Khóa luận tốt nghiệp Nuôi trồng thủy sản: Nghiên cứu ảnh hưởng của Mannan oligosaccharide và nấm men bất hoạt lên sự tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và khả năng đề kháng bệnh của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

TÓM TẮTĐề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide vànam men bat hoạt lên sự tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và khả năng đềkháng bệnh của cá tra Pangasiano

; BỘ GIAODUCVADAOTAOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA LUAN TOT NGHIEP

NGHIEN CUU ANH HUONG CUA MANNAN

OLIGOSACCHARIDE VA NAM MEN BAT HOẠT LÊN SỰ

TANG TRUONG, HIEU QUA SU DUNG THUC AN VA KHA

NANG DE KHANG BENH CUA CA TRA

(Pangasianodon hypophthalmus)

Ngành : NUÔI TRONG THUY SAN

Chuyén nganh : NGU Y

Lớp : DHOSNYSinh viên thực hiện : NGUYEN THỊ THANH LANNiên khóa : 2005 - 2009

TP HÒ CHÍ MINHTháng 9 năm 2009

NGHIÊN CUU ANH HUONG CUA MANNAN OLIGOSACCHARIDE VÀNÁM MEN BÁT HOẠT LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG, HIỆU QUÁ SỬ

DỤNG THỨC ĂN VÀ KHẢ NĂNG ĐÈ KHÁNG BỆNH

CUA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

Tac gia

NGUYEN THI THANH LAN

Khóa luận được trình đề đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ Sư Thủy Sản

Giáo viên hướng dẫn:

LÊ THANH HÙNG

Thang 9 nam 2009

LỜI CẢM ƠN

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM đã tạo cho chúng tôi mộtmôi trường tốt đề học tập,

Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản cùng toàn thé quý thầy cô khoa Thủy San đã tậntình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cũng như động viên về mặt tinh thần cho chúng tôitrong suốt quá trình theo học,

Đặc biệt với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi đến thầy Lê Thanh Hùng đã tận tìnhhướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài này

Cảm on ba, mẹ và các anh chi đã hỗ trợ cho tôi về vật chất lẫn tinh thần dé tôi cóthé hoàn thành đề tài tốt nghiệp này như mong muốn

Chân thành cảm ơn các bạn trong và ngoàải lớp đã luôn bên cạnh, động viên, vàgiúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài này

Do hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên quyên khóa luận này khôngtránh khỏi những thiếu sót Chúng tôi rất mong có sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô

và các bạn đê quyên khóa luận được hoàn chỉnh hơn.

il

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide vànam men bat hoạt lên sự tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và khả năng đềkháng bệnh của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)”, được tiễn hành từ ngày6/4/2009 đến ngày 18/6/2009, tại trại thực nghiệm và phòng thí nghiệm Bệnh HọcThủy Sản, Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Thí nghiệm cho ăn thức ăn bố sung Mannan Oligosaccharide (MOS) và nam menbat hoạt (LE) với các nồng độ lần lượt như sau: 1% MOS, 2% MOS, 1% LE và 2% LEtrong thời gian nuôi 8 tuần Kết quả cho thấy: Thức ăn bổ sung MOS và LE ở 2 nồng

độ 0,1% và 0,2% cho kết quả về tăng trưởng khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống

kê Tỷ lệ sống, hiệu quả sử dụng thức ăn, không khác nhau về mặt thống kê

Tuy nhiên, ty lệ sống của cá nuôi ở các nghiệm thức cho ăn thức ăn bổ sungMOS và LE tăng lên Việc gây cảm nhiễm bệnh cá nuôi thí nghiệm với vi khuẩnEdwardsiella ictaluri bằng phương pháp ngâm ở nồng độ 1,45x106 cfu/ml trong 1 giờcho thay tỷ lệ sống của cá ở nghiệm thức cho ăn thức ăn bổ sung 0,2% LE cao hơn sovới nghiệm thức đối chứng và sai khác này có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy95% (p< 0,05) Các nghiệm thức MOS, MOS, và LE; có tỷ lệ song cao hon nghiémthức đối chứng Tuy nhiên, sự sai khác này không có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin

cậy 95% (p>0,05).

11

ME 0 suangaetgptuprgtaopiegtotidinrtisiigigpiidtgtteistrtorirdrtgiroigigytGENESSESprđôrgrdrsytose 32.1.3 Đặc điểm hình thaie cccccssssssssssssessssssssessessssssscsssssecesessseesseesseeessesseceseeeseens 3

2.1.5 Đặc điểm dinh duGng o cccceeccecccccssesscssessessessessessessessessessessessessessessessessessessesseesees 51] á Bắc ti tÌnt TINS, oc cecvcrrnnceevenreanciiconicumenneninicnnvensbinonnhvewakciebinnsiniiomniéearseosve 52.1.7 Đặc điểm sinh sản - St tt 1S E23 EEEE12E111E21511111111111111111111 111 cxe 62.2 Hoạt Chất Kích Thích Hệ Miễn Dịch 22+ SSE+ESEE+E+EEEE+EEEEEE+EEEE2EzEszEsrs 6

2.2.1, Manta Ol SOSAC CHATS x sicswsscncsvecmananaseweecvons suasiapemessersreswemmncreseataurtasuereansces 6

IV

2.2.2 Nam men Saccharomyces C€F€VÏSÏ(€ S2 +33 8 33 E+3EESEE+eEEserererrersrkrs 102.3 Một Số Nghiên Cứu Về Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo 142.3.1 Đặc điểm sinh học Edwardsiella iGl@ÏuFi - 55t +e+E‡Et+EeEtEEeEeEtzkerertzrerez 142.3.2 Đặc điểm gây bệnh của E.icf4liuri - +55 ScSE2EE2EESEEEEEEEEEEEEErrrrrrrree 15Chương 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 - 173.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu - 2¿+¿22+2£++2+++2Extzrxrzrxerrxee 17

32, Vật Liệu: THỊ, NGHI Than ngang thang tho g4 A53 01340000881550138559868EG0B010101g030553186890180 173.2.1 Đối tượng nghiên cứu - 2 s++t+Ex£EEE2ExEEEE2E1271711271711211 11111111 xe 173.2.2 Dụng cụ và nguyên liệu, hóa CHẤT 5S St St EEE1211212121121112112111111 211 cxe 17E0 18 3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu 1S TT nh HH HH Hành 183.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của MOS, LE lên sự tăng trưởng, tỷ lệ sống và

hiệu:quã sử:dụne Thức ăn GÚA,GÁ ÍTiisscsssesssi20t0056 016106861549355.053889382088-00018.00141540100g.3086 183.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của MOS, LE lên khả năng đề kháng bệnh của cá tra

đối với vi khuân Edwardsiella ietdÏuri 22-55 ©5£+SE+2E££E+EESEEE£EEtEEzEkerkerrssred 223.4 Phương Pháp Định Danh Vi Khuân -2- 2 ++2+++Ex+2Ex++zxzzxzzxerx 233.5 Sơ Đồ Quá Trính Nghiên Cứu - 2 22+®+E+2E£+EE££EE2EE£EEE2EESEEEEEEEErrrrrrvee 313.6 Phương Pháp Phân Tích Và Xử Lí Số Liệu -2¿©2+++2zz+2zz+zzze2 32Chương 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - ¿2-52 ©52+E+£E££E2£EtZE22EZErEerreree 334,1 Thức Ấn: Thí NEhiỆN iscsvsssssvesnisncensssvercerssnnnuneveavnvoneannennsasinerenenanmsmnvemnsnienmanes 334.2 Các Thông Số Môi Trường - 2-2 ©2+22£+2E++EE+£EE+22EE27E2222222222722222.e 34

AQ NIG AG 0 2 Ô 34 4.2.2 Hàm lượng oxy hòa tan (DO) cccceccesseeseessceseeseeeseceeeseceeeseceesseeneeeaeeeseeas 35

Cs) 222 12221221211221121121122112112111 11.11101121 1erre 37 4.2.4 Ham long ammonia ốố 38

4.3 Tỷ Lệ Sốngg - ¿S22 22S19E11221571211221711211711211112111111121111211 111 cre 394.4 Tăng Trưởng Của Cá Thí NghiỆm + + 5+ * 2+ * 2E £vE£vEeverrerrrrrrsrrkre 40

4.5 Hiệu Quả Sử Dụng Thức Ăn Của Cá Thí Nghiệm - 2 2s 22522522 42

4.6 Ảnh Hưởng Của Mannan Oligosaccharide (MOS) Và LE Lên Việc Cải ThiệnÑiio Khúe eS nn 44Chương 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NT serssirseivorsarairneesictsstnanevessenamnissucreseuecksensvesi 48

TT _ 485.2 Đề NgÌị - 5 S1 1 11 2122112112211211211121111111110111 1111110111111 49TÀI LIEU THAM KHẢO - 2-2 ©52+SE£2E£2EE£EEE2EE2E122112211711211211711211 21c xe 50Phụ lục

VI

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TAT

MOS Mamnan Oligosaccharide

DANH SÁCH CAC SƠ DO

Sơ đồ bố tri thí nghiệm (nuôi)

Sơ đồ bồ trí thí nghiệm (gây bệnh)

Vili

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng 2.1 Thành phần thức ăn trong ruột cá tra tự nhiên theo D.Menon và

PiLCheko: (W-WAW HS(GHGE:ĐDODWI VI): cs ssa: c1 810 46quố 638138 1ã,SSEGINGiA43uxiqGGSE.GA40165-4441063838L28 5Bảng 2.2 Các thành phan vách tế bao nam men Saccharomyces cerevisiae 7Bảng 2.3 Thanh phan của nam men bất hoat ccscceccssseessesseessessessessessesssesseessessees 12Bảng 3.1 Công thức phối trộn thức ăn của các NT thí nghiệm -. 20Bảng 3.2 Kết quả LDC va di động đọc trên chai môi trường LDC 24Bảng 3.3 Kết quả lên men và oxy hóa đường glucose (O — F test) - 27Bảng 3.4 Số thứ tự các dia giấy sinh hóa trong giếng 2: 52+cz+cxczxesrszee 28Bảng 3.5 Thuốc thử và kết quả phản ứng sinh hóa trong các giếng 29Bang 4.1 Thành phan sinh hóa của các nghiệm thức thức ăn 2-2 33Bảng 4.2 Tỷ lệ sống của cá ở các nghiệm thức - 2-2 2 +++x++++£xezxserxzee 39Bảng 4.3 Tăng trưởng của cá sau 8 tuần thí nghiệm của 5 nghiệm thức 40Bảng 4.4 Lượng ăn tuyệt đối và hệ số thức ăn của cá sau 8 tuần nuôi 42Bảng 4.5 Tỷ lệ chết (%) tích lũy theo ngày của cá -2- 2 ©z+2z++cxzzzxzsrxcee 44Bảng 4.6 Tỷ lệ sống của cá sau 8 ngày và 14 ngày gây cảm nhiễm 46

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hình dạng ngoài của Cá ffa - - (2c 2 22211112111 1111511111111 1 1 ke 4Hình 2.2 Thành phan tế bào nắm men - 22 2¿£2EE22EE22EE£2EE2EE+22E22zxezred 7Hình 2.3 Cấu trúc hóa hoc của ơ-D-mamnan chiết xuất từ nắm men

QCCHGTOTHCGS CGTFCVĂSÌ các ti 110114 114081114 0618824566514 6 83Á0 604 84140480631 484 1k S1448440 48 860 084 8Hình 2.4 So đồ của phức hợp Mannan-GIcNAc9-ASN o sscessssssesssesseesessessesssesseessesees 8Hình 2.5 Co chế MOS gan kết với mầm bệnh o.oo ees cecsessesssessessvessecseessessessseesesseeeees 9Hình 2.6 Nắm men Saccharomyces cereViSia€ 2-2 2 s2 2Exc£E2EeExzrxerxee I1Hình 2.7 Thành phần vách tế bao nam men Saccharomyces cerevisiae 12Hình 2.8 Vi khuẩn E ictaluri dưới kính hiển vi - cc:¿55cvcsccvxvrsrrrrerree 15Hình 3.1 Hệ thống bể thí nghiệm - - 2-2 £+S+E£2E£EE£EE£EE££EEEEEEEErEerrerreree 19Hình 3.2 Bang ghi kết qua kèm theo của bộ định danh ISD 14 GNR 30Hình 3.3 Kết quả test API — 20E -2-25-©22+22E221E221221122110213021102122212 22 31

DANH SÁCH CÁC ĐỎ THỊ

Đồ thị 4.1 Nhiệt độ của các nghiệm thức vào buGi sáng 2-2-5252 35

Đồ thị 4.2 Nhiệt độ của các nghiệm thức vào buổi chiều 2 2525522 35

Đồ thị 4.3 Hàm lượng DO của các nghiệm thức vào buổi sáng - 36

Đồ thị 4.4 Hàm lượng DO của các nghiệm thức vào budi chiều . 36

Đồ thị 4.5 pH của các nghiệm thức vào buổi sáng -2- 2 22+ +£x+£xzzzxzrez 37

Đồ thị 4.6 pH của các nghiệm thức vào buổi chiều - 2-2 52 2 +22 +22 37

Đồ thị 4.7 Hàm lượng Ammonia của các nghiệm thức - 5-5555 s+<<s+<ss2 38

Đồ thị 4.8 Tỷ lệ sống của cá tra sau 8 tuần nuôi của các nghiệm thức 39

Đồ thị 4.9 Tăng trọng trung bình (g/con) của cá ở các nghiệm thức 4]

Đồ thị 4.10 Tăng trọng trung bình mỗi ngày (g/ngay/con) ở các nghiệm thức 41

Đồ thị 4.11 Hệ số tăng trưởng đặc biệt SGR của cá - -c ScccsSssreseresree 42

Đồ thị 4.12 Lượng ăn tuyệt đối của các NT sau 8 tuần nuôi - 2c s+sszs+¿ 43

Đồ thị 4.13 Tỷ lệ sống trung bình sau 14 ngày gây bệnh - 2-2: ¿522 +2 45

Đồ thị 4.14 Tỷ lệ sống sau 8 ngày và 14 ngày gây cảm nhiễm 46

XI

Cá tra hiện nay đang là đối tượng thủy sản xuất khâu với nhiều mặt hàng chếbiến da dang được xuất khâu qua hơn 40 nước trên thé giới Cá tra được nuôi phổ biến

ở ĐBSCL theo mô hình công nghiệp, với mật độ cao, dịch bệnh nhiều, lây lan nhanh

nên sử dụng kháng sinh để tăng khả năng kháng bệnh của cá Tuy nhiên, việc sử dụngkháng sinh làm tăng chi phi san xuất, lợi nhuận thấp, dư lượng kháng sinh ton tại trongthịt cá làm ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm, gây ảnh hưởng không tốt đến sức khỏecủa người tiêu dùng Vi vậy, van đề sử dụng các chế phâm có nguồn gốc sinh học détăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm hệ số thức ăn, ngày càng được chú ý Do đó,việc nghiên cứu các tác dụng của vách tế bào nấm men (MOS — MannanOligosaccharide) và nam men bat hoạt (inactive yeast) dang và ngày càng được cácnhà nghiên cứu và các nhà sản xuât quan tâm.

Xuất phát từ những thực tế trên, được sự phân công của Ban Chủ Nhiệm KhoaThủy Sản trường Đại Học Nông Lâm, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiêncứu ảnh hưởng của Mannan Oligosaccharide và nắm men bắt hoạt lên sự tăngtrưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và khả năng đề kháng bệnh của cá tra(Pangasianodon hypophthalmus)”.

1.2 Mục Tiêu Dé Tài

Khảo sát hiệu quả của việc bô sung vách tê bào nâm men (Mannan Oligosaccharide) va nam men bat hoạt (inactive yeast) ở các nông độ khác nhau vào thức ăn lên khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của cá tra.

Khảo sát tác động của tê bào nam men (MOS) va nam men bat hoạt (LE) lên ty

lệ sống và khả năng nâng cao sức đề kháng của cá tra sau khi gây cảm nhiễm bệnh cávới vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp ngâm

Chương 2

TỎNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một Số Đặc Điểm Sinh Học Của Cá Tra

2.1.1 Phân loại

Bộ: Siluriformes

Họ: Pangasiidae

Giống: Pangasianodon

Loài: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878)

Tên tiếng Anh: Pagasius catfish

cá bột, cá giông tra và basa được vớt trên sông Tiên và sông Hậu Thông thường, cátrưởng thành được nuôi trong ao tù, lồng, bè, rất ít gặp trong tự nhiên

2.1.3 Đặc điểm hình thái

Cá tra có thân dài, dẹp ngang, không có vảy bao phủ, da trơn, có màu hơi xanhnhạt trên thân lưng, màu xanh nhạt dần ở hai bên hông, bung cá có màu trang bạc, vâylưng và vây đuôi màu xám đen, phần cuối của vây đuôi màu hơi đỏ Đầu nhỏ vừa phải,rộng và dep bằng, mắt tương đối to, miệng rộng có răng lá mía và khẩu cái rất mịn tạo

thành vòng cung, có 2 đôi râu dải, vây lưng và vây ngực có gai cứng, mang răng cưa ởmặt sau Vây hậu môn tương đối dài (Trần Thanh Xuân, 1994)

Cá tra có sô lượng hông câu trong máu nhiêu hơn các loài cá khác Cá có cơ quan

hô hâp phụ và còn có thê hô hâp băng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường nước thiêu oxy hòa tan.

Hình 2.1 Hình dạng ngoài của cá tra

2.1.4 Đặc điểm sinh thái

Cá phân bố ở các tầng nước nhưng thường sống ở tầng đáy Cá có thể sống ở cácthủy vực nước tĩnh và nước chảy, trong các ao tù nước động có nhiều chất hữu cơ, oxyhòa tan thấp

® Nhiệt độ

Nhiệt độ sống thích hợp cho cá tăng trưởng dao động trong khoảng 26 — 30°C(Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ, 2001) Cá tra là loài chịu lạnh kém vì cá tra là mộttrong những loài đặc trưng cho loài phân bố ở vùng nhiệt đới Ở nhiệt độ 15°C thicường độ bắt môi của cá giảm, nhưng cá vẫn sống, ở nhiệt độ 39°C cá sẽ bơi lội khôngbình thường (Trần Thanh Xuân, 1994)

@pH

Ca có khả năng chịu đựng pH từ 5 — 11, nhưng pH thích hợp cho cá phát triểnnhất là 6,5 — 7,5 Ở pH = 5 cá có biểu hiện mat nhớt, các đôi râu teo dần, hoạt độngchậm chap, khi pH = 11 cá sẽ hoạt động lờ do va mất nhớt

® Độ mặn

Ca tra là loài sông chủ yêu ở nước ngọt, không sông được ở vùng nước mặn Nhung có khả năng sông trong vùng nước lo, độ mặn có thê chịu đựng tôi da là 10%o (Mai Đình Yên và ctv, 1992).

® Oxy hòa tan

Cá tra có cơ quan hô hap phụ nên chịu được hàm lượng oxy hòa tan thấp Do đó,

cá có thể nuôi trong các ao nước tù, dơ bân, nơi có nhiều chất hữu cơ hay nuôi trong

bè với mật độ dày (www.fistenet.gov.vn).

2.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá tra là loài háu ăn, ăn tạp thiên về động vật Thức ăn chủ yếu trong tự nhiêncủa cá hương và cá giống là côn trùng có kích thước vừa miệng, động vật thân mềm,

cá nhỏ, mùn bã hữu cơ Khi trưởng thành ở trong điều kiện nuôi thức ăn chủ yếu làthực vật (trích bởi Lê Thanh Hùng, 2006).

Bảng 2.1 Thành phần thức ăn trong ruột cá tra tự nhiên theo D.Menon và P.I.Cheko(www.fistenet.gov.vn).

2.1.6 Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh.Cá sau khi nở tiêu hết noãn hoàng,

có chiều dai từ 1 — 1,5 em Sau 14 ngày ương, cá có thé đạt đến chiều dài trung bình từ

2 — 2,3 em và có khối lượng trung bình là 0,25 g Cá ương 5 tuần tuôi có chiều dai từ 5

— 6 em và có trọng lượng từ 1,28 — 1,5 g/con Sau 1 năm nuôi có thé đạt trọng lượng1,5 kg, sau 3 — 4 nam cá đạt 3 — 4 kg Tất nhiên, tốc độ tăng trưởng của cá tùy thuộcrất nhiều vào mật độ, chất lượng nước và sỐ lượng thức ăn được cung cấp (Trần ThanhXuân, 1994).

2.1.7 Đặc điểm sinh sản

Cá thành thục sinh dục, con đực 3 tuổi và con cái 3 — 4 tuổi Cá tra cái cùng tuổithì thường có trọng lượng lớn hơn cá tra đực từ 30 — 40% Khi thành thục sinh dục, cá

có tập tính bơi ngược dòng di cư tìm đến các bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp

và có đầy đủ thức ăn tự nhiên cho sự phát triển tuyến sinh dục và đẻ trứng Cá đẻ trứngdính vào giá thể thường là rễ của cây cỏ thủy sinh

Sức sinh sản tuyệt đối của cá tra từ vài trăm ngàn đến vài triệu trứng Sức sinhsản tương đối có thể tới 135.000 trứng/kg cá cái

- Hệ số thành thục của cá đực là 1 — 3% và cá cái có thể đạt 20%

(www.fistenet.gov.vn).

- Kích thước trứng tương đối nhỏ đường kính trung bình là 1mm, sau khi trương

có thé tới 1,5 — 1,6mm

2.2 Hoat chat kich thich hé mién dich

Kích thích miễn dich là gia tăng khả năng dé kháng nhiễm bệnh bằng cách nângcao cơ chế miễn dịch không đặc hiệu

Đại thực bào là những tế bào chủ chốt trong hệ thống miễn dịch không đặc hiệu.Đảm nhiệm vai trò tiết ra kháng nguyên tương tự như vi khuẩn gây bệnh

Hoạt hóa đại thực bào tiết ra NO và O; tự do có thé tan công bên ngoài tế bàomam bệnh

Mỗi loại chất kích thích miễn dịch khác nhau sẽ cho một khả năng kích thíchmiễn dịch khác nhau Chất kích thích miễn dịch khác nhau sẽ có hiệu quả khác nhau

type 1 Vì vậy, hiện nay phức hợp Mannan Oligosaccharide trích từ thành tế bào củadòng Saccharomyces cerevisiae rat được ưa chuộng.

Mannan Oligosaccharide thường được chiết xuất từ vách tế bào nam menSaccharomyces cerevisiae và thu nhận bằng phương pháp ly tâm nắm men đã đượctách vỏ (Spring và ctv, 200; trích bởi Kelly, 2004).

Mannoprotein (chứa mannan oligosaccharide)

Hình 2.3 Cau trúc hóa học của ơ-D-mannan chiét xuât từ nâm men

Saccharomyces cerevisiaeLectin là protein gắn với carbohydrate đóng vai trò trung chuyên giữa bên trong

và bên ngoài tế bào Mannase trên bề mặt tế bào biểu mô ruột có tác dụng như một thủthé kết dính với những mầm bệnh có tiêm mao type-1 có lectin chuyên biệt vớimannose (Ofek và Beachey, 1978; Spring và ctv, 2000; trích bởi Kelly, 2004) Vì vậy,

thành ruột non luôn có nguy cơ nhiễm bệnh

Nhiều phân tử Mannoprotein có N — glucans liên kết với cấu trúc trung tâmManyo.;4GlcNAc> — Asn rất giống với những chuỗi Manno N — glycan bậc cao ở độngvật có vú.

NH CH2OH

Protein backbone

| Nhánh mannan - N - acetyl glucosamine |

Hình 2.4 Sơ đồ của phức hợp Mannan-GleNAc>-Asn

2.2.1.1 Vai trò của Mannan Oligosaccharide trên động vật thủy sản

MOS có vai trò quan trọng với DVTS nói riêng và vật nuôi nói chung.

+ Theo Colm A Moran (2008) Bio-Mos có vai trò như sau:

- Tác động lên hệ vi sinh vật đường ruột

- Kết hợp với những vi khuẩn gây bệnh có chứa tiêm mao type 1 và loại trừ trựctiếp chúng từ ruột

- Cải thiện, nâng cao hình thái và cau trúc đường ruột

- Cải thiện giá trị dinh dưỡng và tăng trưởng.

- Điều chỉnh đáp ứng miễn dịch của cơ thê ký chủ

Việc nhận dạng phân tử mam bệnh là quan trọng, phụ thuộc vào các mạch ngắnoligo của mannose trên các Glycol liên hợp được trải dài khắp bê mặt của biêu mô.

9

Có thé chắc chan rang: Những mầm bệnh sẽ kết dính với những thụ thé tiếp nhậntrên tế bào biéu mô bằng cách tạo ra các “đoạn mồi oligosaccharide” được biết nhưnhững tác nhân chống nhiễm trùng trong khẩu phần thức ăn chủ yếu là manno vàpolymano (Dawson và ctv, 2003).

2.2.1.2 Một số nghiên cứu, khảo nghiệm MOS trên động vật thủy sản

Hiện nay, một sô công ty đã sử dụng Mannan Oligosaccharide của vách tê bào

nam men Saccharomyces cerevisiae làm thành phân chính trong một sô sản pham bô

sung vào thức ăn cung cấp cho động vật thủy sản như sản phẩm Bio-MosŸ Tên

thương mại khác như: SAF-Mannan, Y-MOS và Celmanax.

Bio-Mos® được sử dụng cho động vat sống trên cạn rất tốt Tuy nhiên, trongnhững năm gan đây nó được sử dụng cho ngành nuôi trồng thủy san, đạt được ty lệ ônđịnh và có kết quả tốt

Bồ sung Bio-Mos” vào thức ăn của một số loài cá nước ngọt như Silunus glanis(Bogut và ctv, 2006), chỉ ra sự tăng trưởng từ 22-76 gam đối với lô đối chứng và tănglên 83 gam đối với 16 cho ăn thức ăn có bé sung Bio-MosŸ, trung bình tăng trọngkhoảng 9,7% FCR giảm 11,6% (p< 0,01), tỷ lệ chết giảm từ 28,33% xuống còn16,67%.

Thức ăn có Bio — Mos” cho thấy tỷ lệ chết giảm, cải tiến mức độ kháng thé vàkhả năng kháng vài loài vi khuẩn do hoạt động của lysozyme tăng lên (Staykow,2004).

Ngoài ra, hiện nay trên thị trường một số sản phẩm bồ sung MOS vào thức ăntôm được xem như là sản phẩm bô sung kích thích hệ miễn dịch

Các nghiên cứu và khảo nghiệm MOS trên động vật thủy sản nói riêng và trên

vật nuôi nói chung ngày càng nhiều vì các nhà nghiên cứu, các nhà sản xuất đã thấyđược vai trò của MOS và khả năng ứng dụng to lớn của nó vào thực tiễn sản xuất

2.2.2 Nắm men Saccharomyces cerevisiae

Nam men là một loại vi nắm don bao có kích thước 5 — 10 um, được đặt tên theomẫu tự Latinh tượng trưng cho giống và loài Các loài được đặt tên khác nhau tùy theonơi phát hiện và hình thái tế bào của chúng

10

Nâm men đã được sử dụng làm thức ăn gia súc hơn 100 năm nay dưới dạng lên men ở các nông trại Tuy nhiên, trong sản xuât công nghiệp và thương mại hóa thì nhà sản xuât chỉ quan tâm đên một sô loài nhât định, trong đó có Saccharomyces

cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae được biệt đên với tên gọi “men bánh mì” là một trong

những loài được thương mại hóa rộng rãi nhât, một sô dòng được tuyên chọn đê sản xuât rượu, bia và côn công nghiệp.

Chiét xuât nầm men rat giàu amino acid, vitamin và khoáng chat Nó có chức

năng tăng cường sinh trưởng vi sinh vật đường tiêu hóa.

Hình 2.6 Nam men Saccharomyces cerevisiae (www.wdv.com)

Saccharomyces cerevisiae có một lớp vỏ carbohydrate bao bọc được gọi là vách

tế bào chứa hau hết là B-glucan và mannan, là những cấu trúc đường đa giống tinh bột

Hình 2.7 Thành phân vách tê bao nam men Saccharomyces cerevisiae

Bang 2.3 Thành phần của nam men bắt hoạt

TẾ [ấn _ Men torula a Men lactic =

(Nguồn: Hertrampf and Piedad-Pascual, 2000)

Men rượu bia (Brewer’s yeast): Nam men Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces calsberggensis được sử dụng dé lên men rượu bia Sau khi lên men,

12

chúng lăng đọng ở đáy nôi, được ly tâm, sây khô và nghiên đê làm vỡ vách tê bảo.

Một gam men chêt chứa nhiêu tỉ tê bào nam men Bột men rượu bia có màu nâu nhạt, mùi thơm và có vị đăng đặc trưng của men.

Men mật mía (Molasse yeast): là chủng nam Saccharomyces cerevisiae Day là san phâm cua sự lên men mật mia, từ công nghiệp chê biên đường hay côn Ngoài ra,

men này cũng là tê bảo men bánh mì, trên môi trường mật mía Sản phâm sau khi lên

men, được ly trích, làm sạch và say khô

Men Torula: là chủng men Torulopsis utilis, phát triển trên môi trườngsaccharide thủy phân từ gỗ Đây là nguồn cung cấp nắm men quan trọng cho vật nuôi

Men lactic: là các chủng vi khuan Kiuyveromyces lactic và K fracilis, phát triểntrên phụ phẩm của công nghệ chế biến sữa Sau khi lên men, sinh khối vi khuẩn được

ly trích và say khô

Men Alkane: Alkane là hydrocarbon của methane Vi khuẩn lên men là loàiCandida lipolytica Sản phầm lên men của men này, còn gọi là protein đơn bao hayprotein từ dầu hỏa

Nắm men là nguồn cung cấp protein và năng lượng Đặc biệt ribonucleic acid,chứa các nitơ chiếm tỷ lệ 20% protein của nam men Chat xơ trong nam men là rấtnhiều, đặc biệt, ở men alkane Methionine của nam men khá thấp, chỉ chiếm 0,7% (ở

men bia), đến 0,9% (ở men torula) và là yếu tố giới hạn sử dụng nắm men trong thức

ăn Ngoài các thành phần dinh dưỡng, nam men chứ nhiều vitamin nhóm B và đặc biệtcác yếu tố kích thích tăng trưởng

Nam men có thé được dùng làm nguồn cung cấp protein thức ăn cho các loài cá.Nhiều thí nghiệm trên cá hồi cho thấy: Có thể sử dụng men bia, men torula, menalkane bổ sung vào thức ăn Men bánh mì được sử dụng thay thế đến 50% bột cá haymen alkane được sử dụng lên đến 25% thức ăn Nhìn chung, dùng nam men làm cungcấp protein, không hiệu quả kinh tế so với sử dụng bột cá Tuy nhiên, ngoài cung cấpprotein, nam men còn là nguồn cung cấp yếu tô tăng trưởng Vì thế, nam men chủ yếuđược dùng đê sản xuât thức ăn cho cá giông và thức ăn ương nuôi âu trùng các loài cá.

13

Khi ương nuôi tôm, nam men Saccharomyces là nguồn cung cấp chính proteinthức ăn và làm tăng tỷ lệ sống của tôm sú và tôm thẻ Nhật bản tương tự, bỗ sung 13%

men lactic vào thức ăn tôm sú, giúp nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn Trong thựctiễn sản xuất, thức ăn nhân tạo ương nuôi ấu trùng các loài giáp xác, chứa nắm menvới tỷ lệ cao Nắm men là nguồn cung cấp protein chính, có thể thay thế bột cá Tương

tự, trong nuôi ấu trùng nhuyễn thé cũng như nuôi rotifer, men bia và men bánh mì làthành phan chính trong thức ăn nhân tạo, thay thé tảo

Tỷ lệ sử dụng nâm men trong thức ăn thủy sản, có thể theo hướng dẫn sau:

Các loài cá: 5-10%

Các loài tôm: 2-5%

(Trích bởi Lê Thanh Hùng, 2008)

2.3 Một Số Nghiên Cứu Về Phương Pháp Gây Cảm Nhiễm Nhân Tạo

Theo Wolter và Johnson (1994) khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm trên

cá nheo Mỹ (15 — 20 em) với mật độ vi khuẩn E ictaluri là 1,2x10’ cfu/ml ở 25°C, tốc

độ nước chảy 1 lit/phut, cho ăn 3% trọng lượng thân/ngày Ty lệ chết dao động từ 38 —95,3% trong thời gian thí nghiệm là 7 ngày (trích dẫn từ Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004)

Theo Ferguson và ctv, 2004 thì sau khi phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnhđốm trắng ở nội tạng cá tra rồi tiến hành gây cảm nhiễm Kết quả vi khuẩn có khả

năng tạo hoại tử trong 7 ngày (trích dẫn từ Lê Thị Bé, 2002)

Theo Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004, thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá tra bằng cáchtiêm vi khuẩn E ictaluri với mật độ là 1,5x10° cfu/ml và mật độ 1,5x10° cfu/ml dé xácđịnh khả năng bộc phát bệnh, kết quả cá chết 100% sau 6 ngày

2.3.1 Đặc điểm sinh học Edwardsiella ictaluri

- Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae Vi khuan này có một số đặc điểm: là

vi khuân yếm khí tuỳ nghi, có hình que mảnh, Gr (-), kích thước 1 x 2-3 um, khôngsinh bào tử, chuyên động nhờ vào tiêm mao.

14

Hình 2.8 Vi khuẩn £ ictaluri dưới kính hiển vi(nguồn: www.daff.gov.au)

- Khi phân lập nên phát triển ở môi trường thạch

- Nuôi cấy trên môi trường TSA + 5% máu hoặc môi trường BHIA

- U 28 — 30°C, 48giờ khuẩn lạc hiện rõ

- Khuan lạc tròn, nhỏ, trắng đục

- Dấu hiệu bệnh lý: Cá bệnh do vi khuẩn E.ictaluri thường thé hiện kém ăn hoặc

bỏ ăn, gầy yếu, bụng thường trương to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc

vây xuất huyết, mắt lồi Giải phâu bên trong, các cơ quan nội tạng như gan, lá lách,

thận bi hoại tử, tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,2 — 0,5mm

2.3.2 Đặc điểm gây bệnh của E.ictaluri

Bệnh do E.ictaluri được xem là bệnh đáng lưu ý nhất trong nghề nuôi cá Tra, cá

Basa Bệnh lưu hành thường xuyên trong các ao nuôi các tra, cá basa.

E.ictaluri cô khả nang tồn tại rất lâu trong môi trường khi điều kiện thuận lợi Ở25°C, E.ictaluri có thé sống được 90 ngày trong bùn Trong cơ thé cá sau khi khỏibệnh, vi khuẩn có thể tồn tại nhiều tháng ở các cơ quan như gan, thận và não

Vi khuẩn phát triển và gây bệnh mạnh nhất trong điều kiện nhiệt độ 20 — 28°C.Khi nhiệt độ môi trường lớn hơn 30°C, tỷ lệ chết giảm Điều này rất có ý nghĩa trong

việc phòng và trị bệnh do E./cfalur¡ gây ra.

l5

2.3.2.1 Sự xâm nhập vào cơ thể

Trong môi trường nước, vi khuân có thê xâm nhập trực tiêp vào cơ thê cá băng

nhiêu cách: khe mũi, mang và ruột là nhửng vi trí có thê bi vi khuân tân công.

E.ictaluri xâm nhập vào cơ quan khứu giác qua khe mũi, di chuyên vao trong

thân kinh khứu giác và sau đó đi đến não Sự nhiễm trùng bat dau và lan rộng từ màng

não đên hộp sọ và vùng da trên sọ Như vậy tạo nên một lô lõm trên ở đâu cho nên còngọi là bệnh 16 đầu (hole in the head)

VỊ khuân có thê đi vào máu cá nhờ sự hâp thụ thức ăn trong quá trình tiêu hóa

hoặc qua các mao mạch ở mang và kết quả đẫn đến đều là sự nhiễm trùng máu Như

vậy, vi khuân dường như lưu hành trong các mao mạch ở các cơ quan Đây là nguyênnhân dẫn đến sự hoại tử và mat sắc tố ở gan, thận và lách

2.3.2.2 Sự lây lan

Bệnh do E.ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỷ lệ chêt cao Vi khuân có thê lây lan băng nhiêu cách.

E.ictaluri được bài thải ra ngoài môi rường nước qua phan cá hoặc xác cá chết.

Các vi khuan nay có thê xâm nhập lại cơ thê cá khỏe qua mang, mũi và ruột Điêu nay

làm cho quá trình lây lan xảy ra nhanh hơn.

E.ictaluri có thê được mang từ ao này sang ao khác băng các vật dụng trong nuôi

trông như: Vot, xuông, dụng cu cho ăn, kê cả người nuôi, chim, cò và vật nuôi cũnggóp phần làm lây lan mầm bệnh

16

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời Gian Và Địa Diém Nghiên Cứu

+ Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại Trại Thực Nghiệm Khoa Thủy Sản vàphòng thí nghiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM.

+ Thời gian: Đề tài đã được tiến hành từ ngày 6/4/2009 đến ngày 18/6/2009.3.2 Vật Liệu Thí Nghiệm

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá tra thí nghiệm được chuyền về trại thực nghiệm nuôi trong bề xi măng và cho

ăn cùng một loại thức ăn dé cho cá thích nghi với điều kiện môi trường và ôn định sứckhỏe Sau đó, chọn lựa những con có chất lượng tốt, bơi lội nhanh nhẹn, không bị dịtật, kích cở đồng đều, màu sắc đặc trưng có trọng lượng trung bình là 13 - 15 gam dé

bố tri thi nghiệm

3.2.2 Dụng Cu Và Nguyên Liệu, Hóa Chat

- Hệ thống gồm 15 bể Composite có cùng kích thước (47 x 61 x 63 cm)

- Máy ép thức ăn và tủ say thức ăn

- Hệ thống sục khí, thau, vot, xô, rồ,

- Máy đo pH (MP 103), DO (HANNAgxy-check), nhiệt độ (MP 103), NH¿`/NH;,

- Thuốc gây mê MS»

- Cân điện tử và một số dụng cụ cần thiết khác

- Kính hién vi, dụng cụ tiểu phau, can dién tu, lam, lamell, ống nghiệm, đĩa Petri,que cây,đèn côn, bình tam giác, kim tiêm,lưới lau, ông keo nhựa,

i

3.2.3 Thức ăn

Thí nghiệm sử dụng thức ăn tự chế biến từ các nguồn nguyên liệu chủ yếu như:bột cá, cám gạo, bột đậu nành, tinh bột khoai mì, dau cá, CMC, vitamin, bổ sungthêm MOS, LE ở 2 nồng độ 0,1% và 0,2%

Phân tích đặc tính sinh hóa của nguyên liệu thức ăn phối chế làm thức ăn cho cátại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Hoc Nông Lâm TP HCM.

Thanh phần bổ sung thức ăn nghiên cứu chứa MOS va LE theo tỷ lệ sau:

- Thức ăn đối chứng: không có b6 sung MOS và LE

- Thức ăn MOS;: bé sung 1 gam MOS/kg thức ăn tự chế biến

- Thức ăn MOS;: bé sung 2 gam MOS/kg thức ăn tự chế biến

- Thức ăn LE;: bỗ sung 1 gam LE/kg thức ăn tự chế biến

- Thức ăn LE: bỗ sung 2 gam LE/kg thức ăn tự chế biến

3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của MOS, LE lên sự tăng trưởng, tỷ lệ sống và hiệu quả

sử dụng thức ăn của cá tra

3.3.1.1 Hệ thống bể thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên hệ thống gồm 25 bể Composite và được bố tríthành 4 dãy song song Các bé được vệ sinh sạch sẽ trước khi bố trí thi ngiệm bằngformol và chlorine Sau đó, câp nước vào và gây màu nước rôi mới thả cá.

Nước được sử dụng là nước máy sinh hoạt được chứa trong bề trữ để làm bay hơichlorine và được sử dụng trong quá trình nuôi Các bể bố trí cá thí nghiệm được lắpđặt hệ thống sục khí

18

3.3.1.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bé tri theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức tươngứng: NTĐC, MOS,, MOS;, LE; và LE;.Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần tương ứngvới 15 bể khác nhau Mỗi bể cho thả 100 con cá, cá được nuôi trong 8 tuần, ngày cho

ăn 2 lân và cho ăn với lượng tôi đa.

LE; MOS; LE, MOS, DC MOS, LE,

MOS, LE; MOS, MOS,

DC LE; DC LE,

So đồ bồ tri thí nghiệm (nuôi)

Trước khi bé trí thí nghiệm, thức ăn được phối trộn, ép viên, say khô tại Trai Thực

Nghiệm Thuỷ Sản, Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM.

Thí nghiệm được tiễn hành với 5 nghiệm thức thức ăn, thành phần nguyên liệu nhưnhau, chỉ thay đổi hàm lượng Mannan Oligosaccharide và nắm men bat hoạt

+ Thức ăn được phối trộn theo từng nghiệm thức như sau:

19

Bảng 3.1 Công thức phối trộn thức ăn của các NT thí nghiệm (g)

3.3.1.3 Cac chỉ tiêu môi trường

+ Nhiệt độ: đo 2 lần/ngày (6h 30 sáng và 2h 30 chiều), đo bằng máy MP 103

+ DO: đo 2 lần/ngày vào buồi sáng và buổi chiều bằng máy đo HANNA + pH: do 2 lần/ngày vào buổi sáng và chiều bằng máy đo MP 103

oxy-check-+NH:: đo | tuần/lần bằng máy do NH

3.3.1.4 Chăm sóc và quản lí

Cá được cho ăn 2 lần/ngày (8 giờ và 16 gid), cho ăn với lượng tối đa.

Đối với 2 nghiệm thức MOS, va LE; thì ta cho ăn 2 tuần với thức ăn bố sung.Sau đó cho ăn thức ăn của nghiệm thức đối chứng trong 2 tuần va lặp lai,

Sau mỗi lần cho cá ăn, tiễn hành cân lượng thức ăn dư trong máng ăn, tính lượngthức ăn cá ăn hàng tuần và trong suốt quá trình thí nghiệm Thay nước 2 ngày/lần vàsiphon 1 lần, lượng nước thay bằng 1⁄4 lượng nước trong mỗi bề

20

3.3.1.5 Các chỉ tiêu theo dõi cá

i Lượng ăn tuyệt đối (g) = ( thức ăn sử dụng)/(Y số cá x > số ngày nuôi)

ii Lượng ăn tương đối (g) = (Lượng ăn tuyệt d6i)/(TLTB của cá)

ii Tăng trọng (g) — Weight Gain:

WG =W,- Wo

Trong đó:

W>: trọng lượng ca đầu thí nghiệm

\W¡: trọng lượng cá sau thí nghiệm.

iv Tốc độ tăng trọng đặc biệt (%/ngày) (Specific growth rate)

SCR = (LnW; — LnW,)/(T2 — T¡) x 100

Trong đó :

LnW;: trọng lượng trung bình bắt đầu thí nghiệm

LnW;: trọng lượng trung bình cuối thí nghiệm

T, — T¡: khoảng thời gian thí nghiệm

v Hệ số biến đồi thức ăn: (FCR — Food conversion ratio)

FCR = (Lượng thức ăn sử dung)/(Tang trọng cá thí nghiệm)

vi Tỷ lệ sống của cá sau thí nghiệm (%) — SV (Survival Rate)

X(%) = (Nư/Nạ) x 100

Trong đó:

No: Số lượng cá dau thí nghiệm

N¡: Số lượng cá sau thí nghiệm

21

3.3.1.6 Phương pháp thu thập số liệu

Cá thí nghiệm được cân vào ngày đầu khi bé trí thí nghiệm Mỗi ngày cân lượngthức ăn dư để tính lượng thức ăn cá ăn vào vào cuối thí nghiệm

Vi cá tra rat dé bị sốc và bỏ ăn sau môi lần kéo cá nên chúng tôi chỉ tiến hànhcân cá sau khi kết thúc đợt thí nghiệm và cân bằng cân điện tử một số lẻ, có sử dụngthuốc gây mê MS»

Trước khi cân cá một ngày thì ta không cho cá ăn.

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của MOS, LE lên khả năng đề kháng bệnh của cá trađối với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

3.3.2.1 Bồ trí thí nghiệm

Số cá còn lại sau 8 tuần nuôi chọn ngẫu nhiên 20 con ở mỗi bể, chuyền vào thùng

bể nhỏ có thé tích (0,4 x 0,6 x 0,4 m) đã được trữ nước máy 2 ngày và có đánh dấunghiệm thức tương ứng ở mỗi bẻ

Sau 2 ngày trữ cá trong bể nhỏ, ta chuyên cá ra xô chứa nước và có đánh dấunghiệm thức tương ứng, cho 15 ml vi khuẩn vào ngâm với mật độ vi khuẩn khoảng1,45x10° cfu/mL, ngâm trong thời gian 1 giờ rồi vớt cá chuyền vào bê nhỏ đã chuẩn bị

từ trước.

Các lô thí nghiệm được nuôi trong cùng điều kiện như nhau: phòng thí nghiệmtại trại mới Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Nông Lâm, TP HCM, nhiệt độ môi

trường nước khoảng 25 — 27°C, có chế độ thay nước, chăm sóc hàng ngày

ĐC MOS; LE, LE; MOS,

MOS, DC LE; DC LE,

MOS, LE, MOS, LE; MOS,

So đồ bố trí thí nghiệm (gây bệnh)

3.3.2.2 Phương pháp gây bệnh

Phương pháp làm thuần vi khuẩn

22

Vi khuẩn sau khi được phân lập sẽ tiếp tục được làm thuần bằng cách lựa chọnnhững khuẩn lạc riêng lẽ từ các đĩa phân lập và tiến hành cấy ria chúng vào một diaPetri khác với môi trường tương tự như môi trường dùng dé phân lập Tiến hành tiếptục đến khi nào ta quan sát không thấy có khuân lạc khác biệt về hình dạng, kích cở,màu sắc.

3.3.2.3 Chăm sóc và quản lí thí nghiệm gây bệnh

Sau khi ngâm vi khuan, định kỳ thay nước 1 lần/ngày Trong suốt quá trình thínghiệm, cá được cho ăn thức ăn tương ứng với các nghiệm thức thí nghiệm, nhiệt độmôi trường nước khoảng 25 — 27°C

3.3.2.4 Phương pháp thu mẫu

- Theo dõi thí nghiệm bằng cách ghi nhận số cá chết hàng ngày

- Phân lập vi khuẩn trên 3 cơ quan: gan, thận, lá lách (môi trường BHIA)

- Trong quá trình thí nghiệm, cá chết được đem lên phòng thí nghiệm mồ đề kiêmtra các dấu hiệu bện trong như: các đốm trắng ở các nội quan Cá lờ do hay vừa mớichết ta tiến hành phân lập vi khuẩn

3.3.2.5 Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm

Mau cá dùng dé lay mẫu vi khuẩn phải còn sống hay vừa mới chết

Trước khi giải phẫu đặt cá trên khay sạch Quan sát bằng mắt thường, ghi nhậncác biéu hiện: vết thương, điểm xuất huyết và các triệu chứng của bệnh,

Khử trùng bề mặt cơ thé cá bằng cồn 70% ở vị trí cần giải phẫu Mô cá và ghinhận các dấu hiệu khác thường trên nội tạng (gan, thận, lá lách) Khử trùng bề mặt củagan, thận, lá lách Sau đó, dùng kéo cắt một miếng nhỏ chấm lên đĩa thạch với môitrường BHIA và dùng que cấy vòng cay trên đĩa thạch

U trong tủ ấm ở nhiệt độ 27 — 30°C Sau 24 giờ ta quan sát và ghi nhận các đặc điểmsinh lý: hình dạng, màu sắc và kích thước của khuẩn lạc

3.4 Phương Pháp Định Danh Vi Khuẩn

Di động: Được xác định trên môi trường bán ran Khi vi khuân mọc trên môi trường này sẽ làm mờ đường cây và lan ra khỏi đường cây.

23

LDC: Đây là phản ứng đánh giá hoạt tinh decarboxylase của vi khuan dùng dékhử nhóm carboxyl của amino acid tạo thành amine có tính kiềm.

Cách thực hiện:

Cay vi khuẩn có thời gian phát triển không qua 24 giờ

Dùng pipet pasteur chạm vào vi khuẩn thử nghiệm, cấy đâm thang đứng vàochính giữa chai môi trường LDC, sau đó đậy chặt nắp chai lại

Làm huyền dịch vi khuẩn trong 3 — 5ml nước muối sinh lý vô trùng, pha càngđục càng tốt Dùng pipet với đầu typs vô trùng, hút cho vào khỏang 2/3 giếng Đậy nắpbảng nhựa lại, ủ trong tủ ấm ở 35 — 37°C

Đọc kết quả sau khi ủ khoảng 12 — 16 giờ

Bảng 3.2 Kết quả LDC và di động đọc trên chai môi trường LDC

Phản ứng Đọc kết quả

sinh hóa

LDC [+] vi khuẩn mọc và môi [-] vi khuẩn mọc và môi

trường có màu tím hay trường có màu vàng nhac mau.

Di dong [+] vi khuẩn mọc làm [-] vi khuẩn mọc không

nhòe đường cây làm nhòe đường cây.

+ Nhuộm Gram

Nguyên tắc:

Nhuộm gram là một trong những phương pháp quan trọng dé phân loại vi khuẩn.Cho phép phân biệt 2 nhóm vi khuẩn tùy theo phản ứng với thuốc nhuộm

Do sự khác biệt về cau trúc vách tế bào vi khuẩn Gr (+) và vi khuẩn Gr (-) Do

đó, khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm Crystal violet và một chất cắn màu iod (dungdịch Glugol), sau khi tây màu ta có 2 trường hợp xảy ra:

+ Nếu vi khuẩn có màu tim đậm đó là vi khuẩn Gr (+)

24

+ Nếu vi khuẩn bị mat màu sau khi tay, khi nhuộm bổ sung với dung dịchFuchsin vi khuẩn sẽ có màu hồng đó là vi khuẩn Gr (-).

Thao tác:

Có định vét phết vi khuẩn

Ghi tên mẫu, ngày thử nghiệm lên lame

Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên lame

Dùng que cấy đã được tiệt trùng lay 1 lượng nhỏ vi khuân từ một khuẩn lạc don,riêng lẻ dàn mỏng với giọt nước cat

Đề vết bôi khô hoàn toàn

Cố định vết bôi bằng cách hơ qua hơ lại dưới ngọn lửa đèn côn thật nhanh

+ Các bước nhuộm Gram:

Phu Crystal violet (dung dich màu xanh) lên vét bôi trong 30 giây

Đồ bỏ Crystal violet, rửa với nước cất

Phu dung dịch Lugol cô định màu Crystal violet trong 1 phút

D6 bỏ Lugol, rửa với nước cất

Nghiêng lame, nhỏ dung dịch tây (cồn 95 %) đến khi giọt dung dịch tẩy màuchảy xuống không còn màu, rửa nước

Phủ dung dịch Fuchsin lên vết bôi trong vòng 60 — 80 giây

Đồ bỏ dung dịch, rửa nước, dé khô lame

Quan sát vi thê

+ Kiểm tra phản ứng Oxidase:

Xác định sự có mặt của enzyme cytochrome oxidase của vi khuẩn (Vương ThịViệt Hoa, 2003) Đây là nhóm enzyme cuối cùng vận chuyền e- đến oxy phân tử đểtạo thành nước trong chuỗi hô hấp

Nguyên tắc và kết quả:

25

Dùng Pipet pasteur khử trùng và dé nguội, lay một khuan lạc riêng lẻ rồi quệtvào mẫu giấy đã được tam hóa chất thử (Merck, Nam Khoa), dé yên trong vòng 10 —

60 giây rồi đọc kết quả

Trong vòng 60 giây nếu thấy giấy thử oxidase chuyên sang màu tím đen thì kếtquả là dương tính (+), nếu không thay đổi màu thi âm tính (-)

+ Phản ứng Catalase

Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase của một số vi khuẩn hô hấp ky khítùy ý Catalase giúp vi khuẩn ky khí không bị ngộ độc khi môi trường có oxy khôngkhí bởi có sự hình thành chất H;O¿

+Khả năng lên men, oxy hóa đường glucose (O-F test) (Hugh 6 Liefson)

Kiêm tra khả năng sử dung glucose cua vi khuân trong điêu kiện có va không có

Oxy.

Nguyén tac:

Chuan bi 2 ống nghiệm có chứa môi trường O-F đã tiệt trùng

Dùng que cay thang đã tiệt trùng lấy vi khuẩn trên đĩa thạch và cấy thang vào 2ống nghiệm có chứa môi trường O - F

Phủ lên 1 trong 2 ống nghiệm 5 — 10 ml dầu parafin và ủ ở 28 — 30°C

Kiểm tra hàng ngày đến 7 ngày

26

So sánh màu của 2 ống nghiệm với các thay đổi trong bảng kết quả sau:

Bảng 3.3 Kết quả lên men và oxy hóa đường glucose (O — F test)

Ống không phủ dầu Ong phủ dầu Kết quả

paraffin paraffin

Xanh lá cây Xanh lá cây Không phản ứng với

GlucoseXanh lơ ở phần trên Xanh lá cây Phản ứng kiềm tính

Vàng Xanh lá cây Phản ứng oxy hóa

Vàng Vàng Phản ứng lên men

+Thử nghiêm các phản ứng sinh hóa:

Sử dụng bộ test Nam Khoa

Tiến hành định danh vi khuẩn bằng bộ 14 thử nghiệm sinh hóa định danh trựckhuẩn G (-) (DS 14GNR), bằng cách sử dụng hệ thong ma dinh danh va phan mềmđịnh danh vi khuẩn

Các phan ứng: oxidase, catalase, lên men glucose, khử nitrate, thử nghiệm ONPG, sinh urease, PDA, citrate, thủy giải esculin, sinh HạS,

+ Các đĩa giấy sinh hóa được gắn vào các đáy giếng theo thứ tự sau:

27

Bảng 3.4 Số thứ tự các đĩa giấy sinh hóa trong giếng

STT Đĩa giấy sinh hóa

Lên men Glucose

Sinh Indol và sinh HS

+ Sau đó cho vào máy Vortex dé khuấy đều lên

+ Dùng que cấy thang đã khử trùng chạm vào vi khuân riêng lẻ thử nghiệm, cấyđâm thắng đứng vào chính giửa chai môi trường LCD, đậy chặt nắp chai lại

+ Dung pipet với dau tips vô trùng hút huyền dịch VK cho vào mỗi giếng 1 ml(khoảng 2/3 giếng) Đậy nắp bảng nhựa lại và cho vào ủ ở nhiệt độ 30 — 35°C, đọc kết

quả sau khi ủ khoảng 12 — 16 giờ.

28