Tóm tắt phân tích các yếu tố Ảnh hưởng Đến biểu hiện của dấu Ấn mô cd142 Để dự Đoán nguy cơ Đông máu Ở bệnh nhân truyền tế bào gốc trung mô

Tóm tắt phân tích các yếu tố Ảnh hưởng Đến biểu hiện của dấu Ấn mô cd142 Để dự Đoán nguy cơ Đông máu Ở bệnh nhân truyền tế bào gốc trung mô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Lê Đức Sơn

PHÂN TÍCH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN BIỂU HIỆN CỦA DẤU ẤN MÔ CD142 ĐỂ DỰ ĐOÁN NGUY CƠ ĐÔNG MÁU Ở BỆNH NHÂN TRUYỀN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8420201.22

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2023

Công trình được hoàn thành tại:

Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec

Người hướng dẫn khoa học:

TS Hoàng Thanh Vân

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSCs) là một tập hợp các dòng tế bào gốc đa năng, được tìm thấy trong nhiều loại mô trưởng thành, mô chu sinh và mô thai nhi Hiện nay, MSCs được coi là một công cụ đầy hứa hẹn cho các phương pháp tiếp cận y học tái tạo MSCs đã được sử dụng để điều một số bệnh, bao gồm suy tim, viêm khớp gối, tổn thương tủy sống, phổi tắc nghẽn mãn tính, bại não, loạn sản phế quản phổi, đái tháo đường tuýp II, v.v Tuy nhiên, liệu pháp MSCs có nguy cơ dẫn đến một số biến chứng

Thuyên tắc là một trong những tác dụng phụ nghiêm trọng khi bệnh nhân được truyền MSCs Phản ứng này có thể gây ra các biến chứng nguy hiểm, chẳng hạn như huyết khối tĩnh mạch cửa và thuyên tắc phổi Dấu ấn mô (Tissue Factor - TF, hay protein đánh dấu bề mặt

- CD142), yếu tố khởi đầu con đường đông máu ngoại sinh, được chỉ

ra là tác nhân chính dẫn đến thuyên tắc được ghi nhận ở cả mô hình động vật và bệnh nhân truyền MSCs Do đó, TF/CD142 được đề xuất như một dấu ấn sinh học để dự đoán tình trạng đông máu sau khi truyền MSCs

Biểu hiện của TF/CD142 trên tế bào bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố Trong đó, biểu hiện của protein này bị ảnh hưởng bởi các yếu

tố như môi trường nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, môi trường viêm, nồng

độ oxy sinh lý, tình trạng chết tế bào, v.v Thêm nữa, các dòng tế bào khác nhau có mức độ biểu hiện TF/CD142 khác nhau Tuy nhiên, những nghiên cứu trước đây chỉ thực hiện so sánh theo cặp hai hoặc

ba dòng MSCs, do đó chưa đưa ra cái nhìn tổng quát về biểu hiện TF/CD142 giữa nhiều nguồn MSCs Ngoài ra, những hiểu biết hiện nay về TF/CD142 chủ yếu được khám phá dựa trên MSCs nuôi cấy

trong môi trường có bổ sung huyết thanh động vật, đã được một nghiên cứu chỉ ra là làm gia tăng biểu hiện TF/CD142 và thúc đẩy hoạt tính đông máu Một lý do nữa, biểu hiện của TF/CD142 trong những điều kiện như oxy sinh lý và môi trường cytokine chủ yếu được thực hiện trên các dòng tế bào không phải MSCs Trên cơ sở đó, đề tài nghiên

cứu “Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến biểu hiện của dấu ấn mô

CD142 để dự đoán nguy cơ đông máu ở bệnh nhân truyền tế bào gốc trung mô” được thực hiện nhằm cung cấp thêm hiểu biết về

TF/CD142 trên MSCs nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh

và không yếu tố động vật

Đề tài được thực hiện với các mục tiêu như sau:

1 Đánh giá tổng thể hoạt tính đông máu và biểu hiện TF/CD142 ở các nguồn MSCs khác nhau, bao gồm tủy xương, mô mỡ, dây rốn, tủy răng sữa

2 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng biểu hiện TF/CD142 trên MSCs từ dây rốn, bao gồm:

• Thời gian nuôi

• Mật độ tế bào

• Điều kiện nuôi 2% oxy

• Môi trường cytokine (TNFα và INF-γ)

• Điều kiện rã đông và lưu trữ ngắn hạn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về tế bào gốc trung mô

1.1.1 Sơ lược về tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSCs) là một tập hợp các dòng tế bào gốc đa năng, được tìm thấy trong nhiều loại mô trưởng thành, mô chu sinh và mô thai nhi MSCs có nhiều đặc tính nổi bật có thể kể đến như khả năng tăng sinh mạnh mẽ, cả trong

cơ thể và môi trường nuôi nhân tạo; khả năng điều hòa miễn dịch/chống viêm; khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau

Do tiềm năng biệt hóa lớn nên tế bào gốc trung mô được coi là một công cụ đầy hứa hẹn cho các phương pháp tiếp cận y học tái tạo

1.1.2 Các nguồn phân lập tế bào gốc trung mô

MSCs có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau Một

số nguồn chính cho phân lập MSCs có thể được chỉ ra như tủy xương

mô mỡ, dây rốn, tủy răng, máu ngoại vi, nội mạc tử cung, da, cơ, v.v Trong số những nguồn MSCs này, tủy xương (Bone Marrow-derived Mesenchymal Stromal Cells - BM-MSCs), mô mỡ (Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stromal Cells - AT-MSCs), dây rốn (Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells - UC-MSCs) là các nguồn chính được sử dụng trong nghiên cứu ứng dụng lâm sàng Ngoài ra, tủy răng (Dental Pµlp-derived Mesenchymal Stem Cells - DP-MSCs) cũng là một nguồn hứa hẹn trong y học tái tạo

1.1.3 Tiềm năng trị liệu của tế bào gốc trung mô

Hiện nay MSCs đã và đang được thử nghiệm cho điều trị một loạt các bệnh như nhồi máu cơ tim, bệnh viêm ruột, ung thư, rối loạn

hệ thần kinh, các bệnh về răng hàm mặt, SARS-CoV-2, bệnh Crohn, bệnh ghép chống chủ, v.v Theo Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ,

tổng cộng 9356 thử nghiệm lâm sàng về liệu pháp tế bào gốc trên toàn thế giới đã được đăng ký cho đến ngày 23/3/2023 Trong số đó, 1505 thử nghiệm có liên quan đến liệu pháp MSCs

1.2 Hiện tượng đông máu sau truyền tế bào gốc trung mô

1.2.1 Báo cáo trên mô hình động vật và bệnh nhân

MSCs đã cho thấy những tiềm năng trong ứng dụng y học tái tạo và điều trị bệnh, tuy nhiên vẫn tồn tại những thách thức lớn về vấn

đề an toàn Một số nghiên cứu đã cho thấy MSCs kích hoạt quá trình đông máu và gây ra biến chứng huyết khối ở cả mô hình động vật và trên bệnh nhân điều trị Tỷ lệ tử vong cao ∼85% ở chuột đã được ghi nhận sau khi truyền AT-MSCs qua tĩnh mạch với nguyên nhân là do thuyên tắc phổi Một thử nghiệm khác trên chuột cho thấy tiêm AT-MSCs dẫn đến giảm tuần hoàn máu Kiểm tra sau đó phát hiện có MSCs mắc kẹt trong hệ thống mao mạch, dẫn đến 25-40% động vật tử vong do thuyên tắc phổi

Các biến chứng sau cấy ghép MSCs trên bệnh nhân cũng được ghi nhận Năm 2013, một người đàn ông tại Hàn Quốc đến bệnh viện thăm khám vì cơn đau ngực bắt đầu từ một tháng trước Bệnh viện sau

đó phát hiện nhiều vị trí thuyên tắc trong các nhánh động mạch phổi của cả hai phổi, đồng thời có biến chứng nhồi máu phổi phải Người đàn ông này trước đó đã từng 3 lần truyền tĩnh mạch AT-MSCs để điều trị thoát vị đĩa đệm cột sống Cha mẹ của người đàn ông này cũng thực hiện liệu pháp tương tự năm lần Kết quả chụp cắt lớp phát hiện

cả hai người đều có nhiều thuyên tắc ở cả hai nhánh động mạch phổi kèm theo tràn dịch phổi phải

Trong một báo cáo khác, hai bệnh nhân ghép thận và bệnh thận mãn tính đã trải qua huyết khối sau khi truyền UC-MSCs Vào

ngày thứ hai và thứ ba sau khi truyền, cả hai đều bị đau và sưng gần

vị trí tiêm Siêu âm doppler sau đó đã phát hiện các cục máu đông ở tĩnh mạch gần vị trí tiêm, kèm theo đó là sự gia tăng nồng độ D-dimer trong máu (chỉ số đánh giá mức độ thoái hóa của cục máu đông, phản ánh đã có sự hình thành huyết khối trước đó) Ở pha 1b của nghiên cứu sử dụng MSCs từ nhau thai để điều trị bệnh Crohn, một trong ba bệnh nhân điều trị đã xuất hiện huyết khối tĩnh mạch tại vị trí tiêm Một báo cáo khác ghi nhận đã xuất hiện biến chứng huyết khối trong quá trình truyền MSCs có nguồn gốc từ Huyết khối tĩnh mạch cửa gan trái đã được quan sát thấy bằng siêu âm doppler, cùng với đó là sự gia tăng nồng độ D-dimer sau đợt truyền thứ hai Bệnh nhân sau đó được điều trị bằng thuốc chống đông máu và may mắn không có bất kỳ hậu quả nào

1.2.2 Tác nhân gây đông máu sau truyền tế bào gốc trung mô

Các báo cáo về biến chứng huyết khối sau cấy ghép MSCs đã dẫn đến những nghiên cứu sâu hơn về nguyên nhân của hiện tượng này Xét nghiệm PCR và phân tích tế bào theo dòng chảy sau đó đã chỉ ra mối tương quan giữa hoạt tính đông máu của MSCs và mức độ

biểu hiện cao của protein gọi là dấu ấn mô (tissue factor - TF, hay protein đánh dấu bề mặt - CD142)

1.3 Dấu ấn mô và vai trò

1.3.1 Biểu hiện của dấu ấn mô trong các loại mô, tế bào

Về tổng thể, TF được biểu hiện ở hầu khắp các mô cơ quan trên cơ thể Những tế bào biểu hiện cao TF có thể kể đến như: tế bào phế nang, tế bào sao, nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn, tế bào cơ tim, tế bào quanh thành mạch, v.v Ngược lại, protein TF được tìm thấy rất thấp, hoặc gần như không có ở các dòng tế bào như hồng cầu, bạch

cầu đơn nhân, đại thực bào, v.v Nhìn chung, TF hình thành ranh giới bao quanh các mạch máu và bao phủ các cơ quan để bảo vệ chúng khỏi bị thương và các tình trạng bệnh lý khác Ngược lại, để ngăn chặn

sự kích hoạt đông máu bất thường, TF thường không được biểu hiện

ở các tế bào có sự tiếp xúc trực tiếp với máu

1.3.2 Cấu trúc của dấu ấn mô

TF còn được gọi là yếu tố đông máu III, hoặc thromboplastin

mô hoặc CD142, là một glycoprotein xuyên màng thuộc họ thụ thể cytokine lớp 2 Glycoprotein này được mã hóa bởi gen F3 gồm 6 exon Quá trình cắt nối luân phiên có thể tạo ra 3 dạng đồng phân ARN TF khác nhau, bao gồm TF toàn chiều dài (Full length TF – flTF), TF cắt nối (alternatively spliced TF – asTF) thiếu exon 5, và TF kết thúc sớm Trong đó, dạng TF thứ ba do trong quá trình cắt nối luân phiên còn sót lại một phần của intron 1, dẫn tới kết thúc sớm dịch mã và không thể hình thành protein của nó

1.3.3 Chức năng của dấu ấn mô

TF là một protein đa chức năng TF tham gia vào nhiều hoạt động trên các dòng tế bào và có vai trò quan trọng đối với cơ thể TF tham gia vào nhiều hoạt động, bao gồm truyền tin, hình thành mạch, duy trì sự sống, tăng sinh tế bào, xâm lấn di căn và thậm chí là ngăn chặn sự lây lan của mầm bệnh, kháng khuẩn Tuy nhiên, vai trò chính của TF chính là yếu tố khởi đầu con đường đông máu ngoại sinh

Đông máu là một quá trình sinh lý để bảo vệ cơ thể khỏi bị thương và chảy máu TF đóng một vai trò quan trọng trong quá trình đông máu, bằng cách khởi đầu con đường đông máu ngoại sinh Miền ngoại bào TF không có hoạt tính enzyme, nhưng lại là thụ thể cho yếu

tố đông máu VII (Factor VII – FVII) Sau tương tác, yếu tố FVII sẽ

chuyển thành dạng hoạt động (FVII activated - FVIIa), và khởi động hoạt tính protease kích hoạt con đường đông máu Phức hợp TF-FVIIa lúc này phân cắt protein đông máu FX thành dạng hoạt động FXa FXa sau đó thực hiện phân giải prothrombin thành thrombin Thrombin tiếp tục cắt fibrinogen thành fibrin Fibrin sau đó điều hòa hoạt động của

FV, FVIII và tiểu cầu trong giai đoạn khuếch đại, nhằm tạo ra lượng fibrin ổn định và đủ theo nhu cầu Cuối cùng, fibrin sẽ tham gia tạo thành các cục đông để ổn định và đóng chặt miệng vết thương

1.3.4 Mối liên hệ giữa dấu ấn mô và tế bào gốc trung mô

Tình trạng đông máu gây ra bởi TF trong cấy ghép MSCs vẫn chưa thể tìm được những giải pháp khắc phục triệt để, và do đó vẫn cần thêm những nghiên cứu nhằm nâng cao hiểu biết về mối liên hệ giữa TF và MSCs Luận văn này sẽ tập trung thảo luận về mối liên hệ giữa TF và MSCs trong quá trình cấy ghép Vì vậy, các khía cạnh được thảo luận sẽ liên quan đến các yếu tố trước cấy ghép MSCs như: nguồn MSCs, thời gian nuôi, dung dịch đệm truyền, cũng như các điều kiện sau cấy ghép MSCs như: tình trạng viêm, nồng độ oxy, tình trạng chết

tế bào và các đặc điểm lâm sàng

• TF và các nguồn MSCs

MSCs biểu hiện TF không đồng nhất, tùy thuộc vào nguồn mô phân lập BM-MSCs đã được chứng minh là ít có nguy cơ gây biến chứng huyết khối cũng như mức độ biểu hiện của TF rất thấp Những nghiên cứu khác chỉ ra tỷ lệ biểu hiện TF cao ở các nguồn MSCs như AT-, UC-, DP-MSCs

• TF và môi trường nuôi MSCs

Yếu tố huyết thanh bổ sung vào môi trường nuôi MSCs có thể làm tăng biểu hiện của TF Một nghiên cứu so sánh biểu hiện TF ở

MSCs nuôi trong môi trường có huyết thanh thai bò (fetal bovine serum – FBS) và môi trường chứa dung dịch ly giải tiểu cầu người (human platelet lysate – HPL) đã thể hiện điều này

• TF và thời gian nuôi MSCs

Thời gian nuôi MSCs có thể làm suy giảm biểu hiện của TF Nghiên cứu của Christy đã chỉ ra biểu hiện của TF bị suy giảm khi nuôi lâu dài (lên đến 20 lần nhân đôi tế bào) Sự giảm biểu hiện TF ở các thế hệ nuôi cao hơn có thể làm giảm nguy cơ biến chứng huyết khối khi cấy ghép, nhưng lại tạo ra mối lo ngại khác về đặc tính của MSCs khi mà chúng bị thay đổi theo thời gian

dư thừa có thể làm tăng nguy cơ đông máu

• TF và tình trạng viêm

Điều hòa biểu hiện TF và ảnh hưởng của các yếu tố gây viêm

đã được nghiên cứu kỹ Nhiều yếu tố trong quá trình viêm dẫn tới thay đổi biểu hiện TF, có thể kể đến như: lipopolysaccharide vi khuẩn, histamine, cytokine, MCP-1, CD40L, tế bào T, VEGF, PDGF, v.v Ví

dụ, các cytokine tiền viêm như 6, 17, 1β, TNF-α, IFN-γ,

IL-33 làm tăng cường biểu hiện TF Hiệu ứng này bị giảm bớt bởi các cytokine kháng viêm như IFN-γ, IL-4, IL-10 và IL-13

• TF và nồng độ oxy

Thông thường, MSCs được nuôi trong điều kiện oxy khí quyển (21% ~ 159mmHg), nhưng khi được cấy ghép, chúng sẽ phải tiếp xúc với nồng độ oxy vào khoảng 75-100mmHg trong hệ mạch Trong một nghiên cứu trên MSCs, điều kiện oxy sinh lý được chứng minh là làm tăng biểu hiện TF trên MSCs từ tủy xương lợn, nhưng không làm thay đổi biểu hiện TF trên MSCs từ tủy xương người

• TF và tình trạng chết tế bào

Điều kiện chuẩn bị và bảo quản có những tác động nhất định tới chất lượng tế bào Quy trình rã đông, hoặc những biến cố trong quá trình thao tác có thể dẫn đến chết tế bào và theo nhiều cơ chế khác nhau làm tăng biểu hiện TF

• Biểu hiện của gen mã hóa TF và các gen tiền kích thích/ức chế đông máu

TF được mã hóa bởi gen F3, hay còn gọi là TFF3 Xác định mức độ phiên mã gen TFF3 trên các dòng tế bào sẽ cung cấp thêm

những hiểu biết về biểu hiện của TF đối với hoạt tính gây đông máu trên MSCs Ngoài ra, TF không phải yếu tố duy nhất ảnh hưởng đến hoạt tính đông máu trên MSCs Một số yếu tố khác cũng tham gia quá

trình đông máu, có thể kể đến như collagen-1 (COL1A1) kích thích quá trình đông máu, trong khi TFPI và thụ thể Prostaglandin I2 (PTGIR) ức chế quá trình này

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên các các dòng MSCs người có nguồn khác nhau, bao gồm AT-MSCs, BM-MSCs, DP-MSCs, UC-MSCs Bên cạnh đó, tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn người (Human umbilical vein endothelial cells – HUVECs) được sử dụng như một mẫu đối chứng sinh học

2.2.2 Nuôi tế bào

Phương pháp nuôi tế bào trong môi trường không huyết thanh

và không yếu tố động vật được thực hiện theo quy trình đã được công

bố trước đây

2.2.3 Phân tích thời gian tăng sinh

Thời gian tăng sinh (Popµlation Doubling Time - PDT) của MSCs được thu thập, tính toán và phân tích nhằm xác định sự già hóa của tế bào Phương pháp phân tích PDT được thực hiện theo quy trình

đã được công bố trước đây

2.2.4 Nuôi tế bào ở các mật độ khác nhau

Để phân tích mối tương quan giữa mật độ tế bào và biểu hiện

TF, UC-MSCs ở thế hệ thứ 4 được gieo ở các mật độ khác nhau (2x103,

8x103 và 32x103 tế bào/cm2) trên đĩa 6 giếng với hai lần lặp lại, nhằm thu được tế bào ở các mật độ thưa, trung bình và bão hòa Sau hai ngày nuôi, mật độ bao phủ bề mặt thực tế trên đĩa được đo bằng hệ thống đọc vi bản đa chế độ Tecan Spark 20M Tế bào sau đó được thu bằng TrypLE Select Enzyme và nhuộm bằng kháng thể CD142-PE để phân tích bằng kỹ thuật tế bào theo dòng chảy

2.2.5 Nuôi tế bào trong điều kiện oxy sinh lý

Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oxy sinh lý đối với biểu hiện của CD142, UC-MSCs được nuôi trong điều kiện 37oC, 5%CO2

và 2% oxy bằng tủ nuôi oxy thấp chuyên dụng InvivO2 Sau đó tế bào được xác định biểu hiện của CD142 bằng hệ thống phân tích tế bào theo dòng chảy và so sánh với mẫu nuôi ở điều kiện 21% oxy

2.2.6 Phân tích thời gian hình thành cục fibrin

Quy trình thực hiện phân tích thời gian hình thành cục fibrin được tham khảo từ các tài liệu đã công bố Huyết tương nghèo tiểu cầu được thu thập bằng cách ly tâm máu chống đông ở 2500g trong 15 phút, hai lần MSCs ở thế hệ 4 được hòa trong dung dịch đệm NaCl 0.9% hoặc Ringer’s lactate ở nồng độ 5x104 tế bào/ml Đối với mỗi xét nghiệm, 25μl huyết tương nghèo tiểu cầu được trộn với 50μl dung dịch tế bào trong ống eppendorf 2ml và ủ ở 37°C trong 5 phút Sau đó, 25μl canxi clorua đã được thêm vào với nồng độ cuối là 25 mM để bắt đầu quá trình hình thành cục fibrin Thời gian hình thành cục fibrin được ghi nhận là thời gian từ khi thêm canxi clorua đến khi khối kết

tụ fibrin không bị bong ra khi đảo ngược ống eppendorf

2.2.7 Xử lý tế bào với môi trường có chứa cytokine

Nghiên cứu này sẽ đánh giá ảnh hưởng của hai loại cytokine

là TNF-α và IFN-γ đối với biểu hiên TF trên UC-MSCs Quy trình thí