Báo cáo thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm

Báo cáo thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm Bài 1. Hoạt hóa giống, kiểm tra giống và chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men Bài 2. Nhân sinh khối giống nấm men - Đánh giá sinh trưởng và hoạt độ của giống Bài 3. Thực hành lên men nước táo (Apple cider) Bài 4. Thực hành đánh giá quá trình lên men nước táo Bài 5. Thực hành đánh giá chất lượng sản phẩm lên men táo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG TP HCM

HP: THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM

GV: TS Hứa Ngọc Phúc

BỘ CÂU HỎI BÁO CÁO THU HOẠCH

Bài 1 Hoạt hóa giống, kiểm tra giống và chuẩn bị

môi trường nuôi cấy nấm men

Giống nấm men Nhóm/Tổ đã sử dụng là chủng nào? Nêu tên khoa học

và tên thương mại

- nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào thuộc họ sacchanromycetaceae

- tên khoa học Saccharomyces cerevisiae, tên thương mại ascomycota

2 a) Trình bày các bước trong qui trình hoạt hóa giống nấm men? Bước 1: Chuẩn bị môi trường hoạt hóa

 Hòa tan môi trường YPD hoặc dung dịch đường vào nước cất

 Điều chỉnh pH (nếu cần) để phù hợp với nấm men

 Hấp tiệt trùng môi trường ở 121°C trong 15-20 phút

 Để nguội xuống khoảng 30-35°C trước khi sử dụng

Bước 2: Hoạt hóa giống nấm men

Nếu sử dụng nấm men khô:

1 Lấy một lượng nấm men khô theo yêu cầu

2 Hòa vào nước vô trùng ấm (~35-40°C), khuấy nhẹ để tránh vón cục

3 Để yên 15-30 phút, không khuấy mạnh để tránh tổn thương tế bào

Nếu sử dụng nấm men lỏng (từ bảo quản lạnh):

1 Dùng que cấy hoặc pipet lấy mẫu giống từ ống bảo quản

2 Cấy vào môi trường lỏng YPD hoặc nước đường đã chuẩn bị

3 Ủ ở nhiệt độ 28-30°C trong 12-24 giờ để tế bào thích nghi và phát triển

Bước 3: Kiểm tra chất lượng giống sau hoạt hóa

 Quan sát kính hiển vi:

Kiểm tra hình thái tế bào, kích thước, sự nảy chồi

Sử dụng thuốc nhuộm xanh methylen để kiểm tra tỷ lệ tế bào sống/chết

 Đo mật độ tế bào bằng OD600 (nếu có máy đo quang phổ):

Mật độ tế bào đạt khoảng 0.5 - 1.0 OD600 là phù hợp để cấy vào môi trường chính

 Kiểm tra độ thuần khiết:

Cấy một ít dịch giống lên môi trường thạch YPD/Sabouraud để kiểm tra nhiễm tạp

Bước 4: Sử dụng giống để cấy vào môi trường chính

 Sau khi kiểm tra đạt yêu cầu, dịch giống được đưa vào môi trường nuôi cấy chính để nhân giống hoặc lên men

 Tỷ lệ cấy thường là 1 - 10% tùy vào yêu cầu lên men.

b) Nêu các loại dụng cụ, hóa chất, thiết bị cần thiết để thực hành qui trình hoạt hóa giống nấm men?

STT Tên dụng cụ Qui cách Đơn vị Số lượng

20 Giá để ống nghiệm Inox, phi 18 Cái 1

3 a) Trình bày các bước trong qui trình cấy chuyền giống nấm men?

Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất và môi trường nuôi cấy

 Chuẩn bị các dụng cụ cần thiết như que cấy, ống nghiệm, bình tam giác, môitrường nuôi cấy, tủ cấy hoặc đèn cồn

 Tiệt trùng dụng cụ bằng nồi hấp (Autoclave) ở 121°C trong 15-20 phút

 Để môi trường nguội xuống nhiệt độ thích hợp (~45°C nếu là môi trường thạch) trước khi sử dụng

Bước 2: Tạo điều kiện vô trùng trước khi thao tác

 Rửa tay, đeo găng tay, sát trùng bề mặt làm việc bằng cồn 70%.

 Làm nóng vòng cấy/kim cấy trên đèn cồn đến khi đỏ rực, để nguội trong vài giây

 Nếu sử dụng tủ cấy vô trùng (Laminar flow), bật đèn UV khoảng 15-30 phúttrước khi thao tác

Bước 3: Lấy mẫu giống nấm men

 Mở ống nghiệm hoặc bình chứa giống nấm men gần đèn cồn để hạn chế nhiễm khuẩn

 Dùng que cấy vòng/kim cấy lấy một lượng nhỏ nấm men từ môi trường cũ

Bước 4: Cấy chuyền vào môi trường mới

 Nếu cấy vào môi trường lỏng (YPD, Sabouraud ): Nhúng que cấy có chứa nấm men vào bình môi trường mới và lắc nhẹ để phân tán đều

 Nếu cấy vào môi trường thạch nghiêng: Chạm đầu kim cấy chứa giống vào

bề mặt thạch rồi kéo một đường zic-zac nhẹ trên bề mặt

 Nếu cấy rải trên đĩa petri: Nhỏ một giọt dịch giống lên đĩa thạch rồi dùng que cấy tam giác dàn đều mẫu để phân lập khuẩn lạc

Bước 5: Ủ và theo dõi sự phát triển của nấm men

 Đóng nắp ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy (không siết quá chặt để có không khí trao đổi)

 Đặt vào tủ ấm ở 28-30°C trong 24-48 giờ tùy vào mục đích cấy

 Quan sát sự phát triển bằng mắt thường (môi trường lỏng sẽ có độ đục tăng lên, môi trường thạch xuất hiện khuẩn lạc)

Bước 6: Kiểm tra và bảo quản giống

 Kiểm tra bằng kính hiển vi để đảm bảo tế bào nấm men khỏe mạnh, không

có nhiễm khuẩn

 Nếu cần, đo mật độ quang OD600 để xác định sinh khối

 Giữ mẫu giống trong tủ lạnh (4°C) trong thời gian ngắn hoặc tủ -80°C nếu bảo quản lâu dài

b) Nêu các loại dụng cụ, hóa chất, thiết bị cần thiết để thực hành qui trình cấy chuyền giống nấm men?

Dụng cụ

 Ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri (đã khử trùng)

 Que cấy (dạng vòng hoặc que thẳng), kim cấy

 Pipet và micropipet (cùng với đầu tip vô trùng)

 Lọ đựng môi trường nuôi cấy

 Nước muối sinh lý hoặc dung dịch đệm phosphate (PBS) để pha loãng mẫu nếu cần.

 Xanh methylen hoặc Trypan Blue (dùng để kiểm tra tế bào sống/chết khi cần)

3 Thiết bị

 Nồi hấp tiệt trùng (Autoclave) để khử trùng môi trường và dụng cụ

 Tủ cấy vô trùng (Laminar flow) hoặc đèn cồn để tạo môi trường làm việc sạch

 Tủ ấm (Incubator) để nuôi cấy nấm men ở nhiệt độ thích hợp (~30°C)

 Kính hiển vi để kiểm tra chất lượng tế bào nấm men

 Máy đo mật độ quang (Spectrophotometer) để xác định OD600 nếu cần kiểm tra sinh khối

Bước 2 Đậy lá kính sao cho chân của lá kính chạm vào giọt nước hay giọt màu, nghiêng một góc ≤ 45° và hạ lá kính xuống để không có bọt khí

Bước 3 Đặt phiến kính lên bàn mẫu, hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng, quan sát ở vật kính 10X, dùng ốc chỉnh thô nâng bàn vật mẫu chạm tới vật kính, đặt mắt vào quan sát, dùng ốc chỉnh thô hạ bàn mẫu xuống cho đến khi thấy ảnh VSV rồi dùng nút chỉnh tinh vặn để xem rõ ảnh VSV Trên bàn mẫu, dùng ốc di chuyển mẫu vật

di chuyển phiến kính đến vùng muốn quan sát trong thị trường

Bước 4 Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính 40X và điều chỉnh ốc chỉnh tinh để tìm ảnh.

Quan sát tế bào nấm men, tế bào nấm men nảy chồi, tế bào sống, tế bào chết

b) Kết quả thực hành của Tổ: Trình bày kết quả Tổ đã thu thập được và giải thích: khả năng lên men của nấm chủng nấm men được kiểm tra thông qua

khả năng sinh c02 trong ống dumham trong mt nuôi cấy

- Giống nấm men lên trong thạch nghiêng: Nấm lạc nhiều, điển hình, thuần chủng không? ;nấm lạc nhiều được ủ trong mt 24h dòng men có hoạt tính

cao là loại giống thuần chủng

- Hình thái tế bào nấm men trong ống giống quan sát được: Tế bào hình gì? Có thuần chủng không? Số chuỗi tế bào phân nhánh sinh trưởng nhiều hay ít?; tế bào có hình tròn có dạng xoán, là loài thuần chủng ,số chuổi tế bào

phân nhánh nhiều

- Giống có thể dùng để nhân lên cấp 1, cấp 2 được không? Giải thích.

Giống có thể dùng để nhân lên giống cấp 2 vì các tế bào nấm men đủ tiêu chuẩn để dùng trong giống cấp 2 , các thông số kĩ thuật od,ph màu sắc mùi vị … đúng quy định từng dây chuyền công nghệ, đảm bảo nhũng yêu cầu này mới dc cho tiếp vào quy trình lên men

(Nếu có hình kết quả, kèm theo)

BỘ CÂU HỎI BÁO CÁO THU HOẠCH

Bài 2. Nhân sinh khối giống nấm men - Đánh giá sinh

trưởng và hoạt độ của giống

1 a) Vì sao phải nhân giống nấm men lên cấp 1, cấp 2 trước khi lên men?

- Muốn thực hiện một quá trình lên men ở quy mô thí nghiệm ta phải tiến hành nhân giống, đảm bảo số lượng tế bào với tuổi sinh lý đang ở thời kỳ hoạt động mạnh nhất để cấy vào môi trường lên men

Nhân giống ở đây phải qua 2-3 bước, ta thường gọi là nhân giống cấp 1, cấp 2, cấp 3

 Nhân giống cấp 1: được tiến hành trên máy lắc với nhiệt độ và thời gian tùy thuộc vào yêu cầu công nghệ

 Nhân giống cấp 2: Giống cấp 1 được tiếp vào môi trường nhân giống cấp 2 ởtrong bình nhân giống có sục khí và ổn nhiệt

 Nhân giống cấp 3 hay không còn tùy thuộc vào quy mô sản xuất

Tỷ lệ nhân giống từ ống nghiệm vào bình tam giác là một vòng que cấy đến cả dịchhuyền phù của một ống giống, từ cấp 1 sang cấp 2 (hoặc từ cấp 2 sang cấp 3) thường là 1 - 10% hoặc là cao hơn Từ dịch nhân giống cuối cùng vào lên men vào khoảng 0,5 - 10% tùy thuộc vào đặc tính từng chủng vi sinh vật.

Thành phần môi trường nhân giống và lên men gần giống nhau Thông thường thì hàm lượng nguồn cacbon ở môi trường nhân giống thấp hơn lên men, nhưng các thành phần khác thì giàu hơn, đặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng, để phục

vụ cho sinh sản và phát triển của giống vi sinh vật

Chế độ nuôi cấy đặc biệt là nhiệt độ giữa nhân giống và lên men cũng có khác nhau Nếu nhiệt độ lên men thấp thì cần phải nhân giống với nhiệt độ giảm dần để khi vào lên men giống không bị choáng sốc Chế độ sục khí ở các công đoạn này cũng khác nhau, thường thì trong thời gian nhân giống nhu cầu về oxy cao như trong pha sinh trưởng của lên men hoặc cao hơn

b) Hoạt độ giống nấm men của Tổ như thế nào? Xác định qua chỉ thị nào?

 Dịch giống không được tạp nhiễm, đặc biệt là thực khuẩn thể

 Các tế bào đảm bảo ở độ tuổi sinh lý ở thời gian sinh trưởng tốt nhất, có hoạttính cao nhất thường là nửa sau của pha chỉ số

 Các thông số kỹ thuật như OD, pH, màu sắc, mùi vị đúng quy định của từng dây chuyền công nghệ

 Dịch giống có đảm bảo được những yêu cầu này mới được cho tiếp vào lên men

Sinh khối nấm men dùng lên men cider được kiểm tra số lượng tế bào nấm men bằng

2 a) Xác định mật độ nấm men theo mấy cách? Vì sao phải xác định đường chuẩn độ đục OD600 của dung dịch sinh khối giống?

Mật độ nấm men có thể được xác định theo 3 cách chính:

1 Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu (buồng đếm Neubauer hoặc

2 Phương pháp đo độ đục (OD600 - Optical Density at 600 nm)

o Sử dụng quang phổ kế đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch nấm men ở bước sóng 600 nm

o Độ đục tỷ lệ thuận với mật độ tế bào, nhưng cần xây dựng đường chuẩn để quy đổi OD600 ra số lượng tế bào thực tế

3 Phương pháp nuôi cấy và đếm khuẩn lạc (CFU - Colony Forming Units)

o Pha loãng mẫu, cấy lên môi trường thạch và đếm số khuẩn lạc hình thành sau khi ủ

o Phương pháp này chỉ đếm được tế bào sống, nhưng mất nhiều thời gian

Vì sao phải xác định đường chuẩn OD600 của dung dịch sinh khối giống?

 Chuẩn hóa kết quả đo: Độ đục (OD600) chỉ phản ánh gián tiếp số lượng tế bào, do đó cần có đường chuẩn để quy đổi OD600 sang mật độ tế bào thực

tế (tế bào/mL)

 Loại bỏ ảnh hưởng của yếu tố khác: Thành phần môi trường, kích thước tế bào và giai đoạn sinh trưởng có thể ảnh hưởng đến OD600, nên cần xác địnhđường chuẩn cho từng điều kiện cụ thể

 Ứng dụng trong sản xuất: Giúp kiểm soát nồng độ sinh khối trong quá trình lên men một cách chính xác, đảm bảo hiệu suất lên men ổn định.

b) Trình bày các bước thực hành đếm tế bào nấm men bàng buồng đếm tế bào dưới kính hiển vi.

Các bước tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị mẫu đếm

 Lắc đều dung dịch nấm men để tế bào phân bố đồng đều

 Hút 10 µL dung dịch nấm men bằng pipet

 Nếu mật độ tế bào quá cao, cần pha loãng mẫu với nước vô trùng hoặc dung dịch đệm theo tỷ lệ phù hợp

 Nếu cần phân biệt tế bào sống và chết, trộn mẫu với dung dịch xanh

methylen theo tỷ lệ 1:1

Bước 2: Chuẩn bị buồng đếm

 Đặt lamen (cover slip) lên trên buồng đếm Neubauer

 Nạp 10 µL mẫu nấm men vào buồng đếm bằng pipet, nhẹ nhàng để tránh tạobọt khí

 Đợi khoảng 1-2 phút để tế bào ổn định trước khi quan sát

Bước 3: Quan sát dưới kính hiển vi

 Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi, sử dụng vật kính 10X hoặc 40X để quan sát

 Xác định vùng lưới đếm trên buồng Neubauer, mỗi lưới lớn chia thành 25 ô nhỏ

Bước 4: Đếm số lượng tế bào

 Đếm số tế bào trong 4 hoặc 5 ô lớn nằm ở 4 góc và trung tâm của lưới đếm

 Tế bào nằm trên đường viền chỉ đếm nếu chúng thuộc về hai cạnh cố định (thường quy ước đếm các tế bào trên cạnh trên và cạnh trái).

 Nếu dùng xanh methylen, chỉ đếm tế bào không bị nhuộm (tế bào sống).Bước 5: Tính toán mật độ tế bào

Sử dụng công thức tính mật độ tế bào trong mẫu gốc:

 Hệ số buồng đếm Neubauer: 10⁴ (10.000)

 Nếu mẫu đã pha loãng, nhân thêm với hệ số pha loãng

Bước 6: Ghi nhận kết quả và so sánh

 Ghi lại mật độ tế bào nấm men trong mẫu ban đầu

 So sánh với mật độ mong muốn để điều chỉnh nếu cần

c) Công thức tính toán mật độ tế bào/ml là gì? Giống nấm men cấp 1 của Tổ đếm được mật độ bao nhiêu?

Giá trị mật độ quang và mật độ tế bào nấm men

Mật độ nấm men x (triệu tế

bào/mL) 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0OD₆₀₀ Môi trường YPD-Y 0,00 0,16 0,28 0,47 0,63 0,75 0,87 0,98 1,09 1,23 1,38

Sử dụng Excel xác định đồ thị chuẩn sinh khối:

 Hệ số xác định R² = 0.9957 (cho thấy độ chính xác cao của phương trình tuyến tính).

3 a) Kết quả đo độ đục dãy mật độ giống nấm men của Tổ là bao nhiêu? ống nguyên chất 1 / 2.648

c) Giải thích kết quả

- Độ đục nấm men tăng, phản ánh sự tương quan giữa mật độ tế bào và độ đục của

dung dịch

BỘ CÂU HỎI BÁO CÁO THU HOẠCH

Bài 3 Thực hành lên men nước táo (Apple cider)

1 Trình bày các bước thực hành lên men nước táo mà Tổ đã làm?

Nguyên liệu:

 Nước táo tươi hoặc nước ép táo tiệt trùng

 Giống nấm men (Saccharomyces cerevisiae hoặc giống nấm men thương mại như Lalvin EC-1118, Safcider, v.v.)

 Đường bổ sung (tùy thuộc vào độ ngọt mong muốn)

 Chất dinh dưỡng cho nấm men (như DAP – diammonium phosphate, nếu cần)

 Nước sạch nếu cần pha loãng

Dụng cụ, thiết bị:

 Bình lên men (chai thủy tinh hoặc bình nhựa có khóa khí)

 Ống lên men (airlock) để tránh nhiễm khuẩn nhưng vẫn thoát khí CO₂

 Cốc đong, cân đo đường (khúc xạ kế hoặc hydrometer)

 Máy đo pH

 Đèn cồn, que cấy, dụng cụ vệ sinh và khử trùng

2 Chuẩn bị môi trường lên men

 Lọc nước ép táo để loại bỏ cặn nếu cần

 Điều chỉnh pH nước táo (khoảng 3.0 - 4.5 là phù hợp cho lên men)

 Nếu cần, bổ sung đường để đạt nồng độ đường mong muốn (~10-15% Brix)

3 Hoạt hóa và cấy giống nấm men

 Hoạt hóa giống nấm men bằng cách hòa tan men vào nước ấm (~35°C) và

để yên 15 phút

 Bổ sung chất dinh dưỡng cho nấm men nếu cần

 Đổ men đã hoạt hóa vào nước táo, khuấy đều để phân tán men đồng đều

4 Quá trình lên men

 Đổ hỗn hợp vào bình lên men, đậy nắp và lắp ống airlock

 Ủ ở nhiệt độ 18-25°C trong khoảng 5-14 ngày tùy điều kiện

 Quan sát sủi bọt CO₂, mùi hương lên men và sự thay đổi độ đục

5 Kiểm tra và theo dõi

 Đo độ đường (Brix hoặc SG) hàng ngày để theo dõi tiến trình lên men.

 Kiểm tra pH, nhiệt độ để đảm bảo môi trường phù hợp cho nấm men

 Khi đường giảm xuống gần 0°Brix hoặc đạt SG khoảng 1.000-1.005, quá trình lên men chính kết thúc

6 Kết thúc và bảo quản

 Chuyển rượu táo non sang bình mới để loại bỏ cặn

 Ủ lạnh hoặc thanh trùng nếu muốn dừng lên men

 Đóng chai và bảo quản trong điều kiện thích hợp

7 Đánh giá kết quả

 Quan sát màu sắc, mùi vị của sản phẩm

 Đo độ cồn (có thể tính toán từ sự chênh lệch SG ban đầu và cuối cùng)

 Kiểm tra độ chua, độ ngọt để điều chỉnh nếu cần

2 a) Các yêu cầu về nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ, thiết bị để lên men táo như thế nào?

1 Nguyên liệu chính

 Nước táo tươi hoặc nước ép táo tiệt trùng (không có chất bảo quản như kali sorbat, sodium benzoate)

 Đường (tùy thuộc vào lượng đường tự nhiên trong nước táo, có thể bổ sung thêm đường mía hoặc mật ong)

 Men nấm men (Saccharomyces cerevisiae hoặc men thương mại như Lalvin EC-1118, Safcider, Red Star, v.v.)

 Chất dinh dưỡng cho nấm men (Diammonium phosphate - DAP hoặc hỗn hợp vitamin, khoáng chất)

 Nước sạch (nếu cần pha loãng nước ép táo)

2 Hóa chất hỗ trợ

 Acid citric hoặc acid malic để điều chỉnh pH môi trường lên men (~3.0-4.5)

 Sulfite (Campden tablet hoặc K₂S₂O₅ - Kali metabisulfite) để khử vi khuẩn dại (nếu cần)

 Pectinase (enzym phân hủy pectin, giúp làm trong rượu táo)

 Natri hydroxide (NaOH) hoặc axit hydrochloric (HCl) để điều chỉnh pH

 Bentonite hoặc Gelatin (chất làm trong sản phẩm nếu cần)

 Cốc đong, ống nghiệm, chai thủy tinh để đo lường nguyên liệu

 Que khuấy vô trùng để khuấy hỗn hợp men và nước táo

 Máy đo khúc xạ (refractometer) hoặc hydrometer để kiểm tra nồng độ đường(°Brix)