kí sinhtrùng trước khi cho vào bẻ

3.3.3 Vi khuẩn thí nghiệm

Chung # ictaluri VL33 phân lập từ cá tra bị bệnh gan thận mủ vào thang

6/2008 tại Vĩnh Long được bảo quản ở nhiệt độ 20°C tại phòng thí nghiệm Bệnh HocThủy San, Khoa Thủy Sản, Trường Dai Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.4 Phương Pháp Nghiên Cứu

3.4.1 Phương pháp chuẩn bị để đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm

Cá bột 4 và 5 ngày tuổi chứa trong các vèo sẽ được chuyên vào phòng lạnh cónhiệt độ thích hợp dé tránh gây stress cho cá Sau đó đếm số lượng va cho vào cácchậu có thé tích 2 lít đã chuẩn bị sẵn 900mL nước, cho moina vào trong các chậu đểtránh cho cá bột ăn nhau Cho vào mỗi chậu 100mL vaccine thử nghiệm dạng ngâm ởcác lô nghiệm thức theo dõi biểu hiện của cá trong 3 giờ để đánh giá độ an toàn của

vaccine đôi với cá Trong quá trình ngâm nước trong các chậu được sục khí liên tục.

l5

Đối với cá 5g lượng nước trong các bể composite trong quá trình trữ cá được xả

bỏ toàn bộ Sau đó cho vào bé 10 lít nước và 110 mL vaccine thử nghiệm dạng ngâm ởcác lô nghiệm thức, theo dõi 15 phút dé đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệmđối với cá và thực hiện liên tục trong 3 ngày Trong quá trình ngâm, nước trong bể

được sục khí liên tục.

Đối với vaccine thử nghiệm dạng cho ăn sau khi cá đươc ngâm vaccine vàongày thứ 4 tiến hành trộn ImL vaccine với 100g thức ăn dé khô trong 30 phút sau đócho cá ăn Ngày cho ăn 2 lần và cho ăn tối đa Cho cá ăn liên tục trong 30 ngày đểđánh giá độ an toàn của vaccine đối với cá

3.4.2 Phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn

Làm thuần vi khuẩn: vi khuẩn từ ống giữ giống được cấy ria trên các đĩa môitrường BHIA bên trong tủ cấy vô trùng Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ

Từ đĩa cấy chọn những khuẩn lạc đặc trưng đem cấy thuần trên môi trường BHIA vàđem ủ ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ

Tăng sinh vi khuẩn: sau khi vi khuẩn tạo thành các khuẩn lạc trên các đĩa môitrường BHIA đã cấy Ta chọn những khuẩn lạc rời, đặc trưng dùng que cấy vòngchuyền vài khuẩn lạc đã chọn vào bình tam giác chứa 300 mL môi trường BHIB Sau

16

đó cho bình dung dịch tăng sinh lên máy lắc, lắc trong khoảng 18 giờ ở điều kiện nhiệt

độ 25 - 28°C

3.4.3 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn sống

Dé xác định số lượng tế bào vi khuẩn có trong môi trường sau khi tăng sinh tatiến hành pha loãng môi trường theo hệ số 10 dé tạo thành các dung dịch có độ phaloãng từ 10” - 10°

Từ mỗi độ pha loãng hút 0,1 mL dung dịch nhỏ lên đĩa thạch PCA (ở mỗi độ phaloãng lặp lại 2 lần), sau đó dùng que cấy trang, trang đều dung dịch trên thạch, đem ủ

ở 30°C trong 48 giờ

Từ số khuẩn lạc tại mỗi nồng độ tương ứng ta suy ra số tế bào vi khuan có trongdung dich tăng sinh (chỉ đếm ở các đĩa có số khuẩn lạc từ 25 - 250)

Hình 3.2: Số lượng khuẩn lạc trên đĩa cấy phù hợp ở độ pha loãng 10”

3.4.4 Phương pháp gây nhiễm thực nghiệm

Cho cá vào xô có chứa 10 lít nước, cho tiếp vào xô 50 mL huyền dịch vi khuẩn

đã tăng sinh Ngâm cá trong thời gian 1 giờ Trong suốt quá trình gây nhiễm có sửdụng hệ thống sục khí

17

3.4.5 Phương pháp theo dõi cá sau khi gây nhiễm

Sau khi gây nhiễm, ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể Ghi nhận tỷ lệ cá chết

ở mỗi bể Khi cá chết ghi nhận các biểu hiện bên ngoài của cá sau đó giải phau ghinhận các biểu hiện bên trong Đối với cá mới chết ta cay phân lập vi khuẩn từ gan,thận, lách Những cá hấp hối được tính như cá chết

3.4.6 Phương pháp cay phân lập vi khuẩn từ cá bệnh

Phân lập vi khuẩn từ não, gan, thận, và lách

Cách tiến hành:

Dùng kéo và kẹp mô xoang bụng của cá bằng 3 đường cắt (1 đường xuất phát

từ lỗ hậu môn cắt song song với đường bụng và | đường xuất phát từ lỗ hậu môn songsong với đường bên Đường thứ 3 song song rìa nắp mang và cắt 2 đường bên) Khi

mồ cần phải cần thận tránh mũi kéo gây ton hại các cơ quan bên trong Sau khi cắtxong tách rời 1 bên xoang bụng cho thấy nội tạng bên trong

Dùng 1 miếng bông gòn đã tam cồn lau sạch phan máu và dich xoang bụng (nếu

cô).

Quan sát và ghi nhận biêu hiện của các nội quan.

18

Tach lay cơ quan cần phân lập Đặt lên 1 miếng bông gòn đã tam cồn, sau đó

sát trùng mặt ngoài của cơ quan này.

Cắt ngang 1 phần của cơ quan này Chấm cơ quan này lên môi trường thạch đãđược chuẩn bị sao cho mặt vừa mới cắt tiếp xúc với mặt thạch Thao tác này phải đượctiễn hành nhanh và gần ngọn lửa đèn cồn đề hạn chế việc tạp nhiễm

Từ vết chấm cấy ria trên thạch Sau đó đem đĩa thạch đã được cay di ủ trong tu

ủ với nhiệt độ 30°C trong 48 giờ

3.4.7 Phương pháp cấy thuần

Từ các khuẩn lạc thu được sau khi cay phân lập từ cá bệnh ta tiến hành việc câythuần

Mục đích của việc cây thuân là đê định danh vi khuân nhắm xác định chính xác

tác nhân gây bệnh.

Cách tiến hành:

Chọn khuẩn lạc đặc trưng Sau đó, cay ria trên môi trường BHIA đã được chuẩn

bị sẵn Thao tác này phải tiến hành nhanh tránh tạp nhiễm Sau đó đặt các đĩa thạch đãcấy xong vào tủ ủ ở 30°C trong 48 giờ

Nitrate, thử nghiệm ONPG, sinh Urease, PAD, Citrate, thủy giải Esculin, sinh HạS,

sinh Indol, Voges-poskauer (VP), Malonate, LDC, di động Trong bộ định danh này có

một ống thạch mềm dé thử tính di động và phan ứng LDC, một lọ chứa các đĩa giấy déthử phan ứng Oxidase Một bảng nhựa gồm 10 giếng có chứa các đĩa giấy đã được tâmhóa chat dùng dé thử các phản ứng sinh hóa còn lại Các giếng này được đánh số từ 1 —

10 và được xếp theo thứ tự được trình bày ở bảng 3.1

19

Bảng 3.1: S6 thứ tự các đĩa giấy trong các giếng.

Thuy giai Esculin

Sinh Indol va sinh H;ạS

Voges-poskauer (VP)

Su dung Malonate

3.4.8.1 Phương pháp nhuộm Gram

Phương pháp thực hiện:

Nhỏ 1 giọt nước mudi sinh lí lên lame Dùng que cây vòng đã khử trùng đê

nguội, chọn lay một khuan lạc riêng lẽ Chuyên khuẩn lạc sang lame nơi có nước mudisinh lí Dùng que cấy vòng trang đều tạo thành vết bôi để khô tự nhiên trong không

khí.

Sau khi vết bôi đã khô ta cố định mẫu bằng cách hơ thật nhanh mẫu qua ngọn

lửa đèn côn 3 — 4 lân Không được ho quá nóng vi sẽ làm các tê bào co lại.

Phủ dung dịch crystal violet lên vết phết, để 1 phút Rửa bằng nước và nghiêng

lame cho ráo nước.

Phủ dung dịch lugol lên vết phết, dé 1 phút Rửa bằng nước

Nhúng lame vào cồn 95% khoảng 30 giây Rửa bằng nước

Phủ dung dịch fuschin lên vết phết, để 30 giây Rửa nước Đề khô và quan sátdưới vật kính dau

20

3.4.8.5 Thử nghiệm LDC và di động bằng kit định danh IDS 14 GNR

Trong bộ định danh này thử nghiệm LDC và di động được xác định trên môi

trường thạch mềm

Cách tiễn hành: dùng que cay thang đã được tiệt trùng lấy một khuẩn lạc rời cóthời gian phát triển từ 18 — 24 giờ, mở nắp môi trường LDC và cấy đâm thắng xuống

21

đáy lọ môi trường, không cho que cay cham day cua ống môi trường, đóng nắp môitrường lại và dé trong tủ ấm có nhiệt độ 30°C Thao tác này phải tiến hành nhanh vagần ngọn lửa đèn cồn để không bị tạp nhiễm.

Đọc kết quả:

LDC: (+) vi khuan mọc, môi trường giữ màu tím hoặc vàng nhạt

(-) vi khuẩn mọc, môi trường chuyển màu vàng

Di động: (+) vi khuân mọc và lan nhòe đường cấy

(-) vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy

3.4.9 Phương pháp kiểm tra kí sinh trùng của cá

Dé đánh giá tình trạng sức khỏe tổng quát ban đầu của cá và trong quá trìnhnuôi Việc kiểm tra kí sinh trùng được tiễn hành định kỳ 2 tuần 1 lần

Cách tiến hành:

Cá được làm chết và đặt trong khay mồ sạch

Quan sát hình dạng ngoài của cá ở da mang gốc vây Cần lưu ý các biểu hiệnkhác thường bên ngoài như xuất huyết, nồi u hạt trên da, màu sắc của mang

Kiểm tra ngoại kí sinh: dùng lame cạo lay nhớt ở nhiều vi trí khác nhau trên cơthé cá: da, vây, Sau đó gat nhẹ nhớt cạo được lên một lame khác, nhỏ lên đó 1 hoặc

2 giọt nước sạch rồi dàn mỏng lớp nhớt trên lame, đậy lamelle lên và quan sát dướikính hiển vi

Kiểm tra kí sinh trùng ở cung mang: dùng kéo cắt bỏ nắp mang Cắt riêng từngcung mang, nhúng so qua một đĩa nước đã chuẩn bị trước dé rửa bớt máu Đặt từng

cung mang lên lame, quan sát dưới kính hiên vi từ bội giác nhỏ đên bội giác lớn.

22

3.4.10 Phương pháp thí nghiệm

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tóm tắt bồ trí thí nghiệm

Số Tuổi của aay

ngay

ĐC 1 90 ~60 ngày 30 cá

DC 2 90 ~60 ngày 30 cá

ĐC 3 90 ~60 ngày 30 cá

NTI1 90 ~60ngày Vào ngày l,2,3 Từ ngày 4-34 30 cá

NT2 90 ~60ngày Vào ngày lI,223 Từ ngày 4-34 30 cá

NT3 90 ~60ngày Vào ngày 1,23 Từ ngày 4-34 30 cá

23

3.4.10.1 Đánh giá độ an toàn của vaccine thử nghiệm

Đối với cá bột 5 ngày tuổi

Cá được đếm và cho vào các véo có kích thước 45*45*45 cm đặt trong các bềcomposite có thể tích 600 lít đã được chuẩn bị sẵn Số lượng cá ở mỗi nghiệm thức là

300 con Cá được bô trí hoàn toàn ngau nhiên vào 6 véo với nghiệm thức cap vaccine

Hình 3.4: Vèo chứa cá bột 4 ngày tudi

Cá ở 3 bể nghiệm thức cấp vaccine: ngâm cá trong dung dịch vaccine thửnghiệm với liều lượng 1L/ 9L nước ngâm trong 3 giờ

Cho vào mỗi chậu 900mL nước cho cá vào sau đó cho vào mỗi chậu 100mLvaccine thử nghiệm ở các lô nghiệm thức Quan sát biểu hiện của cá trong 3 giờ, quátrình tiễn hành thí nghiệm có sục khí

Cá ở nghiệm thức đối chứng: tiến hành tương tự tất cả các thao tác nhưng

không sử dụng vaccine thử nghiệm.

24

Đối với cá có trọng lượng 5g

Cá được bồ trí ngẫu nhiên vào 6 bể composite có thể tích 600 lít số lượng cá ởmỗi bề là 90 con

Cá ở các bé nghiệm thức cấp vaccine: ngâm trong vaccine thử nghiệm với liềulượng 1L/90L nước ngâm trong 15 phút cá được sục khí liên tục trong suốt quá trìnhngâm Tiến hành liên tục như vậy trong 3 ngày Sau đó cá được cho ăn thức ăn có trộnvaccine liên tục trong 30 ngày ngày ăn 2 lần với lượng ăn tối đa sử dụng thức ăn

Cargill (Aquaxcel-7424) thích hợp với cỡ cá.

Từ ngày thứ 30-45 cho cá ăn thức ăn không có sử dụng vaccine.

Nguồn nước dùng trong thí nghiệm là nước máy đã được trữ trong các bê chứa

nước trước khi sử dụng.

Lượng nước thay mỗi ngày từ 10 — 20% lượng nước của bể nuôi

Trước khi tiễn hành bố trí vào các bề nuôi, cá được kiểm tra kí sinh trùng đảmbảo cá thí nghiệm là hoàn toàn khỏe mạnh Bên cạnh đó cá vẫn được kiểm tra kí sinhtrùng 2 tuần 1 lần

Cá ở các bề nghiệm thức đối chứng không sử dung vaccine thử nghiệm

3.4.10.2 Đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm đối với vikhuẩn Edwardsiela ictaluri

Cá sau khi ngưng cho ăn thức ăn có trộn vaccine 15 ngày được tiến hành gâybệnh đề đánh giá khả năng bảo hộ miễn dịch của vaccine thử nghiệm

Cá tiến hành thí nghiệm được chuyển vào phòng thí nghiệm trong các bểcomposite có thể tích 90 lít mỗi bể 30 con Với nghiệm thức cấp vaccine 3 lần lập lại

và nghiệm thức đối chứng 3 lần lập lại

25

Vào ngày thứ 5 từ lúc chuyên cá chúng tôi bắt đầu tiến hành gây nhiễm bangcách ngâm cá trong 10 lít nước chứa 50 mL vi khuẩn đã tăng sinh trong BHIB ở 25 -28°C trong 18 giờ, trong các xô nhựa có thể tích 16 lít Thời gian ngâm cá gây nhiễm

là 1 giờ và cá được sục khí liên tục trong suốt thời gian gây nhiễm Theo dõi và ghinhận tỉ lệ cá chết trong 14 ngày, biểu hiện và bệnh tích của cá chết đồng thời cấy phân

lập và định danh lại tác nhân gây bệnh.

3.4.11 Phương pháp xử lí số liệu

Xử lí các số liệu thu được bằng phần mềm Minitab

26