Tên đề tài: “Đánh giá khả năng sinh hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng nấm mới, đặc hữu phân lập được từ lá rụng ở Phú Quốc- Việt Nam và tiếp tục công bố loài nấm mới”

Tên đề tài: “Đánh giá khả năng sinh hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng nấm mới, đặc hữu phân lập được từ lá rụng ở Phú Quốc- Việt Nam và tiếp tục công bố loài nấm mới”

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN

Tên đề tài: “Đánh giá khả năng sinh hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng nấm mới, đặc hữu phân lập được từ lá rụng ở Phú Quốc- Việt Nam

và tiếp tục công bố loài nấm mới”

Mã số đề tài: QG 19-70

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Anh Đào

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

1.1 Tên đề tài: “Đánh giá khả năng sinh hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng nấm

mới, đặc hữu phân lập được từ lá rụng ở Phú Quốc- Việt Nam và tiếp tục công bố loài nấm mới”

1.2 Mã số:

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

Họ và tên, học hàm,

việc tham gia

Thời gian làm việc cho đề tài*

1 CN Nguyễn Anh Đào Viện VSV &

40

5 CN Lê Hồng Anh Viện VSV &

CNSH

Nghiên cứu tách chiết, nhân đoạn, giải trình tự DNA

45

6 ThS Nguyễn Thị Vân Viện VSV &

CNSH

Nghiên cứu các đặc tính sinh enzyme ngoại bào của vi nấm

45

1.4 - Thông tin về chủ nhiệm đề tài

Họ và tên : Nguyễn Thị Anh Đào

Ngày, tháng, năm sinh: 1973 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Thạc sĩ

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên Chức vụ:

Điện thoại : 0243.7547407 (CQ) Fax: 02437547407

Mobile: 0912355001 E-mail: daona@vnu.edu.vn;

Tên tổ chức đang công tác: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia

Hà Nội

Địa chỉ tổ chức: E2, 144 Xuân Thuỷ, Cầu Giấy, Hà Nội

1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: 12/2019-12/2021

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng… năm…

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 12 năm 2019 đến tháng 01 năm 2021

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)

PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG

2.1.1 Giới thiệu chung về nấm

Nấm là nhóm vi sinh vật nhân thật, dị dưỡng, vách tế bào thường có chứa chitin và ß-glucan (một số mất chitin, thậm chí là vách trong trong quá trình tiến hóa) Nấm là vi sinh vật hiếu khí, nhờ các cơ quan hô hấp: ty thể với nếp màng trong phẳng và các thể peroxi (peroxisom- cơ quan tử có chứa nhiều oxydaza), tuy nhiên cũng có 2 nhóm kị khí bắt buộc thiếu 2 cơ quan này Tế bào nấm có nhiều dạng, từ dạng tế bào đơn lẻ, chỉ gồm một tế bào đến cấu tạo dạng sợi, phát triển kéo dài sợi, tạo khuẩn lạc (Deacon và CS 2005)

Trong thế giới vi sinh vật, nấm có vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học cổ đại và hiện đại Nấm được sử dụng trong sản xuất thức ăn (Dufossé et al 2014), làm men bánh mì, sản xuất bia và sản xuất kháng sinh, rượu, enzyme, axit hữu cơ và nhiều loại dược phẩm; trong sản xuất dược phẩm, và xử lý ô nhiễm môi trường (Wesenberg et al

2003, Martin 2009, Mapari 2010) trong chẩn đoán lâm sàng bệnh của cây Nấm còn là những vi sinh vật tham gia vào vòng tuần hoàn vật chất và kiểm soát ô nhiễm môi trường trên trái đất (Colombo, 1996, Hyde và cs 2008, Harms và cs 2011) và là công cụ để xây dựng mô hình lý tưởng trong nghiên cứu các vấn đề lý thuyết trong sinh học cơ bản

(Neurospora cassara) (Davis Perkins 2002, Riquelme, 2011)… Rõ ràng đây là kho tàng

gen rất hữu ích cần được sưu tầm, nghiên cứu, ứng dụng và lưu giữ lại cho các thế hệ sau

Vì vậy, việc nghiên cứu đa dạng vi nấm, tìm ra các loài nấm mới, có hoạt tính sinh học cao hoặc sinh ra các chất thứ cấp mới là khâu then chốt cho sự phát triển công nghệ sinh học của mọi quốc gia trên thế giới Nhiều tổ chức, nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu tìm đa dạng vi nấm tại các khu sinh quyển khác nhau, phát hiện loài mới và tìm ra được nhiều hoạt chất sinh học mới ứng dụng trong y, dược học

2.1.2 Nghiên cứu đa dạng vi nấm và số lượng các loài nấm được công bố trên thế giới

Câu hỏi về việc có bao nhiêu loài nấm đôi tồn tại trên trái đất đã gây ra nhiều suy đoán, với các con số chủ yếu được đưa ra từ khoảng nửa triệu đến 10 triệu, và trong một trường hợp cực đoan, thậm chí còn chiếm một phần lớn trong con số ngoạn mục là 1

nghìn tỷ Vào những năm 2000-2011, người ta cho rằng có khoảng 1.000.000 loài nấm tồn tại trên thế giới (Hawksworth 2001) Tuy nhiên, khi khoa học về nấm phát triển, đặc biệt là sau năm 2010, nhận biết về nấm học thay đổi, Hawksworth và cs (2017) kiểm tra nhiều bằng chứng mới từ nhiều nguồn khác nhau để đưa ra ước tính cập nhật về sự đa dạng nấm toàn cầu Họ đưa ra kết luận rằng ước có khoảng 1,5 triệu nấm tồn tại trên thế giới, và trong thực tế con số này có thể lên tới 2,2- 3,8 triệu loài Do nấm có vai trò quan trọng trong đời sống cũng như trong nghiên cứu khoa học nên rất nhiều Bảo tàng giống trên thế giới ngày càng chú trọng vào việc phân lập, phân loại và bảo quản cũng như phát triển nguồn gen nấm sợi Các con số thống kê của các Bảo tàng giống cho thấy số lượng các loài nấm ghi nhận được ở các nước ngày càng gia tăng: Thái Lan tăng từ 700 loài năm 1989 lên trên 4.600 loài (tbrc network.org), Trung Quốc đã điều tra được 40.000 loài (Teng, 1996), Nhật Bản đã tìm được 12.000 loài (Katumoto, 2010),….Đến năm

2017, khoảng 120.000 loài hiện đang được chấp nhận (chiếm 3-8% con số nấm trong thực tế) (Hawksworth và cs 2017)

2.1.3 Một số nghiên cứu đa dạng vi nấm ở Việt Nam

Mặc dù thực tế cho thấy nấm đóng vai trò chính trong việc phân hủy xác thực vật

và có vai trò lớn trong chu trình carbon trong tự nhiên cũng như sự chuyển hóa các chất dinh dưỡng trong hệ sinh thái rừng, nhưng lại có rất ít các nghiên cứu về đa dạng vi nấm

ở Việt Nam, đặc biệt là đa dạng vi nấm phân lập từ xác thực vật Đa số các nghiên cứu đa dạng vi nấm thường được tiến hành trên các mẫu đất (Bùi Xuân Đồng và CS, 2001; Lê Thị Hoàng Yến và CS, 2008-2020), một số nghiên cứu được tiến hành trên không khí (Nguyễn Thị Liên Hoa, 2008), một số khác tiến hành trên thực phẩm (Đặng Vũ Hồng Miên và CS, 2015), hay nấm cộng sinh thực vật (Lê Thị Hoàng Yến và CS, 2011), hay nghiên cứu từ nấm phân lập từ xác thực vật được công bố ở Việt Nam ( Lê Thị Hoàng Yến 2011-2020) Năm 2011, Lê Thị Hoàng Yến và CS nghiên cứu "Đa dạng nấm rác

rừng Quốc gia Cát Tiên" với 16 chi 19 loài: Acremonium sp., Aspergillus tubingensis, Cladosporium cladosporioides, Cylindrocladium sp., Dactylella sp., Fusarium incarnatum, Fusarium sp., Gliocephalotrichum sp., Helicosporium linderi, Idriella sp.,

Menisporopsis sp (2 loài), Paecilomyces sp., Penicillium sumatrense, Pestalotiopsis photiniae, Speiropsis sp., Thozetella sp., Trichoderma sp và Trichoderma spirale

Kết quả nghiên cứu về các loài nấm mới phân lập được từ lá rụng các vườn Quốc

gia Việt Nam đa phần được thực hiện và công bố bởi VTCC: Condylospora vietnamensis (Yen et al 2012), Pseudopestalotiopsis vietnamensis (Nozawa et al 2017), Ceramothyrium phuquocense, Ceramothyrium exiigum, ceramothyrium aquaticum, Hamatispora phuquocense (Le Thi Hoang Yen et al 2018 a,b) Con số này còn khá

khiêm tốn so với sự đa dạng vi nấm ở Việt Nam, vì vậy trong nghiên cứu này, ngoài việc khảo sát khả năng sinh enzyme phân hủy lignocellulose của các chủng vi nấm phân lập được từ rừng quốc gia Phú Quốc, chúng tôi còn tiếp tục nghiên cứu và công bố quốc tế các loài nấm mới, nấm đặc hữu ở Việt Nam Các nghiên cứu này được xuất bản trên Mycoscience và Vegetos

2.2 THÀNH PHẦN XÁC THỰC VẬT VÀ CÁC ENZYME THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH PHÂN GIẢI XÁC THỰC VẬT

2.1.1 Thành phần xác thực vật

Xác thực vật được coi là thành phần chính của sinh khối tái tạo trên trái đất (Saini

và Cs 2015) Nó gồm 3 thành phần chính: Cellulose (40% –50%), hemicelluloss (25% –30%) và lignin (15% –20%) (Chaurasia, 1996) (Hình 1.1)

Hình 1.1 Thành phần cấu tạo của xác thực vật

Cellulose là polysaccharide chính cấu tạo nên các vật liệu lignocellulosic bao gồm hàng trăm đến hơn mười nghìn đơn vị β-1, 4 D-glucose được liên kết trong các chuỗi mạch thẳng không phân nhánh Mỗi chuỗi cellulose được liên kết cạnh nhau thông qua liên kết hydro và tương tác van der waals thành sự sắp xếp microfibrils Mỗi microfibrils của cellulose được tổng hợp từ quá trình kết tinh tự phát với hàng chục chuỗi glucan β-D

liên kết, mỗi chuỗi này được tạo ra bởi một protein tổng hợp cellulose (CESA) (Thorn và cộng sự, 1993) (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học (3 chiều) và công thức phân tử của cellulose

Trong khi hemicellulose được sắp xếp ở dạng dải liên kết chặt chẽ với cellulose và lignin trong thành tế bào thực vật, nó chứa polysaccharide phân nhánh chủ yếu là xylan

và mannan Nó chứa các polysaccharid không đồng nhất phân nhánh của pentose (xylose

và arabinose), hexoses (glucose, mannose và galactose) và các axit hoặc đường (ví dụ: acetic, galacturonic, glucuronic và năm loại đường đơn phân là D-glucose, D-mannose, D-galactose, D-xylose và L-arabinose được liên kết bởi liên kết β-1, 4-glycosidic) (Hình 1.3) (Gibson và cộng sự, 2013)

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của hemicellulose

Hemicellulose chính trong gỗ cứng là xylan (15% –30% trọng lượng khô), một polysaccharide có các đơn vị D-xylose liên kết β-1,4, có thể được thay thế bằng các đơn

vị monosaccharide khác Tuy nhiên, gỗ mềm chứa hemicelluloses chủ yếu ở dạng glactoglucomannan (15% –20% trọng lượng khô), một polysaccharide có các đơn vị β, 1–4 liên kết D-glucose và D-galactose (Gibson và cộng sự, 2011,

www.sciencedirect.com.)

Lignin là chất tạo màng sinh học phức tạp và phong phú nhất trong tự nhiên, chúng cũng là loại hợp chất khó bị phân hủy nhất trong tự nhiên liên kết hóa học phức tạp giữa các monome của nó dẫn đến hợp chất bền vững của vật liệu lignocellulosic (Wong, 2009) Đây là đơn vị bao gồm các đơn vị phenylpropan, được tổng hợp bằng cách trùng hợp gốc các đơn vị guaiacyl (G), đơn vị syringyl (S) và đơn vị p-hydroxyphenyl (H) từ tiền chất coniferyl, sinapyl và rượu p-coumaryl như (Hình 1.4) (Freudenberg et al., 1968, Ralph và cs 2001)

Lignin bao gồm polyme thơm có trọng lượng phân tử cao, chứa nhiều liên kết ete hoặc este bền về mặt sinh học Do đó, các microfibrils cellulase được nhúng trong một

ma trận phức tạp bao gồm hemicellulose và lignin cản trở đường đến cellulase và hemicellulase (Ralph và cs 2001)

Hình 1.4 Cấu trúc của lignin 2.2.2 Các enzyem tham gia phân hủy xác thực vật

2.2.2.1 Enzyme thủy phân cellulose

Cellulose bị thủy phân bởi một hệ enzyme (hệ enzym cellulase), bao gồm 3 emzym chính: Cellulose thực sự bị phân hủy hết bởi ba loại enzyme bao gồm cellobiohydrolase (CBH), endoglucanase (EG) và β-glucosidase (BGL) Những enzym này hoạt động phối hợp cùng nhau để thuỷ phân hoàn toàn cellulose Đầu tiên CBH (hay avilcelase) tấn công vào vùng tinh thể của phân tử cellulose và thủy phân hướng ngoại, sản phẩm chính là cellobiosic Đồng thời enzym endo-glucanase (CMCase) tấn công vào vùng vô định hình của phân tử cellulose và thủy phân hướng nội hoặc ngẫu nhiên để giải phóng cellooligosaccharides Một số trường hợp một vài enzyme có thể kết hợp cả hai hoạt động trên cùng lúc Cuối cùng enzyme β–glucosidase sẽ thủy phân

cellobiohydrosaccharides thành sản phẩm cuối cùng là glucose (Hình 1.5) (Suto 2008)

Hình 1.5 Mô hình các loại enzyme cellulase tham gia vào quá trình phân cắt

cellulose

2.2.2.2 Enzyme phân giải hemicelllulose

Hemicellulose và cellulose tương đồng nhau về thành phần đơn vị cấu tạo, bản chất hoá học và cấu trúc đại phân tử tới mức người ta có thể gộp chúng trong một tên gọi chung là holo-cellulose Có lẽ vì vậy hệ enzym hemi-cellulase cũng tương đồng với hệ enzym cellulase về mọi mặt, cả thành phần, cơ chế tác động và sinh tổng hợp Thực tế sự phân giải hai thành phần này của nguyên liệu ligno-cellulose luôn đi đôi với nhau Xylan

là hemicellulose (thành phần đường chủ yếu là xylose) phổ biến trong tự nhiên Những enzym tham gia phân hủy xylan gồm endo-1,4- xylanase (EC 3.2.1.8) (EC 3.2.1.37), arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) Trong đó endo-1,4- xylanase là enzym thủy phân hemi-cenllulose thành đường D-xylose, mananase (EC.3.2.1.78) thuỷ phân các liên kết trong các thành phần của hemi-celulose như: glucomanan, galactomanan vv… (Camassola M 2012)

2.2.2.3 Enzyme phân giải lignin

Sự phân huỷ lignin là một quá trình được thực hiện bởi một phức hệ gồm nhiều enzym Theo Stephan B.pointing, enzym phân giải lignin gồm các enzym cơ bản: laccase

và peroxidase (lignin peroxidase, mangan peroxidase)

Enzyme laccase:

Laccase (p-benzenediol:oxygen oxidoreductase) là enzyme thuộc nhóm oxi hóa, trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sử dụng phân tử

oxy làm chất nhận điện tử, có thể xúc tác oxy hóa nhiều cơ chất vô cơ và hữu cơ, bao gồm mono, di, tri và polyphenol, amino phenol, methoxyl phenol, các amin vòng thơm

và ascorbate (Buswell 1987, Campos 2001, Chandra 2002) Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozyme này khác nhau về trình tự axit amin

và một số tính chất về động học xúc tác

Tuy vậy tất cả laccaza đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên

tử Cu Những nguyên tử Cu này được chia thành 3 nhóm: T1, T2 và T3, chúng khác nhau

về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử Các nguyên tử Cu T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử Cu T3 không tạo phổ hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh (Laura- Leena 2004)

Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần chính (vùng) A, B, C có khối lượng tương đối bằng nhau, cả 3 phần đều có vai trò trong xúc tác của laccase Vị trí liên kết nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một số nguyên tử Cu nằm ở vùng C và trung tâm 3 nguyên tử đồng nằm bề mặt chung của vùng A và C Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa 1 nguyên tử Cu T1, liên kết với 1 đoạn peptide có 2 gốc histidine và 1 gốc cystein Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600nm tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng Trung tâm đồng 3 nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên

tử đồng T3 Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidine bảo thủ (Laura- Leena 2004, Cordi

va fcs 2007) (Hình 1.6)

Hình 1.6 Hình ảnh không gian 3 chiều của phân tử laccase Tiểu phần A,B,C được

kí hiệu là phần đỏ, xanh lục, xanh lá cây

Enzyme peroxidase

Sự phân huỷ lignin là một quá trình được thực hiện bởi một phức hệ gồm nhiều

enzym Theo Stephan B.pointing, enzym phân giải lignin gồm các enzym cơ bản:

peroxidase (lignin peroxidase, mangan peroxidase) và laccase

Peroxidase là một hemoprotein xúc tác cho phản ứng oxy hóa bởi H2O2 với các

cơ chất như: ascorbate, ferrocyanide, cytochrome với cơ chế phản ứng như sau:

Peroxidase + H2O2 Hợp chất thứ nhất

Hợp chất thứ nhất + AH2 (cơ bị chất oxy hóa) Hợp chất thứ hai + AH0

Hợp chất thứ hai + AH2 (cơ chất oxy hóa) Peroxidase + AH0

2AH Sản phẩm đã bị oxy hóa (Hình 1.7)

Hình 1.7 Cơ chế phản ứng của enzyme Mangan peroxidase (Kuhad và cs1997)

2.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐA DẠNG NẤM SINH ENZYME PHÂN HỦY

XÁC THỰC VẬT

Nấm có khả năng phân hủy lignin hiệu quả hơn các vi sinh khác [42] Các loài nấm đảm

gây thối rữa gỗ được chia thành hai nhóm: thối trắng và thối nâu, dựa trên sự phát triển

hình thái của chúng trên gỗ, phản ánh sự hoạt động phân hủy gỗ khác nhau của chúng

Nấm thối trắng (WRF) phát triển trên các cây rụng lá và dần dần phân hủy cellulose và

lignin bằng cách sử dụng các enzyme oxy hóa có tiềm năng oxy hóa khử cao Các loài

nấm này sau khi phân hủy sẽ bỏ lại phần cellulose màu trắng đặc trưng của gỗ [46]

Ngược lại, nấm thối nâu chủ yếu tồn tại ở các loài cây lá kim và chủ yếu phân hủy

hemicellulose và cellulose, để lại phần gỗ còn sót lại có màu nâu được –màu đặc trưng

của lignin [47] Tuy nhiên, cả nấm thối trắng và một số loài nấm thối nâu, chẳng hạn như

Gloeophyllum trabeum (Bourdot & Galzin) Domański, Orloś & Skirg [48], là những vi

loài nấm có khả năng phân hủy và khoáng hóa lignin do khả năng hình thành một số enzym oxy hóa cho chuyển hóa lignin thành H2O và CO2 của chúng [48,49,50] Các ví

dụ về nấm thối trắng mục nát gỗ phổ biến là Phanerochaete chrysosporium Burds., Armillaria sp., Phlebia sp., Phellinus pini (Brot.) Pilát, Schizophyllum commune Fr., Dichomitus squalens (P Karst.) D.A Reid, Trametes versicolor (L.) Lloyd, Daldinia Concentrica (Bolton) Ces & De Not., Trong khi các loại nấm thối nâu bao gồm Laetiporus portentosus (Berk.) Rajchenb., Monilinia fructicola (G Winter) Honey, Fomitopsis lilacinogilva (Berk.) JE Wright & JR Deschamps, và Postia placenta (Fr.)

MJ Larsen & Lombard

Nấm thuộc ngành Chytridiomycota hầu như không có khả năng sinh ligninlolytic enzyme [51], trong khi Ascomycota (nhóm nấm mốc) và Mucoromycota lại là nhóm có khả năng sinh loại enzyme này tương đối mạnh [52] Một số loại nấm gây thối mềm (ascomycetes)

như Xylaria, Fusarium, Penicillium, Trichoderma, và các loài Aspergillus có thể làm

phân hủy phần mềm hơn của gỗ do tỷ lệ lignin thấp hơn [53] Những loại nấm này đã được mô tả là có khả năng khoáng hóa lignin và có các hoạt động thối rữa gỗ, mặc dù với

tỷ lệ thấp hơn so với nấm basidiomycetes [54,55,56,57] Ngoài ra, một số nấm bệnh thực vật có liên quan đến các hoạt động phân hủy lignin Ví dụ, sản xuất laccase ngoại bào

được tìm thấy ở Botrytis cinerea Pers tác nhân gây bệnh thối mềm ở Daucus carota L., Greeneria uvicola (Berk & MA Curtis) Punith, tác nhân gây bệnh thối nhũn nổi tiếng của nho làm rượu (Vitis vinifera L.), và nhiều loài khác như các loài Pythium và Fusarium [ 58]

Một số loài nấm sợi có khả năng sinh enzyme thủy phân cellulose mạnh như:

Trichoderma reesei, T viridae, Aspergillus niger, A javanicus, Fusarium solani, Humicola grisea, Penicillium pinophinum, Sporotrium pulverlentum, Sporotrium

pulverlentum, Phanerochaete chrysosporium, Monilia sp… (Muthusamy 2008, Sajith và

cs 2016)

Bên cạnh đó có nhiều loài nấm lại sinh ra enzyme phân hủy xylan mạnh Trên thị

trường hiện nay, xylanase được sản xuất từ nấm sợi (Trichoderma và Aspergillus) được

sử dụng phổ biến Đặc tính chung của đa số các xylanase từ nấm là hoạt động hiệu quả

nhất ở nhiệt độ 5-50 oC, pH 3,0- 5,5 và bền ở dải pH từ 4,0- 9,0, nhưng có điểm yếu là không chịu nhiệt, kém bền nhiệt, mất hoạt tính ở nhiệt độ 60-70 oC (Muthusamy 2008, Bhardwaj và cs 2019)

Một số chủng nấm sợi có khả năng sinh laccase cao như: Botrytis cinerea, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarinus, Trametes versicolor, Coprinus cinereus, Phanerochaete chrysosporium, Penicillium sp và Melanocarpus albomyces, Agaricus, Phlebia, Tricholoma, Marasmius, Agrocybe, Mycena, Collybia, (Muthusamy 2008,

Brijwani 2010)

Hình 7 Đa dạng các chi nấm tham gia vào phân hủy xác thực vật

2.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME DO NẤM SINH RA

2.4.1 Trên thế giới

Do nấm có nhiều hoạt tính enzyme phân hủy xác thực vật như cellulase, xenlulase, laccase- enzyme có thể phân hủy các hợp chất vòng thơm nên chúng được sử dụng trong phân hủy sinh học thuốc trừ sâu (DDT, PCB và lindane) và một số hóa chất độc hại

Trichoderma Aspergillus

Myrothecium

verrucaria

Mortierella

verticillata

(benzopyrene, dioxin, xianua, azides, CCl4 và Pentachlorophenol (PCP); trong phân hủy sinh học thuốc nhuộm Azo như amaranth, orange G, thuốc nhuộm dị vòng Azure B và thuốc nhuộm Lip; trong loại bỏ kim loại nặng từ nước thải sinh hoạt và nước thải công nghiệp: Hg, Cu, Ni, Pb, Cd (Bosso, 2014)

- Ngoài ra nấm được sử dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học: cellulase dùng

cho sản xuất các loại nhiên liệu lỏng thế hệ mới, trong công nghệ đồ uống nhờ enzyme

lactase- một thành viên trong họ β-glucosidase có khả năng phân hủy lactose thành glucose và galactose; Pectinase- sử dụng trong sản xuất sữa chua; trong sản xuất các loại mứt hoa quả cũng nhờ đến các loại enzyme từ nấm như pectinase hay cellulase,…( Hyde, 2019)

2.4.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, có một nghiên cứu trực tiếp về khả năng sinh các enzyme phân hủy xác thực vật từ các chủng nấm phân lập được từ xác thực vật Kết quả cho thấy hầu hết các chủng nấm phân lập từ xác thực vật có khả năng sinh ra một trong số các loại enzyme

này khả năng sinh enzyme phân hủy xác thực vật, tuy nhiên Aspergillus niger và Trichoderma, là những chủng có khả năng sinh enzyme cao nhất, đặc biệt chúng có khả

năng phân hủy một số xác thực vật trong tự nhiên như rơm, bã mía, (Lê Thị Phương Thủy 2008, Nguyễn Anh Tuấn và cs 2009, Lê Thị Hoàng Yến và CS, 2009, 2015) Các

tác giả đã nghiên cứu sâu và tinh sạch enzyme xylanase từ Aspergillus awamori F312, Aspergillus oryzae VTCC-F045 (Quyen T.H và cs 2010-2012, Do, T.T Pham,

Một số nghiên cứu khác lại cho rằng Phanerochaete chrysosporium có khả năng

phân hủy lignin tốt (Phạm Thành Hổ, Nguyễn Thị Thanh Kiều), chúng có khả năng phân

hủy một số loại gỗ thường dùng trong công nghệ giấy như tràm bông vàng (Callistemon

citrinus), keo tai tượng (Acacia mangium), bạch đàn (Eucalyptus globules), lồ ô (Bambusa variabilis)

Tuy nhiên cũng có một số nghiên cứu chỉ ra rằng enzyme phân hủy xác thực vật

được do một số loài nấm đảm sinh ra, chẳng hạn như Bjerkandera adusta, Trametes versicolor, Ganoderma aff.subtornatum (Lê Huy Hoàng và cộng sự Năm 2003), nấm chân chim Schizophyllum commune, nấm hương Lentinula edodes có khả năng phân hủy lignin tốt hơn, nấm bào ngư Pleurotus sajro-cajru và nấm mèo Auricularia (Đào Thị

Hóa chất cho nuôi cấy, phân lập, phân loại hình thái vi sinh vật:

K2HPO4; NaCl; (NH4)2SO4; CaCO3; FeSO4; MnCl2; ZnSO4; Pepton; KNO3; MgSO4.7H2O; KCl; NH4NO3; NaNO3; C2H12N2O6, CaCl2 , CuSO4.5H2O; MnSO4.H2O; EtOH, lactophenol, cao nấm men (Oxoid), sucrose; cao malt; dextrose; glucose; chloramphenicol, (Merk-Đức)

Hóa chất cho phân loại sinh học phân tử: Đệm Tris; CTAB; NaCl; EDTA;

ß-mercaptanol; CTAB, NaCl; Chloroform; Isoamyl alcohol; EtOH; Natri Acetate Đức), hạt thủy tinh (đường kính 0,2mm), nước MQ, Redsafe Nucleic Acid Staining, Dream Taq PCR Master mix,

(Merk-Mồi để nhân rDNA đoạn D1D2: Mồi xuôi NL1 (5’-

GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3’) (O’Donnell, 1993); Kít Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing và đệm 5X sequence (Perkin-Elmer Applied Biosystem); proteinase K;

dung dịch đệm dùng cho tách DNA; dNTP (QIAgen, Invitrogen, Đức), TaKaRa Ex Taq

Hot Start Version Kit (Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)

- Hóa chất cho nghiên cứu đặc tính enzyme protein của nấm:

Syringaldazine; xylan (Sigma); CMC (Nissui, Nhật); đỏ Congo (Nissui, Nhật), 3,4-Dimethoxybenzyl alcohol; Azo-Avicel; Azo-CMC; RBBR (Nissui, Nhật)…

3.1.2.2 Thiết bị

- Các thiết bị dùng trong nuôi cấy và phân loại nấm:

Que cấy làm bằng kim nhọn, kẹp pank, đèn cồn, ống nghiệm thủy tinh, bình tam giác (Việt Nam); đĩa Peptri nhựa kích thước 9 cm (Trung Quốc); lam kính, lamen (Nissui, Nhật), Băng dính Cacbon, Đĩa Palladium, cân điện tử- XT 2200C Pressisa (Thuỵ sĩ); nồi khử trùng- Lequex (Pháp); Tủ cấy vi sinh vật- Nuare (Mỹ); máy lắc thường- Gerhardt (Đức); máy lắc ổn nhiệt (Certomat BS-1, Đức); tủ ấm 37 oC- Mecmert (Đức); máy phá vỡ mẫu (Nhật); Máy voltex- VELP (Ý); Tủ lạnh- Sanyo (Nhật Bản); tủ sấy (Carbolite, Anh), máy đo quang phổ (Beckman Coulter, Mỹ); máy ly tâm lạnh- Centrifuge C30P Sartorius Group (Đức); Kính hiển vi quang học- Olympus BX-51(Nhật Bản); Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope) (JEOL JSM 6400)

- Thiết bị dùng cho phân loại vi sinh vật bằng phân tích trình tự gen:

Các loại Pipette 1,000, 200, 100, 20, 2 μl, đầu côn các loại; ống ly tâm 1,5 ml; máy ly tâm lạnh- Centrifuge C30P Sartorius Group (Đức); Máy điện di kiểm tra DNA, máy nhân đoạn DNA (PCR) (Gene Amp PCR system 9700; Applied Biosystem); Máy đọc trình tự tự động- ABI 3100 Avant (Mỹ);

- Thiết bị dùng trong phân tích enzyme: Máy đo quang phổ (BioSpectrometer

- Môi trường gạo- V8: Gạo : nước ép trái cây V8 tỉ lệ 1 : 1

3.2 PHƯƠNG PHÁP

3.2.1 Các phương pháp nghiên cứu enzyme phân hủy xác thực vật

3.2.1.1 Enzyme phân hủy cellulose và hemicellulose

 Sàng lọc bằng phương pháp đục lỗ thạch (Suto 2008):

Cấy điểm chủng nấm cần nghiên cứu vào môi trường thạch đĩa MEA, nuôi trong

tủ ấm 25 oC, từ 7-14 (300) ngày Dùng các ống nhựa vô trùng có đường kính 0,5 cm cắt phần thạch có chứa sợi nấm mọc tốt Đặt miếng thạch vừa cắt lên đĩa thạch có chứa 1%

cơ chất (CMC, xylan), sau đó đặt trong tủ ấm 37˚C trong 24 giờ Nhỏ 10 ml Lugol, đánh

giá hoạt tính enzyme bằng cách đo kích thước vòng phân giải (D-d, mm)

Trong đó D: đường kính vòng phân giải

d: đường kính lỗ thạch

 Định lượng hoạt tính cellulase và xylanase bằng phương pháp DNS (Suto 2008)

- Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường BCM chứa 1% lõi ngô và 1% wheat brand Sau 7 ngày thu dịch lọc làm dịch enzyme thô để đánh giá hoạt tính

- Các bước tiến hành đánh giá hoạt tính:

Dung dịch cơ chất 1%: 0.5g cơ chất (avicel hoặc CMC, sasilin, xylan) trong 40 ml

đệm Tris-HCl 50 mM, pH 7,2 Khuấy từ gia nhiệt đến lúc sôi sau đó khuấy đến khi nguội Bổ sung đệm đến 50 ml

 Chuẩn bị hóa chất

Pha dung dịch DNS: 10g dinitrosalicylic axit hòa tan trong 400 ml nước cất Sau

đó bổ sung từ từ 150 ml dung dịch NaOH (20 g/300 ml), khuấy nhẹ Giữ trong bể ổn

nhiệt 45°C, thỉnh thoảng lắc nhẹ và thêm vào 1.87 ml phenol, 0.5 g Na2SO4 và 200 g

K-Na tartrat tetrahydrat (Rochelle salt) Bổ sung H2O đến 1000 ml, lọc qua giấy và bảo quản trong bình kín tối màu (dung dịch bền màu trong 2 tháng)

 Dựng đường chuẩn:

- Lấy 2 mg/1ml đường D-glucoza (sấy khô ở 80˚C/3 giờ tới khối lượng không đổi) cho vào ống Falcol vô trùng, lắc đều dung dịch đường Pha loãng dung dịch D-glucoza chuẩn thành 9 dung dịch có nồng độ khác nhau như sau (0; 0.2; 0.4; 0.6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0)

- Lắc đều dung dịch pha loãng

- Cho 0,2 ml dung dịch ở mỗi ống nghiệm trên sang các ông mới

- Thêm 0,6 ml dung dịch DNS vào ống nghiệm trên, lắc đều

- Giữ ở nhiệt độ sôi trong 5 phút

- Làm lạnh nhanh trong dung dịch nước đá

- Pha loãng với 4,2 ml nước cất

- Đo sự hấp thụ ở bước sóng 500 nm

Thực hiện phản ứng thành 2 nhóm để thu kết quả chính xác nhất

- Dựng đường chuẩn với các giá trị đo OD trung bình cho mỗi nhóm phản ứng Phương trình đường chuẩn có dạng:

y = ax + b

R2=0.9868 x: giá trị đường khử hấp thụ ở bước sóng 500 nm

y: giá trị đo OD ở bước sóng 500nm

 Tiến hành phản ứng:

- Mẫu: Nhỏ 200 μl dịch enzyme vào ống eppendorff (1,5 ml), giữ 5 phút trong bể

ổn nhiệt 50 °C Bổ sung 200 μl cơ chất đã chuẩn bị như trên và đã được ủ ở nhiệt độ 50

°C Ủ trong máy trộn gia nhiệt 50 °C trong 1 giờ Ly tâm 5000 vòng/ phút trong 5 phút Lấy 0,2mL dịch nổi cho sang ống nghiệm khác Bổ sung 600 μl dung dịch DNS, đun sôi

5 phút và làm lạnh nhanh trên đá Đo độ hấp phụ ở bước sóng 550 nm

- Đối chứng âm: bổ sung dung dịch DNS vào dịch enzyme đã bất hoạt (đun sôi 10 phút), sau đó thêm cơ chất Các bước thí nghiệm tiến hành tương tự như trên

- Glucose được dùng làm chuẩn

- Một đơn vị enzyme (IU) được tính bằng lượng enzyme sinh ra để giải phóng 1 µMol đường khử trong một phút phản ứng

3.2.1.2 Enzyme phân hủy cellulose, hemicellulose có gắn vòng thơm (Thorn1993)

Dùng cơ chất Azo-CMC, Azo-Avicel và Azo-xylan bổ sung 1% vào môi trường PDA, khử trùng, đục lỗ thạch bằng ống hút vô trùng có kích thước 5mm

Các chủng nấm nghiên cứu được nuôi trên môi trường PDA, thu bào tử sau

7-14 (30) ngày nuôi cấy, hòa trong nước cất vô trùng ở nồng độ 108 bào tử/ml Nhỏ 100ml dung dịch bào tử vào môi trường chứa 1% cơ chất đã chuẩn bị phía trên Chuyển đĩa vào

tủ ấm 25 oC Quan sát sự chuyển màu cơ chất để định kết quả Nếu xung quanh giếng xuất hiện vòng trong thì chủng nghiên cứu có hoạt tính và ngược lại

3.2.1.3 Enzyme phân hủy lignin

Enzyme laccase: Nấm được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa LBM, sau 7-20

ngày, dùng ống nhựa vô trùng đường kính 0,5cm, tạo giếng trên bề mặt khuẩn lạc Hoạt tính laccase được nhận biết trên đĩa bằng cách nhỏ 0.1 mL dung dịch Syringaldazin (SGZ) 0.01% vào giếng vừa tạo Phản ứng âm tính: không xuất màu hồng Phản ứng dương tính: xuất hiện màu hồng (Leonowicz và cs 1981)

Enzyme MnP và LiP: tương tự như sàng lọc laccase, tuy nhiên có sự khác ở bước

khi nhỏ dung dịch SGZ, nhỏ thêm vài giọt dung dịch H2O2

Sàng lọc hoạt tính lignolytic của nấm trên môi trường có RBBR 0,01% (Kátia và

cs 2005, Kuma và cs 2011): Dùng ống nhựa vô trùng đường kính 5mm cắt phần thạch có

sợi nấm mọc tốt, chuyển miếng thạch sang đĩa môi trường MEA chứa 0,01% RBBR (màu xanh) Các đĩa được ủ ở 30°C trong 14 ngày Các chủng nấm có hoạt tính ligninolytic sẽ làm mất màu xanh của RBBR

Sàng lọc hoạt tính lignolytic của nấm trên môi trường có RBBR 0,025% (Kátia và

cs 2005, Kuma và cs 2011): Những chủng có hoạt tính ở lần 1 được nuôi trên môi trường

MEA chứa RBBR 0,025%

3.3 Phân loại nấm sợi

3.3.1 Phân loại nấm sợi bằng quan sát hình thái

3.3.1.1 Quan sát khuẩn lạc và cấu trúc sinh bào tử dưới kính hiển vi thường

 Quan sát các đặc điểm khuẩn lạc

Dùng que cấy, cấy điểm chủng nấm cần nghiên cứu vào môi trường thạch đĩa LCA, PDA Đặt đĩa nuôi cấy trong tủ ấm 25 oC, trong 7-14 (30) ngày (Seifert và cs, 2011), quan sát các đặc điểm khuẩn lạc (kích thước, màu sắc khuẩn lạc; màu sắc mặt trái

khuẩn lạc; sự hình thành giọt tiết, sắc tố ra ngoài môi trường, ) và các đặc điểm vi học của chúng

- Nấm được cấy trên môi trường thạch đĩa LCA, ở nhiệt độ 250C từ 1-2 tuần

- Quan sát trục tiếp khuẩn lạc dưới kính quang học ở độ phóng đại 200 lần

- Nhỏ một giọt xanh cotton blue 0.1% (hoặc nước vô trùng, hoặc lactophenol) lên lam kính

- Dùng kim nhọn đã khử trùng bằng đèn gas, lấy trên bề mặt thạch một miếng chứa khuẩn lạc có kích thước khoảng 0,2 mm x 0,2mm rồi chuyển sang lam kính Đặt lamen lên, quan sát dưới kính quang học ở các vật kính có độ phóng đại 400 lần và 1000 lần

- Đo kích thước, và chụp ảnh hình thái cấu trúc các cơ quan sinh sản của nấm Sau

đó so sánh với khóa phân loại của các tác giả uy tín trên thế giới như Ingol, 1942; Matsushima 1975,1996; Ando và CS 1984; Nawawi, 1998; Seifert 2011,… tìm ra sự tương đồng giữa hình ảnh của chủng nấm cần phân loại và hình ảnh trong sách, từ đó đưa

ra kết luận

Ý nghĩa của phương pháp: Phương pháp này dùng để phân loại đến chi, thậm

chí là đến loài các chủng nấm có khả năng sinh bào tử trần, đặc biệt là nhóm nấm Hyphomycetes

3.2.3.2 Quan sát hình thái cơ quan sinh bào tử của nấm dưới kính hiển vi điện tử quét (Samson và cs 1979)

bằng inox, giấy thấm, giấy cacbon, kẹp nhọn đầu,…

Cách làm

Chủng nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường phân loại (LCA, PDA) và quan sát

sự hình thành khuẩn lạc sau 7 ngày- 2 tuần (thậm chí là 1 tháng đối với chủng nấm có khả năng sinh trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy) Cắt khuẩn lạc thành những miếng nhỏ kích thước 2 x 2mm; cố định bằng dung dịch OsO4 1% ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ Sau đó làm mất nước bằng ethanol ở các nồng độ khác nhau (10, 30, 50 và 100%) và cuối cùng thay thế bằng dung dịch Ethanol: isoamyl acetate ở các nồng độ khác nhau như đã chuẩn bị ở trên Mẫu được làm khô bằng cacbon dioxit lỏng trên thiết bị làm khô mẫu (HCP-2: Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) Mẫu sau đó được phủ 1 lớp phủ bằng bạch kim pallatium bằng máy (JUC-5000: JEOL, Tokyo, Nhật Bản) và cuối cùng mẫu vật được quan sát dưới SEM ở điện áp 15 kV (JEOL JSM 6400)

Ý nghĩa của phương pháp: Phương pháp này khá tốn kém, nhưng lại có thể quan

sát mẫu vật ở độ phóng đại lên tới 10000 lần, vì vậy có thể quan sát được những cấu trúc

có kích thước nhỏ bé (0,1- 1 µm), nên có thể dùng để quan sát 1 cấu trúc sinh sản nào đó của nấm mà kính hiển vi thường không quan sát được

3.2.4 Phân tích trình tự rDNA ITS/ 28S đoạn D1D2 của nấm

+ Tách DNA cho phản ứng PCR (O’Donnell 1993)

Chuẩn bị hóa chất:

Dung dịch đệm phá tế bào (100mL): Tris 0.1M, pH 7.5-10 ml; 1% CTAB-1 g; NaCl 0.7M-14 ml; EDTA 10mM- 2 ml (of 0.5M stock); 1% ß-mercaptanol- 1 ml (trong trường hợp cần thiết), nước MQ 73mL

Cách làm:

Cho 100 µl đệm phá tế bào và 100 µg hạt thủy tinh (đường kính 0,2mm) vào ống eppendoff 1,5 ml, sau đó cho khoảng 100mg sinh khối nấm vào ống, dùng dụng cụ chuyên dụng nghiền nát sợi nấm, vortex dung dịch thành dạng huyền phù Thêm 1/10 thể tích proteinase K 20mg/mL, đảo nhẹ nhàng, ủ 600C trong vòng 60 phút Làm lạnh trên

đá, sau đó cho thêm 1:1 thể tích hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ nhàng, ly tâm lạnh 15000 vòng/phút trong 15 phút Hút phần dịch trong, cho sang ống Eppendoff mới Cho thêm 1:1 thể tích EtOH 100% và 1/10 thể tích natri acetate 3M, để -

200C trong 20 phút Ly tâm lạnh 15000 vòng/phút trong 10 phút, thu kết tủa Rửa sạch

kết tủa bằng cách cho EtOH 70% vào, ly tâm lạnh 15000 vòng/ phút trong 5 phút, bỏ dịch, thu kết tủa (lặp lại 3 lần) Làm khô DNA bằng cô quay chân không trong 3-5 phút hoặc để khô tự nhiên Hòa tan tủa trong nước MQ, để -200C trước khi sử dụng

- Mồi cho nhân đoạn rDNA 28S đoạn D1D2:

Mồi xuôi NL1: 5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG -3’

Mồi ngược NL4: 5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3’

- Mồi cho nhân đoạn ITS:

Mồi xuôi ITS1: 5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

Mồi ngược ITS4: 5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: Trước hết DNA bị biến tính thành sợi đơn ở

95oC trong 3 phút; Sau đó DNA được nhân đoạn ở 30 vòng, chu trình nhiệt như sau: (1) giai đoạn biến tính DNA thành sợi đơn ở 95oC trong 30 giây, (2) giai đoạn bắt cặp- các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của DNA đích: 55oC trong 30 giây, (3) cuối cùng nhiệt độ được nâng lên mở rộng 72oC trong 1 phút- nhiệt độ thích hợp cho ezyme

Taq polymerase hoạt động); kết thúc nhân đoạn DNA: nâng nhiệt độ lên 72o trong 5 phút, sau đó giảm xuống 4oC, giữ mẫu ở nhiệt độ này

- Kiểm tra các sản phẩm PCR trên gen agarose

- Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit của QIAgen (Invitrogen, Đức)

- Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu: Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ khả kiến

ở các bước sóng 260 và 280 Tính tỷ lệ tinh sạch: OD 260/OD280 > 1,7 -1,8

+ Phản ứng khuếch đại DNA cho sequencing

Các sản phẩm PCR tinh sạch được khuếch đại với bộ kít Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) và 2 đoạn mồi NL1 và NL4 trên máy

GeneAmo PCR System 9700 (Applied Biosystems), với chu trình nhiệt như sau: Đầu tiên AND bị biến tính thành sợi đơn ở 96oC trong 2 phút; Sau đó DNA được nhân đoạn ở 25 vòng, chu trình nhiệt như sau: (1) giai đoạn biến tính DNA thành sợi đơn ở 96oC trong 10 giây, (2) giai đoạn bắt cặp- các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của DNA đích: 50oC trong 5 giây, (3) cuối cùng nhiệt độ được nâng lên mở rộng 60oC trong 1 phút-

nhiệt độ thích hợp cho ezyme Taq polymerase hoạt động); kết thúc nhân đoạn DNA:

nâng nhiệt độ lên 72o trong 5 phút, sau đó giảm xuống 4oC, giữ mẫu ở nhiệt độ này Khác với nhân đoạn sản phẩm rDNA ở trên, sản phẩm nhân đoạn rDNA cho sequencing lúc này được sản phẩm là các đoạn DNA đơn được duỗi ra

+ Tinh sạch sản phẩm cho sequencing:

Mẫu được chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml Thêm 5µl EDTA 1,25 M, thêm 60µl ethanol 100% Trộn nhẹ nhàng Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút Đổ bỏ dịch phía trên Rửa bằng 10 µl ethanol 70% Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút Làm khô mẫu bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút

+ Đọc trình tự DNA

Trình tự của đoạn D1/D2 rDNA 28S của chủng nấm được đọc trực tiếp trên máy

đọc trình tự tự động 3100 Avant Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của

các loài đã được xác định trong ngân hàng gen

Xây dựng cây phân loại sử dụng phần mềm Cluxstal phiên bản 1.83 và NJ tree hoặc MEGA X (Kumar 1984 và Saito 1987)

Ý nghĩa của phương pháp: Đây là phương pháp quan trọng trong phân loại nấm

Tuy dữ liệu về các đoạn trình tự gen cấu trúc dùng để phân loại nấm trong ngân hàng gen còn chưa được đầy đủ, nhưng việc phân tích trình tự rDNA đoạn 28S và 18 của các chủng nấm cần phân loại cũng đưa ra được thông số cần thiết để phân loại đến chi, loài Thông thường nếu độ tương đồng giữa chủng nấm nghiên cứu với chủng nấm gần gũi nhất trên ngân hàng gen bank < 98% thì đã có thể có gợi ý rằng đó là một chi hoặc loài mới (Seifert và cs, 2011)

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Đánh giá khả năng sinh enzyme phân hủy ligninolytic của các chủng nấm phân lập

4.1.1 Đánh giá khả năng sinh enzyme CMCaza và xylanase

Từ 500 chủng nấm phân lập được từ lá cây rụng thu thập được ở các vườn Quốc gia Phú Quốc và Mã Đà Việt Nam, đã được sàng lọc khả năng sinh enzyme CMCaza, xylanase: enzyme CMCaza, xylanase thông qua phương pháp đục lỗ thạch, đo vòng phân giải cơ chất (CMC và xylan) Kết quả được trình bày trên Bảng 4.1, Hình 4.1,2

Bảng 4.1 Khả năng sinh enzyme phân hủy xác thực vật của các chủng nấm được

Hình 4.2 Khả năng phân hủy CMC và xylan của các chủng nấm bằng phương pháp đặt

Các chủng nấm này được nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy lắc BCM chứa 1% lõi ngô và 1% wheat brand, ở nhiệt độ 30 oC, trong vòng 5 ngày Thu dịch nuôi cấy, thử hoạt tính β-glucosidase, xylanase như trong mô tả trong phần phương pháp Kết quả được thể hiện trên Bảng 4.2

Bảng 4.2 Hoạt tính β-glucosidase và xylanase của 35 chủng nấm được lựa chọn

ST

T Kí hiệu chủng

Loài gần gũi có

độ tương đồng cao nhất

Độ tương đồng Tên khoa học

Hoạt độ enzyme (U/mg)

glucosidase Xylanase

β-1 VN08-Fβ-1054

Trichoderma harzianum

100 Trichoderma

sp 17,8 ± 0.05 68,4 ± 0.02

2 VN08-F1063

Fusarium nygamai

4 VN08-F1083 Fusarium solani 100 Fusarium sp 49,2 ± 0,05 40,7 ± 0.04

5 VN08-F1085

Trichoderma reesei

48,5 ± 0.003

100 Trichoderma

sp 50,2 ± 0,05 47,6 ± 0,02

T Kí hiệu chủng

Loài gần gũi có

độ tương đồng cao nhất

Độ tương đồng Tên khoa học

Hoạt độ enzyme (U/mg)

glucosidase Xylanase

12 VN09-F1146

Trichoderma spirale

100 Trichoderma

sp 11 ± 0,06

37,1 ± 0.002

13 VN09-F1147

Trichoderma spirale

100 Trichoderma

sp 21,4 ± 0,12 22,3 ± 0.05

14 VN09-0054

Aspergillus flavus

100

Aspergillus sp 22,1 ± 0,0 34,7 ± 0.05

15 VN09-0055

Aspergillus flavus

18 VN09-0066

Fusarium solani 100

Fusarium sp

15,1 ± 0,003 22,1 ± 0.09

19 VN09-0067

Aspergillus versicolor

100

Aspergillus sp 2,4 ± 0,004 29,7 ± 0.03

20 VN09-0068

Aspergillus assiutensis

100

Aspergillus sp 6,7 ±0,001 34,7 ± 0.04

21 VN09-0069

Trichoderma atroviride

100 Trichoderma

sp 14,3 ± 0,03 33,5 ± 0.07

22 VN09-0072

Aspergillus assiutensis

100

Aspergillus sp 5,9 ± 0,04 22,4 ± 0.03

23 VN09-0074

Fusarium incartum

100

Fusarium sp 34,2 ± 0,04 19,4 ± 0.01

24 VN09-0076

Aspergillus assiutensis

100 Aspergillus

sp 12,1 ± 0,05 21,1 ± 0.02

25 VN09-0077

Fusarium nelssonii

100

Fusarium sp 9,7 ± 0,05 11.2 ± 0.03

26 VN09-F0078

Trichoderma aethiopicum

29 VN09-F0094 Fusarium solani 100 Fusarium sp 11 ± 0,04 33.0 ± 0

30 VN09-F0095

Aspergillus toxicarius

100

Aspergillus sp 11,9 ± 0 11.1 ± 0

31 VN11-F0091

Trichoderma erinaceum

100 Trichoderma

sp 15,7 ± 0,03 22.1 ± 0.01

32 VN11-F0092

Trichoderma aethiopicum

100 Trichoderma

sp 48,3 ± 0,05 22.3 ± 0.03

33 VN11-F0093

Trichoderma erinaceum

Kết quả phân tích hoạt tính β-glucosidase và xylanase cho thấy, các chủng nấm có hoạt tính cao trên môi trường thạch đĩa thì có thể phát hiện được các hoạt tính này khi

nuôi cấy dịch thể Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Trichoderma reesei

QM9141- để làm đối chứng dương Đây là chủng nấm đã được nghiên cứu rất kỹ về hoạt tính CMCaza và xylanase (Hrmová, 1986), ngoài ra chúng còn được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu khác như một chủng chuẩn để tham khảo hoạt tính cellulase và xylanase của nấm (Ghosh và Nanda 1994)

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, trong số 35 chủng nấm phân lập được

ở Việt Nam, có duy nhất chủng VN09-F119 là có hoạt tính xylananse cao hơn hẳn chủng đối chứng QM9141, hoạt tính xylanase của VN09-F119 đạt 117 U/mg, trong đó chủng đối chứng chỉ có 27,3 U/mg

Xét về độ đa dạng các chi nấm có khả năng phân hủy CMC và xylan, Aspergillus, Fusarium và Trichoderma là ba chi nấm có khả năng phân hủy CMC và xylan cao (Bảng 4.2) Có 8/35 (22,86 %) chủng nấm Aspergillus, 11 (31,43%) chủng Fusarium và 13/35 (37,14%) chủng Trichoderma có khả năng sinh xylanase và cellulase cao Ngoài ra các chi Penicillium, Chalara và Chloridium cũng là các chi có khả năng sinh cellulase và

xylanase cao, tuy nhiên chỉ có 01/35 chủng nấm nghiên cứu Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu trước đó (Lê Thị Hoàng Yến và cs 2009, Lê Thị Phương Thủy 2009, Pham T.H và CS 2010-2012, Do, T.T 2012, Nguyen, H.Q và Quyen, D.T 2010,…)

Hình 4.3 Đa dạng thành phần và số lượng các chủng nấm có khả năng sinh

cellulase và xylanase cao

4.1.3 Đánh giá khả năng phân hủy cellulose có vòng thơm của các chủng nấm lựa

chọn

Cả 35 chủng nấm có khả năng sinh cellulase và xylanase cao (Bảng 4.2) tiếp tục được đưa ra nghiên cứu để lựa chọn khả năng phân hủy CMC, Avicel và xylan có gắn hợp chất vòng thơm Azo bằng phương pháp cấy trực tiếp các chủng nấm trên môi trường thạch PDA có bổ sung 0,1% Azo-CMC, Azo-Avicel và Azo-xylan Kết quả được trình bày trên Bảng 4.3

Bảng 4.3 Khả năng phân hủy các hợp chất CMC, Avicel và xylan gắn vòng thơm

Azo-CMC Azo-Avicel Azo-xylan