i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan rằng luận văn “Khảo sát tính chất methyl hóa các gene DAPK, p16 INK4α , p15 INK4b , p14 ARF trên mẫu dịch phết người bệnh Ung thư vòm họng tại Việt Nam” là
GIỚI THIỆU
CƠ SỞ HÌNH THÀNH LUẬN VĂN
Ung thư là bệnh lý do sự tăng trưởng không kiểm soát của tế bào, có khả năng xâm nhập vào các mô khác Một trong những loại ung thư phổ biến là Ung thư Vòm họng (UTVH), bắt nguồn từ vùng vòm họng - khu vực phía sau khoang mũi và phần trên của hầu UTVH có thể lan rộng sang các khu vực khác trong cơ thể thông qua quá trình di căn.
Năm 2020, toàn cầu ghi nhận 133.354 ca mắc ung thư mới với 8.008 ca tử vong, trong đó Châu Á có 113.659 ca, Việt Nam chiếm 6.040 ca (Global Cancer Observatory, 2020) Xét nghiệm sinh thiết tế bào là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán ung thư, nhưng thường chỉ được thực hiện khi bệnh đã tiến triển, do triệu chứng ở giai đoạn đầu thường mơ hồ hoặc không có Nhiều nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới cho thấy sự methyl hóa quá mức tại vùng promoter của đảo CpG có liên quan đến tiến trình phát triển của nhiều loại ung thư Sự thay đổi trong biểu mô, bao gồm methyl hóa vùng promoter, được xem là yếu tố liên quan đến bệnh ung thư vòm họng, trong khi mất đoạn nhiễm sắc thể số 9 kích thích methyl hóa quá mức các gene ức chế khối u, dẫn đến biến đổi trong biểu mô của vòm họng (Dai et al.).
Nghiên cứu về tính chất methyl hóa bất thường trên nhiễm sắc thể số 9 ở bệnh nhân mắc UTVH tại Việt Nam hiện còn hạn chế Để cung cấp thêm dữ liệu về tình trạng methyl hóa vượt mức trong vùng promoter trên đảo CpG của bệnh nhân UTVH, chúng tôi tiến hành khảo sát sự methyl hóa của DNA, với mục tiêu khẳng định đây là một dấu hiệu sinh học quan trọng trong việc chẩn đoán sớm bệnh Các gene được khảo sát bao gồm DAPK, p16 INK4α, p15 INK4b và p14 ARF.
(thuộc nhiễm sắc thể số 9) trên mẫu dịch phết người bệnh ung thư vòm họng tại Việt Nam”
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu này nhằm xác định mối liên quan giữa mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG trong vùng promoter của các gene mục tiêu, so sánh giữa mẫu dịch phết của người lành và người bệnh UTVH Việc phân tích tính chất methyl hóa vượt mức tại các đảo CpG sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh học và tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán cũng như điều trị bệnh.
- Xây dựng cơ sở dữ liệu nghiên cứu bằng phương pháp Meta-analysis
- Khảo sát các đặc điểm của các bộ mồi cho các gene mục tiêu bằng phương pháp In-silico PCR
- Xác định mối tương quan dựa trên số liệu thống kê giữa tính chất methyl hóa trên các gene mục tiêu với bệnh ung thư vòm họng.
CÂU HỎI NGHIÊN CỨU
Tính chất methyl hóa vượt mức tại các vị trí CpG trong vùng promoter của các gene ức chế khối u trên Nhiễm Sắc Thể số 9 có thể liên quan đến tình trạng mắc UTVH ở người Việt Nam, bao gồm cả những người không mắc bệnh.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Bệnh nhân đến khám tại bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh, phòng khám chuyên khoa Tai Mũi Họng.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu này cung cấp dữ liệu khoa học về bệnh UTVH ở mức phân tử, tập trung vào mối liên hệ giữa các yếu tố lâm sàng của ung thư vòm họng và sự methyl hóa bất thường tại các CpG trong vùng promoter của các gene ức chế khối u trên nhiễm sắc thể số 9 Việc xác định mối tương quan này cho thấy methyl hóa vượt mức có thể là một dấu ấn sinh học tiềm năng, hỗ trợ trong việc sàng lọc, chẩn đoán sớm và điều trị cho bệnh nhân UTVH tại Việt Nam.
KẾT CẤU CỦA LUẬN VĂN
Danh mục hình và đồ thị
Danh mục từ viết tắt
Chương 1: Cơ sở hình thành luận văn
Chương 2: Cơ sở tổng quan nghiên cứu
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 4: Kết quả nghiên cứu
Chương 5: Kết luận và kiến nghị
CƠ SỞ TỔNG QUAN
UNG THƯ VÒM HỌNG
1.1 Sơ lược về giải phẫu học
Vòm họng, nằm ở phía trên hầu họng và sau mũi, kết nối mũi với miệng, là một không gian quan trọng trong hệ hô hấp UTVH, hay ung thư vòm họng, là loại khối u ác tính phát sinh từ biểu mô niêm mạc của vòm họng và có khả năng lan rộng sang các vùng lân cận Theo National Cancer Institute (2023), có ba loại UTVH khác nhau.
- Type 1: ung thư biểu mô tế bào gai sừng hóa
- Type 2: ung thư biểu mô tế bào gai không sừng hóa
- Type 3: ung thư biểu mô không biệt hóa
Hình 2 1: Vòm họng theo giải phẫu
Ung thư vòm họng được phân thành bốn giai đoạn khác nhau (National Cancer Institute, 2023):
Giai đoạn 0 là giai đoạn đầu tiên của ung thư, trong đó các tế bào bất thường được phát hiện trong niêm mạc vòm họng Những tế bào này có khả năng tiến triển thành ung thư và lây lan sang các mô xung quanh Đây cũng được gọi là tình trạng biểu mô ung thư ở vị trí ban đầu.
Ung thư giai đoạn I đã phát triển và được phát hiện trong mũi họng, hoặc có thể đã lan rộng từ vòm họng đến hầu họng và/hoặc vào khoang mũi.
Giai đoạn II của ung thư xảy ra khi bệnh đã lan rộng đến một hoặc nhiều hạch bạch huyết ở một bên cổ và/hoặc ảnh hưởng đến hệ thống bạch huyết ở phía sau cổ họng.
Giai đoạn III của ung thư là khi bệnh đã lan đến không gian vòm họng và các cơ xung quanh, đồng thời ảnh hưởng đến một hoặc nhiều hạch bạch huyết ở cả hai bên cổ Ngoài ra, ung thư có thể đã mở rộng tới xương ở đáy hộp sọ, xương cổ, cơ hàm, và các khu vực xung quanh mũi và mắt.
Giai đoạn IV của ung thư được chia thành hai phần: Giai đoạn IVA, trong đó ung thư đã lan đến não, các dây thần kinh sọ, hầu họng, tuyến nước bọt gần tai, xương quanh mắt, và/hoặc các mô mềm của hàm Ung thư có thể cũng đã di căn đến một hoặc nhiều hạch bạch huyết ở một hoặc cả hai bên cổ và/hoặc phía sau cổ họng Giai đoạn IVB cho thấy ung thư đã lan rộng từ các hạch bạch huyết ở cổ họng đến các hạch bạch huyết xa hơn, bao gồm các hạch bạch huyết ở giữa phổi, dưới xương đòn, nách và các bộ phận khác.
Hình 2 2: Các giai đoạn bệnh UTVH
1.2 Tình hình bệnh Ung Thư Vòm Họng trên Thế Giới và Việt Nam
Bệnh UTVH có tỷ lệ nhiễm cao nhất ở Đông Nam Trung Quốc, Đông Nam Á, Bắc Phi, Trung Đông và Bắc Cực, nhưng hiếm gặp ở các khu vực khác Nghiên cứu của Dai và cộng sự (2016) cho thấy nhóm tuổi mắc UTVH trung bình là 50, thấp hơn so với nhiều loại ung thư khác với độ tuổi trung bình là 65 Theo thống kê toàn cầu năm 2020, có 133.354 trường hợp UTVH và 8.008 ca tử vong, với khu vực Châu Á ghi nhận số ca mắc mới cao nhất Tại Việt Nam, năm 2020 có 6.040 trường hợp mắc UTVH, chiếm tỷ lệ 6,0%, đứng đầu khu vực về tình trạng mắc bệnh và tử vong do UTVH (Global Cancer Observatory, 2020).
1.3 Nguyên nhân và chẩn đoán
Có 3 nhóm nguyên nhân chính gây ra bệnh UTVH: nhiễm Virus Epstein-Barr, yếu tố gene di truyền và yếu tố môi trường (Lun & Chow, 2013) Chẩn đoán bệnh UTVH bao gồm các bước: khám lâm sàng, nội soi, kiểm tra huyết đồ để xác định công thức máu, chẩn đoán hình ảnh bằng chụp X-ray, chụp cộng hưởng từ, chụp cắt lớp và cắt lớp tán xạ (National Cancer Institute, 2023) Tuy nhiên, để xác định chính xác bệnh UTVH, sinh thiết tế bào được coi là tiêu chuẩn vàng vì có độ chính xác cao Tuy nhiên, nó chỉ có thể thực hiện được khi bệnh đã phát triển đến giai đoạn muộn và đã có xuất hiện khối u Để phát hiện bệnh UTVH ở giai đoạn sớm, cần tìm kiếm các dấu hiệu sinh học và sử dụng chúng như công cụ hỗ trợ cho sàng lọc, chẩn đoán sớm ung thư nói chung và UTVH nói riêng là rất cần thiết (Chan et al., 2002; Cui et al., 2016; Lun & Chow, 2013) Bên cạnh đó, methyl hóa DNA là một hiện tượng mang tính thuận nghịch Khả năng kích hoạt lại các gene ức chế khối u diễn ra trên gene có thể được thực hiện hoàn toàn thông qua việc sử dụng các loại thuốc giải methyl hóa Điều này đã mở ra tiềm năng phát triển phương pháp điều trị ung thư vòm họng thông qua con đường giải methyl hóa, đã được thử nghiệm trong vài năm qua Loại thuốc giải methyl hóa phổ biến bao gồm các thuốc ức chế enzyme DNA methyltransferase (DNMT) và enzyme histon deacetylase (HDAC) Ví dụ, 5-aza-2’- deoxycytidine và 5-Azacytidine là hai loại thuốc có khả năng ức chế DNMT Trong một nghiên cứu của Zhang và đồng nghiệp trên bệnh nhân mắc ung thư vòm họng và dương tính với Epstain-Barr, azatidine đã cho thấy hiệu quả trong việc giải methyl hóa tại các vùng promoter của các gene liên quan đến quá trình ly giải virus Epstain- Barr (Xiang & Zhang, 2005) Do đó, methyl hóa vượt mức có thể dùng như một chất đánh dấu để chẩn đoán sớm và theo dõi bệnh UTVH (Kwong et al., 2002)
Nghiên cứu này tập trung vào cơ chế methyl hóa DNA để xác định mối liên hệ giữa tính chất methyl hóa không bình thường của các gene và bệnh ung thư tuyến vú (UTVH) Mục tiêu là phát triển phương pháp sử dụng methyl hóa DNA như một dấu hiệu sinh học cho việc sàng lọc và phát hiện sớm UTVH.
METHYL HÓA DNA
Quá trình methyl hóa DNA liên quan đến việc chuyển đổi nhóm methyl (-CH3) thành Cytosine tại vị trí carbon thứ năm, tạo thành 5-Methyl-Cytosine Quá trình này phụ thuộc vào enzyme DNA methyltransferase và chủ yếu diễn ra tại các vị trí Cytosine ở đầu 5' tiếp giáp với Guanosine trong cặp CpG Các CpG này tập trung ở vùng 5' của các gene, hình thành các khu vực gọi là đảo CpG (Cui et al., 2016; Locke et al., 2019).
Các đảo CpG có độ dài từ 0,5 đến 3,0 kilobase và quá trình methyl hóa DNA tại các đảo này ảnh hưởng đến biểu hiện gene trong quá trình biến đổi tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự im lặng của một số vùng gene trên nhiễm sắc thể Nghiên cứu gần đây cho thấy methyl hóa DNA có vai trò quan trọng trong sự xuất hiện và phát triển của bệnh ung thư, với các biến đổi trong phân bố của 5-Methyl Cytosine góp phần quan trọng vào quá trình hình thành bệnh này.
Quá trình methyl hóa DNA ở các gene tại vị trí CpG trong khu vực 5’-promoter đã gia tăng, dẫn đến sự bất ổn và tắt biểu hiện gene (Delpu et al., 2013) Sự biến đổi này không chỉ xảy ra giữa các loại mô khác nhau mà còn giữa các vùng não, giữa chất xám và chất trắng, và thậm chí có sự khác biệt giữa các tế bào (Ladd-Acosta et al.).
Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy sự phát triển trong phân tích methyl hóa DNA, cho phép thực hiện trên toàn bộ gene với lượng mẫu nhỏ Năm 2021, một nghiên cứu về UTVH đã thành công trong việc giải trình tự exome và phát hiện những biến đổi di truyền liên quan đến bệnh này, bao gồm sự thiếu mất nhiễm sắc thể số 9 trong tế bào biểu mô vòm họng, dẫn đến sự tăng trưởng của khối u Ngoài ra, sự methyl hóa vượt mức ở vùng promoter cũng được ghi nhận, với tỉ lệ thay đổi theo giai đoạn tiến triển của bệnh Nghiên cứu chỉ ra rằng bệnh nhân có mức độ methyl hóa thấp có khả năng đáp ứng tốt với liệu pháp hóa trị Những phát hiện này cho thấy methyl hóa DNA có thể được sử dụng như một dấu hiệu sinh học trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh UTVH Do đó, nghiên cứu này tập trung vào các gene DAPK, p16 INK4α, p15 INK4b và p14 ARF để phát triển phương pháp chẩn đoán bệnh UTVH ở giai đoạn sớm, không xâm lấn.
Gene DAPK (Death Associated Protein Kinase) nằm trên nhiễm sắc thể số 9 tại vị trí 9q21.3, thuộc nhóm gene điều hòa chu kỳ tế bào và có vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự phát triển của khối u thông qua việc kích hoạt gama-interferon Gene này không chỉ ngăn chặn sự xâm lấn của tế bào ung thư mà còn ức chế quá trình chết theo chương trình do DAPK gây ra Mức độ DAPK ảnh hưởng lớn đến sự xâm lấn của khối u qua con đường apoptosis của p53, giúp ngăn chặn cái chết không kiểm soát và duy trì sự ổn định của hệ thống tế bào Nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự không hoạt động của gene DAPK có thể góp phần vào sự phát triển của nhiều loại ung thư, bao gồm cả ung thư vú.
Methyl hóa promoter của gene DAPK có tỷ lệ cao ở các khối u UTVH nguyên phát, lên đến 88,0% (Fendri et al., 2009), 79,2% (Z Zhang et al., 2012) và 88,2% (Wong et al., 2002), trong khi các biểu mô vòm họng bình thường không bị methyl hóa Những nghiên cứu này chỉ ra rằng quá trình methyl hóa quá mức của gene DAPK có thể được coi là một dấu ấn sinh học tiềm năng, phục vụ cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán mới cho UTVH giai đoạn sớm mà không gây xâm lấn cho bệnh nhân.
Gene p16 INK4α, hay còn gọi là Cyclin-Dependent Kinase inhibitor, là một gen ức chế khối u quan trọng nằm ở vị trí 9p21.3 trên nhiễm sắc thể số 9, bao gồm ba exon mã hóa 156 axit amin Gene này đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa chu trình tế bào thông qua con đường tín hiệu p16 INK4α/Rb, bằng cách ức chế Cyclin-Dependent Kinase (CDK), ngăn chặn sự tương tác của CDK với Cyclin, từ đó ức chế quá trình phosphoryl hóa trên pRb và làm ngưng chu trình tế bào Nghiên cứu của Xiao và cộng sự vào năm 2016 cho thấy quá trình methyl hóa trên gene p16 INK4α ở mẫu mô sinh thiết của khối u vòm họng cao hơn đáng kể so với mẫu người bình thường, và sự methyl hóa trong mẫu máu của bệnh nhân UTVH cũng cao hơn rõ rệt so với mẫu máu bình thường Những phát hiện này mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm dựa trên các mẫu khác nhau.
Hình 2 5: Con đường tín hiệu của gene p16 INK4α
Các gene p15 INK4b và p16 INK4α nằm cạnh nhau trên nhiễm sắc thể 9 tại vị trí p21, và sự mất locus INK4a/ARF/INK4b là một trong những biến đổi di truyền phổ biến nhất trong ung thư ở người Hai gene này có độ tương đồng 85,0% ở mức acid amin và các protein INK4 tương tác với CDK4 và CDK6 để ngăn chặn sự tương tác của chúng với cyclin, đồng thời ức chế phosphoryl hóa qua trung gian CDK4/6 Khi p15 INK4b hoặc p16 INK4α bị mất biểu hiện, sự kiểm soát của các protein thuộc họ Rb bị mất, dẫn đến việc E2F liên kết và không thể giữ tế bào ở chu kỳ G1.
Hình 2 6: Con đường tín hiệu của gene p15 INK4b
Gene p14 ARF là một chất ức chế khối u quan trọng, có khả năng ngăn chặn sự hình thành ung thư bằng cách điều chỉnh chu kỳ tế bào và kích hoạt quá trình tử vong tế bào Chức năng của p14 ARF chủ yếu thông qua tương tác với protein p53, giúp ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào bất thường Cụ thể, p14 ARF kích hoạt chuỗi tín hiệu p53/p21, dẫn đến hiện tượng bắt giữ tế bào ở chu kỳ G1 Khi p14 ARF mất chức năng, hoạt động của Kinase p34cdc2 giảm, làm suy yếu chuỗi tín hiệu p53/p21 và gây bắt giữ tế bào ở chu kỳ G2.
Mất locus INK4a/ARF/INK4b trên nhiễm sắc thể 9p21 là một trong những biến đổi di truyền phổ biến nhất trong bệnh ung thư ở người Các gene p16 INK4α, p15 INK4b và p14 ARF đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành và ức chế sự phát triển khối u Trong nhóm gene INK4, p16 INK4α và p15 INK4b là các chất ức chế phụ thuộc vào cyclin, tương tác với CDK4 và CDK6 để kiểm soát chu kỳ tế bào.
ARF tham gia vào việc điều chỉnh gene p53, và các gene này có liên quan đến sự hình thành khối u (Kim & Sharpless, 2006) Vì vậy, việc nghiên cứu các khu vực gene này là rất quan trọng trong công trình nghiên cứu của chúng tôi.
3 NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự bất thường trong tính chất methyl hóa liên quan đến nhiều loại ung thư, bao gồm cả ung thư tế bào vảy (UTVH) (Wong et al., 2002) Cụ thể, nghiên cứu của Joseph Kwong và cộng sự năm 2002 đã phân tích tính chất methyl hóa ở các vùng gene RASSF1A, RARβ2, DAPK, p16 INK4α, p15 INK4b, p14 ARF, MGMT và GSTP1 từ 33 trường hợp khối u nguyên phát, 25 khối u nhúng parafin và 6 mẫu mô bình thường Kết quả cho thấy tỷ lệ methyl hóa promoter trong các mẫu UTVH lần lượt là 84,0% đối với RASSF1A, 80,0% đối với RARβ2, và 76,0% đối với DAPK.
14 p16 INK4α ; 17,0% đối với p15 INK4b , 20,0% đối với p14 ARF ; 20,0% đối với MGMT và
Nghiên cứu cho thấy sự methyl hóa gene GSTP1 đạt 3,0% (Kwong et al., 2002), trong khi không phát hiện methyl hóa ở 6 mẫu mũi họng bình thường Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra sự tăng methyl hóa gene promoter trong huyết thanh và đờm của bệnh nhân ung thư phổi Thay đổi methyl hóa cũng được phát hiện trong huyết thanh và nước bọt của bệnh nhân có khối u ở đầu và cổ Năm 2009, Fendri A và nhóm nghiên cứu đã khảo sát methyl hóa gene RASSF1A và DAPK từ 68 mẫu mô sinh thiết, với tần suất methyl hóa lần lượt là 91,0% và 88,0% (Fendri et al., 2009) Nghiên cứu năm 2016 của Dai và đồng nghiệp cho thấy tần suất methyl hóa của gene DAPK, p16 INK4α và p15 INK4b lần lượt là 88,0%, 16,0–66,0% và 21,0–50,0%, có sự tương quan với các giai đoạn bệnh (Dai et al., 2016) Hơn nữa, methyl hóa cũng được phát hiện trên nhiều nền mẫu khác nhau, bao gồm sinh thiết, máu, dịch phết, phân và nước tiểu (Locke et al., 2019).
4 NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM
Năm 2005, Trần Ngọc Tú nghiên cứu methyl hóa gene RASSF1A và p16 INK4α trong ung thư biểu mô miệng ở phụ nữ Việt Nam không hút thuốc và uống rượu, phát hiện mất đoạn dị hợp tử trên nhiễm sắc thể 9 dẫn đến không hoạt động của gene p16 INK4α (Tran et al., 2015) Năm 2018, Lao và cộng sự tổng hợp dữ liệu từ 9 nghiên cứu toàn cầu về bệnh niêm mạc họng, phát hiện methyl hóa vượt mức ở các gene DAPK, p16 INK4α, p15 INK4b, p14 ARF (Lao et al., 2018) Năm 2019, Lao đã tổng hợp 99 bài báo và 12 nghiên cứu lâm sàng, xác nhận mối liên hệ giữa methyl hóa vượt mức các gene này với bệnh UTVH, với tần suất methyl hóa ở người châu Á cao hơn so với châu Mỹ và châu Phi (Lao et al., 2019) Năm 2020, luận án tiến sĩ của Lao Đức Thuận chứng minh sự gia tăng đáng kể methyl hóa các gene DAPK, p16 INK4α, p15 INK4b, p14 ARF ở nhóm bệnh so với nhóm chứng (Lao, D.T, 2020).
Các nghiên cứu đã chỉ ra mối tương quan có ý nghĩa giữa quá trình methyl hóa vượt mức ở các mẫu bệnh và mẫu lành, đặc biệt là quá trình methyl hóa vượt mức của các gene.
VẬT LIỆU
Bài viết này kế thừa bộ mẫu nghiên cứu luận án tiến sĩ của TS Lao Đức Thuận, thu thập từ bệnh nhân mắc bệnh ung thư vòm họng tại Khoa Tai Mũi Họng Bệnh viện Chợ Rẫy, TP Hồ Chí Minh, theo số 516/BVCR-HDDD năm 2017 Bệnh nhân được lựa chọn dựa trên các tiêu chí cụ thể nhằm đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của nghiên cứu.
Mẫu bệnh được thu thập từ bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc UTVH, với việc xác định loại mô học theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và có thông tin bệnh sử rõ ràng.
- Mẫu chứng được lấy từ bệnh nhân được chuẩn đoán không mắc bệnh UTVH
- Tất cả các mẫu lấy từ bệnh nhân đều có sự đồng thuận của đối tượng
- Cỡ mẫu nghiên cứu xác định theo công thức ước tính hệ số tương quan (Pourhoseingholi et al., 2013):
Giá trị tới hạn mức Z(1-α)/2 theo phân phối chuẩn với α 5% là 1,96 Sử dụng p = 0,57 từ nghiên cứu trong luận án "Nghiên cứu một số tính chất phân tử của bệnh ung thư vòm họng ở người Việt Nam" của tác giả Lao Đức Thuận (Lao, Đ.T 2020) Tần suất methyl hóa trên gene p16 INK4α được đưa vào tính toán do đây là tần số thấp nhất trong nghiên cứu, nhằm đạt được cỡ mẫu cao nhất.
- d: Độ chính xác mong muốn = 0,1 (10%)
- Kết luận n = 37,6; do đó cỡ mẫu được chọn ≥ 38
1.2 Các công cụ, trang thiết bị và hoá chất
Dụng cụ và trang thiết bị
- Pippette và đầu tip các loại
- Máy Vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)
- Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức)
- Bộ dụng cụ điện di DNA (Biorad)
- Bộ dụng cụ đọc kết quả điện di
- Máy đo quang phổ (Scanning UV/VIS, Smart Spec, BioRad)
- Dùng cho quá trình tách chiết: Tris-HCl, EDTA 0,5M, NaCl 2,5M, β- mercaptoethanol 99,9%, 1% CTAB, nước cất đã hấp, protein K 1mg/ml, PCI: phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25/24/1) TE 1X, ethanol 70%, isopropanol
- Dùng cho quá trình PCR và điện di: Master mix (2X) (bio-line), primer forward 10 μM, primer reverse 10 μM, nước cất đã hấp, agarose, TBE 1X, gel red 6X, thang phân tử 100bp
Phần mềm tìm kiếm thông tin và xử lý kết quả thống kê phân tích
- NCBI: phần mềm dùng cho việc thu thập tìm kiếm dữ liệu thông tin
(https://www.Ncbi.Nlm.Nih.Gov)
- Pubmed: khai thác tất cả các công trình nghiên cứu khoa học đã công bố về Y – Sinh trong Med-Line (https://Pubmed.Ncbi.Nlm.Nih.Gov)
Genebank là một nguồn tài nguyên quý giá, cho phép người dùng tìm kiếm thông tin về trình tự nucleotide và protein, phân loại (taxonomy), bộ gen (genome), bản đồ gen (mapping), cấu trúc protein, cũng như thông tin về các vùng domain Ngoài ra, Genebank còn cung cấp các bài báo đã được công bố trên Pubmed, giúp người nghiên cứu tiếp cận và khai thác dữ liệu một cách hiệu quả.
- GeneCards: Tìm trình tự các gene mục tiêu (https://www.Genecards.Org)
IDT analyzer là công cụ hữu ích giúp xác định các thông số quan trọng của mồi, bao gồm chiều dài mồi, tỷ lệ % GC, nhiệt độ nóng chảy và khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp như Hairpin, Self-dimer, và Hetero-dimer.
- MethPrimer: tìm vị trí vùng Promoter các đảo CpG và trình tự mồi biến đổi bisulphite (https://www.Urogene.Org/Cgi-Bin/Methprimer)
- Annhyb: khảo sát độ quá trình bắt cặp và kích thước sản phẩm của mồi
(https://Www.Bioinformatics.Org/Annhyb)
BioEdit 7.7.1 là phần mềm miễn phí cho việc xem, hiệu chỉnh và phân tích trình tự nucleotide Phần mềm này cung cấp các công cụ mạnh mẽ để xem và so sánh trình tự, đồng thời hỗ trợ phân tích sự tương đồng giữa các trình tự khác nhau.
(https://Bioedit.Software.Informer.Com)
- MedCalc: dùng để phân tích thống kê (https://www.Medcalc.Org)
Hình 3 1: Tóm tắt quá trình thực hiện đề tài
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Xây dựng cơ sở dữ liệu bằng phương pháp Meta-analysis
Thu thập thông tin dữ liệu trình tự tương ứng cho các gene từ các cơ sở dữ liệu uy tín như NCBI, PubMed, GeneCards, Google, Google Scholar
Các từ khóa sử dụng trong quá trình tìm kiếm bao gồm “nasopharyngeal carcinoma”; “methylation”; “DAPK”; “ p16 INK4α ”; “p15 INK4b ”; “p14 ARF ”;
“diagnosis”; “epigenetic” Các nghiên cứu được sử dụng thỏa các tiêu chí sau:
- Tiêu chí lựa chọn: có thiết kế nghiên cứu bệnh chứng, dữ liệu về tần suất của quá trình methyl hóa các gene mục tiêu, cỡ mẫu rõ ràng
Tiêu chí loại trừ bao gồm các bài viết sử dụng ngôn ngữ khác, tóm tắt, báo cáo trường hợp, thư gửi biên tập viên, bài báo chưa xuất bản, nghiên cứu không liên quan và thiếu thông tin quan trọng cần thiết cho việc phân tích.
Sau khi thu thập, các bài báo sẽ được đưa vào phần mềm MedCalc để thực hiện tổng hợp thống kê và phân tích, nhằm đánh giá mối tương quan giữa tính chất methyl và các yếu tố liên quan Các thước đo được sử dụng bao gồm tỷ lệ mắc bệnh (Proportion), tỷ suất chênh (Odds ratio - OR), phép thử Cochrane’s Q và chỉ số I² để thực hiện đánh giá.
- Phép thử Cochrane’s Q: được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa các phân nhóm
- Chỉ số I 2 : chỉ số ước tính sự đồng nhất và bất đồng nhất
- CI 95%: Khoảng tin cậy được sử dụng trong bài báo là 95%
- DF: độ tự do các nghiên cứu
Chúng tôi đã sử dụng phần mềm MedCalc của MedCalc Software Ltd để thực hiện phân tích thống kê dữ liệu, trong đó chỉ số OR được đưa vào khảo sát với mức ý nghĩa được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3 1: Hệ thống điểm của giá trị OR trong y học theo MedCalc 2023
Giá trị OR Giá trị RR Điểm Ý nghĩa Điểm Ý nghĩa
> 1 Khả năng mắc bệnh cao hơn khả năng không mắc bệnh
> 1 Yếu tố phơi nhiễm làm tăng khả năng mắc bệnh
= 1 Khả năng mắc bệnh bằng khả năng không mắc bệnh
= 1 Không có mối liên hệ nào giữa yếu tố phơi nhiễm và khả năng mắc bệnh
< 1 Khả năng mắc bệnh thấp hơn khả năng không mắc bệnh
< 1 Không có mối liên hệ nào giữa yếu tố phơi nhiễm và khả năng mắc bệnh
2.2 Phương pháp khảo sát trình tự mồi
Khảo sát các cặp mồi khuếch đại cho vùng gene mục tiêu DAPK, p16 INK4α, p15 INK4b, và p14 ARF được thực hiện dựa trên nghiên cứu của H.Zhang et al (2015) và Wei et al (2013) Các cặp mồi này được đánh giá tính vật lý bằng phần mềm IDT Ligo Analyzer, sau đó tiến hành đánh giá quá trình bắt cặp và kích thước sản phẩm bằng phần mềm MethPrimer và Annhyb.
Bảng 3 2: Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên gene Tên mồi Trình tự 5’-3’ β-actin Beta-F ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC
The article provides essential primer sequences for the genes p15 INK4b, p14 ARF, and p16 INK4α, which are crucial in cancer research For p15 INK4b, the forward and reverse primers are p15-S1-F (GGTTTAGTTGAAAACGGAATTT) and p15-S1-R (TCTCTCCTCCTAAAAAACCTAAA), respectively, with additional sequences for p15-MF, p15-MR, p15-UF, and p15-UR Similarly, p14 ARF primers include p14-S1-F (GGTGCGTGGGTTTTAGTTTGTA) and p14-S1-R (AACATCAACACGAAAACCACA), along with p14-MF, p14-MR, p14-UF, and p14-UR sequences Lastly, for p16 INK4α, the primer sequences are p16-S1-F (GGAGGAAGAAAGAGGAG) and p16-S1-R (CTACAAACCCTCTACCCA), complemented by p16-MF, p16-MR, p16-UF, and p16-UR These sequences are vital for amplifying these tumor suppressor genes in molecular biology studies.
Các bước thực hiện bao gồm việc đánh giá các thông số vật lý của mồi xuôi (F), mồi ngược (R), methyl (M), unmethyl (U) và chuỗi (S) bằng phần mềm trực tuyến IDT Oligo Analyzer, tuân theo các tiêu chuẩn đã được quy định.
- Chiều dài của mồi nằm trong khoảng 17-28 bp
- Phần trăm GC nằm trong khoảng 40-60%
- Không có sự lặp lại của các base G hoặc C liên tiếp dài hơn 3 base ở đầu 3’ của mồi
- Nhiệt độ tan chảy (Tm) nằm trong khoảng 50-65°C
- Giá trị ∆G (kcal/mole) của hệ mồi lớn hơn hoặc bằng -9 kcal/mole.
TIẾN TRÌNH THỰC HIỆN
3.1 Chiết xuất DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform
- Chuẩn bị mẫu: 20 àl mẫu dịch phết vào 700àl dung dịch đồng nhất mẫu (EDTA:14ul; Tris-HCl: 70ul; NaCl2,5M: 140ul; SDS: 30ul; proteinase K: 10ul, nước tinh sạch: 436 ul)
- Bước 1: Ly tâm mẫu ủ 13000 vòng/ phút trong 10 phút
- Bước 2: Thu lấy dịch nổi và hòa dịch nổi với một thể tích tương đương dung dịch PCI (phenol: chloroform: isoamylalcohol tỷ lệ 25:24:1)
- Bước 3: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút, thu lấy dịch nổi và hòa dịch nổi với một thể tích tương đương dung dịch PCI (phenol: chloroform: isoamylalcohol tỷ lệ 25:24:1)
- Bước 4: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút, thu lấy dịch nổi và thêm vào một thể tích tương đương chloroform
- Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch nổi và thêm vào một thể tích tương ứng isopropanol với 1/10 thể tích NaOAC, lắc đều mẫu
- Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 20 phút, thu tủa và bổ sung thêm 1 ml ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút
- Bước 8: Tủa được phơi khô bằng máy ủ nhiệt khô trong 30 phút
- Bước 9: Bổ sung thờm 100àl TE (Tris HCL 0,1 mM; EDTA 0,01 mM)
Bước 10: Để xác định nồng độ và độ tinh khiết của DNA từ mẫu bệnh phẩm sau khi tách chiết, cần tiến hành đo mật độ quang với tỷ lệ A260/A280 nm.
3.2 Thực hiện PCR khuyếch đại gene chứng nội β-actin
Trỡnh tự mồi được sử dụng theo Hửpfner và cộng sự (Hửpfner et al., 2003)
Tên mồi Trình tự 5’-3’ Kích thước
Phản ứng PCR được thực hiện với thành phần phản ứng:
Hình 3 2: Chu trình nhiệt độ
Sản phẩm PCR sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%, dung dịch đệm TBE, điện thế 100V trong 30 phút
3.3 Thực hiện quá trình bisulfite
Chuẩn bị: Đảm bảo làm việc trong điều kiện sạch sẽ và tránh nhiễm sắc thể DNA ngoại lai Đối với mẫu DNA sử dụng 500 ng đến 2 àg DNA
- Bước 1: Thu thập mẫu DNA
Bước 2 trong quy trình là chuẩn bị mẫu DNA, trong đó cần đo nồng độ của mẫu bằng máy đo mật độ quang tại bước sóng 260 nm và xác định độ tinh khiết của mẫu DNA tại bước sóng tương ứng.
- Bước 3: Cho 2 àg DNA với 52 àl Reagenet PD và 60 àl bisulfite mix từ kit.Trộn đều và đảm bảo đủ phân bố bisulfite đều trong mẫu
Đặt mẫu vào máy luân nhiệt với các điều kiện: 98°C trong 5 phút, sau đó 64°C trong 3,5 giờ (hoặc theo hướng dẫn của bộ kit cho thời gian cụ thể), và duy trì ở 4°C cho đến khi lấy mẫu.
- Bước 5: Làm sạch: sử dụng cột và các bước làm sạch theo hướng dẫn cụ thể của kit
- Bước 6: Thu nhận sản phẩm của bisulphite-treated DNA từ cột bằng cách sử dụng elution buffer theo hướng dẫn của kit
- Bước 7: Lưu trữ ở -20°C hoặc -80°C nếu không sử dụng ngay
3.4 Phân tích sự methyl hóa bằng kỹ thuật Nested-Methylation – Specific
Bước đầu tiên trong quy trình là thiết lập phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi (forward và reverse) cho vùng DNA cần kiểm tra sự methyl hóa DNA mẫu phải được xử lý bằng bisulphite, giúp chuyển đổi các cytosine không methyl hóa thành uracil, trong khi các cytosine methyl hóa vẫn giữ nguyên Sau đó, tiến hành chạy PCR với các điều kiện phù hợp theo mô hình chu kỳ nhiệt và cặp mồi đã chọn, nhằm tạo ra sản phẩm PCR ban đầu.
Bước 2 trong quy trình Nested-PCR là thiết lập phản ứng với một cặp mồi nằm bên trong vùng DNA đã được khuếch đại từ PCR bước 1 Sản phẩm PCR từ bước trước sẽ được sử dụng làm mẫu cho PCR bước 2 Điều kiện chạy PCR bước 2 sẽ phụ thuộc vào mô hình chu kỳ nhiệt cụ thể và cặp mồi được chọn.
Bước 3 trong quy trình là phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên thạch agarose 2% Thực hiện điện di với điện thế 100V trong 60 phút, sử dụng thang chuẩn 100bp và gene chứng nội β-actin để đảm bảo độ chính xác của kết quả.
3.5 Giải trình tự kiểm tra sản phẩm
- Một số mẫu sau khi thực hiện MSP bước 1 được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa
- Dùng phần mềm BioEdit chỉnh sửa trình tự, sắp giống cột và tìm vị trí bắt cặp các cặp mồi
3.6 Thực hiện thống kê và phân tích kết quả
Kết quả điện di từ Nested-MSP sẽ được nhập vào phần mềm MedCalc để thực hiện phân tích thống kê, nhằm đánh giá mối tương quan giữa tính chất methyl và các yếu tố liên quan Các thước đo quan trọng bao gồm khoảng tin cậy 95% (CI), tần suất methyl hóa (p), chỉ số nguy cơ tương đối (Odds ratio - OR) và tỉ suất số (Relative risk - RR).
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN
XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP META- ANALYSIS
Sau khi loại bỏ các nghiên cứu không phù hợp, chúng tôi đã thu thập được 16 nghiên cứu liên quan đến gene DAPK, 13 nghiên cứu về gene p16 INK4α, 2 nghiên cứu về gene p15 INK4b và 1 nghiên cứu về gene p14 ARF trong giai đoạn từ năm 2002 đến 2020 Do đó, phần phân tích tổng hợp chủ yếu tập trung vào các bài báo về gene DAPK và p16 INK4α Các bài báo này đã được tổng hợp các thông số như chỉ số nguy cơ (OR), khoảng tin cậy 95%, phép thử Cochrane’s Q và chỉ số I² để phục vụ cho quá trình phân tích.
Hình 4 1: Quá trình tìm kiếm thu thập dữ liệu khoa học công bố trực tuyến
1.1 Đặc điểm của các nghiên cứu methyl hóa trên gene DAPK
Chúng tôi đã thu thập 16 nghiên cứu đáp ứng tiêu chuẩn khảo sát, với tổng cộng 1.472 mẫu, trong đó có 895 mẫu từ bệnh nhân mắc bệnh UTVH và 487 mẫu từ những người không mắc bệnh ung thư Các nghiên cứu này được thực hiện trong khoảng thời gian từ năm 2002 đến 2020.
Trong 16 nghiên cứu, nguồn gốc dân tộc của bệnh nhân chủ yếu là từ châu Á, với 11/16 cá nhân (chiếm 68,25%), trong khi 5 nghiên cứu còn lại (31,75%) có bệnh nhân từ châu Phi Sự phân bố này cho thấy bệnh UTVH có liên quan đến yếu tố chủng tộc Tất cả 15 nghiên cứu đã áp dụng phương pháp MSP để phân tích tính chất methyl hóa Thêm vào đó, 6 nghiên cứu đã sử dụng mẫu máu và dịch cơ thể nhằm xác định mối liên hệ giữa quá trình methyl hóa gene.
Phương pháp DAPK và UTVH mang đến một cách tiếp cận ít tác động đến cơ thể, giúp đánh giá mối liên hệ giữa tính chất methyl hóa và bệnh UTVH Đây cũng là một phương pháp tiềm năng trong việc sàng lọc, chẩn đoán và tiên lượng bệnh UTVH.
Bảng 4 1: Đặc điểm các nghiên cứu về sự methyl hóa vượt mức trên vùng promoter gene DAPK
Kwong và cộng sự năm 2002
2 Wong TS và cộng sự năm 2002
Chang và cộng sự năm 2003
4 Kong WJ và cộng sự năm 2006
Kong và cộng sự năm 2009
6 Challouf và công sự năm 2012
Tian và cộng sự năm 2013
M Tong và cộng sự năm 2002
Wong và cộng sự năm 2004
10 Ali Fendri và cộng sự năm 2009
11 Nawaz và cộng sự năm 2015
12 Yang và cộng sự năm 2015
Hutajulu và cộng sự năm 2011
14 Z Zhang và cộng sự năm 2012
15 Z Zhang và cộng sự năm 2012
16 Lao, T.D và cộng sự năm
Hình 4 2: Biểu đồ rừng tần suất methyl hóa gene DAPK trên ca bệnh
Kết quả kiểm định ngẫu nhiên (random effects): pc,97; Q= 349,24; DF; p < 0,0001; I 2 ,13%%; CI 95% cho I 2 ,52 – 96,34
Hình 4 3: Biểu đồ rừng tần suất methyl hóa gene DAPK trên ca chứng
Kết quả kiểm định ngẫu nhiên (random effects): p=9,72; Q= 81,83; DF; p < 0,0001; I 2 y,22%%; CI 95% cho I 2 g,84 – 86,58
Hình 4 4: Biểu đồ rừng tỉ số nguy cơ tương đối các nghiên cứu trên gene DAPK Kết quả kiểm định ngẫu nhiên (random effects): OR,1; Q= 51.04; DF; p < 0,0001; I 2 f,69%; CI 95% cho I 2 E,39 – 79,68
Tần suất methyl hóa của gene DAPK đã được đánh giá trong hai nhóm nghiên cứu, cho thấy nhóm bệnh có Q = 349,24 (p < 0.001) và chỉ số I² là 95,13%, trong khi nhóm chứng có Q = 81,83 (p < 0,001) và I² là 79,22% Sự chênh lệch đáng kể giữa nhóm bệnh (p = 63,97%) và nhóm chứng (p = 9,72%) cho thấy mối tương quan giữa methyl hóa DAPK và bệnh UTVH Biểu đồ rừng tỷ số nguy cơ tương đối trong hình 4.4 chỉ ra rằng tần số methyl hóa cao hơn có liên quan đến sự gia tăng nguy cơ mắc bệnh UTVH.
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng tỷ lệ methyl hóa ở nhóm bệnh cao gấp 11,11 lần so với nhóm chứng, với mức tăng có ý nghĩa thống kê 5% Nghiên cứu này tương đồng với kết quả của Lao và cộng sự (2023), khi tổng hợp từ 13 nghiên cứu cho thấy sự tương quan giữa methyl hóa và gene.
Bảng 4.2 trình bày phân tích mối liên quan giữa quá trình methyl hóa gene DAPK và nguy cơ mắc UTVH theo chủng tộc và nguồn mẫu Kết quả cho thấy quá trình methyl hóa gene DAPK có mối tương quan đáng kể với sự phát triển của UTVH, với các chỉ số OR lớn hơn 1 (Châu Á OR=9,98; Châu Phi OR=7,83; mô OR=0,31; máu OR=4,14; dịch cơ thể OR=6,02) Điều này chỉ ra rằng methyl hóa gene DAPK có liên quan đến sự phát triển của UTVH ở người Châu Á và Châu Phi, tương tự như nghiên cứu của Lao và cộng sự (Lao et al., 2023) Quan sát này gợi ý rằng dân số châu Phi có thể dễ bị ảnh hưởng bởi quá trình methyl hóa.
Chỉ số nguy cơ (OR)
Hiệu ứng ngẫu nhiên Châu Á 564/895 71/487 9,98 7,5 – 13,29
