Nghiên cứu sàng lọc sơ sinh bệnh thiếu enzym glucose 6 phophat dehydrogenase tại bvđk melatec

Phân tich két qua sàng lọc một số trường hợp thiếu hụt enzyme G6PD từmầu máu gót chân tre sơ sinh.... Cùng như các rối loạn liên quan đến di truyền khác, bệnh thiểu enzyme G6PD chưa có p

TẠ THỊ LAN ANH

TẠI BỆNH VIỆN DA KHOA MEDLATEC

Chuyên ngành: Y sinh học di truyền

Mà sổ: 8720101

LUẬN VÀN THẠC SỶ Y HỌC

CÁN BỌ HƯỚNG DÂN KHOA HỌC

1 TS Đoàn Thị Kim Phượng

2 TS Trịnh Thị Quế

HÀ NỘI - 2023

Dê hoàn thành luận vãn này tôi xin bày tó lòng biết ơn chân thành tới Hun giảm hiệu, phòng Dào tạo Sau đụi học trưởng (tụi học Y ỉ là Nội dà tạo (liều kiện thuận lợi cho tói trong suot quá trình học lộp và hoàn thành luận vãn.

7oi xin bày tó lòng kinh trọng và biểt ơn sâu sắc tởi toàn thè càc thầy cò

Bộ môn Y sinh học - Di truyền trường Dại học Y Hà Nội đà dạy dồ tụo diều kiện cho tôi trong suốt quà trinh học lập và nghiên ci'ru.

Tôi xin bày lo lỏng kinh trọng và biết ơn sâu sắc lời 7'S Doãn Thị Kim Phượng TS Trịnh Thị Ọuề hai người cỏ luôn định hướng cho tôi trong nghiên cừu truyền dạy cho tòi kiên thức khoa học và cuộc song Sự dộng viên, giùp dờ

và diu dắt cua các có dã giũp lòi cò thèm nghị lực dê vượt lẽn những khô khàn

và hoàn thành nghiên cứu này.

Tòi xin chân thành cám ơn Han giám doc và tập thê cân bộ nhãn viên Trung tâm xét nghiệm Bệnh viện Da khoa Medlatec dã tạo diêu kiện thuận lợi cho tôi trong suổt quà trinh hục tập và làm luân vãn.

Tõì xin chùn thành cam ơn các Thầy cô trong Hội dồng dà dọc và dông góp nhiều ỳ kiên quý báu cho ban luận vãn này.

Cuắi cùng vời những lình cam dặc biệi nhai, lòi xin bày ló lòng biết ơn sâu sac lởi gia dinh, bạn bè và dâng nghiệp, dà luôn dộng viên khích lự và giúp

dờ tôi trong SUÔI quá trình học tập và nghiên ciru.

Hà Nội ngàv 09 tháng 1J năm 2023

Tòi là Tạ Thị Lan Anh.hục viên Bác sĩ nội trú khoá 46 chuyên ngành Y sinh học di truyền, xin cam doan:

I Đây là luận vãn do bán thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dần cùa TS Đoàn Thị Kim Phượng và TS Trịnh Thi Que

2 Nghiên cứu này không trùng lập vói bất ki nghiên cứu nào khác dà dược cõng bỗ tại Việt Nam

3 Các số liệu và thòng tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chinh xãc trung thực và khách quan

Tòi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này

Hà Nội ngày 09 thảng 1J nãm 202Ỉ

Tác giã luận vân

DẠT VÁN DÈ 1

CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I I Cơ sờ sinh hóa và di truyền cua bệnh thiều enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase 3

1 1.1 Cơ sư sinh hóa và sinh lý của bệnh thiếu enzyme G6PD 3

1 1.2 Cơ sơ di truyền cùa bệnh thiếu enzyme G6PD 6

1.2 Chân đoán và điều trị bệnh thicu enzyme G6PĐ 11

1.2.1 Chấn đoán 11

1.2.2 Diều trị 13

1.2.3 Phòng bệnh 13

1.3 Sàng lọc sơ sinh bệnh thiếu enzyme G6PD 14

1.3.1 Các yếu tổ nguy cơ ánh hường den ket qua sàng lọc sơ sinh bệnh thiếu enzyme G6PD 14

1.3.2 Một sỗ kỳ thuật phát hiện thicu enzyme G6PD 16

1.3.3 Chương trinh sàng lục sơ sinh ớ nước ngoài và Việt Nam 17

1.4 Một sô kỳ thuật di truyền xác định đột biến gen G6PD 21

1.4.1 Kỳ thuật PCR vã một sỗ biển the cua PCR 21

1.4.2 Kỳ thuật giái trinh lự Sanger 22

1.4.3 Kỳ thuật giài linh tự thế hệ mới NGS 22

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ DOI TƯỢNG NGHIÊN CỬƯ 25

2.1 Địa diêm và phương pháp nghiên cửu 25

2.2 Đổi tượng nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cữu 25

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.3.2 Tinh cỡ mẫu 25

2.3.5 Kỳ thuật sứ dụng đê xét nghiệm bệnh thiếu enzyme G6PD 30

2.4 Nhập và phân tich so liệu 32

2.4.1 Nhập sổ liệu 32

2.4.2 Xứ lý số liệu 32

2.4.3 Sai số và khổng chế sai sổ 32

2.5 Đạo đúc trong nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3: KẼT QUÁ NGHIÊN cửu 34

3.1 Dặc diêm chung VC đối tượng nghiên cứu 34

3.1.1 Đặc diem cân nặng khi sinh 34

3.1.2 Dặc diêm về giới tính 35

3.1.3 Đặc diêm số ngày tuôi cua tre được lẩy mầu xét nghiệm sàng lọc sơ sinh 35

3.1.4 Dặc diem VC dân tộc 37

3.1.5 Dặc diêm về tuồi mẹ 37

3.2 Một số yếu tố anh hương đến sàng lọc sơ sinh bệnh thiếu enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase 39

3.2.1 Mồi lién quan giữa giới tinh và hoạt độ enzyme G6PD ớ các ngưỡng nguy cơ 39

3.2.2 Mổi liên quan giừa cân nặng khi sinh và hoạt độ enzyme G6PD ơ các ngưỡng nguy cơ thiếu enzyme G6PD 40

3.2.3 Mối liên quan giừa tuổi được sảng lọc và hoạt độ enzyme G6PD ở các ngưỡng nguy cơ thiếu enzyme G6PD 42

3.2.4 Mối liên quan giữa dàn tộc và hoạt độ enzyme G6PD ờ các nguy cơ thiểu enzyme G6PD 44

3.3 Phân tích kết quá sàng lục một số trường hợp thiếu enzyme G6PD từ mẫu máu gót chán tre sơ sinh 45

4.1 Đặc điếm đối tượng nghiên cứu 504.2 Khao sát một sổ yểu tố liên quan với nguy cư thiếu enzyme G6PD ư tre

sơ sinh 514.2.1 Mối liên quan giữa giới tinh và hoạt độ enzyme ờ các ngưởng nguy

cơ thiều G6PD 514.2.2 Mổi tương quan giữa cân nặng dược sàng lục và hoạt độ enzyme ớcác ngưởng nguy cơ thiêu G6PD 524.2.3 Mỗi liên quan giừa tuỏi được sàng lọc và hoạt độ enzyme ớ các ngưởng nguy cơ thiếu G6PD 544.2.4 Mổi liên quan giữa dân tộc và hoạt độ enzyme ờ các ngưỡng nguy

cơ thiếu G6PD 554.2.5 Mối liên quan giừa tuỏi mẹ và nguy cơ thiều enzyme G6PD 564.3 Phân tich két qua sàng lọc một số trường hợp thiếu hụt enzyme G6PD từmầu máu gót chân tre sơ sinh 574.4 Hạn che cùa nghiên cứu 69

KÉT LUẬN ••••••••••••■••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••■••••••••••a 70

KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHÁO

PHỤ LỤC

6PGD 6-Phosphogluconate Dehydrogenase

CNSHA Chronic nonspherocytic hemolytic anemia

Tan mâu mạn linh hồng cầu không trônddNTP dideoxynucleotide triphosphate

lư/ư International Unit/ Unit: dơn vị đo lường quốc tế

NADP- Nicotinamid dinucleotide phosphate

NADPH Nicotinamid dinuclcotidc phosphate khứ

NGS Next-generation sequencing Giai trinh tự thế hệ mới

RBC Red blood cell: Tổ bào hồng cầu

sàng 8

Bang 1.2 Các dạng đột biến cua các biến the G6PD 9

Bang 2.1 Các mầu máu đạt chuấn và không dạt chuắn trong lấy mầu máu gỏt chân 28

Bang 2.2 Các biến số cua mục tiêu I trong nghiên cửu 29

Bang 2.3 Các biền sổ cua mục tiêu 2 trong nghiên cứu 29

Bang 3.1 Đặc diêm về cân nạng 31

Báng 3.2 Đặc diêm về giới tinh 35

Bang 3.3 Đặc diêm ve tuổi lẩy mầu 35

Bảng 3.4 Đặc diem về dân tộc 37

Băng 3.5 Dặc diem ve tuổi mẹ 37

Bang 3.6 Mối liên quan giữa giới tinh và hoạt độ enzyme G6PD 0 các ngưởng nguy co thiêu enzyme G6P 39

Bang 3.7 Moi liên quan giửa cán nặng khi sinh và hoạt độ enzyme G6PD ứ các ngường nguy cơ thiếu enzyme G6PD 40

Bang 3.8 Moi liên quan giữa tuôi được sàng lọc và hoạt độ enzyme G6PD ờ các ngưỡng nguy cơ thiếu enzyme G6PD 42

Bang 3.9 Mối liên quan giừa tuồi dược sàng lọc và hoạt độ enzyme G6PD trung binh ơ nhóm ngày tuồi lẩy mầu 43

Bang 3.10 Mồi liên quan giữa dân tộc và hoạt độ enzyme G6PD ờ các nguy cơ thicu enzyme G6PD 44

Bang 3.11 Mỗi liên quan giửa tuồi mẹ vã hoạt độ enzyme G6PD 45

Bang 3.12 Hoạt độ enzyme G6PD trong màu máu thâm khô cùa tre sơ sinh dược sàng lộc 45

Bang 3.13 Hoạt độ G6PD máu gót chân và máu tình mạch cua một số tre trong nhóm nguy cơ cao 46

Bang 3.14 Đặc diêm lâm sang vã kiêu gcn tương ứng cùa một số tre có nguy cư cao thicu enzyme G6PD 47

Bang 4.1 Một sổ dột biền dà đirợc ghi nhận trên các dân tộc ớ Việt Nam 62

Biêu đồ 3.1 Ngày tuồi lấy mầu cua tre sơ sinh trong nghiên cứu 36

Biêu đồ 3.3 Phân bố hoạt độ enzyme G6PD trong các nhóm cân nặng dược

kháo sát 41

Hình 1.1 Vai trò cua enzyme Glucosc-6- phosphate Dehydrogenase trong

việc chống lại tôn thương oxy hóa 5Hĩnh 1.2 Vị tri cúa gen G6PD trên NST giới tinh X 7Hình 1.3 Cơ chế di truyền gen liên kết nhiễm sắc thê X cùa bệnh thiếu

enzyme G6PD 8Hình 1.4 Những dột biền thưởng gặp nhất trên khung đọc cua gen G6PD

10Hình 1.5 Sơ dồ tham khao các bước sàng lọc sơ sinh bệnh thiều enzyme

G6PD 20Hĩnh 2.1 Vị tri lấy máu gót chân cho tre sơ sinh 27Hình 2.2 Nguyên lý kỳ thuật huỳnh quang định lượng xác định hoạt độ

enzyme G6PD 30Hình 3.1 Pha hộ cua gia đình người bệnh mả 151122-1940014054 49Hĩnh 4.1 Sự tác động cua đột biến G6PD Union đến chức náng cua enzyme

G6PD 66Hĩnh 4.2 Giông hàng trinh tự acid amin quanh vị tri dột biên ơ 1 số loài bang

phần mềm Cluslal Omega 67Hinh 4.3 Nguy cơ di truyền gen bệnh cho con cua gia dinh người bệnh mà

151122-1940014054 68

ĐẠT V ÁN DÈ

Thiếu enzyme Glucose-6-phosphate Dehydrogenase (G6PD) là một bệnh lý roi loạn chuyên hóa enzyme ớ người, di truyền liên kct vái nhiễm sac the giới tinh X

Trên thế giới, ước tinh khoang 4.9% dàn số mắc bệnh thiếu enzyme G6PD tương ứng vói khoang hơn 500 triệu người, 7% dân số the giới bị ánh hương?" Bệnh xây ra ờ tre sơ sinh trên mọi lục địa mồi năm khoang 11 triệu tre sơ sinh thiêu enzyme G6PD được sinh ra? * Sự phân bố địa lý cua bệnh tương quan chặt chê với ty lệ lưu hành bệnh sốt rét, vi thiếu hụt G6PD bao vệ chống lại bệnh sốt rét? Hơn 33% gánh nặng sửc khoe toàn cầu do tang bilirubin máu lã kết quả cùa thiếu enzyme GÓPD 4

Ớ tre sơ sinh, thiều enzyme G6PD làm tăng nguy cơ với vàng da bệnh lý

do tang bilirubin trong máu Nồng dụ cao bilirubin tự do huyết thanh có thê vượt qua hàng rào máu não và dần đen một loạt các rối loạn thần kinh, bao gồm bệnh nào cấp tinh do bilirubin gây ra kemicterus (bệnh nào do bilirubin mụn tinh - vâng da nhãn nào) vã thậm chi tư vong? Biến chứng vãng da nhân nào nểu cỏ qua khỏi cũng dè lại di chứng chậm phát triển tàm thân vận dộng, và trờ thành gánh nặng cho ca gia dinh và xà hội Nhờ sự tiến bộ cua khoa hục các phương pháp sàng lọc hiện nay cõ hiệu qua cao, chi phi re thời gian nhanh chóng Cùng như các rối loạn liên quan đến di truyền khác, bệnh thiểu enzyme G6PD chưa có phương pháp diều trị đặc hiệu, nều dược chân đoản sớm và diều trị kịp thời, chúng ta có thê hạn chế được các biến chửng, giúp tre phát triển bình thường

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về sàng lọc sơ sinh bệnh thiếu enzyme G6PD Một nghiên cứu thu thập dữ liệu ở các trung tâm sàng lọc sơ sinh tại Trung Quốc trong vòng 4 năm (2013-2017) với ty lệ sàng lọc lã 82-83% cho thấy ty lệ

Bangkok Thái Lan cho thấy ty lệ thiếu enzyme G6PD là 11.1% ơ nam và 5.8%

o nừ.9 Nước la dà có một sổ còng trinh nghiên cứu VC sàng lọc thiếu enzyme G6PD

ớ tre so sinh tại các khu vực khác nhau Theo kết qua nghiên cứu cua Trần Thị Chinh Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sụ cho thấy tỷ lệ thiếu enzyme G6PD ờ người Kinh I là Nội và quanh I lả Nội là 1,75%.10

Ớ Việt Nam chương trình sàng lọc sơ sinh bệnh thieu enzyme G6PD dược dưa vào thi diêm tại I là Nội nám 2000 và dược dưa vào triển khai tại Bệnh viện Nhi trung ương và Bệnh viện Từ Dù Tử năm 2015, chương trinh sàng lọc

sơ sinh bệnh thiều enzyme G6PD dã được mớ rộng triển khai tròn cà nước tại nhiều cơ sơ y tế nhưng các nghiên cứu vè sàng lọc sơ sinh dồi với bệnh thiếu enzyme G6PD vần còn nhiêu hạn chế về các báo cáo kết quá sàng lọc Vậy nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu dè tài: “Nghiên cứu sàng lọc sơ sinh bệnh thiểu enzyme Glucose-6 pliosphat Dehydrogenase tại Bệnh viện Da khoa Medlatec” với hai mục tiêu:

/ Kháo sút một xổ yểu tổ anh hưởng đến hoạt dộ enzyme Gỉucose-6- phosphat Dehydrogenase từ mầu mâu gót chân trê sư sinh.

2 Phân tích kết lỊUỚ sàng lọc một số trưởng họp thiều hụt enzyme G6PD từ mầu mâu gót chân trè sư sình.

CHU ƯNG 1

1.1 Cơ sớ sinh hóa và dỉ truyền của bệnh thiểu enzyme

Thiếu enzyme Glucose-6-phosphat Dehydrogenase (G6PD) là một bệnh

di truyền do đột biến gcn liên kết nhiễm sac the (NST) giới tinh X lãm giám hoạt độ G6PD cua hồng cầu gây nên hậu qua tan máu khi có một số tác nhân oxy hóa như đậu tầm thuổc chồng sổi rét

/././ Cư sớ sinh hóa ràsinh lý ciia hệnh thiển enzyme G6PD

1 ì.i.ì Cân trác và cơ chê hoạt đụng cua enzyme G6PD

Enzyme G6PD ờ người là enzyme có cẩu trúc bậc 4 phức tạp cấu tạo bới nhiều monomer Mỗi monomer gồm 515 axil amin, có trọng lượng phàn tư khoang 59 kDa./; ;' Enzyme G6PD hồng cầu người có hai dục tinh cơ ban là tính không đồng nhất và lính chuyến dạng phân tứ G6PD có the tồn tại dưới nhiêu dụng như: monomer, dimer, trimer tetramer và hexomer Các cấu trúc nãy cỏ thê chuyên dạng lần nhau trong điều kiện invitro tuy nhiên dạng monomer không xuất hiện ớ diều kiện sinh lý dạng hoạt dộng là dimer và tetramer Độ pll vã nồng độ ion cao sè chuyền trạng thái cân bang ve phía dimer, trong khi diêu kiện pH thấp gãy ra sự chuyên dịch vê phía tetramer, các monomer không hoạt dộng cũng có thê được hình thành ờ pH cao.p Hình anh hiên vi diện tư cho thấy rằng tetramer chiếm ưu thể dưới pH 6 và dimer chiếm

ưu the trên pH 8.75

G6PD là một enzyme then chốt mơ đầu và diều khiên tốc dụ cùa con dường Hexose monophosphate (HMP) Con dường HMP là con dường oxy hóa glucose xay ra song song với dường phân trong tai ca các mô, song ty lộ thấp hơn nhiều(5-10%)./0 Con dường này tuy không cung cấp nhiều nàng lưọng

nhưng cung cắp nhiều NADPH vã ribosc cần thiết cho quá trình tồng hợp DNA

ơ hồng cầu và một số mó khác, dặc biệt là nhùng tế bão thiếu ty thề thi con dường HMP lại chiếm ưu thế Trong con đường này enzyme G6PD với coenzyme là NADP+, xúc tác quá trinh oxy hóa glucose ố-phosphate (GÓP) thành ỗ*pho$phoglucono-cMactonc và tạo ra NADPH?7 Trong hầu hết các tế bão cùa cơ the con người NADPH lã chất cho điện tứ quan trọng cần thiết cho nhiêu quá trinh sinh tông hợp bao gôm một so phan ứng trong con đường tông hợp axit béo tông hợp cholesterol vã hormone steroid Ngoài ra NADPH tham gia vào quá trinh khứ các chẩt oxy hóa cùa te bào Vi te bào hồng cầu vận chuyến oxy bàng cách lien kết với hemoglobin, các gốc tự do có thê dược tạo

ra nên các tể bào hồng cầu có nhu cầu lớn VC NADPH đè khư glutathione oxy hóa (GSSG) và một số nhõm sulfhydryl protein Sụ tái lạo ôn định cùa glutathione khư (GSH) phụ thuộc vào nguồn cung cấp ôn đjnh cúa NADPH Hong cầu trương thành tông hợp một lượng lớn GSH giúp bao vệ hồng cầu khoi các chất oxy hóa bao gồm hydrogen peroxide (H2O2), các anion superoxide (Oy ) và các gổc hydroxyl (OH-), dược tạo ra như san phẩm phụ cua quá trinh oxy hóa hcmc bàng oxy Các chắt oxy hóa cùng dược tạo ra bơi các dại thực bảo dược hoạt hóa (vi dụ trong quá trinh nhiễm trùng) vã bơi các hồng cầu sau khi tiếp xúc với một sổ tác nhân nhầt định Khi chất oxy hóa tích

tụ chúng sè làm tôn thương protein vã lipid cua tế bào Quá trinh khư cua H2O2 dược lãng cường đáng kê bơi enzyme OSSG GSH dược chuyên dôi thành GSSG Sau dó lượngGSH lụi dược phục hồi bơi enzyme glutathione reductase Trong quã trinh này NADPH bị oxy hỏa thành nicotinamide adenine dinucleotide phosphate khứ (NADP-) kích thích con dường HMP dê tái tạo NADPH Sau stress oxy hóa, thiếu oxy hoặc nhiễm loan, hồng cầu cỏ thề tăng lượng glucose dược chuyên hóa qua con đường HMP lên đen 10 đến 20 lan dê tảng tạo ra GSH Sự kết họp chặt chõ cua chuyên hóa glutathione với con dường

HMP bao vệ hồng cầu trương thành khoi stress oxy hóa/’®

Mặt khác, lừ việc bất hoạt có mục liêu G6PD trong tế bào gốc phôi vã tir các bằng chửng khác, người ta thấy rò ràng ràng vai trò sinh lý chinh cua enzyme G6PD là san xuắt NADPII.5

Hình 1.1 i'ai trò I lia enzyme (ỉlucose-6- phosphate Dehydrogenase trong

việc chống lại tồn thương oxy hóa19 I.I.I.2 Cơ chề bênh sinh cua bệnh rhieu enzyme C6PD

Sự thiếu hụt G6PD lã do đột biến di truyền trong gen G6PD Sự thiếu hụt G6PD anh hường có chọn lọc đen các hòng cầu vi hai lý do Thứ nhất, các

lề bào hồng cầu rắt dễ bị stress oxy hóa lừ cãc chất oxy hóa ngoại sinh trong máu cùng như các gốc oxy liên tục được tạo ra ơ chu kỳ hemoglobin oxy hóa

và khư oxy hóa cứa nó Khi thiều hoạt dộng G6PD chúng giam khá nâng chịu stress và do đó có nguy cơ bị phá huy (tan máu) Thứ hai hầu het các dột biền

đà biết làm giam sự ổn dinh cấu trúc cua enzym và vi hồng cẩu không có khà nâng tông họp protein, nên hoạt độ enzym giám theo sự lão hóa của tế bào Người ta ước tinh rang trong mâu binh thường, hồng cầu lưới có hoạt độ G6PD cao hon khoang 5 lần so với 10% hồng cầu già nhát? Theo nghiên cứu cua Longo vã cộng sự thiêu hoãn toàn enzyme G6PD sè gày chết phôi, do vậy, không có trường hợp cá the thiếu hụt hoàn toàn enzyme này?1 Trong hau het các trường hợp, ờ trạng thái ồn định, hậu qua của sự thiếu hụt enzyme G6PD là không đãng chủ ý ngoài lượng NADPH được tạo ra bơi hoạt dộng cùa lượng enzyme còn lại chúng còn được tạo ra bời hoạt động cua enzyme 6- Phosphogluconate Dehydrogenase (6PGD) du đe giữ cho tế bào hồng cầu tiếp tục hoạt dộng nhưng bị giam tuổi thọ Khi có tác nhãn oxy hóa xâm nhập, các

le bào hống cầu thiều G6PD không thê tảng cường sàn xuất NADPH dần đen việc GSH nhanh chóng bị cạn kiệt, hemoglobin và các protein khác bị tôn thương, hồng cầu bị thực bão hoậc tan máu?2

ỉ Ị 2 Cư sở di truyền cũn bệnh thiểu enzyme G6PD

ỉ 1.2.1 Cơ chề di truyền

Enzyme G6PD dược quy định bới gen G6PD nằm trên nhánh dài vùng

2 báng 8 cua NST X (Xq28) bao gồm một khung đọc mơ với 13 exon và 12 intron, kích thước khoang 20 kb; nó mã hóa 515 acid amin và vùng khơi dộng giàu GC (hơn 70%) Phần 5' không dược dịch mâ cùa mRNA tương ứng với exon I và một phần cùa exon II; codon khơi dầu năm ơ exon II Kiêu dại G6PD dược gọi là G6PD B

ỈỈÌ11I1 1.2 Vị tri cua gen (Ì6PD trên XSTgiới tính X

Gen G6PD di truyền lien két giới tinh X theo quy luật Mendel nên người

nam vả người nừ SC có kiêu gen khác nhau Người nam chi mang một NST X nên chi cô kiêu gen bân hợp tứ (hemizygous) binh thưởng hoặc bân hợp tư gen bệnh Trong người nử cỏ hai NST X nên sè có kiêu gen dồng họp tư binh thường (homozygous normal), dị hợp từ mang gen dột biến (heterozygous) và dồng hợp tư gen dột biến (homozygous deficient) Kiêu gen dị hợp tư cua người nừ biêu hiện bệnh ớ các mức độ rất khác nhau do ờ nữ có hiện tượng bất hoạt NST giới tính X tử giai đoạn phôi thai Thề kham với sự bất hoạt ngầu nhiên cùa 50% NST X mang gcn binh thường và 50% NST mang gen đột biên tạo ra hai quần thê hồng cầu tương ứng Đo vậy người nừ mang kiêu gen dị hợp tư cùng thiếu enzyme G6PD và cùng cỏ thế biêu hiện tan máu giống như người nam bị bệnh Diều này dược giai thích do sự bất hoạt một cách không ngầu nhiên cùa nhiễm sắc the X dần dền hoạt độ enzyme còn lại dao dộng trong khoáng 30- 30% hoạt độ enzyme binh thường."

Bô b| bệnh Mọ mang gen

XY ị XX

Con trai Con trai Con gái Con gái

bi bệnh bỉnh thường mang gon bị bệnh

Hình 1.3 Cư chê (li truyền gen liên kết nhiễm sắc thê X

cùa bệnh thiểu enzyme (Ỉ6PD 1.1.2.2 Càc biển the cua gen G6PD

Tổ chức Y tế Thể giới dã phân loại các biến the G6PD khác nhau theo mức độ thiêu hụt enzyme và mức độ nghiêm trọng cua triệu chứng tan máu như sau:?/

Ráng 1.1 Phân loại biền thề G6PD theo hoạt (lộ enzyme và triệu chửng

lâm sàng

Loại dột biển G6P1) Hoạt độ enzyme (%) Triệu chứng lâm sàng

không liên lục

Gen G6PD the hiên tính da hình đáng chú ý trong quằn the người, có

khoang 400 biến thê dã dược phát hiện và 230 biến thê G6PD dã dược xác định

về các dột biển (Bang 1.2) Hầu hết là đột biến sai nghĩa (dột biến gày ra sự thay thê acid ainin) hoặc mất doạn nho trong killing đọc (gày ra mắt một hoặc một vài acid amin) chúng sè tạo ra một protein G6PD bất thường về cấu trúc, giám chức nàng Các dột biến dịch killing không dược phát hiện, do chùng có thê dần đốn hoạt dộ cua enzym bang không và gây chết phôi

Bứng 1.2 Các dang dột biển cùa các biển thế GbPlý

Các biến the G6PD phó biền nhất bao gồm G6PD A", G6PD Địa Trung Hái (Meditenanian) G6PD Canton và G6PD Union O6PD A- (c.2O2G>A/ C.376A>G) xuất hiện với tần suất cao ờ Châu Phi, Nam Âu Bắc và Nam Mỳ G6PD Địa Trung Hái (C.563OT) được tim thay chu yen ớ Trung Đông, bao gồm ca Israel, và lã nguyên nhân chính gây ra bệnh thicu G6PD ờ người Do Thái và người Kurd G6PD Canton (C.1376G>T) được phát hiện chu yếu ờ người Trung Quốc và biển the G6PD Union (C.1360OT) dược tim thảy trẽn toàn the giới Các biến thê G6PD với hoạt độ enzym khác nhau gây ra các mức

dụ nghiêm trọng của bệnh làm sàng khác nhau

Các dạng thiêu hụt G6PD nghiêm trọng cỏ liên quan đen bệnh thiểu máu tan mâu hồng cẩu không tròn mạn tinh Các dột biển gây ra bệnh thiếu máu nãy thường tập hợp ờ exon 10 một vũng quan trọng dối với quá trình dime hóa protein

Hình 1.4 Những dột biến thường gặp nhắt trên khung dọc cua gen GbPD'^ Cite Exon dược hiên thị dưới dạng các hộp dược dành sổ Hinh trôn phía trên là dột biển gày ra các biển thè loại II và III Càc hình tròn phía dưới dại dien cho cãc dột biền le te làm phút sình các biền thê nghiêm trọng (loại l) Hình elip là dột biên gãy ra các biển thê loại IV Hình vuông dó = mai doạn nho Dau (X) = một dột biên võ nghĩa 1= dột biến vị tri noi 202A và 968C là hai vị tri thay thể ba:ơ trong G6PD A-

Một số nghiên cứu dà chi ra rang sự phàn bỗ cua các biến the G6PD cùng thay dối theo khu vực dịa lý và/hoặc nhóm dân lộc () Việt Nam một nghiên cứu ớ Lâm Đồng đà chi ra it nhất 7 da hình G6PD."* Nguyền Thi Huệ vã cộng

sự dà xác định dirực 8 dạng da hình khác nhau, trong dó 6 dột biển thay the axit amin và 3 dạng lả đột biến mới.2' G6PD Viangchan là biến the phổ biến nhất Đáng chú ý hai biến the sai nghĩa mới (novel non-synonymous valiant) (Vietnam I vã Vietnam?) và một da hình im lậng (novel silent polymorphism) (Vietnams) dà dược xác định Mặc dù tần sổ cùa các dột biển này thấp, nhưng

có thê một the hệ dột biến G6PD mới dang xuất hiện trong quần the Việt Nam 1.2 Chấn đoán và diều trị bệnh thiểu enzyme G6PI)

1.2 ĩ Chắn đoản

ỉ.2.ỉ ì Dặc diêm lâm sàng

Nhùng đối tượng thiếu enzyme G6PD thường không có biêu hiện triệu chứng lâm sảng Tuy nhiên, khi liếp xúc với lác nhân oxy hóa như một sổ loại thuốc, hóa chất, thức ãn có tính oxy hóa cao có the dẫn đen các hội chứng lâm sàng

Tan mâu sơ sinh

Tình trụng thiếu máu do tan mâu và vàng da so sinh kéo dài là hai vấn

de nghiêm trọng mã tre sơ sinh gặp phai Thicu enzyme G6PĐ lã một trong nhùng nguyên nhân chinh dần den vãng da bệnh lý Một sô thuốc chong sot rét (primaquine, tafenoquine, ) khang sinh (ciprofloxacin, ofloxacin, ), vitamin K hay nhiễm trũng cùng là tác nhân gây tan máu

Kgộ dộc dậu him (Bệnh Favismf

Các di chứng lãm sàng cua việc ăn phai đậu tầm đâ dược báo cão vảo dầu thế kỳ 20 mặc dù mối liên hệ giữa những loại đậu này và rổi loạn lâm sàng

dã dược xác định nhiều thế ký trước đó Hiện nay biến the Địa Trung Hai dược cho là liên quan nhất với bệnh Favism Các triệu chửng cua bệnh Fasvim có thè

xuằt hiện sau khi án dậu khỏ hoặc đông lạnh, nhưng đặc biệl có kha nâng xay

ra sau khi ân dậu tươi Divicíne và ỉsouramil dược cho lã nhùng thành phân dục cua dậu tầm làm tâng hoạt dộng cùa con dường hexose monophosphate, thúc dây quá trinh tan máu ờ nhùng bệnh nhân thieu enzyme G6PD 6 Tre bú

mẹ có mẹ ản dậu tầm cũng có nguy cư bị tan máu

Favism bicu hiện như thiêu máu tan máu cap tinh, thường xay ra khoang 24 giờ sau khi ãn đậu Dái máu nghiêm trọng hơn so với chửng tan máu do thuốc hoặc nhiễm trùng gãy ra mặc dù người bệnh cỏ nồng độ bilirubin thắp hon Tinh trạng thiếu máu cắp tinh và nghiêm trọng do thiểu máu cục bộ hoác do kết tua các hem dần den suy thận cap ớ một số người bệnh Nhửng người bệnh có cơn tan máu cấp mức độ nậng có the can truyền máu

Thiêu máu lun máu mạn linh không phái hong cãit hình tròn (Chronic nomphevocylic hemolytic anemia ■ CNSHA)

Một tý lệ rất nhó các trường hợp bị thiếu enzyme G6PD có thiếu máu mãn linh với mức độ nghiêm trọng khác nhau Người bệnh thường iả nam giới, hầu như luôn có con sốt ơ tre sư sinh, và do dó bệnh nhãn dưực lãm xét nghiệm

do vàng da không rò nguyên nhàn hoặc sói mật khi lớn lén Triệu chứng thường gặp là lách to mức độ vừa ứ tre nho và sau dó có thè tàng kích thước du dè gây khó chịu cư học và/hoặc cường lách Mức độ nghiêm trọng cua thiếu máu dao dộng ứ nhừng người bệnh khác nhau, tử tự giới hạn den mức độ can phụ thuộc vào truyền máu Thiếu máu thưởng dắng sac nhưng kich thước hồng cầu lớn phần lớn là do tâng hồng cầu lưới (lên den 20% hoặc hơn) Hình thái tế bào hông câu không phái là dậc trưng (do dó dược gọi là không phái tê bào hình cầu nonspherocytic) Xét nghiệm bilirubin vã lactate dehydrogenase máu lăng Túy xương không tăng nguyên bào nuôi, trừ khi có sự thiều hụt folate Trong CNSHA do thiếu enzyme G6PD không giống như trong tan máu cấp tính dược mô ta ữ trên, lan máu chu yếu là ngoại mạch Tuy nhiên, các te

bão hong cầu cua nhùng bệnh nhàn này cũng dề bị lôn ihưưng oxy hóa cấp linh, và do các tác nhân tương tự cỏ the gây ra bệnh thiêu máu tan máu cap linh ó những người bị ihicu enzyme G6PD thường sê gãy ra dợl kịch phát nghiêm trọng ờ những người bị thiều enzyme G6PD mức dộ nặng.

ỉ.2.ỉ.2 Dặc (tiếm cợn tàm sàng

Trường hợp không cỏ tan máu: Nồng độ hemoglobin máu hỉnh anh hổng cầu binh thường

Khi xáy ra con tan máu cấp:

+ Hemoglobin mãn Hematocrit giám nhanh

+■ So lượng hong càu máu ngoại vi giam, dời song ngắn, xuất hiện hồng cầu có hinh dạng bãt thường: hình câu hòng cầu có the I ỉeinz

+ I lông câu lưới máu ngoại vi tâng

+ 1 loạt độ G6PĐ giam

+ Neu tan máu nặng, nước liêu xuất hiện haptoglobin và hemoglobin tự do

- Chân đoán mức độ thiếu enzyme dựa vào hoạt dộ enzyme trong máuHoạt dộ enzyme G6PD dược coi là binh thường là lừ > 2OOƯ/IO|; hồng cầu hoặc 7-10 Ư/gl Ib tùy theo nhã sán xuất với hàng máy tương ứng

- Xác định các biến thê G6PD bằng các phương pháp phan ứng chuỗi polymerase (PCR) giai trinh tự Sanger, giai trinh lự the hộ mới

1.2.2 Diều trị

Hau hêt triệu chứng sê tự het sau khi nhùng chát gây khới phát bệnh dược thái trừ trong những trường hợp tan máu do dùng thuốc hoặc hỏa chất, cần ngay lập lức dừng thuốc Nếu lan máu nặng cần truyền máu Ớ tre SƯ sinh thiếu G6PI1 tùy mức dộ vàng da và nông dộ bilirubin máu mà thực hiện các biện pháp chiếu dèn hay truyền thay máu đê phòng bệnh nào do tảng bilimbin lự do khi chúng vượt quá ngưởng

1.2.3 Phòng bệnh

Các biện pháp phòng bệnh đóng vai trò rất quan trọng cho người bệnh

thiều enzyme G6PD.

- Người bị bệnh cân thận trọng trong việc sư dụng thực phàm, thuốc có tinh oxy hóa trong danh mục khuyến cáo Thông báo VC tinh trạng thiếu enzyme G6PD cùa bán thân cho bác sì trước khi sư dụng thuốc Trướng hợp bầt buộc phái dùng các loại thuốc có nguy cơ thi can phai theo dõi chặt chẽ vắn dề tan máu vâng da

- Với các tre mắc bệnh thiếu G6PD cằn trang bị kiến thức cho cha mẹ cúa tre về bệnh, các yếu tố nguy cơ nhùng nguy hiềm có the gộp phai vả các biện pháp phòng tránh

- Doi với vùng có tý lộ bệnh cao, vùng sốt rét lưu hành nên dưa xét nghiệm hoạt dộ enzyme G6PD trơ thành xét nghiệm thưởng quy trước khi chi định các thuổc có tinh oxy hóa cao như thuốc chong sot rét Primaquin

- Dưa việc phát hiện thieu enzyme G6PD vào chương trinh sàng lọc sư sinh, giáo dục tuyên truyền trong cộng đồng ỷ thức dược tầm quan trụng cua việc lầm soát bệnh

- Tư vấn tiền hỏn nhân cho người bệnh, người mang gcn bệnh về sự di truyền bệnh

1.3 Sàng lọc sơ sinh bệnh thiếu enzyme G6PD

/ 3 ỉ Các yếu fit nguy cơ anh hướng dển kết quà sàng lọc sơ sinh bệnh thiếu enzyme G6PD

Nhâm chân đoán sớm vã diêu trị kịp thời cho bệnh nhãn thi vai trô cùa sàng lọc là rắt quan trọng Tuy nhiên đe đánh giá được chinh xảc nguy cơ mắc bệnh thiếu enzyme G6PD thi kết qua cùa xét nghiệm lọc phai thật chinh xác loại bo dược các yêu lô nhiều làm anh hướng và từ đỏ điêu chinh quá trinh sàng lọc sao cho phù hợp Một sổ yểu tố nhiều dược chia ra yếu lố từ phía trê và từ phía kỳ thuật xét nghiệm

Các you tố từ phía tre sơ sinh có thê kè dển như các trường hợp tre bị tan máu các trường hợp này cỏ thê gây nên âm tinh giá cho kci qua sàng lọc Ớ

những tre bị lan máu cap linh, xẽl nghiệm sàng lọc bệnh thiểu enzyme G6PD

có thể âm linh giá vi lượng hồng cẩu già có mức độ thiêu hụl enzym nhiều hơn

đã bị lan máu: hống cầu non và hồng cầu lưới có hoạt linh enzym binh thường hoặc gần binh (hường, vì vậy khuyến cáo cằn làm lại xét nghiệm trong các trường hợp này Theo Viện Tiêu chuân Phòng xét nghiệm vã Lâm sàng I loa Kỳ (CLSI) và một sổ Hướng dim thực hành sàng lọc sơ sinh khác, tất ca cảc trường hợp tre sàng lọc lần đầu tiên có nguy cơ cao thiếu G6PD sè được xét nghiệm lại trên chính mầu máu đà có Dổi với các tnrờng hợp sinh non và nhẹ càn sau

28 ngày hoặc trước khi ra viện sè dược lấy máu lần 2 đê xét nghiệm đo hoạt độ enzyme G6PD Khi kết qua sàng lọc dương linh, các xét nghiệm chân đoán sè được thực hiện tiểp theo đó?° Tuy nhiên ơ Việt Nam quy trinh nãy chưa dược thực hiện thường quy việc sàng lọc sơ sinh bệnh thiếu enzyme G6PD thường chi dửng lại ớ mức độ sàng lục phụ thuộc vào điểu kiện kinh tế nhận thức cua

bổ mẹ tre

Ngoài ra ờ những người dị hợp lử gen G6PD có thế khó chần đoán vi tinh trạng bất hoạt nhiễm sắc the X dẫn đển sự thiếu hụt một phần hoạt độ enzyme sè không dược phát hiện một cách đáng tin cậy bằng các xét nghiệm sàng lọc

Tinh trạng thiếu enzyme G6PD cùng liên quan đến sự phân bố địa lý như

đà trinh bảy ờ trên Mật khác, bệnh do di truyền nên ớ nhừng người có kết hôn cận huyết lâng ty lệ di truyền bệnh cho đời sau

Glucose-6-phosphal dehydrogenase lã một enzyme nên hoại độ chịu ánh hương bới lãc dộng nhiệt dộ Việc bao quan mẫu trong mỏi trường có nhiệt dộ

và độ ám cao có thè làm lảng nguy cơ dương lính gia Hoạt độ G6PD có ihê giam 20% sau 3 ngày dược bao quan Ư nhiệt độ phòng và độ àm thấp (<30%) nhưng cỏ thè giàm den 60% nếu bao quán ớ 35 dụ c với độ âm cao?* Tuy nhiên, các mầu dược bao quan ơ 4°c trong I tháng hoặc ờ -20°C trong I năm vần giừdược him 90% hoại tinh cua enzyme/1

1.3.2 Một sổ kỹ thuật phát hiện thiểu enzyme G6PD

Xét nghiệm {/nang phô G6PD

Glucose*6*Phosphat Dehydrogenase trong hồng cầu dược giai phóng boi tác nhân ly giai có trong thuốc thứ G6PD dược giai phóng từ các tế hào hồng cầu xúc tãc Glucose-6-phosphate de khư NADP thành NADPH Tổc dộ khư NADP thành NADPH dược đo bang sự gia tảng độ hàp thụ ờ bước sóng 340

nm dược tạo ra trong phan ứng dược xúc tác bời cnzym tỳ lệ với hoạt độ G6PD trong mầu

riêu chuãn vàng đế chắn đoán G6PD ơ cấp dộ phòng thi nghiệm là xét nghiệm quang phô dịnh lượng tòng hoạt độ cua enzym trong huyêt lương (có thè loại bõ bạch cầu dê phân tích chinh xác him) Hoạt dộ enzyme G6PD dược linh bang sự thay dồi độ hấp thụ ớ bước sóng 340 nm (AAbs) ờ một nhiệt độ nhất định và dược chuân hóa bời nống dụ cùa hemoglobin (cho kết quá bằng đơn vị enzyme trên gam hemoglobin, U/gHb) hoặc bang sổ lượng hồng cầu (dơn vị enzyme trên mỗi hồng cầu U/RBC) Kỳ thuật nãy bị anh hương bời nồng dộ hemoglobin trong mẫu máu và có thề dản dến giá trị ước linh cua hoại

độ G6PD cao "giá” ơ những dối tượng bị thiêu máu hoặc thiếu sắt Các yểu tố như giám thê lích hồng cầu tăng số lượng hồng cầu lưới hoặc kết hợp ca hai yếu tố này dược cho là góp phần làm lãng hoạt độ dược đánh giá Ưu diêm cua phương pháp: Định lượng chinh xác hoạt dộ enzyme, liến hãnh dồng thời trên nhiêu mẫu Tuy nhiên, phương pháp này dõi hỏi phòng xét nghiệm với dây đu trang thiết bị đội ngù dược đão tạo chuyên 11ÌỎ11

Kỹ thuật miễn (lịch huỳnh (Ịuang (tịnh lượng hoạt (tộ enzyme trong (lồm màu khỏ (Kỳ thuật này sè (lược trình bày kỳ ờ phàn phương pháp nghiên cửu) Test khử methemoglobin

Tác dộng cua nitrit lên te bào hồng cầu dàn den hĩnh thành một dạng oxy hóa methemoglobin, và khi có mật xanh methylcn methemoglobin bị khư thành hemoglobin màu nâu (hông qua con đường oxy hóa Sự thiếu hụt cùa

Glucose-6-phosphai dehydrogenase dược xác định bằng việc methemoglobin không dõi màu nâu sau khi thêm xanh mclhylcn Dây là phương pháp dịnh linh

Ưu diêm cua phương pháp là tra kểt qua nhanh vã không cần trang ihiểl bị phức tạp-

Phương pháp tạo vòng form aza n

Phương pháp lạo vòng formazan là một phương pháp định lính, dựa trên nguyên lý chuyển màu cua3-(4.5-DimethylthiazoI-2-yl)- 2.5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) lừ một chất cỏ màu vàng nhạt chuyên sang màu xanh thảm khi có mật NADPH được lạo ra bới enzyme G6PD Dường kính cua vòng màu xanh thê hiện hoạt dộ enzyme có trong mầu máu bệnh phẩm Ưu diêm cua phương pháp này lã có thê liến hành dược trẽn mầu máu thắm khó, trường hợp thiếu G6PD không có vòng màu xanh thầm (fonnazan) Tuy nhiên thời gian trã kết qua nhanh nhất là sau 8 giờ và phụ thuộc vào điều kiện và thời gian báo quan màu

Test nhanh hàng phương pháp Hirono -1-methoxy PMS Sephadex

Hồn hợp chất (G6P NADP saponine) và hồn hợp MTT-PMS dược hòa tan trong nước và trộn với gel Sephadex Nguyên lý cua phương pháp này cùng tương tự như phương pháp lạo vòng Formazan Ưu diêm cùa phương pháp là tra ket qua nhanh chi sau 30 phút và không cằn trang thict bị phức tạp

Phương pháp đo tể hào dòng chây

Phát hiện enzyme hoạt động ờ tửng hong cau đơn le bao gom cã hong cẩu lưới nên rất có giá trị xãc định lượng G6PD ớ đối tượng nừ dị hợp lừ hoặc bệnh nhàn có thiếu mâu do thiểu sắt hoặc bị bệnh huyết sắc tố do phương pháp xét nghiệm này không bị ánh hường bơi nông độ hemoglobin Ưu diem cua phương pháp là xét nghiệm nhanh, đơn gian, tuy nhiên chi phi xét nghiệm tốn kém và dồi hoi trang thiết bị nhàn lực dược dào tạo

1.3.3 Chương trình sàng lọc sơ sinh ỡ nước ngoài vù dệt Nam

Hiện nay theo thống kê cua Tỏ chức sàng lục sơ sinh thế giới (1SNS)

bệnh thiếu enzyme G6PD dà dược đưa vào chương trinh sàng lục ờ 13 nước trên the giới?’ Thiểu enzyme G6PD là bệnh thích hợp đổi với sàng lọc sư sinh,

nó đáp ứng đu các tiêu chuẩn cua một bệnh có thê sàng lọc sư sinh: có các test sàng lọc hiệu qua và tin cậy, bệnh cỏ ty lệ mắc cao thê nặng có các biến chứng nặng nề tuy nhiên có các phương pháp điều trị hiệu qua giúp giam các biền chứng Sàng lọc góp phần làm giam thời gian chân đoán bệnh, số lần nhập viện, mức độ nặng cua bệnh, so lân chân đoán không chinh xác cũng như giam tý lộ

tư vong cua các trưởng hợp bệnh não do bilirubin Vi vậy việc dưa sàng lọc thiếu enzyme G6PD vào chương trinh sàng lục sư sinh rất cần dược cân nhấc.Nám 1989, WHO khuyên cảo sảng lục tre sư sinh về tinh trạng thiêu enzyme G6PD ớ các vũng có tý lộ mắc bộnh từ 3 dền 5% ư nam giới.?/ Mục đích cúa việc sàng lọc lâ dê cho phép theo dõi chặt chè sự phát tricn cua bệnh vãng da sơ sinh và diêu trị cảng sớm càng tot

Thiếu enzyme G6PD phổ biến nhất ờ vùng Trung Đông Châu Phi Đông Nam Á và Dịa Trung I lai- trùng lặp với những khu vực đã hoặc dang lưu hành bệnh sổt rét Tý lệ thiếu enzyme G6PD qua một sổ nghiên cứu ư các nước như sau: 4-7% ơ Trung Quốc 1.9% ơ Philippin 4-7% ơ Mỷ, trong khi dó Trung Đông, châu Phi và một sỗ nưởc châu Á có tỳ lệ thiếu enzyme G6PD lên đen 23-29%.-^ Tại Thái Lan nghiên cứu cùa Pongsatom vã cộng sự trên 922 trê sư sinh nam tại vùng đóng bac bang xét nghiệm diêm huỳnh quang trên mầu máu cuồng rỗn cho kết qua 14.4% tre bị thiểu enzyme GóPD?'

Singapore lã một trong những quốc gia đau tiên áp dụng chương trinh sàng lọc hàng loạt này vảo nám 1965 Dừ liệu tử Singapore cho thấy với các biện pháp phòng ngừa, ty lộ mắc váng da nhân nào dà giam dáng kê?5 Chương trinh sàng lọc sư sinh bệnh thiếu enzyme G6PD tại Hy Lạp năm 1977 đã báo cáo so bệnh nhân nhập viện dê điều trị bệnh Favism giam bốn lần?1

Tại Việt Nam chương trinh sàng lọc sư sinh dược dưa vào thi diêm từ năm

2000 Hiện tại cùng với sàng lọc sư sinh bệnh thiếu enzyme G6PD nước ta cùng

dà tricn khai khấp cá nước 4 bệnh: tâng sàn thượng thận băm sinh, suy giáp trang

bầm sinh, rỗi loạn chuyền hóa galactose và phenylkcto niệu.

Các nghiên cửu cho thay tý lệ thiếu enzyme G6PD rất khác nhau giừa cãc dân tộc và các vũng địa lý Tần suất thiếu enzyme G6PD lĩ dân tộc Kinh và dân tộc Mường vón song bẽn ngoài vũng lây truyền bệnh sot rét là thấp (tương ứng lả 0.5% và 0.7%) Trong khi dó các dân tộc sống ờ chân dồi cùa 4 tinh phía Bắc Việt Nam (Thanh Hóa Sơn La Hà Giang và Hòa Bình), vùng sinh san cua vật trung gian truyền bệnh sỏt rét chinh Anopheles minimus, dao động

từ 9.7% dển 31%y Nghiên cứu sàng lục sơ sinh bệnh thiếu enzyme G6PD tại bệnh viện phụ sán thành Phổ cần Thơ năm 2022 cho tỷ lộ thicu enzyme G6PD

là 1.67%, nghiên cứu sàng lọc sơ sinh cua Trần Thị Chi Mai và cộng sự tại Bệnh viện Nhi Trung ương trên 5680 tre với tý lệ thiếu enzyme G6PD là 0.79%.w’

Cức bước sàng lọc sư xinh thông thưởng:

- Tint thập mầu máu gỏt chàn trê sơ sinh, gửi tới phòng xét nghiệm

- Màu máu dược tiếp nhận, đánh số, đánh giã hoạt dụ G6PD trong mầu mâu khò

- Kết qua dương linh dược thông báo với cha mẹ tre

- Tư van ket qua vả xét nghiệm chân doản bang do hoạt độ enzyme máu lình mạch hoặc xét nghiệm dột bicn gen G6PD

Hình 1.5 Sư đồ tham khan các hước sàng lọc sư sình

bệnh thiểu enzyme GỗPD*1

1.4 Một số kỹ thuật di truyền xác định đột biến gen G6PI)

1.4.1 Kỹ thuật PCR l à một sổ biển thể cùa PCR

Phán img chuồi polymerase (PCR) là một kỳ thuật sinh học phân tư cơ ban dược dung dê khuếch dại theo cap sổ nhân một lượng nho trinh tự acid nucleic (thường lã DNA) dựa vào cãc nguyên lý chu kỳ nhiệt, kết quá tạo ra số lượng lớn các ban sao xác định Kỳ thuật PCR dược coi là một trong nhừng kỹ thuật hừu dựng nhất trong lĩnh vực sinh học phân lư hiện đại

PCR hoạt dộng dựa trên nguyên lỷ mõ phong quã trinh tái ban DNA trong le bào sứ dụng các chu kỳ luân nhiệt và enzyme DNA polymerase chịu nhiệt PCR và các biến thê cua nó như Multiplex P('R (PCR đa mồi) ARSM PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR Hệ thống khuếch dại các dột biền bền với nhiệt) có thê dược sư dụng dê chân đoán nguyên nhân cho các trường hợp thiểu enzyme G6PD sứ dụng nhóm các biến the thưởng gặp hoặc dã biết trước trình tự biến the Multiplex PCR sư dụng nhiều cập mồi khác nhau trong cùng một phàn ứng ARMS-PCR được sư dụng de xác djnh kicu gen SNP (đa hình đơn nucleotide) với sự trợ giúp cùa các mồi bển nhiệt Cãc đoạn mỗi cho các alen dột biến (có SNP) vã alen binh thường (không có SNP) cho phép khuếch dụi chọn lục và có thê dề dàng phân tích sau khi điện di Sự biền dõi cua một bazơ đơn xay ra ờ đầu 3' cùa mồi sao cho một mồi khớp với alen binh thướng và moi kia khớp với alcn dột biên Ca hai biên thê moi dược kết hợp trong một hỏn hợp phan ứng PCR duy nhổt dê quá trinh PCR dược thực hiện dồng thời Sự hiện diện cua một biến thể alen phụ thuộc vào kha nàng gán mồi vã khuếch đại alcn binh thường hoặc alcn dột biến Sự biên dõi mỗi lủ diêm nhấn quan trọng nhất trong cơ chế cùa ARMS-PCR Dây là các phương pháp nhanh, re liền và khá dơn gian, tuy nhiên, chất lượng vã độ chinh xác cũa dữ liệu thu dược lại phụ thuộc nhiều vảo Việc chuẩn bị mầu và chai lượng DNA Ngoài ra nhiều kỳ thuật PCR còn dôi hòi việc thiết kế mồi khá công phu các

ỉ 4.2 Kỹ thuật giãi trình tự Sanger

Phương pháp giai trinh tự gcn Sangcr ra dời nám 1977 còn dược biết đến với tên gọi giãi trinh tự dideoxy hay giai trinh tự "dừng chuồi" Kỳ thuật náy thực hiện dựa trên kỳ nguyên lý dìmg lóng hợp mạch dơn DNA dang dược tổng hợp khi gặp nucleotide không có nhõm 3*-OH Nhóm 3’-OI ỉ dóng vai trò cho phép gắn thèm một nucleotide mới vào chuỗi Khi một ddNTP dược thêm vào chuồi, vì không có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào phán ứng tỏng hợp sè dừng lại Enzyme polymerase xúc tác phán ứng gắn các dNTP vào mạch dơn cùa DNA dê kéo dài mạch ờ vị tri 3'- oil và dừng hũ nếu gắn các ddNTP vão chuồi Đặc trưng cua phương pháp này là tạo ra bán sao có chiều dài khác nhau từng nucleotide, phục vụ cho việc thu thập tin hiệu dê giái trinh tự các nucleotide trên một đoạn DNA ngắn (-lOOObp)

Trong một phan ứng chứa ca dNTP và ddNTP nên sau phán ứng tống hợp hình thành các doụn DNA có dộ dài khác nhau do ddNTP gần ngầu nhiên lãm dừng phan ửng Dựa vào sự sai khác về độ dài các doạn DNA hiên thị Iron ban gel sau diện di dê xác dịnh trinh tự trong gene

Giãi trinh tự Sanger lã một phương pháp cho kct quá kha nhanh, mang lại lợi ich chi phi hiệu quà khi sứ dụng trên một nhóm it trinh tụ đích (1-20 trinh tự dich) Sanger có thê dược ãp dụng đê chân đoán cho các biển thê dà biểt trinh tự - dột biến diêm Tuy vậy kỹ thuật này lốn nhiều thời gian và chi phi nếu áp dụng trong việc giái trinh lự loàn bộ gen G6PD dè tim nguyên nhân cho các trường hợp thiểu enzyme G6PD

1.4.3 Kỹ thuật giãi tình tự the hệ mới - NGS

Giai trình tự the hộ mới (NGS) là giai trinh tự một so lượng lớn DNA

cạnh nhau trong cùng một hệ thòng Kỳ thuật này dà mờ ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứu hộ gen giúp hiện thực hóa các tiềm nâng chân doán, điểu trị dựa trên dữ liệu cá thê Nhờ có NGS, các nhà di truyền học lâm sàng hiện nay

dã có thê giái đáp nhửng câu hoi về một tinh trạng bệnh mà trước dó dược cho

là không cô lời giá Với lốc độ độ chinh xác ngày càng táng, hiện nay NGS dược áp dụng ngày càng nhiêu trong chân đoán y khoa

NGS dược phát triển theo sau sự ra đời cua giãi trinh tự Sanger, về cơ ban ca NGS vã phương pháp Sanger đều có bước tống hợp DNA sư dụng DNA polymerase vã dNTPs Tuy nhiên NGS không sư dụng thêm ddNTPs như Sanger mã lại sư dụng hoặc các dNTP gan huỳnh quang (kỳ thuật Illumina và SMRT) hoặc dọc trình tự dựa trên sự giai phỏng chát (pyroscquccing và ion torrent sequencing) Nói chung, đê thực hiện NGS cân thực hiện quy chinh với

5 bước chinh:

+ Bước I: Tách chiết DNA hệ gcn;

+ Bước 2: Tạo thư viện NGS: DNA hệ gen được cat thành những manh sợi kép nho có kích thước tương lự nhau (nhờ song siêu ãm hoặc nhờ enzyme); sau đó chúng sè được chinh sưa (như gắn thèm adapter cần thiết) sao cho có thê tương thích với giả bám (platform) giãi trinh tự;

+ Bước 3: Tạo cụm (cluster): mỗi manh DNA sè dược gan ờ các vị tri riêng biệt trên bề mặt thict bị giai trình tự (flowcell) bang các adapter dà gần tnrớc đó Mỏi mãnh DNA này tiềp theo sè được khuếch dụi theo kỹ thuật PCR lạo thành một cụm có trinh lự giong hệt nhau dựa vào các moi PCR oligonucleotide cỏ trình lự bố sung với adapter dược gần sần trên flowcell;+ Bước 4: giãi trinh tự từng cụm: lũy thuộc vào kỳ thuật NGS mà có các cách thực hiện khác nhau: giai trinh tự bàng tòng hợp hoặc giai trinh tự bằng giái phóng chất;

+ Bước 5: ghép nổi các đoạn DNA dã dược giai trinh lự bàng phần mềm tin sinh đề tạo ra một trình tự dầy du cua hệ gen

NGS có the giai trinh tự loàn bộ hộ gen trong cùng một lúc tuy nhiên phương pháp này khá tốn kẽm nỏ còn cung cấp quá nhiều thông tin dần đến tốn nhiều thòi gian đê phân tích Do vậy thay vì giai trinh lự loàn bộ hộ gcn, các bác sì lâm sàng cũng như các nhà nghiên cửu thường chi lập trung kỳ thuật NGS vào một nhóm gcn nhất định, hay còn gọi là giai trinh lự dich/giài trinh

lự nhóm gen

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN cưu

2.1 Địa (liêm và phương pháp nghiên cứu

- Địa diem nghiên cứu: Trung tâm Xét nghiệm Bệnh viện Đa khoa Medlatec

- Thời gian nghiên cứu: 09/2022 - 09/2023

2.2 Đổi tượng nghiền cứu

Mục tiêu í:

Tiêu chuân tựu chọn

- Tre sơ sinh có kết quá lầy mâu gót chân cùa xét nghiệm sàng lọc sơ sinh bệnh thiếu enzyme G6PD

- Cha mẹ bệnh nhản đồng ý tự nguyện tham gia

- Thòng tin của trê dược thu thập dầy đủ, mầu mâu gót chân dược lấy dứng theo quy trinh kỹ thuật

Tiêu chuân loụi trừ Tre dược truyền máu

.Mục tiêu 2: Cảc tre nguy cơ cao sau sàng lọc bệnh thicu enzyme G6PD thực hiện xét nghiệm chân doán như định lượng hoạt độ enzyme G6PD máu tình mạch vã hoặc xét nghiệm gen G6PD

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3 J Thiết kể nghiên cừu

- Nghiên cứu mô ta cắt ngang tiển cửu kết hợp với hồi cửu

2.3.2 Tính cở num

- Phương pháp chọn màu: Chọn màu thuận tiện trong thời gian lữ tháng 09/2022 đến tháng 09/2023 thu dược 3223 mẫu sàng lọc máu gót chân tre sơ sinh cỏ day du thông tin lại bệnh viện Da khoa Medlaỉec cho mục liêu I và 5 trường hợp lãm xét nghệm chân đoán cho mục tiêu 2

2.3.3 Sơ đồ nghiên cứu và cách tiền hành nghiên ci'm

— Tbu thập bỏ sơ vã thòng tin nghiên cửu cua bịnh nhan

lá III xét nghi ợ UI sáng lọc sơsinb tbicu bụt enzyme G6PD

Các yêu cầu lấy mầu máu gót chân:

- Lầy mầu bằng vết chích ờ gót chán và thấm lên giấy thầm

- Máu từ vet chích gót chân ớ tre sơ sinh chu yểu được lầy ơ ngày 2-7 sau sinh Kỳ thuật thu thập dược mô la với diêm chinh dược liệt kê dưới dây:Bước I: Làm sạch da bằng gạc tấm cồn và dê khô

Bước 2: Chích vào gót chân cũa tre với lười trích vô khuẩn hoặc dụng cụ lạo vet rạch ớ gót chân sâu khoang l-2mm Chích sâu hơn 2mm ư tre nhò có thè tôn thương xương

Bước 3: Lau sạch giụi máu dầu liên Nhẹ nhàng chạm giấy thầm lên

be mật giọt máu sao cho du lượng máu thấm rộng du vòng tròn trên giầy thắm Kiêm tra cà 2 mặt cũa giấy thấm dè dám bao răng máu dâ thấm và bão hoà hết giấy

Hình 2.1 ị'ị tri lẩy mán xót chần cho tre sư sinh

Bung 2.1 Các mầu máu đạt chuẩn và không đạt chuấn trong lầy mẫu máu

gót chân

tròn in trên giấy thầm Không có nhiều kíp máu hay áp mầu giấy thấm đê lấy máu nhiều lần trừ) củng một vòng tròn Không đụng chạm trời mầu giấy thấm hoặc dàn giụi mãu trên màu giấy thấm

Mầu máu không đạt chuẩn

Không lấy dược mầu máu

» » • » ♦ Lượng mầu không du cho xét nghiệm

Mầu có các giụt thấm lan sang ca nhùng giọt khác

^ Ểb^ ^ ^ Mầu máu bị pha loăng, mẩt màu hoặc bị nhicm

bân

^^®(H^^ Mầu máu có các vòng huyết thanh

2.3.4 Biển sổ nghiên cửu

2.3.4.1 Khao sát một so yen lổ Hèn quan đen hoạt (ỉộ eng ine G6PD ơ tre sơ sình trong sàng lục bệnh thiếu enzy me G6PD bang phương pháp lay máu gõl chân

Bâng 2.2 Các hiển số cũa mục tiêu ỉ trong nghiên cừu

lừ mẫu màu gót chân trê sơ sinh

Bang 2.3 Các biến sẩ ciia mục tiêu 2 trong nghiên cứu

sàng lọc sơ sinh Định lượng

Tuỗi Ire tinh bàng ngày

Thu thập

từ phiếu sàng lọc

Bệnh án nghiên cứu

5 Tuồi mẹ lúc sinh Dinh lượng Tuồi mẹ tinh bằng

nảm

2.3.4.2 Phân úch kết quã sàng lọc m ộl sổ trường hợp thiều hụt enzyme G6PD

STT Tên biến Loại biến Chi sổ/

Dịnh nghĩa

Phương pháp

1 G6PD máu gót chânHoạt độ enzyme Định

lượng

Hoạtdộ G6PD lầy máu gót chán

Thu thập lữ phiếu sàng lọc2

1 loạt độ enzyme

G6PD máu tĩnh

mạch

Dịnh lượng

I loạt dộ G6PD máu tĩnh mạch

Thu thập từ bệnh án nghiên cứu

3 Bien the gcn GÓPD Dịnh tinh

Xác định các biển thế G6PD dựa vào các phương pháp

^iãi trình tự gcn

4 Tien sư gia đinh Dịnh tinh

Tiền sư gia đình cỏ người dà dược chăn đoán thiêu enzyme G6PD

Thu thụp từ bệnh án nghiên cứu