Xác Định biến thể gen brca1, brca2 của người bệnh ung thư tuyến tiền liệt bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới tại bệnh viện bạch mai

cô dột biền gen BRCA1, BRCA2 Chinh vi vậy việc phàn tích các gcn BRCAÌ.BRCA2 đê xác định các biến thê gây bệnh dang trờ thành một vấn dè thict yếu trong việc phát hiện sớm.. Hơn nữa các

NGUYÊN THỊ HOÀI

XÁC ĐỊNH BIẾN THÊ GEN BRCAÍ, BRCA2 CỦA

NGƯỜI BÊNH UNG THƯTUYÉNTIẺN LIỆT BÀNG KỶ THUẬT GIẢI TRÌNH TỤ THÉ HỆ MÔI TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI

LUẬN VÀN THẠC sỉ

HÀ NỘI - 2024

NGƯYẺN THỊ HOÀI

XÁC ĐỊNH BIÉN THÊ GEN IỈRCA1, BRCA2

CỦA NGƯỜI BỆNH ƯNG THƯTƯYÉN TIẾN LIỆT BANG KỲ THUẬT GIÃI TRÌNH TỤ THẺ HỆ MỚI

TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI

Chuyên ngành: Y sinh học (li truyền

Mi sổ: 8720101

LUẬN VÀN THẠC Sĩ ĐỊNH HƯỚNG ỦNG DỤNG

Cản bộ hướng dẫn khoa học;

1 PGS TS BS Lương Thị Lan Anh

2 PGS TS BS Phạm Câm Phương

HÀ NỘI - 2024

Dê hoàn lluình lu (in vãn này tôi xin bày to lông hiêt <nt chùn thành tới Ban giâm Ini’ll Phòng Dào tụo sau (lụi học Trường Dụi học T Hà Nôi (ỉà tựo (lieu kicn cho tòi trong suot quà trinh hục tàp và hoàn thiỳn ỈU(in vàn.

Tôi xin bày to lòng kinh trọng và biẽt ơn sâu sãc tời toàn thê cãc Thây cô Bộ môn Y Sình học • Di tmyên Trường Dại học Y Hà Nội dã dạy dô và tạo diêu kiện cho tôi trong suòt quà trình học tập và nghiên cữu.

Tôi xin già lởi cam ơn den các anh chị dồng nghiýp tụi Trung tâm Y hục hụt nhàn và Ung bườu Bộnh viýn Bạch Mai dã ho trự tôi rat nhiều trong quà trinh thực hiện nghiên cừu.

Tôi xin bày tó lòng kinh trọng và bĩèt ơn sâu sac tời PGS.TS.BS Lương Th Ị Lan Anh và PGS.TS.BS Phạm Câm Phương, dà luôn lụn tình hưởng dan và chi bao tôi trong quà trinh học tập nghiên cữu Sự dộng viên, dìu dắt cua hai cô dã giúp tôi

cô thèm nghị lực de vượt qua những khò khản và hoàn thành nghiên cữu này Tôi xin chân thành cam im các Thây cô trong Hội dòng dà dọc và dõng góp nhiêu ỳ kiên quý bàu cho ban luận vân này.

Cuôi cùng, vời những tinh cam dậc biét lôi xin bày to lòng biêl ơn sâu sàc tới gia dinh, bọn bè và dõng nghiệp dà luôn dộng viên, khích lộ và giúp dờ lõi trong quã trình học lập và nghiên cữu.

Hà Nội ngày thùng 10 năm 2024

Tác giá luận vàn

Nguyen Thị Hoài

truyền, xin cam đoan:

I Đây là luận vân do ban thán tỏi trực ticp thực hiện dưới sự hướng dẫn cua PGS.TS Lương Thị Lan Anh và PGS.TS Phạm Câm Phương

2 Nghiên cứu này không trũng lập với bất ki nghiên cứu nào khác dà được công bố tại Việt Nam

3 Các số lieu và thỏng (in trong nghiên cứu là hoãn toàn chinh xác trung thực

Viết tất Tiếng Anh Tiếng Việt

ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate Chat ức che kẽo dãi chuồi cua

DNA polymerase

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynbonucteotide triphosphate

FDA Food and Drug Administration Cục quan lý Thực phâm vã Dược

phàm Hoa Kỳ

đồngHRR Homologous Recombination Repair Sửa chừa tãi tồ hợp tương dồng

MLPA Multiplex Ligation - dependent probe

Amplification

Kỳ thuật khucch dụi da dầu dò phụ thuộc hệ thống ghép kênhMNP Multiple - nucleotide polymorphism

NCCN National Comprehensive Cancer Netw­

ork

Mạng lưới ung thư quốc gia Hoa

Ky 'NER Nucleotide excision repair Sứa chửa cảt bo nucleotideNGS Next Generation Sequencing Giai trinh tự thè hộ mới

NHEJ Non homologous end joining Nối dầu không tương dồng

NIH National Institutes of Health Viện nghiên cứu Sức khoe Quổc

SNP Single Nucleotide Polymorphism Da hĩnh đơn nucleotide

SNV Single nucleotide variant Biến thế đơn nucleotide

DẠT VÁN DÈ 1

CHƯƠNG 1: TÓNG QƯAN TÀI LIỆƯ 3

I.I Dịch tề bệnh ung thư tuyền tiền liệt 3

1.1.1 Thế giới 3

1.1.2 Việt Nam 3

1.2 Biêu hiện lâm sàng cua ung thư tuyến tiền liệt 4

1.3 Các gen liên quan đến ung thư tuyến tiền liệt 5

1.4 Vai trò cua gcn BRCAI BRCA2 trong bệnh sinh cua ung thư tuyến tiền liệt 6 1.4.1. GenBRCAi 6

1.4.2 Gcn BRCA2 8

1.4.3 Vai trỏ cua protein BRCAÌ vả ỈỈRCA2 trong sứa chừa DNA 9

1.4.4 Ý nghĩa làm sàng cùa đột biển gen BRCAỈ BRCA2 trong bệnh lý ung thư tuyển tiền liệt 12

1.5 ứng dụng xét nghiệm gen BRCA ờ người bệnh ung thư tuyên liền liệt 13 1.6 Các phương pháp khao sát dột biến gen BRCAÌ, BRCA2 14

1.6.1 Phương pháp giai trinh thể hệ thử nhất 14

1.6.2 Phương pháp khuếch dại đa đau dò dựa vào hệ thong ghép kenh 17

1.6.3 Phương pháp giài trinh tự the hệ mới 18

1.7 Các nghiên cứu trong vã ngoài nước về đột biến gen BRCAI/2 ớ người bệnh ung thư tuyến tiền liệt 19

1.7.1 Tinh hình nghiên cứu ngoài nước 19

1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

CHƯƠNG 2: ĐỚI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIẾN cửu 21

2.1 Đổi tượng nghiên cứu 21

2.1.1 Tiêu chuân lựa chọn 21

2.2.1 Địa diem nghiên cứu 21

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 21

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.4 Cờ mẩu 21

2.3 Các biển số chi só nghiên ciru 22

2.4 Quy trinh nghiên cứu 25

2.4.1 Các bước quy trinh nghiên cứu 25

2.4.2 Trang thict bị và hoá chất 26

2.4.3 Quy trinh xét nghiệm đột biển BRCAÌ/2 trong mẫu mô u băng kỳ thuật giái trinh tự thế hệ mới 28

2.4.4 Quy trinh xét nghiệm đột biến gen BRCAI BRCA2 trong mẫu máu bang kỳ thuật giai trinh tự Sanger 29

2.5 Phương pháp phân tích và xư lý sổ liệu 29

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 30

2.7 Sơ đồ nghiên cửu 31

CHƯƠNG 3: KÉT QƯÁ 32

3.1 Thông tin chung ve đối tượng nghiên cứu 32

3.2 Các biến thê gen BRCAI và ỈỈRCA2 ớ người bệnh ung thư tuyển tiền liệt 34 3.3 Nhận xét một sỗ đặc diêm lâm sàng, cận lâm sảng cua người bệnh ung thư tuyền lien liệt cô biến thê gây bệnh gen BRCA2 40

3.3.1 Tuôi mắc bệnh cũa người bệnh ung thư tuyến tiền liệt có bicn thê gây bệnh gen BRCA2 40

3.3.2 Dặc diêm lâm sàng, cận lâm sàng cua người bệnh ung thư tuyến tiền liệt có biến thê gen IỈRCA2 41

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 57

4.1 Đặc diêm chung VC doi tượng nghiên cứu 57

4.2 Các biến the gen BRCAI và BRCA2 ó người bệnh ung thư tuyến tiền liệt 57 4.2.1 Tỳ lệ người bệnh ung thư tuyền lien liệt có biến the gen BRCA 57

4.2.2 Mỏ ta biến the gen BRCA2 ờ 5 người bệnh ung thư luyến tiền liệt 59 4.3 Nhận xét một sỗ dặc diêm làm sàng, cận lâm sàng cùa người bệnh ung thư tuyền tiền liệt có bicn thê gcn BRCAỈ. BRCA2 62

4.3.1 Tuổi mắc bệnh cũa người bệnh ung thư tuyến tiền liệt có bicn the gen BRCA2 62

4.3.2 Đặc diêm lãm sàng, cận lãm sàng cua người bệnh ung thư tuyển tiền liệt có biến the gen BRCA2 63

4.3.3 Phân tích đặc diêm lâm sàng ơ những người bệnh mang biển thê gây bệnh Iren gen BRCA2 64

4.4 Hạn chế cua nghiên cứu 69

KÉT LUẬN 70

KIÊN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHÀO

PHỤ LỤC

Bang 2.1 Các biền số chung VC đói tượng nghiên cữu 22Bang 2.2 Các biển số chi sỗ theo mục tiêu nghiên cửu 1 22Bang 2.3 Cãc biền sỗ chi sổ theo mục tiêu nghiên cứu 2 24Bang 2.4 Phân loại diêm dự doán kha nâng gày bệnh cua các cóng cụ tin sinh 26Bang 2.5 Thiel bị sinh học phân tứ chinh sứ dụng trong nghiên cứu 26Bang 2.6 I loá chất sinh học phân tứ sứ dụng chinh trong nghiên cứu 27

Bang 3.3 Tiền sứ gia dinh cua người bệnh ung thư luyến lien liệt 33Bang 3.4 Tý lộ biển thế gen ỈỈRCA trong nghiên cứu 34Bang 3.5 Mô ta biến the gen BRCA2 ơ 5 người bệnh ung thư tuycn lien liệt 35Bâng 3.6 Phân loại các biển thê gen BRCA2 theo Clinvar vã ACMG AMP 36Bang 3.7 Phán tích khá náng gây bệnh các biến thê ó người bệnh ung thư tuyên

tiền liệt theo tiêu chi cùa Hiệp hội bệnh học Phân tư và Di truyền Y học Hoa kỳ .37

Bang 3.8 Phân tich khã nâng gãy bệnh cũa các bien the ờ người bệnh ung thư

tuyến liền liệt bang câc công cụ tin sinh 39

Bang 3.9 Tuổi míc bệnh cùa người bệnh ung thư tuyến tiền liệt có biển thê gây

bệnh gen BRCA2 40

Bang 3.10 Một sổ dục diêm lãm sàng, cận lãm sàng cùa 5 người bênh ung thư

tuyến liền liệt cô biến thế gày bệnh gen BRCA2 41

I linh I I Số trường hợp ung thư mắc mới trên toàn thế giới năm 2022 3

Hình 1.2 Sơ đổ nhiễm sắc the 17 và vị tri gcn BRCA1 6

Hình 1.3 Cầu trúc protein RRCAI 7

Hĩnh 1.4 Sơ đồ nhiễm sắc thè 13 và vị tri gen BRCA2 8

I linh 1.5 Cẩu trúc protein BRCA2 8

I linh 1.6 Vai trò cua protein BRCA/ và RRCA2 trong sứa chừa DNA 11

Hình 1.7 Sư đo dỏng thời gian cua các công nghệ được sứ dụng đê phát hiện các dột biến gen BRCA 14

Hình 1.8 Nucleotide có gắn nhỏm 3'-OH so với nucleotide không có 15

I linh 1.9 Quy trinh kỳ thuật giai trinh tự Sangcr 16

Hình 1.10 Quy trinh kỳ thuật MLPA 17

Hình 1.11 Quy trinh kỳ thuật giai trinh tự thế hộ mới 19

Hình 3.1 Biêu đồ mỏ ta ti lệ biến the gcn BRCA1/2 32

Hình 3.2 Dừ liệu phân tích kha nâng gây bệnh cua biến thê c.7879A>T sư dụng phần mem Polyphen - 2 40

Hình 3.3 Kct qua chụp CT cho thấy nhiều di căn tiêu xương ơ xương dốt sống và xương chậu vào tháng 4 nám 2021 (mùi tên) 43

Hình 3.4 MR1 tuyến tiền liệt cho thấy dường viền lồi cua tồn thương bao tuyến tiền liệt ờ T2W (mùi tên) 44

Hĩnh 3.5 Ket qua chụp CT cho thấy nhiêu sự kết hợp giừa di cân huy xương và nguyên bào xương vào tháng I núm 2022 (mùi lên) 45

I linh 3.6 I linh ánh tôn thương phối và hạch chậu trên cắt lớp vi tinh 48 Hình 3.7 Chụp MRI tuyến tiền liệt cho thấy tòn thương giam tin hiệu T2 xâm lẩn đến bàng quang (mũi rèn mâu vàng) và hạch chậu chung trái (mùi tên đò) 50

Hĩnh 4.1 Tần suất dột biến gcn RRCA2 ờ người bệnh ung thư tuyến tiền

liệt trong một so nghiên cửu 58

Hình 4.2 Cấu trúc cùa gcn BRCA! và HRCA2 hiên thị các vùng mâ hỏa

các miền protein dược xác dịnh RCCR và OCCR 59

Sơ đò 2.1 Sơ đô nghiên cứu 31

Sơ dồ 3.1 Vị trí tương dối các biến thê dược xác định trcn gen BRCA2 35

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phà hệ cùa người bệnh 01 43

Sơ dô 3.3 Sơ dó pha hộ cua người bệnh 02 47

Sơ đồ 3.4 Sơ dồ phã hộ của người bệnh 03 50

Sơ đồ 3.5 Sơ đồ pha hệ cùa người bệnh 04 52

Sơ dỗ 3.6 Sơ dỗ phá hộ cùa người bệnh 05 54

ưng thư lã một trong những nguyên nhãn gây tứ vong hãng đàu và là ráo cân lớn trong việc lủng tuổi thọ ờ mọi quốc gia trên thế giới.1 Theo thống kè cua GLOBOCAN năm 2022 linh hình măc mới và tu vong do ung thư trên toàn thế giới

CÓ xu hường tảng Ước tinh có khoang gần 20 triệu ca ung thư mắc mới và gần 10 triệu ca tư vong do ung thư.2 Trong dó ung thư tuyền tiên liệt (UTTTL) lã loại ung thư hay gặp (hữ hai ờ nam giới và là nguyên nhãn gày tư vong do ung thư đứng thử

5 ơ nam giới.2

Tại Việt Nam theo thống ke cùa GLOBOCAN nãm 2022 UTTTL củng lã một trong 5 k\u ung thư phô biến nhất ờ nam giới vời gần 6.000 ca mac mới và 2.800 ca

lừ vong do ung thư?

Hiện nay cỏ nhiều nghiên cứu VC UTTTL dà lãm sủng to các vấn de ve sinh bệnh học chấn đoán và diều trị ƯTTLT Một trong những nguyên nhân dược nhẳc den nhiêu nhất lã đột biền gcn BRCAỈ, BRCA2 ớ người bệnh UTTTL Đột biến gen

BRCA1, BRCA2 không chi làm làng nguy cơ mầc UTTTL mà còn liên quan den sự tiến trièn nhanh các giai doạn cua bệnh, dáp ứng diều trị kém và lien lượng xấu ư người bệnh mắc UTTTL khảng cắt tinh hoãn, di cản 4' Theo khuyến cáo cùa Mạng lưới ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCCN National Comprehensive Cancer Network) nhưng người bệnh ƯTTTL kháng cắt tinh hoàn, di cân cỏ dột biền tề bào dòng mam (germline) và te bão sinh dường (somatic) hong các gen sưa chừa tãi tố hợp tương dồng (IIRR Homologous Recombination Repair) như BRCAỈ BRCA2 ứưọc dự đoản đáp ứng tốt với các chất ức chế poly-ADP nbose polymerase (PARP1 - Poly ADP nbose polymerase inhibitors) như olaparib rucaparib và niraparib* Từ năm

2020 Cục quan lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA - Food and Dnig Administration) đà chắp thuận việc sứ dụng các chắt ức chc PARP1 như Olaparib hay rucapanb trong diêu trị ƯTTTL kháng cắt linh hoãn, di càn cô dột biền gen BRCA1,

BRCA2 Chinh vi vậy việc phàn tích các gcn BRCAÌ.BRCA2 đê xác định các biến thê gây bệnh dang trờ thành một vấn dè thict yếu trong việc phát hiện sớm diều trị hiệu qua bệnh lý UTTTL

Tụi Việt Nam hiện các nghiên cứu vè phân tich biến thê gen BRCAI BRCA2 ứ người bệnh UTTTI còn hạn chề it thông tin Các gen BRCAI HRCA2 có kich thước khá lớn đột biển năm rái rác nên việc sứ dụng các kỹ thưật như giái trinh tự the hộ thử nhât (Sanger) kẽt hợp phương pháp khuếch dại da dâu dò phụ thuộc hộ thong ghép kênh (MLPA • Multiplex Ligation • dependent probe Amplification) gáy lốn kém về chi phí và thời gian tra kết quá Ngoài ra phần lớn các nghiên cứu trong

vả ngoải nước hiện chi dùng mầu máu người bênh dê xét nghiệm Như vậy chi ghi nhận dược 11 lệ dột biến te bào dóng mầm mã bo sõt ti lệ dột biến te bảo smh dường

Vả trong các bệnh lý ung thư mầu mô u vùi nen (FFPE Formalin - fixed paraffin • embedded) là loại màu có thê giúp bào quan cấu trúc mô nguyên vẹn thời gian dài Đây cũng là nguồn nguyên liệu phong phũ cho nghiên cứu hồi cứu VC ung thư mõ bệnh hục di truyền phân tứ Hơn nữa các hiệp hội ung thư trên thè giới cũng khuyên nghị xét nghiêm gen BRCA trong ƯTTTL nên dược dề xuất trên ca mô khối

u và màu mâu, dè phát hiện các biến thê gảy bệnh tế bào dòng mầm và tề bào sinh dường.'*9 Với tiến bộ s ượt bậc cua khoa học vã công nghệ, gìái trinh tự thề hệ mới (NGS - Next sequencing) dược de xuất như lá phương án thay the hửu hiệu vá kha thi cho phát hiện biến thê ơ hai gen này Vi vậy chúng tỏi thực hiện de tài: "Xác dinh biển thí* gen BRCAỈ, BRCA2 cùa người bệnh ung thư tuyển tiền liệt bang kỹ thuật giái trinh tự thể hệ mới tại bệnh viện Bạch Mai" Nhằm dạt dược mục tiêu sau:

/ 1/(5 tá các biền thể gen BRCA I, BRCA2 ở người bịnh CTTTL bằng phương pháp giãi trình tự thể hệ mới.

2 Nhận xét một sơ đặc them Him sàng, cận lâm sùng của người bệnh CTTTL

cỡ biển thể gen BRCAI, BRCA2.

w 1

CHƯƠNG ITÒNG QI AN TÀI LIỆU

1.1 Dịch tễ bệnh ung thư tuyền tiên liệt

Tại việt Nam UTTTL có xu hường tăng nhanh ve ti lệ mac mõi hẫng nảm Theo thống kẽ cua GLOBOCAN nám 2022 ƯTTTL chiếm 6.2% tồng sỗ ca ung thư mắc mới Đứng thữ 7 trong các loại ung thư phô biền nôi chung cho ca hai giới, và xếp thử 5 trong các loại ung thư phồ biến ỡ nam giới?

1.2 Biếu hiện lâm sáng của ung thư tuyền tiền liệt

UTTTL cô biêu hiện không đồng nhắt về mật làm sàng nhiều người bệnh có mức độ ác tinh cao tiền tnền nhanh, di cản sớm Nhưng cũng có những người bệnh phát tnỡi chậm vã xu hướng tiến tnẻn thấp

Ớ giai đoạn dầu bệnh thưởng phát triển chậm không triệu chứng Neu phát hiện và điều trị kịp thời, người bệnh cô thê sồng thêm được nhiều năm, thậm chi là chữa khỏi hoán toán Ớ giai đoạn muộn, ung thư tiền triền rất nhanh cỏ khá nâng gây tư vong ƯTTTL có 4 giai đoạn như sau:

• Giai đoạn I: Mó ung thư dược phát hiện ớ tuyển tiền hệt tròng giống như mỏ tuyến tiền hệt bình thưởng

• Giai đoạn II Khối u khu trú trong tuyển tiền hột cô thê được phát hiện khi thăm khám trục trâng, xêt nghiệm PSA trong máu hoặc cat dòt tuyến tiền hệt nội SOI

Giai đoạn III: ung thư xâm lẩn mò xung quanh tuyến tiền hệt tin tinh

• Giai đoạn IV Te bào ung thư di cân tỏi hạch bạch huyết xâm lấn cơ quan lán cận như trực trâng, báng quang, hoặc di cản xa den xương, gan phổi

Ve mật mỏ học các khối u trong ƯTTTL được đảnh giá mức độ ác tinh theo thang diem Gleason Diem Gleason được tinh bảng tỏng điểm cua hai mô hình mô học chicm ưu the nhắt trong khối u mồi mỏ hình dược chẩm diêm tứ 1 den 5 cắp

độ càng thấp, te bảo ung thư càng giống tế bào binh thường

Hộ thống phân loại mô bệnh học mới nhất cua UTTTL dựa trên hội nghị dồng thuận cua Hiệp hội quốc tế vẻ bệnh học tict niệu 2014 (ISUP International Society

of Urological Pathology) Hệ thống này chia ra 5 dộ dựa trên diêm Gleason như sau:

1.3 Các gcn liên quan den ung thư tuyền tiền liệt

Nguyên nhãn gây ung thư lâ sự két hợp cũa yểu tổ di truyền và tác động lừ yếu

tố môi trường Sự thay đổi di truyền cùa các hệ thống điều hoâ tế hão lã cơ sớ chinh gãy ung thư Các bắt thường di truyền có thê anh hướng lẽn nhiêu gcn có nhiệm vụ kiêm soát quá trinh phát triên và phân chia cua te bào (gen ức che khối u) Dột biên cũng có thế biến một gen binh thường trơ thành gen sinh ung thư (oncogene) Hat loại gcn có vai trò chinh trong ung thư là gcn ức chế khối u và gcn sinh ung thư.Gen ức chề khối u lả những gcn binh thưởng cỏ chức nâng lãm chậm lại quả trinh phân chia tế bão sưa chữa những DNA bị lồi hoặc khơi động quả trinh "chết theo chương trinh” cua tề bào (apoptosis) Khi gcn ức chế khối u không hoạt động binh thường, te bào có thê phát triền vả nhân lên vỏ kiêm soát, dần tới ung thư Sụ bat thường cua gcn ửc chẽ khôi u có thê là từ di truyền, nhưng da sô là do mac phai.Gen sinh ung thư (oncogene) là nhóm gen thử hai có the gây ung thư Hầu hết các gen ung thư có nguồn gổc lừ các gen tiền ung thu (proto - oncogene), binh thường các gcn này có chức nâng giúp tế báo lớn lên vả phân chia Khi gen tiền ung thư bị dột biển hoặc cỏ số lượng quá nhiêu, nõ có thê hoạt dộng quá mức vả trơ thành gcn sinh ung thư khiến tề bào phảt triền ngoài tầm kiêm soát, phàn chia vỏ độ dẫn tới ung thư Một số ít ung thư xay ra do đột biến gen lien ung thư di truyền, tuy nhiên da sô lã do dột biên gen tiên ung thư mẳc phai

Sự khác biệt quan trọng giữa gcn sinh ung thư và gen ức che khối u trong bệnh ung thư là gen sinh ung thư lã kết qua cùa việc kích hoạt quá mức gen lien ung thư còn gcn ức chế khối u gảy ra ung thư bới chủng bị bất hoạt

Người ta ước tinh rang 5-9% các trưởng hợp ƯTTTL và khoang 12% các trương hợp UTTTL di càn lã do yếu tổ di truyền.10

Các nghiên cứu gân đày đà chi ra rang sự biển dỏi Ư các gcn liên quan đèn quá trinh sứa chùa tôn thương DNA đóng vai trò quan trọng trong quá trinh phát triển và biệt hoá cua ƯTTTL Nhỏm gen nãy gồm cãc gen sừa chùa không khớp như AU w/ MSH2 MSHo PMS2 vá các gen tái tố hợp tương dồng BRCA1

BRCA2 ATM PALB2.CHEK2

Ngoài ra còn một số gen khác cùng được chững minh có liên quan đen sụ phát sinh phát tncn cua ƯTTTL như ỈỈOXB1Ỉ BRP1 và NSB1

Trong đó gcn BRCA1 BRCA2 là hai gen ức chế khổi u cỏ liên quan nhiều đen

sự phát sinh, phát triền, diều trị ƯTTTL Đột biến gãy bệnh ở gen BRCAỈ và gen

BRCA2 can trớ con dường tái tô hợp tương dông, hên quan đến việc sưa chừa các dứt gày sợi đỏi trong DNA có thỏ dan den ung thư

1.4 Vai trò cua gen BRCA1, BRCA2 trong bệnh sinh cùa ung thư tuyến tiền liệt

1.4.1 Gen BRCA1

BRC'AI là một gcn ức che khối u liên quan den ung thư vú vã ung thư buồng trứng dược phát hiện năm 1994 do các nhà khoa học thuộc Viện nghiên cữu Sức khoe Quốc gia Hoa Kỹ Gcn nãy nằm trên nhành dài cua nhiễm sắc thê 17 (17q2l)

Nhiễm sắc thể số 17

Hình 1.2 Sơ dồ nhiễm sắc thè 17 và vị trí ỊỊCII BRCAl

(Nguồn: National Institutes of Health)11 BRCAỈ là một gen lờn chữa 24 cxon trong đõ 22 exon mà hóa dài khoang lOOkb .'Men binh thường cùa nô tạo ra một phàn tư mRNA kích thước 7.8kb vã phân tư mRNA nây mà hỏa protein BRCAI gồm 1.863 axil amin.1- u

httnSCD MinlinkftMCT

MinWn TinMv Trinh

W iring KES WKIS

Hi rill 1.3 Can trite protein KRCAI (Nguồn: Katy s Orr và cộng sự 2OỈ5)'*

cẳu trúc cua protein BRCAI bao gồm một miền liên kết RING ớ đẩu N tận (được mả hoã bởi exon 2-7) một miền liên kểt BRCT ờ đầu c tận (được mà hoá bời exon 16-24) và các vùng mà hóa bới exon 11-13 (Hình 1.3)

ơ dầu N tận cũa protein BRCAI miền RING liên két với protein BRAD ỉ lạo

sự ôn dinh cho protcinn BRCA1 vã BRAD1 phức họp BRCAI ■ BRADI cõ chức nâng như enzym E3 ubiquitin ligase Mien Ring có vai trò quan trọng trong việc dicu chinh quá trinh sứa chừa DNA Ngoài ra dầu N tận còn chưa một tin hiệu xuất hạt nhân (NES ■ Nuclear export signal) góp phần vào quá trinh vận chuyên protein BRCAI trong te bảo

ơ đẩu c tận cùa protein BRCA1 cỏ chứa miền liên ket RRCT lã vũng gắn phosphoprotcin dục hiệu với protein (lược phosphoryl hóa bới hộ thong enzym ATM ATR kinase Phosphoryl hóa là co che chinh trong con dường phan ứng với tốn thương DNA

So với các miền khác, exon 1113 bao phủ một phần lớn protein BRCAI nó chửa 2 miền định hướng nhãn (NLS - Nuclear localization signal or sequence), một miền trung tủm một cụm Serine (SCD - Serine cluster domain) Các acid amin dược mà hỏa bởi exon 11-13 chứa những vị tri gẩn dành cho nhiều loại protein quan trọng như Rad50 Rad5l ycu tổ phiên mà c-Myc và chất diều hòa chu kỳ tế bão Rb Retinoblastoma.14'^

1.4.2 Gen RRCA2

Gen BRCA2 được phát hiện bời GS Michael Stratton và TS Richar Wooster (Viện nghiên cứu ung thư Anh) năm I995.'6 Gen BRCA2 năm trên nhánh dài nhiễm sảc the I3(l3ql2.3)

Nhiêm ức thê số 13

Hình 1.4 Sơ đồ nhiễm sắc thề 13 và vị tri gen BRCA2

(Nguồn: National Institutes of Health)1!

Gen BRCA2 chứa 21 exon, alcn cua BRCA2 tạo một phân tư mRNA kich thước IO.4kb phân tư mARN này mà hóa protein BRCA2 gồm 3.418 acid amin.1’

(■.a 1002 2085)

Mt*n IMnhA

RA 051

( .250- 500)

IMS)

Hình 1.5 Cẩn trúc protein RRCA2 (Nguôn: Paul R Andreassen và cộng sự 2021)'

Ớ đàu N tận cua protein BRCA2 là mien liên kết PALB2 Vùng trung tàm cùa protein BRCA2 chứa miền liên kểi RAD5I từ axil amin 1.002 đển 2.085 bao gồm 8 lần lặp BRC (lừ BRCI đền BRC8) Ngoại trữ BRC5 BRC6 mòi BRC đều

có thê gán riêng rè với RAD5I trong kỳ thuật lai 2 thành phần (protein và protein) cùng như ờ trong ong nghiệm khi được biêu hiện như lả protein dung hợp GST (glutathion -S- transferase) Kha nàng gẳn các BRC cùng khác nhau BRC4 hoại tinh gẩn cao hơn BRC1 4 lần Tiếp đen lã mien liên ket DNA (DBD) tại dầu c cua protein BRCA2 (C-DBD), kéo dài axit amin 2.482 - 3.184, bao gồm mien xoàn ổc (axil amin 2.482-2.668) và ba nep gap OB Một số lượng lớn dột biền gây ung thư dược phát hiện năm ờ domain này Có một miên liên kẽt RAĐ51 bô sung ơ đầu c tận với ba tin hiệu định hướng nhãn.’

1.4.3 lai trò ciia protein RRCAt vá KRCA2 trong sưa chữa DMA

1.4.3.1 Các cư chè sưa chữa tòn thưtntg DMA

Trong quá trinh sao chép DNA, các tổn thương DNA có thề xay ra do các tác nhân bên ngoài hoặc tự phát sinh Tổn thương DNA có thê đirợc phân loại thánh haí nhom khác nhau gồm đứt gày sợi dôi (DSB - Double strand break) vá dứt gày sợi dơn (SSB - Single strand break) Dirt gày sợi đôi dược coi là dạng tôn thương DNA nguy hiếm nhát vi tính toàn vẹn cùa ca hai chuỗi DNA bị tôn hại cũng một lúc Nếu cãc tôn thương DNA không dược sưa chữa, có kha năng tạo ra các dột biên trong tê bào sinh dưỡng hoặc te bào dòng mầm diều này cỏ thê dần dền sụ hình thành các tế bào bất thường, kich thích sự phát triển khối u phát sinh ung thư

Các tể bão tự bao vệ minh khói những tổn thương này bang cách kích hoạt điếm kiêm tra thiệt hụi DNA và các cơ chề sưa chữa tòn thương DNA Một sổ con dường sưa chữa tôn thương DNA:

- Các con dường sưa chừa đứt gày sợi dơn: sứa chữa cẫt bo bazư (BER - Base excision repair) và sứa chừa cải bo nucleotide (NER - Nucleotide excision repair)

- Các con dường sưa chừa dứi gãy sợi đôi: nổi đẩu không tương dồng (NHU

- Non homologous end joining) hoặc sưa chữa theo hướng tương dồng H1DR - homology directed repair)

Sự phối hợp cua cãc con đường nãy dõi hoi phai có quy định chặt chẽ đẽ ngân chăn sự mất ồn định cùa bộ gen.

ì 4.3.2 ỉ'ai trò tua protein tỉ RCA I và RRCA2 trong sưa chừa DNA

Ca protein BRCAI vả BRCA2 đều dóng vai trò quan trọng trong việc duy tri tinh toàn vẹn cùa bộ gen thông qua quá trinh sưa chữa tôn thương DNA bang con dường tái tỏ hợp tương dồng

Trong te bảo binh thường, protein BRCA1 rất quan trọng trong việc duy trì

sự ôn định di truyên thòng qua quá trinh sưa chữa DNA vã chêt theo chương trinh cua tế bào dồng thời hoạt dộng như một protein ức ché khối u Protein BRCAI còn tham gia diều khiên sự biêu hiện gcn p53 và gen GADD45 ■ gcn dãp ứng sai hóng cùa DNA Protein BRCAI tham gia sứa chữa tôn thương dữt gãy DNA sựi dôi bắt dâu bang phosphoryl hóa, sau dó kêt hợp VỚI protein BRCA2 và các protein quan trọng (RAD5I BARDI) tạo phức hợp gản vào vị tri DNA tổn thương và khới dộng tái tồ hợp.”

Cũng như protein BRCAI protein BRCA2 cũng có chức nâng ức che sự phát trien cùa khối u Protein BRCA2 cõ liên quan den việc sứa chừa DNA bị hư hong Trong nhân cua nhiều loại tể bào binh thưởng, protein BRCA2 tương tác VỚI một số protein khác dê hãn gắn các dứt gãy trong phàn từ DNA Những vet dữt gãy DNA có thê do cãc you tố nội sinh (như quá trinh nhiễm săc thê trao dôi vật liệu di truyền chuán bị cho phân chia te bão ) hoặc các veil to ngoại sinh như (bửc xạ tự nhiên, các tãc nhàn y tề như tia xụ thuốc ) Bằng cách giúp sưa chùa DNA protein BRCA2 đóng một vai trò quan trọng trong việc duy trì sự ôn định cùa thòng tin di truyền cùa tể bào?*

Khi protein BRCAI vã BRCA2 bị mẳt chức nâng sẽ ánh hướng dền quá trinh sưa chừa các tôn thương dứt gãy sợi dôi diều này dàn đen sụ hình thành cua các tể bào khới phát khỗi u hoặc tế bão ung thư

A Chức rAng BRCAI vá BRCA2 binh thương B ■ BRCA1 ù BRCA2 mil chức nàng

3RCA1

PhospbMvl boaBRCAI

DNA ton throng

Sin chùa DN'Athit bji cm p53 bok ck gen bỉm ưa khk

TingpSJ Thúc dây p21 Dàng chu kỳ té bao Apoptosis (chét tế bào I

Tin? sob lé báo

Hình 1.6 lai trò cùa protein BRCA/ và tỉ RCA 2 trong sứa chữu DNA

(Nguồn: Panesur và cộng sự 2016^

1.4.4 Ý nghỉu hint sùng cùa dột biển gen BRCA I BRCA2 trong bịnh lý ung thư tuyển tiền liệt

Tý lệ đột biến gen ỈỈRCA trong quần thề chung lã tương dỗi thấp (1/800 -

1/400) tuy nhiên trong u rn L ly lộ phát hiện dột biến gcn BRCAÌ HRCA2 là khã cao Ty lộ dột biến te bào dòng mầm cua BRCAi và ỈỈRCA2 lần lượt là 0,5% và 3,5% tý lệ phát hiện đột biền te bão sinh dường cùa gen BRCAI. BRCA2 lần lượt là

5.7% vả 3.2%.”

Nguy cơ mắc ƯTTTL gia tâng dối với những người mang đột bicn gcn BRCAI

RRCA2 Những người dân õng dưới 65 luỏi mang đột biển IỈRCA2 có nguy cư phát trién L'TTTL cao gấp 7 lần so với những người không cõ dột biến.’1 Mặc dú nguy

cơ ƯTTTL ỡ những người mang dột biền BRCAI thắp lum so với những người có dột biến BRCA2 nhung vàn có nguy cơ tương dối tảng gấp hai lần ờ nam giới dưới

65 tuõi so với dân sỗ nôi chung.-'-’

Đột bicn gcn BRCAI, BRCA2 không chi làm tâng nguy cư mắc UTTTL mã nó còn cỏ liên quan den diễn biến lâm sàng, lien triẻn vã điều trị ƯTTTL Đột biến gcn

BRCAÌ/2 cỏ liên quan den các đặc diêm lảm sàng bất lợi ơ khối u nguyên phát và kêt qua xấu ư người bệnh mẳc UTTTL kháng cắt tinh hoàn, di càn.;’

Hiện nay dicu trị UTTTL thường kct hợp nhiêu phương pháp như phàu thuật, xạ trị kẽl, liệu pháp ức chẽ androgen, hoả trị.-4 Đỗi với những trường hựp UTTTL di cản liệu pháp ức che androgen lã phương pháp điều trị cơ bán cô thê kết hợp với hoá trị liệu như Docctaxal Tuy nhiên phần lớn người bệnh, cuối củng tiền triẽn thành UTTTL khảng căt tinh hoàn, di cản và không dãp ứng với các biện pháp diều trị thông thường Liệu pháp ức che P/\RPi được âp dụng trong diều trị nhùng người bệnh ƯTTTL khảng cải tinh hoàn, có đột biến dòng mầm hoặc sinh dường trong gen BRCAI. BRCA2.b2i

Theo khuyên cáo cùa Mạng lưới ung thư quốc gia Hoa Kỹ những người bệnh UTTTL kháng cất tinh hoàn, di cán, cõ dột biến te bào dòng mầm và tề bào sinh dường trong các gcn sưa chừa tái tố hợp tưưng dồng như BRCAI BRCA2 dược dự đoán dáp ứng tốt với câc chất ức che PARPi như olaparib rucaparib vâ niraparib.'’

Từ nám 2020, Cục quan lý Thực phàm và Dược phàm Hoa Kỳ đã chấp Ihuụn việc

sứ dụng cãc chất ức chế PARPi như Olaparib haỵ rucaparib trong diều tri UTTTL kháng cắt tinh hoàn, di căn có đột biến gcn BRCAl. RRCA2.1

1.5 I ng (lụng xét nghiệm gcn HRCA ư người bệnh ung Ihư tuyền tiền liệtTrong UTTTL sự hiện diện cua dột biển gcn RRCA trong mõ ung thư (dột biến

tể bào sinh dường) và hoặc trong máu ngoại vi (dột biến te bão dòng mầm) cung cáp thông tin cho việc tiên tiên lượng, dự đoản bệnh tir dỏ lựa chọn các phương pháp điều trị và tư vẩn di truyền ung thư phũ hợp cho người bệnh vã gia dinh.Đầu tiên việc xác định dột biến gen BRCA cho phép lập ke hoạch diều trị phù hợp Xét nghiệm gen BRCA lã diều cằn thiết de xãc định xem người bệnh cỏ đù diet! kiện áp dụng các phương pháp điều trị mới nhấm mục tiêu vã hiệu qua hay khòng chẳng hạn như chắt ức chề polymerase poly-ADP-ribosc

Thứ hai việc xác định đột biến te bào dòng mầm mầm trong gen BRCA giúp cho bác sì cỏ thê tư vẩn vẻ di truyền ung thư cho các thành viên trong gia đinh đẽ xác dịnh nhừng người mang gcn cỏ nguy cư cao và cô cãc phương án sàng lọc sớm

dế phát hiện các tình trạng bệnh lý ung thư liên quan den dột bten gen BRCA.Theo khuyên nghị mới nhắt cùa I lội khoa học Ý và hướng dần thực hành làm sáng mới nhất cua Hiệp hội Ung thư Nội khoa Châu Âu (ESMO - European Society for Medical Oncology) tot nhất là nên kiêm tra các biển thê gây bệnh gen

BRCA trong mô khối u trước, vi khá nâng phát hiện đột biến BRCA cao hơn so với phán tích dòng mầm Nhùng người bệnh được phát hiện có biến thê gây bệnh gcn

BR(.’A thông qua xét nghiệm khối u nên dược xét nghiệm dòng mầm vã tư vần di truyền Xét nghiệm khối u cùng nên dược đề xuất cho nhùng người bệnh dã trai qua xét nghiệm tẽ bào dõng mâm ban dâu nhưng không xác định dược biên thè gây bệnh Cuối cùng, olaparib có thê dược cân nhắc sau khi dùng các tác nhãn nội tiết tố mới cho người bệnh mac UTTTL di cân kháng cắt (inh hoàn có đột biền gen

BRCAI hoặc BRCA2^

1.6 Các pinning pháp kháo sát dột biền Ren BRCA1, BRCA2

Trong nhiều năm qua các phương pháp xét nghiệm khác nhau đã được phát triển nhầm phát hiện cãc đột bien gen BRCAI RRCA2 (Hình 1.7)

MLPA •

lỉìrih 1.7 Sư dồ dòng thời gian cùa các câng nghị dược sư dụng de phát hiện các

dột hiển gen RRCA iSguòn: Alessandro Ị.avont và cs 2022fx Sanger sequencing: giai trinh lự thè hẻ thứ nhát: MLPA: khuèch dại đa đau dò phụ thuộc hộ thống ghẽp kênh; \GS: giai trinh tự the hê mửi.

1.6.1 Phương pháp giãi trình the hộ thứ nhất (Giúi trinh tự Sanger - Sanger sequencing)

Giãi trinh tự gcn lã kỳ thuật xác định trinh tự DNA cùa các gcn cụ thê, mà hoá hoặc không mà hoá cho các protein chức nàng cụ thê

Giãi trinh tự thề hộ thứ nhất hay còn gụi là giai trinh tự Sanger được Fred Sanger vã các cộng sự phát minh vào nảm 1977 ngày nay phương pháp này dược

sứ dụng phô bicn trong các phông xét nghiệm di truyền, và trơ thành một phương pháp tiêu chuẩn trong di truyền hục lãm sàng

Nguyen lỷ cơ ban cua phương pháp giai trinh tự Sanger là dựa vào hoạt dộng cùa enzyme DNA polymerase trong quã trinh tổng hợp DNA Enzyme DNA polymerase xúc tác gần các nucleotide vào mạch dơn DNA dang tông hợp ờ vị tri 3'

có chứa nhóm - oil tự do (dNTP - deoxy nucleotide), khi gặp nucleotide không có nhõm 3’- OH (ddNTP - dideoxy nucleotide) thi phan ứng tồng họp bị dừng lại

Hình /.8 .Nucleotide cô gắn nhúm Ì^OH so vôi nucleotide không có

nhôm 3'-OH Nguồn: https;//medùun.com‘\agnahr/sanger-and-nuixum-gilhert-sequencing-

824272279b5f

Phương pháp giai trinh tự Sanger sư dụng các deoxy nucleotide đà bị chinh sứa lãm mắt nhõm hydroxyl ữ dầu 3’ của phân tử đường (ddNTP) Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vi không cỏ nhóm 3’-0H nên một nucleotide không được thêm vào phán ứng tông hợp sè dừng lại Trong một phân ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên khi phan ứng tòng hợp DNA xay ra các đoạn DNA dược hình thành sè

có độ dài khác nhau do ddNTP gần ngẫu nhiên làm dửng phan ửng Dựa vào sự sai khác ve độ dái các đoạn DNA hiên thi trên ban gel sau diện di dê xác định trình lự trong gcn.16

Hình ỉ 9 Quy trình kỹ thuật giãi trình tự Sanger

(Nguồn: Ariana s Huffmyer 2023ịi9

Giài trinh tụ Sanger đưực sứ dụng trong việc giai trinh tự chẩn đoán một gen dơn lé kiêm tra các biền the trinh tụ cụ thê, xác nhận các biền thê dược xác định bằng phương pháp giái trinh tự thế hộ mới

Giai trinh tự Sanger là một phương pháp cho kct qua khá nhanh, độ chinh xác cao, mang lại lợi ích chi phi - hiệu quá khi sư dụng trên một nhóm ít trinh tự dich (1-20 trinh tụ dich) Tuy nhiên do Sanger chi có thê giái trinh tự một đoạn DNA ngán nên khi giái trinh tự những gcn cỏ kich thước lớn hoặc de tìm các biến dõi di truyền ơ những bệnh lý chưa rõ nguyên nhàn lại khá tốn kém VC chi phi vả thời gian

1.6.2 Phương pháp khuếch dại tỉa dâu dò dựa vào hộ thống ghép kênh (MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

Phương pháp khuếch đại đa dầu dò dựa vào hộ thống ghép kênh (MLPA) dược

mô ta lằn dầu vào nám 2002 bơi Schouten J.P và cộng sự dây là một xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction) đa mỗi sư dụng nhiều đầu dỏ mỗi đầu dỏ đặc hiệu cho một trình tự ĐNA khác nhau, dài khoang 50 • 100 nuclcotid (chu yếu lã câc cxon cùa một gen cụ thè cân quan tâm), đẽ đành giã sỏ ban sao tương dôi cũa từng trình tự DNA.'1

Nguyên lý cua phương pháp MLPA:

Kỳ thuật MLPA sứ dụng các đoạn dỏ (probe) có khá nâng lai hóa với phán tứ ĐNA dich đặc hiệu và việc thict ke các probe rất quan trọng Mỗi đoạn dô gồm 2 chuồi oligonucleotide có kích thước khác nhau (gụi là đoạn dỡ xuôi và đoạn dò ngược).Các đoạn probe sẽ gân dặc hiệu \áo các exon cua phân tư DNA đich sau dó enzym ligase dược thèm vào de nổi hai đoạn probe này lại với nhau tạo thành doụn probe hoán chinh \ à dược khuếch dại bảng phan ửng PCR vời cặp môi dậc hiệu

- Đoạn đệm đưực thiết ke dài ngẩn khác nhau nên khi phán ứng PCR khuếch dại sẽ tạo ra nhiều đoạn DNA cõ chiều dãi khác nhau vã dược phân tảch bảng diện

di mao quàn (mồi dược dánh dầu huỳnh quang)

Hình 1.10 Ọ uy trình kỳ thuật MLPA (Nguồn: Jan p Schouten và cộng sự 2002) ,:

MI.PA là phương pháp được nu tiên lựa chọn dê phát hiện câc đột biến mât đoạn, lập đoụn lớn trên gcn (cấp độ exon) với độ chinh xác cao \à cho kềt quã nhanh chõng.1 Trong nhùng năm gằn đây MI.PA dà dược sư dụng thành công trong chân doán và nghiên cửu các bệnh lý ung thư Tuy nhiên các kít cua phương pháp này không có cho tài ca các gcn cân có trinh tự dâu dõ biet trước nen sỏ hạn chế khi kháo sãi nhiều gen phải hiện các đột biến mới.

1.6.3 Phương pháp giãi trình tự the hệ mới (.VƠS- ,\ext Generation Sequencing)

Giái trinh tự Sanger vã MLPA dược coi là phương pháp tiêu chuán váng dê xác định dột biến gcn BRCAI và BRCA2 Tuy nhiên, do kich thước gcn ỉiRCAl/2 lớn, đột biến nầm rái rác trên gcn khiến quy trinh chân doán tổn nhiêu thời gian và chi phí Gằn đây với những cai tiến trong cõng nghệ giai trinh lự DNA và sự xuat hiện cua các công cụ giai trinh tự thê hẻ mới dà cung câp một giai pháp thay thê mạnh mè dê phát hiện dột biển, cai thiện dáng kế tóc dụ vã hiệu qua cua xét nghiêm DNA.”

(ìiai trinh tự the liệ mới lã còng nghệ cho phép giai mà đổng thời hàng triệu DNA cúng lũc dựa trẽn nguyên lý giai trinh tự song song (parallel sequencing), qua dó giủp nâng cao hiệu suất cua quả trinh giai mà hộ gen người Các bước thực hiên gôm: Tách chici: DNA hoặc RNA dược phân lập từ màu bệnh phâm màu (mầu nuôi cầy té bào, tề bào dóng lạnh, te bào xư lý bằng formalin-parafiin mâu, nước bụt vá mầu xương, ) Tùy thuộc vào loại có thê sư dụng nhiều phương pháp khác nhau, chang hạn như chiết xuất hỏa học hoặc phá vỡ cơ học

• Chuân bị thư viện: các đoạn DNA được nhân bán và phàn mánh thành các manh nho hơn (small fragment) Các manh nhó hơn này sau dó được gằn nhẫn bang

bộ diều hựp (adapters) dặc hiệu và mà vạch (barcodes), diều này cho phép mây giái trình tự phàn biệt các phán ttr t)\’A riêng le Sau khi gan nhẫn các manh Ì)NA dược nhân ban dề tạo thư viện DNA (ĐN/\ libraries)

• Giai trinh tự: hộ thống SC đọc'giai trinh tự các đoạn ngắn, sau đó dược đối chiểu theo bộ gcn hoặc hệ phiên mã tham chiểu

• Phân tich dừ liệu: dừ liệu dược phân tich bang công cụ tin sinh học đê dưa ra thông tin hữu ích như biến thê di truyền, mức độ biêu hiện gen và chinh sứa ngoại gen (epigenetic).

Hình 1.11 Quy trình kỹ thuật giúi trình tự thề hệ mứi

1.7 Các nghiên cứu trong và ngoài nưóv về dột biến gen BRCA1/2 ờ người bệnh ung thư tuyển tiền liệt

/ 7 ì Tình hình nghiên cừu ngoài nước

Nghiên cứu cùa Elena Castro vã cộng sự (2013) đà phân tích 2.019 người bệnh mac ƯTTTL trong dó có 18 người mang dột biên gen BRCAI 61 người mang dột biến gen BRCA2 và 1.940 người không mang đột biến trẽn gen BRACl/2 Kct quá nghiên cứu cho thay những người bệnh ƯTTTL có dột biển gen BRCAỈ/2 thường cỏ diêm mô bệnh học > 4 giai đoạn T3/T4 liên quan đến hạch và di cản lúc chân đoán hơn UTTTL ờ những người không mang mầm bệnh?

Fatiha Salmi vả cộng sự (2021) đã tiến hãnh nghiên cửu khao sát đột biền tể bào dòng mầm gcn BRCAI/2 bằng kỳ thuật giái trinh tự thề hộ mới Nghiên cứu khao sát trên 30 người bệnh được chần đoán ƯTTTL có yếu tố gia dinh Độ tuồi tning binh cua các người bệnh trong nghiên cứu lã 67.43 tuồi (khoang 54-80) và tàt

ca cãc người bệnh dều có biêu hiện ung thư biêu mô tuyển tiên liệt ớ mức dộ cao (độ IV) kích thước khối u lớn (> T2) vã di càn xa Theo kết quá nghiên cứu tần suất dột bicn gen BRCA! (3.33%) vã ^/fC7I2 (10%) tần suất cộng gộp ca hai lã 13.33%?’

Nghiên cữu cùa Wei chen vã cộng (2022) Hen hãnh nghiên cứu trẽn 172 người bệnh Trung Quốc bị UTTTL có dột biến te bào dõng mầm BRCAI/2 nghiên cửu chi

ra rang những người bệnh mang đột biển tế bào dõng mầm trên gen BRCA1/2 dược chân đoán ớ độ tuổi sớm hơn (trung bình 67 tuổi, từ 34 -89 tuôi) và hầu hét đều cỏ UTTTL kháng cất tinh hoàn, di cân (chiếm 54.65%)?'

Enrica Antolini vã các cộng sự (2024) dà tiền hành xct nghiệm giai trinh tự thế

hộ mới gcn BRCA1/2 trên màu mô u vùi khối nen cua 70 ngirừi bệnh dược chân doán UTTTL ơ các giai đoạn khác nhau Ket qua nghiên cứu có 46 70 (66%) màu không thê đánh giá dược do chất lượng DNA thu dược kém và cỏ độ phân manh cao 4 24 màu có bien thê gây bệnh gcn^/ỈCJ2gổm 01 biến thê trẽn cxon 10 là C.I244A>G (p.His4!5Arg) 03 bien the tren exon II là c.5946dclT (p.Serl982fs) C.33O2A>G (p.Hisl lOIArg), C.3I95 3l98delTAAT (p.AsnlO66fs) Không phát hiện biến the gãy bênh trẽn gen BRCAỈ."

1.7.2 Tình hình nghiên cửu trong nước

Nghiên cứu ve dột biến BRCAỈ/2 bất dầu trong vài năm gần dây chu yếu chì trên càc người bệnh ung thư vú Trần Trung Toàn (2022) nghiên cứu tinh trụng dột biến BRCA//2 trên 26 người bệnh ung thư vú bảng kỳ thuật giái trinh tự gen thể hệ mới ket qua phát hiện 8 trưởng hợp người bệnh cô dột biến BRCA (26.9%) trong dỡ

có 7 người bệnh có dột biến BRCAI và I người bệnh cỏ dột biền ỈỈRCA2 (3.8%) I người bệnh có biển thê ý nghía chưa xãc định cua gcn BRCA2.ĩ't

Hiện nay tại Việt Nam nghiên cứu đánh về các biến thê gây bệnh trên gcn

BRCAI BRCA2 trong ƯTTTL côn han chc it thõng tin

CHƯƠNG 2DÕI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu

2.1 Dồi lượiig nghiên cứu

Người bệnh được chân đoán xác định lã ung thư tuyền tiền liệt bơi cảc bác sĩ chuyên khoa ung bướu, theo hướng dần chắn đoán cùa Bộ Y lể.24 (Phụ lục I)

2 I I Tiên chuun lựa chọn

• Người bệnh ƯTTTL cô mầu mô u vùi khối nến FFPE được lưu trừ tại Bệnh viện Bạch Mai

Dược xét nghiệm đột biển gen BRCAl/2 bang kỳ thuật giãi trinh tự thế hệ min.

- Có dầy du thông tin hỗ sơ bệnh án

2.1.2 nêu chuiin loại trừ

- Người bệnh ƯTTTL cỏ kèm cảc loại ung thư khác,

- Mầu mỏ không du chất lượng DNA dê phân tích bang kỳ thuật NGS: độ toàn vẹn cua DNA (DIN - DNA Integrity Number) không đạt 3 và hoặc nồng độ DNA mầu mó u không dạt 10 - 30 ng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Dịa diêm nghiên cứu

♦ Đơn vị Gcn -Tế bào gốc Trung tâm Y hục hạt nhàn và Ưng bướu Bệnh viện Bạch Mai

+ Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, Trường Dại học Y llà Nội

2.2.2 Thời gian nghiên cừu

+ Thời gian nghiên cứu: Tử năm 1/2023 dển nám 8/2024

2.2 ỉ Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu mỏ ta cắt ngang

2.2.4 Cở mẫu

Báo cào loạt ca bệnh, nghiên cữu đà thu thập dược 60 mẫu

2.3 Các biến số, chi sổ nghiên cứu

Báng 2.1 Các biến số chung về doi lượng nghiên cứu

thu thậpTuôi chân đoán Tuôi người bộnh (đon vị: nãm)

Hồ so bệnh án

Bệnh mụn tinh

kèm theo

Các bệnh lỷ khác ngoài ung thư như tảng huyết áp đái tháo đường, viêm gan

Biến danh mục Hỗ sơ bệnh án

*Theo khuyên cào sùng lọc bệnh ìỳ UTTTL độ luth mức CTTTL sự gia tàng nông

dộ PSA theo tuắi."

Bang 2.2 Các biền sổ, chi sổ theo mục tiêu nghiên cứu I

Tên bicn

Phân loại biên

Chi sổ

Phinmg pháp thu 'hập

Giái trinh tựNGS

Exon Biền rởi rạc Vị tri cxon cứa gcn

ĐB

Tra cứu CSDL trinh tự

hộ gen NCB1

Tên biến Phán loại

hiến

Chi số

Phương pháp thu

•hập

Công cụ thu

•hậpThay dổi DNÂ Biến danh

mục

Thay dôi trinh tự Nucleotide trên trinh tụ mã hoả DNA

Đọc kết qua xét nghiêm gen

Giãi trinh tự NGS

Thay đòi

protein

Biền danh mục

Thay dôi acid amin trong phản tư protein

Tra cứu CSDL trinh lự

hộ gen NCBI

Kieu biển thè Biển danh

mục

Vô nghĩa Sai nghĩa Dịch khung Chẽn Mất nu

Tra cứu CSDL trinh tự

hệ gen NCBI

phản

Dị họp tư đống hợp từ

Đọc ket qua xét nghiệm

Giãi trinh tựNGS

Phản loại bicn

the

Bien đanh mục

Gây bệnh

Có kha nàng gây bệnh

Chưa rô chức nàng(VUS)

Lành tinh

I ra cứu CSDL Clinvar

ACMG phần mềm tin sinh

Nguồn gổc

biến thê

Biển danh mục

Dõng mầmDông sinh dường

Đọc ket qua xét nghiệm

Giãi trinh tự NGS mẫu mõ

u Sanger mẫu máu ngoại vi

Bang 2.3 Các biền sổ, chi sổ theo mục tiêu nghiên cứu 2

Tên bicn Phân loại

Phương pháp thu thậpBien the gen Biển danh

mục

Biền thế gen nều cô phàl hiên Dọc kềt quã xét

nghiêm genTuóichân

Hồ so bệnh án, Kết quá mô bệnh họcNồng dụ PSA

tại thòi diêm

* Dièm Gleason (lược (tánh giã bởi bác sì giãi phẫu bệnh cỏ kinh nghiêm Phân (tộ

mõ bềnh học theo diem Gleason theo hưởng dẫn cùa Htẻp hột cptồc tề về bênh học tìểt niệu 2014 fl SUP International Society- of Urological Pathology).

2.4 Quy trình nghiên CÚ1I

2.4 ỉ Các bước quy Irình nghiên cứu

X Bước 1: Quy trinh thu thập số liệu

Lựa chọn và thu thập thòng tin lârn sàng cùa người bệnh UTTTL đạt tiêu chuẩn theo màu bệnh ản nghiên cửu Lấy thông tin về tuồi, liền sư bệnh, tiền sư gia dinh người bệnh, triệu chửng làm sàng, cận lâm sàng

X Bước 2: Lấy mầu bệnh phẩm

- Thu thập cãc màu mó u vùi nên đạt tiêu chuản cua những người bệnh ƯTTTL trong nghiên cửu Xác định phân độ mô bệnh hục theo hệ thống thang diem Gleason (mầu mô u dược đánh giá và tinh diêm Gleason bời bác sì giai phau bệnh)

- Các chi số trẽn được đánh giá, phản loại theo hướng dẫn chân đoán và điều trị ƯTTLT của Bộ Y Tẻ (Phụ lụcl)

X Bước 3: Xét nghiệm di truyền phân tứ băng phưưng pháp giai trinh tự thể hệ mói trên mẫu mô u thu thập được ứ bước 2

- Tách chict DNA tir màu mò u cùa người bệnh trong nghiên cứu

- Tien hành xác định các biển the gcn HRCAI/2 từ các màu mô u bảng kỳ thuật NGS (sư dụng kit BRCAaccuTest™ PLUS, Hãn Quốc)

X Bước 4: Tiến hành giãi trinh tự Sanger mẫu mâu cùa những người bệnh

có biến thế gen RRCAl. RRCA2 trong màu mô u.

X Bước 5: Phán lớp bion the gen RRCA1 RRCA2 cua người bệnh ung thư tuyển tiền liệt

- Theo dừ liệu Clinvar (Dừ liệu biển thế làm sàng cùa Viện quốc gia Hoa Kỳ)

- Theo cảc tiêu chi cùa Hiệp hội bệnh học phân tư và Di truyền y học Hoa kỳ (ACMG/AMP 2015) - phụ lục 3

X Bước 6: Phân tích kha nỉng gầy bệnh cua biền thế theo các công cụ tin sính+ Công cụ Polyphen 2 được sư dụng đế đánh giá kha năng gây hại cùa các biền thè thay thề cặp nucleotide bang cách dự đoán tác dộng có thè xay ra cua axit amin thay the dổi với cau trúc vã chức nâng cua protein

+ Công cụ Mutations taster được sứ dụng đê ước tinh tác dộng cua biến thẻ lên sàn phàm gen protein Có thê sữ dụng đánh giá khá nàng cua các biến thê thay thể cặp nucleotide, chẽn mat nucleotide hoặc các hiến thê dồng nghĩa, biên thè vùng intron.+ SIFT lả công cụ dự doán liệu sự thay dôi một axit amin có anh hướng den chức nảng protein hay không.

I Công cụ CADD được sư dụng đê dự đoán kha nàng gày hại cùa biển thè thay the cặp Nu, chèn hoặc mất Nu Điềm phrcd dược tinh toán bơi công cụ CADD dao dộng tử 1 đèn 99, diêm câng cao thi dộ gây hại càng cao

Húng 2.4 Phân loại diêm dự do Ún khá nâng gây hịnh cùa các công cạ tin sinh

2.4.2 Trang thiết hị và hoá chất

Ràng 2.5 Thief hị sinh học phán tír chinh sử dụng trong nghiên cứu

Tu bao quan âm 20 độ c Panasonic Nhật Ban

Tù bao quán mát 2-8 độ c Alaska Việt Nam

Thiết bị Nhà sân xuất

Tú an toàn sinh học cấp 2 AZBIL tclstar- Technologies Tảy Ban NhaMicropippette 2, 10, 20, 200 và

1000 pL

Eppendorf, Đức

Máy luân nhiệt 96 giêng (PCR) Eppendorf Đức

Máy do nồng dộ ĐNA Qubit Ivitrogen - Liletechnologies Mỳ

Mây điện di kiêm tra kích thước

ProFlex1 M 3x32-well PCR System Thermo Fisher Mỹ

3130x1 Genetic Analyzer Thermo Fisher Mỳ

Hung 2.6 Hoủ chut shill học phân tứ sứ dụng chinh trong nghiên cứu

Agcncourt AMPurc XP- hạt tữ tinh sạch PCR

Beckman Coulter Mỹ

Miseq Reagent Micro kit V2 300 Illumina Mỳ