Tóm tắt khảo sát Điều kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của Độc tố thần kinh bont a và bont b tái tổ hợp từ vi khuẩn clostridium botulinum phân lập tại việt nam

Tóm tắt khảo sát Điều kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của Độc tố thần kinh bont a và bont b tái tổ hợp từ vi khuẩn clostridium botulinum phân lập tại việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Khuất Hoàng Thùy Linh

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH CHUỖI NHẸ ENDOPEPTIDE CỦA ĐỘC TỐ THẦN KINH BoNT/A VÀ BoNT/B

TÁI TỔ HỢP TỪ VI KHUẨN Clostridium botulinum PHÂN LẬP TẠI

VIỆT NAM

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn: TS PHẠM BẢO YÊN

Phản biện 1: TS Lê Thị Thu Hồng

Phản biện 2: TS Nguyễn Văn Sáng

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại Khoa Sinh Học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồi 9 giờ

00 phút ngày 05 tháng 05 năm 2023

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin – Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

Ngày nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang trở thành vấn đề đáng lo ngại trên toàn xã hội Nguyên nhân gây nên ngộ độc thực phẩm có thể đến từ nhiều nguồn khác nhau như dư lượng các chất hóa học trong hoa quả, rau củ, nấm mốc từ thực phẩm bị hỏng và ôi thiu hay đến từ các vi sinh vật khác có khả năng sản xuất độc tố Một số vụ ngộ độc do tiêu thụ pate chay trong khoảng cuối năm 2020 đến 2022 đã dấy lên mối quan ngại sâu sắc về việc thanh kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm hiện nay Các vụ ngộ độc thực phẩm này được xác định

được gây ra bởi vi khuẩn Clostridium botulinum (C botulinum), một loại vi khuẩn kỵ khí có

khả năng sinh độc tố nguy hiểm

Độc tố thần kinh botulinum (BoNT) là loại độc tố mạnh nhất mà con người biết đến

hiện nay được sinh ra bởi các loài vi khuẩn thuộc chi Clostridium BoNT gây tê liệt thần

kinh cơ thông qua việc ức chế quá trình xuất bào tại các synap thần kinh Do độc tính của BoNT có thể gây chết người nên việc phát triển thuốc giải cho độc tố này là vô cùng cần thiết

Để thu được BoNT trực tiếp từ vi khuẩn C botulinum để làm đích phát triển thuốc là

vô cùng khó khăn do điều kiện an toàn phòng thí nghiệm nghiêm ngặt Vậy nên, tổng hợp BoNT tái tổ hợp là sự lựa chọn thích hợp Tuy nhiên, làm việc với độc tố này đòi hỏi điều kiện trang thiết bị đắt đỏ và cũng đặt ra thách thức cho vấn đề an toàn sinh học Việc chỉ tổng hợp chuỗi nhẹ không chỉ đảm bảo các yêu cầu cho một đích phân tử để phát triển thuốc

mà còn giải quyết vấn đề an toàn sinh học

Ở Việt Nam hiện nay, các nghiên cứu về BoNT chỉ mới dừng lại ở cấp độ gen mà chưa có các công trình sâu hơn về protein Vì vậy, với mong muốn có những nghiên cứu về protein

BoNT được sinh ra bởi các chủng C botulinum tại Việt Nam nên đề tài: “Khảo sát điều

kiện biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam” được thực

hiện

Mục tiêu:

Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch chuỗi nhẹ endopeptidase của độc tố thần kinh

BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ vi khuẩn Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam

Nội dung nghiên cứu:

1 Nhân dòng đoạn gen mã hóa cho bonta-lc và bontb-lc từ chủng Clostridium botulinum phân lập tại Việt Nam

2 Khảo sát điều kiện biểu hiện của chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp từ

3 Tinh sạch chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh BoNT/A và BoNT/B tái tổ hợp

4 Xây dựng cách thức đánh giá hoạt tính của chuỗi nhẹ của độc tố thần kinh BoNT/A

và BoNT/B tái tổ hợp trên nền cơ chất peptide đã được thiết kế

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Bệnh ngộ độc botulism và vi khuẩn Clostridium botulinum

1.1.1 Lịch sử và phân loại bệnh ngộ độc botulism

1.1.1.1 Lịch sử bệnh ngộ độc botulism

Ngộ độc botulism là một dạng ngộ độc gây liệt thần kinh cơ cấp tính xảy ra ở người

và động vật có nguyên nhân do nhiễm độc tố thần kinh botulinum (BoNT) (Johnson và Montecucco, 2008) Justinus Kerner là người đầu tiên đã xuất bản chuyên khảo chi tiết đầu tiên về “Fleischvergiftungen” (ngộ độc thần kinh) vào những năm 1820 (Justinus, 1822) Các mô tả đáng tin cậy đầu tiên liên quan đến ngộ độc thịt lại đến từ vụ ngộ độc xúc xích ở Württemberg xảy ra vào cuối thế kỷ XVIII (Geiges, 2002) Qua việc nghiên cứu và thống kê các vụ ngộ độc trên thế giới, các nhà khoa học nhận định rằng các loại thực phẩm gây ra ngộ độc botulism rất khác nhau giữa các quốc gia và phản ánh văn hóa trong thói quen ăn uống của người dân tại quốc gia đó

1.1.1.2 Phân loại bệnh ngộ độc botulism

Bệnh ngộ độc botulism ở người được phân thành năm dạng cơ bản (Johnson và Montecucco, 2008): (1) Ngộ độc qua thực phẩm:, (2) Ngộ độc ở trẻ sơ sinh, (3) Ngộ độc đường ruột ở người lớn, (4) Ngộ độc tại các vết thương, (5) Ngộ độc do điều trị

1.1.2 Thực trạng bệnh ngộ độc botulism hiện nay

1.1.2.1 Thực trạng trên thế giới

Ngộ độc botulism là một bệnh hiếm gặp tại các nước phát triển, tuy nhiên, hằng năm vẫn có các ca tử vong do các biến chứng của bệnh gây ra Tại Pháp, một quốc gia phát triển

tiêu biểu tại châu Âu, mỗi năm có thể xảy ra từ 10 đến 25 vụ Tại Mỹ, trong các năm từ

2001 đến 2017 đã có 326 trường hợp ngộ độc botulism được báo cáo Các vụ ngộ độc thường xảy ra lẻ tẻ và có tần suất trung bình là 19 vụ mỗi năm Nguyên nhân ngộ độc thường đến từ các loại hoa quả hoặc các thực phẩm có nguồn gốc rau củ đóng hộp gây ra Theo thống kê của Hệ thống giám sát bùng phát dịch bệnh do thực phẩm quốc gia Trung Quốc công bố, trong giai đoạn từ tháng 1 năm 2004 đến tháng 12 năm 2020, trên toàn Trung

Quốc đã xảy ra 80 vụ bùng phát ngộ độc có liên quan đến C botulinum với tỷ lệ tử vong lên

đến 14,25% Trong các vụ ngộ độc được thống kê thì ngộ độc do BoNT/A được xác định là phổ biến nhất với tỷ lệ 51,85%, tiếp theo là BoNT/B có tỷ lệ xếp thứ hai thấp hơn về độ phổ biến (33,33%) Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, nguyên nhân chính gây ra các vụ bùng phát ngộ độc đến từ đậu phụ thối và thịt bò khô không được bảo quản và chế biến dung cách

1.1.2.2 Tình hình tại Việt Nam

Tại Việt Nam, các vụ ngộ độc botulism chưa từng được ghi nhận trước đây Tuy nhiên, vụ ngộ độc xảy ra vào tháng 8 năm 2020 do ăn pate chay đã khiến ngành y tế phải nhìn nhận lại nhiều ca bệnh trong quá khứ vì có thể các bệnh nhân tử vong bởi ngộ độc botulism mà không phải là đột quỵ hay một bệnh tiêu hóa cấp tính có triệu chứng tương tự Các mẫu bệnh phẩm trong vụ ngộ độc này được thu thập tại Bệnh viện Chợ Rẫy ghi nhận sự xuất hiện của gen độc tố BoNT/B (Le Quoc Hung, 2021) trong khi kết quả của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương (NIHE) lại cho thấy nguyên nhân gây ra ngộ độc là kiểu độc tố kép A(B) với gen mã hóa cho độc tố B là gen câm [Tang Thi Nga, 2021] Một số vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra vào năm 2021 cũng được xác định có nguyên nhân đến từ thực phẩm

nhiễm C botulinum Trong đó có vụ ngộ độc trẻ sơ sinh ở Hà Nội được xác định nhiễm

BoNT có kiểu độc tố kép A(B) với gen B là gen câm [Tang Thi Nga, 2022]

1.1.3 Vi khuẩn Clostridium botulinum

1.1.3.1 Đặc điểm của vi khuẩn Clostridium botulinum

C botulinum là một vi khuẩn Gram dương có hình que, sống kỵ khí, sinh bào tử, di chuyển được và có khả năng sinh độc tố thần kinh botulinum Các bào tử của C botulinum

có sức đề kháng cao giúp vi khuẩn sống sót trong các điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao,

môi trường có pH thấp hay điều kiện kỵ khí C botulinum tồn tại phổ biến trong môi trường đất, nước và không khí bụi C botulinum sản sinh độc tố trong môi trường kỵ khí như ở

trong các loại đồ hộp hay thực phẩm muối chua có khả năng gây ngộ độc thực phẩm

1.1.3.2 Các con đường gây nhiễm vi khuẩn C botulinum

Nguồn gốc chủ yếu gây nhiễm C botulinum đến từ các loại thực phẩm đóng hộp, đặc

biệt là các loại thực phẩm có độ acid thấp (pH >4,6), thực phẩm chế biến sẵn có liên quan đến khoảng 10% số vụ bùng phát Các trường hợp ngộ độc ở trẻ sơ sinh thường do ăn phải bào tử vi khuẩn có trong thực phẩm, đặc biệt là ăn mật ong có chứa bào tử Các trường hợp ngộ độc đường ruột ở người lớn thường xảy ra trên các bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch Mắt hoặc vết thương hở trên da đôi khi cũng là con đường xâm nhập của vi khuẩn và gây nhiễm độc tố Ngoài ra, nguyên nhân gây ngộ độc đến từ việc đưa trực tiếp độc tố vào cơ thể Những trường hợp này gọi là ngộ độc do điều trị

1.1.4 Triệu chứng và điều trị

1.1.4.1 Các triệu chứng lâm sàng khi nhiễm bệnh

Các triệu chứng lâm sàng của bệnh bắt đầu từ các biểu hiện khó chịu như buồn nôn

và nôn và có thể dẫn đến tử vong trong vòng 24 giờ nếu không được điều trị kịp thời Các triệu chứng đầu tiên thường bắt đầu từ 12- 36 giờ sau khi ăn phải chất độc Nhìn đôi, nhìn

mờ, yếu nhãn cầu, khó phát âm, khó đọc, khó nuốt và khô miệng là các triệu chứng điển hình của bệnh Tùy thuộc vào liều lượng độc tố mà bệnh nhân nhiễm phải mà các triệu chứng xảy ra trong vài giờ hay thậm chí kéo dài trong vài tuần Tuy nhiên, các triêu chứng của ngộ độc botulism thường dễ bị nhầm với triệu chứng của một số bệnh đường tiêu hóa, đột quỵ hay hội chứng Guilain – Barre khiến cho việc chẩn đoán và điều trị gặp nhiều khó khăn hơn

1.1.4.2 Các phương pháp điều trị khi mắc bệnh

Đối với các tình trạng nhiễm độc nhẹ, việc điều trị triệu chứng như hô hấp nhân tạo, đặt ống nội khí quản và mở khí quản, với các trường hợp năng hơn, đặt ống thông dạ dày hoặc nước tiểu sẽ trở thành sự lựa chọn ưu tiên Thuốc chống độc được chỉ định cho các bệnh nhân mắc ngộ độc botulism do nguyên nhân ngộ độc thực phẩm

1.2 Độc tố thần kinh botulinum và các protein trong chuỗi dẫn truyền thần kinh 1.2.1 Độc tố thần kinh botulinum

1.2.1.1 Nguồn gốc và phân loại BoNT

Độc tố thần kinh botulinum có công thức phân tử là C6760H10447N1743O2010S32 là một

protein thuộc nhóm neurotoxin thường do các vi khuẩn thuộc chi Clostridium sinh ra BoNT

là chất độc nhất mà con người biết đến hiện nay với liều gây chết trung bình (LD50) ở người

là khoảng 1,3-2,1 ng/kg khi tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp, 10-13 ng/kg khi hít phải hoặc

1000 ng/kg khi uống (Aoki, 2001)

Theo phân loại truyền thống, BoNT được phân thành 8 kiểu huyết thanh ( từ A đến

H, trong đó, kiểu H mới được công nhận vào năm 2014) được phân biệt với nhau bằng kháng huyết thanh động vật Ngoài ra, một hệ thống phân loại BoNT dựa trên việc phân tích

trình tự gen 16S rRNA cũng được đề xuất bởi Hill và cộng sự cho thấy mối quan hệ về mặt

di truyền của các chủng chứa gen bont với nhau và với các loài khác cùng thuộc chi Clostridium

1.2.1.2 Cấu trúc phân tử của BoNT

Mặc dù có sự biến đổi về trình tự acid amin, cũng như sự khác biệt về miễn dịch học, tất cả các kiểu huyết thanh của BoNT đều có chung một cấu trúc phân tử tương tự với nhau BoNT là một chuỗi polypeptide đơn, không hoạt động, dài 150 kDa Khi hoạt động và có hoạt tính, BoNT tách ra thành cấu trúc chuỗi đôi với chuỗi nhẹ (light chain- LC, có độ dài khoảng 50 kDa) có hoạt tính endopeptidase có khả năng phân cắt protein trong dẫn truyền thần kinh và chuỗi nặng (heavy chain- HC, dài khoảng 100 kDa) được nối với nhau bằng liên kết disulfua Liên kết disulfua, các liên kết không cộng hóa trị và một đoạn duy nhất được cấu tạo bởi đầu tận cùng N của HC, được gọi là "vành đai" bao quanh miền LC

1.2.2 Các protein trong dẫn truyền thần kinh (SNARE)

1.2.2.1 SNAP-25

SNAP-25 là một protein ưa nước gồm 206 acid amin liên kết với màng thông qua các gốc palmityl bằng liên kết thioeste với bốn gốc cysteine có khoảng cách gần nhau ở trung tâm của protein (Hình 4) Các đầu tận cùng amino (-N) và carboxyl (-C) có khả năng bảo tồn cao và cuộn gập liên kết phân tử

Các độc tố thần kinh BoNT/A, E, C1 đã cắt một liên kết peptide đơn ở đầu tận cùng –

C để phân cắt SNAP-25 Để BoNT/E phân cắt SNAP-25 tại Arg180-Ile181 Trong khi đó, SNAP-25 bị phân cắt bởi BoNT/A tại Gln197- Arg198

1.2.2.2 Synaptobrevin (VAMP)

Synaptobrevin (VAMP) là một phần của phức hợp protein SNARE có vai trò kết nối

và hợp nhất túi synap và đóng vai trò trung tâm trong quá trình xuất bào thần kinh gồm khoảng 120 acid amin (số lượng acid amin chính xác phụ thuộc vào nguồn gốc của protein) Các nghiên cứu trước đó đã chỉ ra rằng trong khi BoNT/B chỉ hoạt động đặc hiệu trên kiểu đồng phân VAMP-2 thì kiểu độc tố D, F và G lại phân cắt cả hai kiểu đồng phân

1.2.2.3 Syntaxin

Syntaxin là một họ protein chủ yếu được định vị trong màng trước synap có liên kết với synaptotagmin Syntaxin có vai trò trong điều chỉnh lượng túi synap có sẵn được giả phóng qua quá trình xuất bào Syntaxin có nhiều dạng đồng phân, trong đó, đồng phân syntaxin 1A và 1B xuất hiện với tần suất chiếm ưu thế và liên kết với SNAP-25 và VAMP-2 tạo thành một phức hợp protein SNARE có vai trò quan trọng trong giải phóng chất dẫn truyền thần kinh

1.2.3 Cơ chế cắt protein trong chuỗi dẫn truyền thần kinh của BoNT

Các BoNT ngăn chặn sự giải phóng Acetylcholine (Ach) từ các đầu mút vận động khiến cho các cơ xương không thể co lại mặc dù vẫn xuất hiện các điện thế hoạt động đi đến

1.3.2.2 Vector biểu hiện

Việc sử dụng các vector biểu hiện khác nhau sẽ ảnh hượng đến khả năng biểu hiện đoạn gen mục tiêu do sự khác nhau của promoter có mặt trong vector hoặc các cấu trúc được dung hợp trong vector có thể ảnh hưởng đến quá trình hòa tan protein tái tổ hợp trong

vật chủ E coli Promoter là yếu tố được quan tâm đầu tiên khi lựa chọn vector biểu hiện do

đây là yếu tố quyết định cường độ và thời gian phiên mã (Papaneophytou, 2014) Vì vậy, chỉ khi vector được lựa chọn có một promoter đủ mạnh thì protein tái tổ hợp quan tâm mới

được biểu hiện nhiều và phù hợp với mục đích biểu hiện Tuy nhiên, nếu protein tái tổ hợp

là độc hại thì vector được lựa chọn nên có promoter làm giảm khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp

1.3.2.3 Vật chủ (dòng tế bào biểu hiện)

Các chủng E coli dùng trong biểu hiện cũng là một yếu tố gây ảnh hưởng đến quá

trình biểu hiện protein tái tổ hợp Tùy vào mục đích và vector tái tổ hợp mà dòng tế bào biểu hiện được lựa chon là khác nhau Đôi khi để biểu hiện một số protein khó biểu hiện như protein màng, protein chứa các codon hiếm, protein chứa liên kết disulfide hay protein gây độc cho tế bào, các vật chủ được lựa chọn để biểu hiện protein tái tổ hợp phải được biến đổi để có thể biểu hiện được các protein trên (Papaneophytou, 2014) Thêm vào đó, việc promoter hoạt động quá mạnh mẽ cũng có thể gây ức chế hoạt động chủa tế bào biểu hiện hoặc gây chết tế bào

1.3.2.4 Các điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ được sử dụng trong qua trình biểu hiện ảnh hưởng đáng kể đến kết quả thu được (Francis, 2010) Việc sử dụng nhiệt độ cao trong quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp

có thể thúc đẩy quá trình tăng trưởng tế bào, tuy nhiên, do tốc độ tăng trưởng tế bào cao nên

có thể dẫn tới xác suất mất plasmid cao hơn và kích thích phân chia sai vector biểu hiện dẫn đến không biểu hiện được gen tái tổ hợp, đặc biệt là đối với tế bào mang plasmid được biểu hiện (Ramirez,1994) Trong điều kiện nhiệt độ thấp, protein được phiên mã và dịch mã chậm hơn, tế bào cũng phân chia chậm hơn giúp protein tái tổ hợp sau khi được tổng hợp sẽ cuộn gấp đúng như mong muốn (Papaneophytou, 2014)

Nồng độ chất cảm ứng cũng ảnh hưởng đến lượng protein tái tổ hợp có thể thu được sau biểu hiện Ngoài ra, nồng độ chất cảm ứng, tiêu biểu là IPTG, được sử dụng trong quá trình biểu hiện cũng quyết định khả năng hòa tan của protein tái tổ hợp được biểu hiện (Ramirez,1994) Vì vậy, cần giữ nồng độ chất cảm ứng ở một mức phù hợp đối với từng loại protein được biểu hiện Theo nghiên cứu của Ramirez và cộng sự (1994) thì nồng độ IPTG phù hợp được sử dụng trong quá trình biểu hiện nằm trong khoảng từ 0 đến 1 mM Ngoài ra chất cảm ứng được sử dụng trong biểu hiện cũng được quyết định bởi vật chủ được lựa chọn cho biểu hiện Vì vậy, tùy thuộc vào vật chủ được lựa chọn mà quyết định khoảng nồng độ chất cảm ứng và chất cảm ứng phù hợp

1.3.2.5 Phương pháp nuôi cấy

Việc lựa chọn phương pháp nuôi cấy phù hợp giúp tối đa hóa lượng protein tái tổ hợp sau biểu hiện thu được Mỗi phương pháp lại có ưu và nhược điểm khác nhau, tùy thuộc vào loại protein tái tổ hợp cần biểu hiện, tế bào biểu hiện được lựa chọn cùng với các điều kiện nuôi cấy và điều kiện phòng thí nghiệm mà lựa chọn phương pháp nuôi cấy phù hợp nhất

1.3.2 Một số phương pháp đánh giá hiệu quả biểu hiện của protein tái tổ hợp

1.3.3.1 Đánh giá hiệu quả biểu hiện bằng điện di SDS-PAGE

Điện di polyacrylamide với SDS là một kỹ thuật thường xuyên được sử dụng trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích phân tách các protein được mô tả bởi Laemmli (Laemmli,1970) Kỹ thuật này được mô tả trong quá trình Laemmli nghiên cứu một protein không rõ nguồn gốc di truyền được gọi là IP trên phage T4

1.3.3.2 Đánh giá hiệu quả biểu hiện bằng Western blotting

Western blotting (WB) hay còn được gọi là protein blotting hoặc immunoblotting là

kỹ thuật được phát triển từ DNA (Southern) blotting và RNA (Northern) blotting do Towbin

và cộng sự mô tả (Towbin, 1979) Đây là kỹ thuật thường được sử dụng trong xác định protein WB cho phép chuyển protein từ gel SDS sang màng hấp phụ sau đó sử dụng các mẫu dò kháng thể chứa các kháng thể chống lại các protein cần phân tích cùng với các bước hiện màu giúp khẳng định sự có mặt của protein quan tâm

1.3.3.3 Đánh giá hiệu quả biểu hiện bằng ELISA

ELISA hay xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme được mô tả độc lập lần đầu vào năm 1971 bởi Engvall và Perlmann và bởi van Weemen và Schuurs ELISA khác với các phương pháp cổ điển ở chỗ các tương tác kháng nguyên-kháng thể cụ thể được nhận

ra bởi sự kết hợp của một chất đánh dấu enzyme và một chất phản ứng, thường là kháng thể

Do có độ nhạy cao mà các chất đánh dấu enzyme có thể được phát hiện bằng phản ứng với chất nền thích hợp Hơn nữa, các bước của phản ứng ELISA gồm các thành phần phản ứng

và không phản ứng được tách ra riêng biệt cho phép các thành phần không phản ứng và có thể ức chế không liên quan dễ dàng được loại bỏ

1.3.3.4 Đánh giá hiệu quả biểu hiện bằng thử hoạt tính

Một trong số các phương pháp được dùng để đánh giá hiệu quả của biểu hiện protein, đặc biệt là protein tái tổ hợp là thử hoạt tính của protein đó với cơ chất đặc hiệu Tùy vào đặc tính của protein được biểu hiện mà sử dụng các phương pháp thử hoạt tính khác nhau

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên, vật liệu và thiết bị

2.1.1 Mẫu DNA của vi khuẩn C botulinum

Mẫu DNA tổng số Cb được phân lập từ chủng vi khuẩn C botulinum Cb chứa đoạn gen mã hóa cho bontb-lc và mẫu DNA tổng số của chủng C botulinum NIFC 672 chứa đoạn gen mã hóa cho bonta-lc và bontb-lc được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ

sinh thực phẩm Quốc gia (NIFC) Các mẫu được bảo quản ở -20oC

2.1.2 Mẫu dịch tiết ngoại bào cho phản ứng cắt cơ chất

Các mẫu dịch tiết ngoại bào chứa một lượng nhỏ BoNT/A và BoNT/B được cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (NIFC) Các mẫu này được dùng làm đối chứng cho quy trình thử hoạt tính của BoNT/A-LC và BoNT/B-LC tái tổ hợp trên nền cơ chất được thiết kế

2.1.3 Các hóa chất và nguyên liệu khác

Các chủng vi sinh vật được sử dụng bao gồm chủng E coli TOP10 (Novagen, Mỹ), chủng E coli BL21 (DE3)- RIL (Novagen, Mỹ), chủng E coli C41 (Lucigen Corp, Anh)

được bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các vector thương mại sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm vector tách dòng pGEM-T (Promega, Mỹ), vector biểu hiện pET-22b(+) (Novagen, Mỹ) và pETM33-Nsp5-Mpro (Addgene, Mỹ)

Các cặp mồi sử dụng trong PCR, nhân dòng được trình bày trong Bảng 1 Đoạn gen

bonta-lc và bontb-lc được khuếch đại lần lượt bằng hai cặp mồi bonta và bontb có trình tự

mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) đã được công bố trong nghiên cứu trước đó (La Thi Huong Huyen, 2021) được thiết kế ở hai vị trí khác nhau nhằm xác định chính xác trình tự gen