Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xử lý bã cà phê thành đường và các hợp chất phenolic

LỜI CẢM ƠNLời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Viện Nghiên cứu Công nghệSinh học và Môi trường, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM và các thầy cô giáo,

; BỘ GIAO DỤC VÀ ĐÀO TAO _

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NGHIÊN CỨU XỬ LÝ BÃ CÀ PHÊ THÀNH ĐƯỜNG VÀ CÁC HỢP CHÁT PHENOLIC

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện : NGUYEN VIET TAT

Mã số sinh viên : 17126129

Niên khóa : 2017 — 2021

TP Thủ Đức, 08/2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ;TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU XỬ LÝ BÃ CÀ PHÊ

THÀNH DUONG VÀ CÁC HOP CHAT PHENOLIC

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

TS TRINH THỊ PHI LY NGUYEN VIET TAT

TP Thủ Đức, 08/2022

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Viện Nghiên cứu Công nghệSinh học và Môi trường, Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

và các thầy cô giáo, các cán bộ, nhân viên trong Khoa đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều

kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trịnh Thị Phi Ly đã tận tình hướng dẫn,

chi dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu dé hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

này.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới chị Vân Anh, tập thể sinh viên phòng 304: Thử

nghiệm Hóa — Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã luôn hỗ trợ, giúp

đỡ trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới những người thân, bạn bẻ đã luôn động viên trongsuốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiép

Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân quý nhất tới gia đình Cam on ba, mẹ đã

sinh thành và dưỡng dục tôi khôn lớn, cảm ơn cậu em trai đã luôn ủng hộ tinh than

Xin chân thành cảm ơn tat cả mọi người!

Tp Hồ Chi Minh, ngày 19 tháng 06 năm 2022

XÁC NHAN CỦA TÁC GIÁ

Tôi tên Nguyễn Viết Tat, MSSV: 17126129, Lớp : DHI7SM (Số di động:

0356124502, Email 17126129@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh học

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luận tốt nghiệp

do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàntrung thực và khách quan Tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng về những cam kếtnày.

Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 06 năm 2022

Người việt cam đoan

1

TÓM TẮT

Mỗi năm, có hơn 6 triệu tan bã cà phê thải ra môi trường trên thé giới Trong bã càphê có nhiều thành phần có giá trị như đường và các hợp chat phenolic nhưng chưa đượckhai thác hợp lý Trong nghiên cứu này, mục đích chính là khai thác các sản phẩm cógiá trị ké trên dé góp phan giảm thiểu ô nhiễm môi trường Ba cà phê được thủy phânbằng enzyme đề thu hồi lượng đường lớn trong chúng và trước đó bã cà phê được tiền

xử lý dé loại bớt các chất gây cản trở quá trình thủy phân Kết qua cho biết điểm tối ưu

dé tiền xử lý là đun hồi lưu trong dung môi acetone/nước (1:1) trong 3,6 giờ với nồng

độ sodium hydroxide (NaOH) là 0,75% (w/v) Quá trình thủy phân bang Viscozyme đạt

kết quả tối ưu nhất ở thời gian 72 giờ và tỉ lệ enzyme/co chất là 5% (v/w) với bã cà phêđược hap tiệt trùng trước ở 121°C trong 15 phút Nồng độ đường khử trong dịch thủy

phân là 10,86 g/L (tương đương với 214,62 mg/g), trong đó đường mannose chiếm gần

50% lượng đường khử Mặt khác, dịch thủy phân cũng chứa 214,59 mg GA/L hợp chấtphenolic với hoạt tính chống oxy hóa tương đương với 137,41 mg AA/L và hàm lượngcaffeine là 14 mg/L.

Từ khóa: bã cà phê, tiền xử lý, thủy phan, mannose, hợp chat phenolic

1H

Every year, more than 6 million tons of spent coffee grounds are discharged into the environment around the world There are many valuable ingredients in spent coffee grounds that have not been properly exploited In this study, the main aim 1s to exploit valuable products such as sugars, phenolic compounds to improve the efficiency of the coffee industry and reduce the burden of environmental pollution Spent coffee grounds are enzymatically hydrolyzed to recover their large sugar content And before that, the spent coffee grounds are pretreated to remove substances that interfere with the hydrolysis process The results show that the optimal point for pretreatment is reflux boiling in acetone/water (1:1) for 3,6 hours with a NaOH concentration of 0,75% (w/v).

The hydrolysis by viscozyme achieved the best results at 72 hours and the enzyme/substrate ratio was 5% (v/w) with the coffee grounds pre-steamed at 121°C for

15 minutes The concentration of reducing sugar in the hydrolyzate was 10,86 g/L (equivalent to 214,62 mg/g), in which mannose sugar accounted for nearly 50% of the reducing sugar Other, the hydrolyzate also contained 214,59 mg GA/L of phenolic compounds with antioxidant activity equivalent to 137,41 mg AA/L and caffeine content

of 14 mg/L.

Keywords: spent coffee grounds, pretreatment, hydrolysis, mannose, phenolic compounds

Iv

MỤC LỤC

Trang

Le ee iSOA TR A Tá [Lá ceneneeoeosoiooeesseiobirooretioroiof0S0G520000G0 0301800600 iiTOM TAT ooo —— ÔỎ iii

ra II LTD SA CC Me ea ee ee ee ere iv

MUG LUG scssscavsssavosnsnneassumeressnenncanwuanae sateensnsessnnanasea ecanssaecdeuanavaeuesanesaisouenesararenencamacaannses VANT BACH OAR GHẾ VIET DAT suonneaoboguotibtosaoseng6iGisgu60070105508000G0ã001300006 viiiEAGT A IN seeeeeenseennoesennuhrtosooteruonotooeirnugortgioqoisgotog80805030050808500 ixM.9IsE2(es0e len %Efinirgii, T071 G xeeeseoeneeetoEnertouisstitfkki6cEtrsgvSGngoá00iu5i:0608g0n8SöxEpdaif4nuii4215438ãXG014603g8<5ukii 1

2.3 Caen bien cứu lIỀn:QUđTsizsssestsssessiissss15666662054608030594g38-4EL58834.G096g36ip8u2ggtisgSbcbebiooei:2S230EE 72.3.1 Tiền xử lý bã cả phê -2-22222222222221222122122122121121121111211211 21121112 ee 72.3.2 Thuy phan ba ca ph6 ou ee ee ee 7 2.3.3 Hoạt tính sinh học của dung dịch thủy phan -+ ++-++<£+>£+>cz=czzczr+ 82.4 Kĩ thuật quang phổ hấp thu phân tử (UV — ViS) -©2¿©22222222E22E+2EczEczxze 82.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao — High performance liquid chromatography

05090 — 92.6 Phương pháp bề mặt đáp ứng — Response surface methods (RSM) 9

2.6.1 Nguyên tắc hoạt động - 2 2 2S2E+2E22E22E2212112117112112112112112121212121 2 c0 92.6.2 Công dụng RSM -©222-2222222211222112711122211221122122 22 re llChương 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHAP o s.csocsscsssessesssessesssesseesessessnseseesneeeees 12

3.1 Thời gian và địa diém nghiên cứu - 2¿+22++2E++2E++EE++EE+2EEEzEErerxrcrrree 12

Suds Wat ligy TTEHIỀT/CỮUssxzsxx2s295g03:5560556421:960:B8.A02S.0313NS9M0LSBS.DINSSSMSHLSEEISCRLSESR-2ESHG IS0/889S, 123.2.1 Đối tượng nghiên CHU ccccccccc ccs essessessecsessssesessessessesseesessessessesseseesenseeseneseees 12

20 12

3.3 Phuong phap nghién CUU 22 13

3.3.1 Xác định thành phan nguyên iG oo cece ccsessessessssessessessesseseessessesseeeeeseeees 145.3.1.1 Xác Ciel OG Biren nguyên cn emcees ec scene var aecunheneranneiaesaneerie 14

scales 2080501) TL CHỦ) VŨ ⁄onggnuanggonisiaidgnoidgsoik0000040000001260210006180020130 NRG 14

3.3.1.3 Xác định hàm lượng protein thÔ 5-6 22 S21 2212211221221 21 1 tre 15

3.3.1.4 Xác định hàm lượng ÌIpId - - cece 25222 *£*+£+E+E£E£eEeEexrxerrrrrkrxrrrrrrrreree 15

3.3.1.5 Xác định hàm lượng carbohydrate tổng sỐ 2- 222 222z+22222z+2E222zz+2 l6

3.3.2 Tối ưu hóa điều kiện tiền xử lý bã cà phê -5+22+©7++2c+seresrrssrrreee 163.3.3 Chỉ số lưu giữ nước -:-©2¿2++22+22+221221271211271211221211211211211211 212 ee 17

3.3.4 Hàm lượng lignin không hòa tan - - cee 22 S2* SE S222 re 18

3.3.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của enzyme đến quá trình thủy phân 183.3.6 Xác định nồng độ đường khử trong dich thủy phân - 2-2-5255: 183.3.8 Dinh lượng phenolic tổng số (TPC) ::s:scsssessessessecsesseeseesessesseesecsesseeseeseeneees 193.3.9 Đánh giá kha năng chống oxy hóa DPPH -2- 22 2222++2z22++2+z£z+zzxzex 19

3.3.10 Dinh luong caffeine oe eee 20

Chương 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ, -22- 2222222222E2EE22E222122122222212222222e 29

2 - - -= =Ằằ— Ặằằ—ằẶằằẪn= nắn 29

J1 :֜-+1Aa 29

TÀI LIEU THAM KHẢO - 52s SE‡E2EEEE2EEEEEEEEEEE2EE112111112111211111111 1E XC 30PHỤ LỤC

Vil

: Gallic Acid Equivalents

: High performance liquid chromatography

: International Coffee Organization

: Reducing sugar content

: Response surface methods

: Trolox Equivalents

: Ultrasound - assisted extraction

vill

DANH SÁCH CÁC BANG

TrangBảng 3.1 Ma trận bố trí thí nghiệm mã hóa các biến độc lập -2 22- 17

Bảng 3.2 Bồ trí nghiệm thức thủy phân bã cà phê - 2-22 222222222+z252z2 18

Bang 4.1 Thành phan nguyên liệu bã cà phe cccecceecseeceeceeseecseeceeseeeeeesseeseeeseees 21Bang 4.2 Kết quả bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện tiền xử ly bã cà phê theo phươngpháp bề mặt đáp ứng (RSM — CCD)), -2-©22+22+222222E1223122312211221122122212 22 xe 22Bảng 4.3 Bang phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm mục tiéu 23Bảng 4.4 Hàm lượng lignin không hòa tan trước và sau tiền xử lý 24Bang 4.5 Nồng độ các loại đường đơn trong dịch thủy phân tối ưu 2]Bang 4.6 Kết qua phân tích dịch thủy phan ccscssscssessseesseesseesseesseesneesseesneesneesnees 28

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc của cellulose - 2-©2¿+2s+2E22E122E22E122121122127122212212221221 2122 xe 5

Hình 2.2 Một số hợp chat phenolic có trong bã cà phê -2- 52552552552 6

Hình 2.3 p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl aleohol - - 7

Hình 2.4 Biểu diễn hình thức của chức năng đáp ứng -2-2-©22252z+22+z55++2 10

i ee EA HH en 12Hình 3.2 Sơ đồ nội dung nghiên COU 2.0 cece ccc ceseeeseesseeeseesseesseesseessetsseeteeseeeseees 13Hình 4.1 Biéu đồ bề mặt phản ứng thé hiện ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm mục(11 ee eee ee te eee etme ee ee eee er eae a care tener erent cee ae 23Hình 4.2 Biéu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian đến hàm

lượng đường khử trong quá trình thủy phân bã cà phê . -5: 25

Hình 4.3 Trắc nghiệm phân hạng với 4 nghiệm thức có hàm lượng đường cao nhất 26

Hình 4.4 Sắc ký đồ phân tích thành phần đường dich thủy phân - - 27Hình 4.5 Sắc kí đồ phân tích hàm lượng caffeine trong dịch thủy phân tối ưu 28

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Môi trường là yếu tổ quan trọng ảnh hưởng đến sự tôn tại và phát triển của con

người Vì vậy, vấn đề về môi trường ngày càng được chú trọng và quan tâm Phát triển

bền vững và bảo vệ môi trường mang tính chất sống còn của mỗi quốc gia trên thé giới.Trong đó, nguyên nhân lớn nhất dẫn đến ô nhiễm môi trường chính là rác thải và bã càphê (BCP) là một yếu tô góp phan trong chúng

Cà phê là thức uống phô biến trên thế giới Quá trình sơ chế và xử lý cà phê nguyên

liệu thành thức uống đã thải ra một lượng lớn chất thải bao gồm vỏ cà phê và BCP Chếbiến một tan cà phê nhân thải ra khoảng 650 kg BCP (Murthy va Naidu, 2012) BCP có

2 nguồn thải chính: các cửa hàng (quán cà phê, nhà hàng, ) và nhà máy sản xuất cà

phê hòa tan Ước tính rằng các nguồn này trung bình một năm thải ra khoảng 6 triệu tan

BCP Việc thải bỏ trực tiếp BCP ra môi trường mà không qua xử lý có thể dẫn đến cácvấn đề về ô nhiễm môi trường (Campos-Vega và ctv, 2015)

Việc tái chế và xử ly chat thải thành những sản phẩm có giá trị không những đemlại lợi ích cho kinh tế, xã hội mà còn có ý nghĩa quan trọng trong bảo vệ môi trường

Hiện tại BCP được nghiên cứu làm phân hữu cơ, làm chất hấp thụ để loại bỏ ion kim

loại (Fiol va ctv, 2008), sản xuất diesel sinh học và nhiên liệu sinh học (Caetano va ctv,2012), làm tiền chất dé sản xuất than hoạt tính (Kante và ctv, 2012), làm chất bé sungthực phẩm, polymer sinh học và vật liệu composite BCP chứa một lượng lớnpolysaccharide bao gồm galactomannan và arabinogalactan, protein và các hợp chất

phenolic chưa được quan tâm khai thác sử dụng (Mussatto và ctv, 2011) BCP là một

trong những nguồn nguyên liệu chứa đường mannose đồi dao (20-30%) và một lượngcác hợp chất phenolic cao (Nguyen và ctv, 2017) Do đó việc thu nhận đường và hợpchat phenolic trong bã cà phê dé sử dụng làm chất bé sung dinh dưỡng, cung cap nănglượng và chống oxy hóa được quan tâm nghiên cứu

Từ những vấn đề trên, tác giả đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu xử lý bã cà phêthành đường và các hợp chất phenolic”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Khai thác các sản phẩm có giá trị như đường và hợp chất phenolic từ bã cà phê,góp phần xử lý môi trường, giảm thiểu ô nhiễm thông qua các phương pháp an toàn

đồng thời nâng cao hiệu quả ngành công nghiệp cà phê

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Tôi ưu hóa điều kiện tiền xử lý bã cà phê

Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của enzyme đến quá trình thủy phân bã cà phê.Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính sinh học của dung dịch sau thủy phân.

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về bã ca phê

Cà phê là một sản phẩm nông nghiệp phổ biến và là thức uống được tiêu thụ rộng

rãi Theo dit liệu của Tổ chức cà phê quốc tế (International Coffee Organization — ICO),

niên vụ năm 2018/2019 đã có hơn 10 triệu tan ca phê được sản xuất Brazil, Việt Nam,Colombia, Indonesia, Ethiopia, Honduras và Ấn Độ là lần lượt các quốc gia có sản lượngnhiều nhất — chiếm hơn 80% sản lượng toàn thế giới Trong đó, Việt Nam đóng gópkhoảng hơn 1,8 triệu tấn Trong quá trình biến đối từ hạt cà phê đến sản phẩm dé sửdụng thì sẽ tạo ra một nguồn chat thải lớn — đó là bã ca phê Theo Murthy và Naidu(2012), từ 1 tan hat cà phê qua quá trình chế biến sẽ thải ra khoảng 650 kg BCP BCPkhông tham gia vào chuỗi thức ăn, là một nguyên liệu không thé làm thực phâm nên

phần lớn đã được đồ vào các bãi chôn lap

2.2 Thành phần hóa học của bã cà phê

Thành phần hóa học của BCP phụ thuộc vao loại cà phê, vi trí địa lý, tuổi cây, khí

hậu và điều kiện thổ nhưỡng của vùng trồng cây cà phê Tuy nhiên, hầu hết chúng đều

có thành phần tương tự nhau

Thành phần chiếm lượng lớn trong BCP là carbohydrate, cụ thể hơn là cellulose

và hemicellulose, chúng kết hợp với nhau đề tạo nên khoảng 50,1% khối lượng khô củaBCP Mannose, galactose và arabinose là thành phan chinh cua hemicellulose, trong khiglucose là thành phần chính của cellulose Mannose, glucose va glactose lần lượt chiếm

khoảng 28,6%, 9,2% và 12,3% khối lượng nguyên liệu (Trinh và ctv, 2018).

Có thê thấy, mannose chiếm lượng lớn trong lượng đường tổng số của BCP

Mannose là một loại đường quan trọng được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, phụ gia, dược phẩm Nó cũng được chứng minh tăng cường hệ miễn dịch và mang lại nhiều lợi

ích cho sức khỏe Mặt khác, nó cũng có nhiều tác dụng như là thay thế kháng sinh làm

chất phụ gia trong chăn nuôi, ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn và ức chế sự phát

triển của mầm bệnh đường ruột trong thức ăn chăn nuôi (Berge và Wierup, 2012) Tuy

nhiên, việc sản xuất mannose bằng tổng hợp hóa học và chiết xuất thực vật không đủ

đáp ứng nhu cầu công nghiệp hiện nay Vì vậy, BCP là một trong những nguồn tự nhiên

đôi dào mannose, có tiêm năng to lớn nêu quy trình thu nhận mannose có hiệu quả.

Ngoài carbohydrate, các hợp chất chiếm nhiều tiếp theo trong BCP là lignin (không

tan trong acid) và protein, mỗi loại lần lượt chiếm khoảng 25% và 15% khối lượng khô.

Bên cạnh đó BCP cũng chứa một lượng dau đáng kể, với hơn 10% khối lượng khô đượcghi nhận trong một số nghiên cứu (Hamamre và ctc, 2012; Melo va ctv, 2014)

Các thành phần khác được tìm thấy trong BCP với lượng nhỏ bao gồm tro, các hợpchất phenolic, caffeine và tannin (Low và ctv, 2015)

Cellulose là homopolyme mạch thang của gốc B-D-glucose, kết hợp bằng liên kết

B (14) glucoside Thông thường, các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật sơ cấp

có mức độ trùng hợp trong khoảng từ 5000 đến 7500 đơn vị đơn phân glucose, với gỗ

là khoảng 10000 và khoảng 15000 đối với bông Là thành phần chính của mô nâng đỡ

thực vat Cellulose không tan trong nước, bị thủy phân trong môi trường sulfuric acid

nóng, không có giá trị dinh dưỡng đối với người và đa số động vật Ở động vật ăn cỏ,các vi sinh vật trong ống tiêu hóa sản sinh ra enzyme cellulase thủy phân cellulose thành

các B-D-glucose nên mới tiêu hóa được cellulose.

Trong quá trình sinh tông hợp, lực Van der Waals và các liên kết hydro liên phân

tử giữa các nhóm hydroxyl và oxy của các phân tử lân cận thúc đây sự xếp chồng songsong của nhiều chuỗi cellulose tạo thành các sợi cơ bản, rồi tiếp tục tập hợp lại thànhcác sợi lớn hơn, gọi là microfibril (đường kính 5—50 nm và chiều dài vài micromet)(Moon và ctv, 2011).

Hemicellulose là polysaccharide phong phú thứ hai trong các lớp sơ cấp và thứ cấp

của thành tế bào thực vật Vai trò chính của hemicellulose là gắn chặt liên kết giữa

cellulose va lignin trong thành tế bao thực vat Hemicellulose là các

heteropolysaccharide có cấu trúc phức tap, dé bị thủy phân bởi acid tạo thành các đườngđơn tương ứng (Duchesne và ctv, 2001).

Cellulose và hemicellulose liên kết chặt chẽ với nhau trên bề mặt của mỗi

microfibril Nhìn chung, hemicellulose bao gồm các đơn vị glucose, mannose, galactose, D-xylose, L-arabinose và lượng nhỏ L-rhamnose được kết hợp bằng liên kếtB-(1—4) (Sjostrom, 1993) Hemicellulose có cau trúc khác nhau ở các loài thực vật valoại tế bào khác nhau Hemicellulose là những phân tử sinh học vô định hình, có nhánh.Mức độ trùng hợp trung bình của hemicellulose nằm trong khoảng 80 — 200 phân tử

D-(Scheller va Ulvskov, 2010).

2.2.2 Các hợp chat phenolic

Các hợp chat phenolic thực vật là những hợp chat hóa học quan trọng vì chúng là

chất chống oxy hóa mạnh Những chất chống oxy hóa này có thê được sử dụng để sảnxuất thực phẩm chức năng hoặc thực phẩm bồ sung (Dai và Mumper, 2010)

Tất cả các hợp chất phenolic đều chứa ít nhất một vòng thơm với một nhómhydroxyl trong cấu trúc của chúng và có hơn 8000 hợp chất riêng lẻ với sự thay đối cautrúc (Laura, 2019).

Một số hợp chất phenolic có nhiều trong BCP như chlorogenic acid, 1,5 gammaquinolactone, quinic acid, caffeic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, pyrogallic acid,những chất này được xem là có giá trị cao bởi những hoạt tính sinh học mạnh của nó(Zuorro và Lavecchia, 2012).

Nicotinic acid Quinolinic acid Pyrogallic acid

Hình 2.2 Một số hợp chat phenolic có trong bã cà phê

2.2.3 Lignin

Lignin là một thành phần chính trong sinh khối lignocellulose Lignin có thể được

định nghĩa là polyphenol vô định hình phát sinh từ quá trình trùng hợp khử hydro của

ba monome phenylpropanoid, cụ thé là coniferyl alcohol, sinapyl alcohol và ø-coumarylalcohol (Hình 2.3) Lignin phục vu mục dich kép là liên kết và làm cứng các sợi gỗthông qua sự phân bố của nó giữa và trong thành tế bao Bằng cách giảm sự thẩm thấucủa nước qua thành tế bào trong các mô xylem, lignin đóng một vai trò quan trọng trongviệc vận chuyên nước, chất dinh dưỡng và các chất chuyên hóa Nó tạo độ cứng chothành tế bào và hoạt động như một chất kết dính giữa các tế bào gỗ, tạo ra một vật liệu

có khả năng chịu nén, va đập và uốn cong vượt trội Nó cũng mang lại khả năng chống

lại sự suy thoái sinh học (Lebo và ctv, 2002).

HC=CHCH;OH HC=CHCH;OH CH=CHCH;OH

OCH3 HạCO OCH;

OH OH OH

p-coumaryl alcohol coniferyl alcohol sinapyl alcohol

Hình 2.3 p-coumary] alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol.

2.3 Các nghiên cứu liên quan

nóng hoặc hơi nước (steam explosion), phương pháp vi sóng và phương pháp sinh học

như dùng các loại nắm và vi khuẩn Các phương pháp tiền xử lý thường bẻ gãy liên kếtgiữa lignin và polysaccharide, phá vỡ cấu trúc lignocellulose, loại bỏ lignin, làm tăngdiện tích tiếp xúc của polysaccharide với enzyme thủy phân do đó nâng cao hiệu suấtquá trình thủy phân polysaccharide Mỗi phương pháp tiền xử lý phù hợp với một sốloại nguyên liệu khác nhau tùy theo cấu trúc và thành phần hóa học của nguyên liệu đó.BCP bao gồm các polyme polysaccharide và polyme phenolic Bản chất không đồngnhất của hemicellulose làm cho BCP giàu các monosaccharide khác như mannose,galactose va arabinose ngoài glucose (Campos-Vega va ctv, 2015)

Theo Ballesteros va ctv (2015) đã kiểm tra việc sử dụng NaOH kèm theo các điềukiện liên quan như một tiền xử lý và nhận thấy lượng đường có thê thu hồi được trướckhi xử lý tiếp cao hơn 14% so với điều kiện bình thường Simões và ctv (2013) đã kiểmtra việc gia nhiệt BCP kèm theo các điều kiện như một tiền xử lý và thấy rằng đã cảithiện hàm lượng của galactomannans lên 15% Ravindran và ctv (2017) đã kiểm tra các

quy trình tiền xử lý khác nhau theo trình tự để tối đa hóa lượng đường, họ phát hiện ra

rang quá trình tiền xử ly phosphoric acid — acetone đã dẫn đến lượng đường tăng gấp1,7 lần

2.3.2 Thủy phân bã cà phê

Sau khi tiền xử ly, BCP chứa phan lớn polysaccharide được thủy phân dé giảiphóng các loại đường hòa tan mà phan lớn là đường đơn Một trong những phương pháp

7

phô biến nhất là thủy phân bang acid loãng Acid sulfuric thường được sử dụng dé thủyphan BCP (đã tiền xử lý) ở nhiệt độ cao (>100°C) trong 45 phút đến 2 giờ (Burniol-Figols và ctv, 2016) Hiện nay, thủy phân bằng enzyme là phương pháp hiệu quả, an

toàn và thân thiện với môi trường, được sử dụng thay thế acid để phá vỡ các

polysaccharide.

Mamnanase, cellulase và hemicellulase là một vài trong s6 các enzyme được sửdụng phổ biến nhất Nghiên cứu của Nguyen và ctv, 2017 thì kết quả thu được sau khithủy phân bằng enzyme cellulase và pectinase là 11,8; 6,1; 22,3 g/L tương ứng của

glucose, galactose và mannose từ 100g BCP đã tiền xử lý bang ethanol

Ca hai phương pháp đã được chứng minh là có khả năng thu được hơn 80% lượng

đường có sẵn khi được sử dụng với một tiền xử lý thích hợp

2.3.3 Hoạt tính sinh học của dung dịch thủy phân

Theo Getachew (2017), dịch thủy phân BCP đã tiền xử lý ethanol kết hợp vi sóng

được nghiên cứu về tổng hàm lượng phenolic và chất chống oxy hóa Kết quả cho thấy

giá trị tong hàm lượng phenolic dao động ở khoảng 33,1 — 51,2 mg Gallic AcidEquivalents (GAE)/g, còn hoạt động chống oxy hóa gốc tự do DPPH và ABTS' lần lượt

dao động ở khoảng 0,36 — 0,51 và 0,39 — 0,76 mmol Trolox Equivalents (TE)/g.

Nhiều nghiên cứu về chiết xuất các hợp chất phenolic bằng ethanol từ BCP cũng

đã được thực hiện, với tổng hàm lượng phenolic nằm trong khoảng 20 — 30 mg GAE/g,hoạt động chống oxy hóa gốc tự do ABTS* 396,2 mg TE/g (Zuorro và ctv, 2015)

2.4 Kĩ thuật quang pho hap thu phân tử (UV — Vis)

Quang phô hấp thu phân tử là phương pháp phân tích hàm lượng dựa vào nguyên

lý hấp thụ năng lượng khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện tử Vùng bức xạ

được sử dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần và vùng khả kiến tương ứng

với bước sóng từ 200 — 800nm Hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ tuân theo định luậtLambert — Beer.

Khi chiếu một chùm sáng có bước sóng phù hợp đi qua một dung dịch chất màu,

các phân tử sẽ hấp thụ một phần năng lượng chùm sáng, một phần ánh sáng truyền qua

dung dịch Xác định cường độ chùm sáng truyền qua, từ đó tính toán được nồng độ hợp

chất cần phân tích trong dung dịch (Nguyễn Văn Đến, 2002)

Công thức Lambert-Beer: A=elC€

Trong đó: A (Absobance): độ hấp thụ

§

e: hằng số tỉ lệ, độ hấp thụ quang riêng (L/mol.cm)

I: chiều dày của lớp chất hap thụ (em)C: nồng độ của chất hấp thu (mol/L)2.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao — High performance liquidchromatography (HPLC)

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là quá trình tách các chất

ở trạng thái lỏng dua trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có

khả năng hap thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyên qua pha tinh dé mangchất phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động Do các chất phân tích có ái lực khácnhau với pha tĩnh nên chúng di chuyên với tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau

Ưu điểm của phương pháp này là lượng mau phân tích rat ít, chỉ khoảng 20 uL cho

1 lần phân tích và mẫu chỉ cần hòa tan mà không cần làm bay hoi, do đó HPLC có thé

phân tích được các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy do nhiệt độ trong quá trình

Với một chat sẽ có một thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thé căn cứ

vào tính chất này đề phân tích định tính Độ lớn peak được đặc trưng bằng diện tích hay

chiều cao, hai đại lượng này tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong một khoảng xác địnhnào đó, được sử dụng để định lượng chất phân tích (Từ Vọng Nghi, 2004)

2.6 Phương pháp bề mặt đáp ứng — Response surface methods (RSM)

Phương pháp bề mặt đáp ứng được dùng dé khảo sát mối quan hệ giữa một haynhiều biến đáp ứng và một tập hợp các biến thực nghiệm định lượng hay các yếu tó.Phương pháp này thường được áp dụng sau khi đã xác định một số yếu tố quan trọng cóthé kiểm soát được và muốn tìm các giá trị của các yếu tô để có đáp ứng tối ưu

2.6.1 Nguyên tắc hoạt động

Trong trường hợp chung, người ta gọi là bề mặt đáp ứng, đại diện hình học hàmmục tiêu của một quá trình vật lý không gian - thời gian ngẫu nhiên cho những biếnkích thích Đặc tính được nghiên cứu, hay hàm mục tiêu Y là kết quả của sự chuyên đổibằng một chức năng đáp ứng rõ rang (hay còn gọi là chức năng chuyên đổi) Sự thay dồi

9

giá trị của các biến đầu vào sẽ kéo theo sự thay đối chức năng của hàm mục tiêu Những

mô hình thí nghiệm của mặt đáp ứng lưu ý đến sự lựa chọn các biến kích thích, xác địnhcác giai đoạn quan sát và tính toán sai số Những biến đầu vào Xi (i = 1, 2, , n) cũngđược gọi là các biến cơ sở Chúng được đặc trưng bởi một loạt các thông tin thống kê pj

(=1,2, , p) (chức năng phan phối độc lập hoặc tương quan, cơ hội chuẩn hóa) Trong

trường hợp chung, những biến Xj là những biến đổi thay đôi theo không gian — thời gian

Nhìn chung, hình thức của chức năng chuyền đổi nay tùy thuộc vào các biến cơ sở

và việc nghiên cứu và tính xấp xi Nó xuất hiện trong chức năng thường là hoặc tuyến

tính hoặc phi tuyến tinh và được đặc trưng hóa bởi những thông số Xx (k = 1, 2, ,1)một cách ngẫu nhiên hay xác định Việc điều chỉnh mục tiêu dựa trên cơ sở của những

số liệu thực nghiệm, nó cho phép ta suy ra được các thông số Xx Sự biểu diễn hình họccủa chức năng đáp ứng đưới dang một đường cong, một mặt phẳng hoặc một mặt phẳnggia tăng được gọi là bề mặt đáp ứng Chức năng đáp ứng có thé được viết đưới dang nhưtrong Hình 2.4.

Y X/u) = Y ( X/p)Thôngsố Biến kích thích

Sửa chữa — —————*' Chọn và sắp xêp

Hình 2.4 Biểu diễn hình thức của chức năng đáp ứng

Đề xây dựng một bề mặt đáp ứng, cần phải khai báo:

X= {X1, X¿, , Xn} : biến cơ sở

= {un, H, , ta} : thông tin thống kê về vecto X

W (X/u) : tính xấp xỉ các hàm mục tiêu Y, được ghi theo công thức chức năng của

X đông thời cho biết được những thông kê p nào đó và nó có được hoặc là do sự điềuchỉnh các thông số y (mặt đáp ứng phân tích) hoặc là bờ mô hình vật lý liên tiếp

|.| : hệ mét trong không gian của biến cơ sở và hàm mục tiêu Nó cho phép đo được

chất lượng điều chỉnh từ sự xấp xi W đến mục tiêu Y.

10

2.6.2 Công dụng RSM

- Xác định các mức yếu tố thỏa mãn đông thời các thông số kĩ thuật mong muốn

- Kết hợp tối ưu hóa các yếu tố dé cho kết quả mong muốn và mô tả kết quả tối ưu đó

- Kết qua đặc trưng khi nó bị ảnh hưởng bởi những sự thay đổi của các mức yếu tô vượtquá mức đang quan tâm.

- Đạt được một sự hiểu biết về định lượng của hệ thống xử lý vượt quá vùng thử nghiệmtrong nghiên cứu.

- Sản xuất các sản phâm đặc trưng trong vùng tối ưu, ngay cả khi kết hợp các yếu tốkhông chạy.

- Điều quan trọng là tìm ra các điều kiện cho một quá trình 6n định bằng các dấu hiệu

vô hình (Nguyễn Thị Vân Anh, 2019)

11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2021 đến tháng 05/2022 tại Phòng thử nghiệm

Hóa — Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lam

TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

BCP pha máy thu từ một số quán cà phê trên địa bàn thành phố Thủ Đức, TP Hồ

Chí Minh Sau khi thu về thi làm khô ở nhiệt độ phòng, rồi ray qua ray có đường kính 1

mm Tiếp tục mang di sấy ở 50°C trong 24 giờ Thu mau, bảo quản kín trong bình hút

2

A

am.

3.2.2 Dụng cụ

Chén cân, chén nung, bình hút âm, bình định mức, cốc thủy tinh, bình tam giác,

ống đong, buret, bình cầu, bình cầu thủy tinh cổ dài, Ống nghiệm, micropipet, giấy lọc

12

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Bã cà phê

Phân tích thành phân Tại dẫu

nguyên liệu

Bho

Tối ưu hóa điều kiện tiền xử lý bã cà phê (đun hồi lưu trong dung môi acetone:nước = 1:1, tỉ lệ

nguyên liệu/dung môi = 1:25) bằng phương pháp bề mặt đáp ứng với hai yếu tô ảnh hưởng được

tối ưu là thời gian đun hồi lưu và nồng độ NaOH

Kt

Tìm được điểm tối ưu của 2 yếu tố ảnh hưởng

QeKhao sat anh hưởng của enzyme Viscozyme đến

tỉ lệ enzyme/cơ chất và thời gian thủy phân

n quá trình thủy phân với hai yếu tố khảo sát là

Phân tích thành phần đường, hàm lượng phenolic tổng số, hàm lượng caffeine và hoạt tính

chông oxy hóa

Hình 3.2 Sơ đồ nội dung nghiên cứu

3.3.1 Xác định thành phần nguyên liệu

3.3.1.1 Xác định độ 4m nguyên liệu

Sử dụng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi theo TCVN 10788:2015

Chuẩn bị chén sứ đã say đến khối lượng không đổi và cân (Ohaus, Trung Quốc)

có khối lượng mo (g) Cân và cho vào chén thủy tinh mẫu BCP rồi ghi nhận khối lượng,khi đó tong lượng chén sứ và mẫu là mi (g) Đặt chén sứ vào tủ say (Memmert, Duc) va

say ở nhiệt độ 105°C + 2°C, say khoảng 2 giờ thi lay ra đặt trong bình hút 4m cho nguộiđến nhiệt độ phòng rồi cân và ghi nhận khối lượng Cân xong mang chén sấy tiếp khoảng

2 giờ thì cân lại lần nữa đến khi trọng lượng chén mẫu giữa các lần sấy không thay đổi

Ghi nhận khối lượng m:(g)

Công thức tính độ âm

H = (mi - m›)/(mị — mo) x 100

Trong đó :

H: độ ẩm (%)

mo: khối lượng chén sau khi say đến khối lượng không đổi (g)

my: khối lượng chén và mẫu trước khi sấy (g)

ma: khối lượng chén và mẫu sau khi sây đến khối lượng không đổi (g)

đến khi mẫu được cacbon hóa hoàn toàn Ngay khi tắt bếp, đặt chén vào lò nung, đậy

nắp và nung ở nhiệt độ 550°C + 50°C đến khi khối lượng không đổi Cuối cùng, lay ra,

bỏ vào bình hút 4m, dé nguội đến nhiệt độ phòng rồi cân chính xác đến 0,0001 g

mo: khối lượng ban đầu của mẫu thử (g)

mị : khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g)

ma : khối lượng chén và mẫu sau khi nung đến khối lượng không đổi (g)

14

H :độẩm nguyên liệu (%)

3.3.1.3 Xác định hàm lượng protein thô

Sử dụng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 8099-1:2015.

Cân chính xác 0,5 + 0,0001 g BCP và 4 g hỗn hợp xúc tác KaSOx:CuSO¿ (AR,Trung Quốc) theo tỉ lệ 10:1, dang bột cho vào các bình đun Làm thêm 1 mẫu trắng.Thêm 10 mL HzSO¿ 98% (AR, Trung Quốc) Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấpđến khi ngừng tạo bọt Sau đó đun sôi hỗn hợp đến khi chuyền từ nâu sang màu xanhngọc bích Dé nguội và phân tích trên thiết bi Kjeldahl (Gerhart, Đức) Pha loãng dungdich phân hủy với 10 mL nước cat và lắp vào máy Thêm từ từ khoảng 35 mL dung dịchNaOH 40% (AR, Trung Quốc ) Chuẩn độ bang HCl 0,1 N (AR, Trung Quốc) Điểm

kết thúc chuẩn độ đạt được khi dung dịch chuyển sang hồng nhạt

—_ (Vị-Vo)*Cw*14,007

Công thức tính hàm lượng nito tổng số: X„= txotirpsf-o x 100

trong đó: Xa : hàm lượng nitơ tổng số (%)

Vo : thé tích dung dich HCI chuẩn dùng cho mẫu trang (mL)

Vi : thé tích dung dich HCl chuẩn dùng cho mẫu thử (mL)

CM : nồng độ mol của dung dịch HCI (mol/L)

m : khối lượng mẫu thử (g)

14,007 : khối lượng mol của nito (g/mol)

Sử dụng phương pháp chiết Soxhlet

Say khô bình cầu trong bộ thiết bị soxhlet đến khối lượng không đổi va dé nguộitrong bình hút ẩm Cân khối lượng chính xác đến 0,0001 g Cân khoảng 1 g BCP (chínhxác đến 0,0001 g) và gói bằng giấy lọc rồi đưa vào ống soxhlet Cho vào một lượng vừa

đủ n — Hexane (AR, Trung Quốc) và chiết hồi lưu trong 5h Sau đó, đem hỗn hợp thu

lo)