Đánh Giá Khả Năng Tương Tác Của Nanobody A8 Với Botulinum Neurotoxin Type A Và Bước Đầu Ứng Dụng Trong Làm Giàu Độc Tố.pdf

Các phương pháp phát hiện độc tố botulinum hiện nay chủ yếu dựa trên sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể, kết hợp với các kỹ thuật phân tích tiên tiến như endopeptidase hoặc khối

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lương Trung Hiếu

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TƯƠNG TÁC CỦA NANOBODY A8 VỚI BOTULINUM NEUROTOXIN TYPE A VÀ BƯỚC

ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG LÀM GIÀU ĐỘC TỐ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2025

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lương Trung Hiếu

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TƯƠNG TÁC CỦA NANOBODY A8 VỚI BOTULINUM NEUROTOXIN TYPE A VÀ BƯỚC

ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG LÀM GIÀU ĐỘC TỐ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS Lê Thị Hồng Nhung, cô đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Nhờ có sự tận tâm, chỉ dẫn và đồng hành cùng những định hướng quý báu của cô trong suốt hành trình đã giúp tôi trưởng thành, học hỏi, tích lũy nhiều kinh nghiệm làm việc và hoàn thành tốt luận văn này

Bên cạnh đó, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới TS Phạm Bảo Yên Phòng Enzyme học và Phân tích hoạt tính sinh học đã dành thời gian quý báu để hướng dẫn và đưa ra cho tôi nhiều ý kiến cùng những lời khuyên, định hướng hữu ích trong suốt quá trình làm việc cũng như hoàn thành luận văn Thạc sĩ

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, cùng các thầy cô thuộc Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên-Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền dạy những kiến thức quý báu và

hỗ trợ máy móc, nguyên vật liệu giúp tôi hoàn thành được luận văn này

Trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn Thạc sĩ, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình từ các thành viên, các học viên

và sinh viên làm việc tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh và Sinh học phân tử trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi cũng xin cảm ơn học viên cao học Bùi Thị Thu Hoài, sinh viên Phạm Thành Đạt

đã luôn hỗ trợ giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Xin cảm ơn viện Y sinh Nhiệt Đới thuộc trung tâm Nhiệt Đới Việt Nga đã cung cấp hóa chất Lc-BoNT/A tái tổ hợp cho đề tài này

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã ở bên khích

lệ, động viên, chia sẻ và luôn bên tôi trong suốt thời gian qua

Khóa luận này được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu từ

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AP Alkaline phosphatase Alkaline phosphatase

APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate

ATP Adenosine triphosphate Adenosine triphosphate

BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate BoNT Botulinum neurotoxin Độc tố thần kinh botulinum BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò

CBB Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue CDR Complementarity-determining region Vùng xác định bổ sung

ddH2O Nước cất loại ion Nước cất loại ion

1-Ethyl-3-(3-EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Ethylene Diamine Tetraacetic

Acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Xét nghiệm miễn dịch liên kết

enzyme FRET Fluorescence resonance energy transfer Truyền năng lượng cộng hưởng

huỳnh quang

IP Immunoprecipitation Kết tủa miễn dịch

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Isopropyl

β-D-1-thiogalactopyranoside

ITC Isothermal Titration Calorimetry Đo nhiệt lượng chuẩn trong

điều kiện đẳng nhiệt HRP horseradish peroxidase horseradish peroxidase

Lc-BoNT/A

Light chain botulinum neurotoxin Chuỗi nhẹ độc tố botulinum

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NBT Nitro Blue Tetrazolium Chloride Nitro Blue Tetrazolium

Chloride NHS N-Hydroxysuccinimide N-Hydroxysuccinimide

Ni-NTA nickel-nitrilotriacetic acid nickel-nitrilotriacetic acid

PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis Điện di gel polyacrylamide PBS Phosphate buffered saline Đệm phosphate chứa muối

vesicle VHH variable heavy domain of heavy chain Vùng biến đổi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Hình ảnh vi khuẩn Clostridium botulinum 2

Hình 2: Phân loại các nhóm độc tố dựa trên huyết thanh 3

Hình 3: Cấu trúc phức hệ độc tố thần kinh 6

Hình 4: Cơ chế phân tử gây bệnh của độc tố botulinum 7

Hình 5: Môi trường nuôi cấy C botulinum 9

Hình 6: Cấu trúc nanobody so với kháng thể truyền thống 11

Hình 7: Alc-B8 liên kết với vùng chuỗi nhẹ LC của độc tó botulinum 13

Hình 8: Phương pháp ELISA 14

Hình 9: Phương pháp Western blotting 15

Hình 10: Cấu trúc plasmid chứa trình tự mã hóa nanobody A8 và trình tự axit amin của nanobody A8 19

Hình 11: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21

Hình 12: Quy trình biotin hóa 27

Hình 13: Quy trình làm giàu độc tố bằng hạt từ streptavidin 28

Hình 14: Kết quả kiểm tra PCR colony 29

Hình 15: Kết quả biểu hiện nanobody A8 với hai nồng độ IPTG 0 mM và

0,5 mM được thể hiện trên gel SDS-PAGE và Western blotting 30

Hình 16: Kết quả phân tích điện di SDS-PAGE và Western blotting tinh sạch nanobody A8 31

Hình 17: Kết quả nhận diện nanobody A8 bằng Anti-Llama 33

Hình 18: Kết qua xác định nồng độ sử dụng của nanobody A8 với Lc-BoNT/A tái tổ hợp bằng phương pháp dot blotting 34

Hình 19: Kết quả phân tích đánh giá tương tác của nanobody A8 với Lc-BoNT/A

bằng điện di SDS-PAGE và Western blotting, 36

Hình 20: Kết quả phân tích kháng nguyên Lc-BoNT/A bằng ELISA gián tiếp 38

Hình 21: Tính toán biotin nanobody A8 dựa trên trình tự amino acid 40

Hình 22: Kết quả phân tích khả năng biotin hóa nanobody A8 bằng SDS-PAGE, Western blotting và dot blotting 41

Hình 23: Kết quả phân tích điện di SDS-PAGE và Western blotting kiểm tra khả

năng liên kết nanobody A8 biotin, Lc-BoNT/A với hạt từ streptavidin 42

Hình 24: Kết quả phân tích điện di SDS-PAGE kiểm tra khả năng làm giàu,

Lc-BoNT/A bằng phức hệ streptavidin-nanobody A8 biotin 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Đệm và hóa chất sử dụng 19

Bảng 1: Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc và chu trình PCR khuẩn lạc 22

Bảng 2: Thành phần SDS-PAGE … 24

Bảng 3: Bảng tinh sạch nanbody A8 32

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Clostridium botulinum và ngộ độc botulinum 2

1.1.1 Vi khuẩn Clostridium botulinum và phân loại 2

1.1.2 Ngộ độc botulinum 4

1.1.3 Độc tố thần kinh botulinum và cơ chế gây độc 5

1.2 Phương pháp phát hiện vi khuẩn Clostridium botulinum và độc tố thần kinh botulinum 8

1.2.1 Xác đinh sự có mặt của vi khuẩn Clostridium botulinum 8

1.2.2 Các phương pháp xác định sự có mặt của độc tố thần kinh botulinum 9

1.3 Kháng thể miền đơn – nanobody 10

1.3.1 Giới thiệu chung về nanobody 10

1.3.2 Nanobody A8 12

1.4 Các phương pháp đánh giá khả năng tương tác của nanobody 13

1.4.1 ELISA 14

1.4.2 Western blotting 15

1.5 Phương pháp làm giàu độc tố 16

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên liệu 18

2.2 Đệm và hóa chất sử dụng 19

2.3 Máy móc và trang thiết bị 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 20

2.4.2 Phương pháp biến nạp 21

2.4.3 Phương pháp PCR 22

2.4.4 Phương pháp biểu hiện protein trên E coli 22

2.4.5 Tinh sạch nanobody A8 bằng sắc ký ái lực Ni-NTA 23

2.4.6 Phương pháp điện di SDS-PAGE 23

2.4.7 Phương pháp Dot blotting 24

2.4.8 Phương pháp Thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 25

2.4.9 Phương pháp ELISA 26

2.4.10 Biotin hóa nanobody A8 27

2.4.11 Phương pháp kết tủa miễn dịch để làm giàu độc tố 28

2.4.12 Phân tích, xử lý kết quả 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Biểu hiện và thu nhận nanobody A8 29

3.1.1 Biến nạp plasmid pET28a-A8 29

3.1.2 Biểu hiện nanobody A8 trên E coli 29

3.1.3 Tinh sạch nanobody A8 bằng cột Ni-NTA Agarose 31

3.1.4 Xác nhận nanobody A8 bằng kháng thể anti-Llama 32

3.2 Đánh giá khả năng tương tác của nanobody A8 34

3.2.1 Đánh giá tương tác của nanobody A8 với Lc-BoNT/A tái tổ hợp bằng dot blotting 34

3.2.2 Đánh giá khả năng tương tác với Lc-BoNT/A tái tổ hợp thông qua Western blotting 35

3.2.3 Đánh giá khả năng tương tác với Lc-BoNT/A tái tổ hợp thông qua ELISA 37

3.3 Sử dụng Nanobody A8 để làm giàu độc tố 39

3.3.1 Biotin hoá nanobody A8 39

3.3.2 Xác định tải lượng làm giàu LC-BoNT/Arc của hạt từ đã được chức năng hoá 41

3.3.3 Khả năng làm giàu Lc-BoNT/A của phức hệ hạt từ streptavidin đã chức năng hoá 44

KẾT LUẬN 45

KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của TS Lê Thị Hồng Nhung và TS Phạm Bảo Yên Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực

MỞ ĐẦU

Botulinum neurotoxin là một chất độc thần kinh được tiết ra bởi vi khuẩn

Clostridium botulinum, có khả năng gây tử vong với liều lượng cực thấp ở người (chỉ

với 1-2 ng/kg) Độc tố botulinum được phân loại thành bảy kiểu huyết thanh được ký hiệu từ A đến G, trong đó nhóm A được coi là có độc tính mạnh nhất và là độc tố phổ biến nhất trong các ca nhiễm độc ở người Trên thế giới, từ năm 2004 đến năm 2018

có 6932 trường hợp ngộ độc botulinum được báo cáo từ 59 quốc gia, với tỉ lệ tử vong toàn cầu là 1,37% Ở Việt Nam, từ năm 2020 đến nay đã ghi nhận nhiều ca tử vong liên quan đến ngộ độc botulinum, trong đó các ca nhiễm đều liên quan đến ngộ độc thực phẩm Điều này đặt ra nhu cầu về việc phát triển các phương pháp phát hiện độc

tố botulinum trong các nguồn thực phẩm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Các phương pháp phát hiện độc tố botulinum hiện nay chủ yếu dựa trên sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể, kết hợp với các kỹ thuật phân tích tiên tiến như endopeptidase hoặc khối phổ, giúp đạt được độ nhạy cao trong việc phát hiện độc tố Tuy nhiên, để tăng khả năng phát hiện và tránh các ảnh hưởng của nền mẫu thực phẩm, bước làm giàu độc tố nhằm tách và cô đặc chúng ra khỏi nền mẫu phức tạp là vô cùng quan trọng

Trong nghiên cứu này chúng tôi hướng đến tổng hợp kháng thể thế hệ mới, nanobody, ứng dụng cho làm giàu độc tố thần kinh botulinum Nanobody là kháng thể miền đơn hay còn gọi là VHH, được tổng hợp bằng công nghệ DNA tái tổ hợp Trình tự mã hóa nanobody được phân lập từ kháng thể chuỗi nặng từ một số loài lạc

đà và cá mập Nanobody có ưu điểm là kích thước nhỏ gọn, bền nhiệt và bền pH, dễ dàng biểu hiện và cải biến ở dạng tái tổ hợp ở vi khuẩn Nhờ những đặc tính nổi trội trên, các xu thế sử dụng nanobody cho chẩn đoán và điều trị ngày càng phát triển Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào sử dụng nanobody cố định lên hạt từ cho việc làm

giàu độc tố botulinum type A Vì thế đề tài nghiên cứu của chúng tôi là “Đánh Giá

Khả Năng Tương Tác Của Nanobody A8 Với Botulinum Neurotoxin Type A Và Bước Đầu Ứng Dụng Trong Làm Giàu Độc Tố” được thực hiện với các mục tiêu

cụ thể là: i) thu nhận và tinh sạch được nanobody A8 tái tổ hợp; ii) đánh giá được khả năng tương tác của nanobody A8 với chuỗi nhẹ độc tố thần kinh botulinum type A và iii) bước đầu ứng dụng nanobody này trong quy trình làm giàu chuỗi nhẹ độc tố thần kinh botulinum type A sử dụng hạt từ streptavidin

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Clostridium botulinum và ngộ độc botulinum

1.1.1 Vi khuẩn Clostridium botulinum và phân loại

Clostridium botulinum là loại vi khuẩn Gram dương, di chuyển nhờ tiên mao,

có khả năng hình thành bảo tử Chúng có hình dạng thẳng, hình que, kích thước 0,5

– 2,4 µm chiều rộng và 1,6 – 22,0 µm chiều dài [19] Vi khuẩn C botulinum có thể

được tìm thấy trong đất, môi trường trầm tích và trong các sản phẩm thực phẩm trong môi trường kỵ khí [20] Ngày nay chúng được nghiên cứu là vi khuẩn có khả năng sản sinh ra độc tố thần kinh botulinum, là một loại độc tố nguy hiểm nhất từng được biết đến trên thế giới [11], [14] Chất độc thần kinh botulinum neurotoxin là nguyên nhân gây ra ngộ độc botulinum [44]

Hình 1: Hình ảnh vi khuẩn Clostridium botulinum

(nguồn: https://phil.cdc.gov/details.aspx?pid=2107)

Độc tố được tạo ra ở các chủng Clostridium được phân thành 7 type khác nhau

đánh chữ theo bảng chữ cái: A, B, C, D, E, F, G như trong hình 2 [35], [45] Các loại độc tố này được xác định bằng cách sử dụng các huyết thanh đa dòng nhằm trung hòa độc tính ở động vật được tiêm độc tố tương đồng Giữa các type còn được phân loại thành các subtype khác nhau, đặc trưng bởi số thứ tự bên cạnh type Sự phân loại này

là do sự khác biệt trình tự axit amin > 2,5% giữa các subtype trong cùng một loại type [21], [22]

Hình 2: Phân loại các nhóm độc tố dựa trên huyết thanh [45]

Các chủng Clostridium sinh độc tố botulinum được phân loại theo các đặc điểm

sinh lý và nghiên cứu trình tự gen 16s RNA [27] Trong đó, độc tố được sản sinh bởi

C botulinum được phân thành bốn nhóm I-IV [55]

Các chủng vi khuẩn nhóm I có nhiệt độ phát triển tối ưu từ 35oC đến 40oC và bào tử có khả năng chịu nhiệt cao [19] Các chủng vi khuẩn nhóm II có nhiệt độ phát triển tối ưu từ dưới 30oC [15] Các chủng vi khuẩn nhóm I và II xếp vào loại vi khuẩn phân giải protein, là những vi khuẩn sử dụng protease của chúng để phân giải protein trong môi trường xung quanh Protein phân giải thành các axit amin có thể được sử dụng làm nguồn dinh dưỡng để phát triển cho nhóm vi khuẩn này, với các axit amin như arginine hay phenylalanine là các axit amin quan trọng cho sự phát triển của chúng Nhờ đặc tính phân giải này dẫn đến sự phát triển của vi khuẩn trong các thực phẩm giàu protein hay môi trường kỵ khí như thực phẩm đóng hộp Gen mã hóa độc

tố botulinum của các chủng vi khuẩn nhóm I và II hầu hết nằm trên nhiễm sắc thể

Các chủng vi khuẩn nhóm III sản xuất ra các độc tố thần kinh loại C và D có nhiệt độ phát triển tối ưu 40oC Bào tử chịu nhiệt trung bình, gen mã hóa botulinum qua trung gian phage [12] Các chủng vi khuẩn nhóm III xếp vào loại vi khuẩn phân không giải protein, sử dụng nguồn dinh dưỡng ngoài protein như carbohydrate, lipid Các chủng vi khuẩn nhóm IV tạo ra độc tố loại G, với bào tử chịu nhiệt trung bình, gen mã hóa botulinum nằm trên plasmid [61]

Các loại độc tố nhóm I và II sản xuất ra các độc tố thần kinh type A, B, E, F gây bệnh ngộ độc botulinum ở người [6], trong đó độc tố thần kinh loại A được xác định

là độc tố gây độc nhất ở người [39] Các loại độc tố nhóm III là C, D gây ngộ độc botulinum ở động vật [13], [59] Độc tố loại G thuộc nhóm IV được báo cáo là xảy

ra hiếm trong các vụ ngộ độc botulinum [52]

1.1.2 Ngộ độc botulinum

Ngộ độc botulinum (hay còn gọi là ngộ độc thịt) là bệnh hiếm khi xảy ra Trong

đó các các dạng ngộ độc botulinum chủ yếu trong tự nhiên là: ngộ độc thực phẩm, ngộ độc ở trẻ sơ sinh, ngộ độc do vết thương và ngộ độc đường ruột ở người lớn Ngoài ra ngộ độc botulinum do điều trị và do đường hô hấp là những con đường mắc bệnh không có trong tự nhiên

Ngộ độc thực phẩm botulinum là dạng ngộ độc do sử dụng hay tiêu thụ các sản phẩm có chứa độc tố thần kinh Đây là nguyên nhân chủ yếu trong các dạng ngộ độc botulinum Các sản phẩm chứa độc tố thần kinh botulinum chủ yếu là các thực phẩm đóng hộp, bảo quản tại nhà [20] Các loại thực phẩm này có thể chứa bào tử hoặc tế

bào sinh dưỡng của C botulinum, có môi trường phù hợp với sự phát triển của bào

tử (môi trường kỵ khí hoặc môi trường axit trong các sản phẩm giàu protein như thịt đóng hộp hoặc xúc xích), và sự không chế biến đúng cách hoặc lây nhiễm sau chế biến góp phần tạo điều kiện để dẫn đến ngộ độc thực phẩm Thời gian ủ bệnh do ngộ độc thường từ 18 đến 36 giờ [4] sau khi sử dụng thực phẩm nhiễm độc Các triệu chứng đầu tiên thường gặp bao gồm: buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy, miệng khô, mắt nhìn đôi và nhìn mờ, ngoài ra còn một số triệu chứng khác như khó nói, sụp mí cuối

cùng là liệt cơ gây suy hô hấp và dẫn đến tử vong [49] Tỉ lệ tử vong cao nếu không được chẩn đoán và hỗ trợ kịp thời

Bệnh ngộ độc botulinum trẻ sơ sinh là tình trạng ngộ độc khi C botulinum xâm

nhập và đường ruột của trẻ sơ sinh Đây là tình trạng ngộ độc phổ biến nhất ở Hoa

Kỳ [8] Nguyên nhân của tình trạng là do nhiễm vi khuẩn từ đất và sử dụng mật ong

Hệ vi khuẩn đường ruột của trẻ sơ sinh chưa được hình thành, không có khả năng

cạnh tranh và ức chế sự phát triển của C botulinum, dẫn đến hình thành độc tố

botulinum trong đường ruột [53] Các triệu chứng bao gồm táo bón, khóc yếu, khó nuốt Các ca nhiễm báo cáo các bệnh nhân dưới 12 tháng tuổi Dạng này dễ gây nhầm lẫn trong chẩn đoán với các triệu chứng giống với một số bệnh chung ở trẻ sơ sinh

Ngộ độc do vết thương là một dạng hiếm gặp, xảy ra khi bào tử C botulinum

xâm nhập vào vết thương Bào tử xâm nhập và phát triển tại chỗ tại các vết thương hoặc áp xe Bệnh xảy ra chủ yếu do vết thương sau phẫu thuật, do tiêm chích ma túy với các dụng cụ và thuốc bị lây nhiễm Thuốc, ma túy tiêm thường pha trong axit dẫn đến gia tăng sự phát triển của vi khuẩn Các triệu chứng tương tự như bệnh ngộ độc

do thực phẩm ngoài trừ những triệu chứng tiêu hóa với thời gian ủ bệnh từ 4 -14 ngày Bệnh ngộ độc ruột ở người trưởng thành có nguyên nhân giống với ngộ độc ở trẻ sơ sinh Bệnh thường xảy ra ở các bệnh nhân bất thường về đường ruột như biến chứng sau phẫu thuật hoặc các bệnh liên quan đến tiêu hóa

Bệnh ngộ độc cũng có thể do nguyên nhân tiêm độc tố botulinum quá liều lượng cho phép trong quá trình điều trị thẩm mỹ Ngộ độc qua đường hô hấp là quá trình hít phải độc tố thần kinh botulinum thông qua con đường khí dung, dạng ngộ độc này không xuất hiện trong tự nhiên, các báo cáo dạng ngộ độc này xuất phát từ trong các phòng thí nghiệm hoặc trong các sự kiện khủng bố

1.1.3 Độc tố thần kinh botulinum và cơ chế gây độc

1.1.3.1 Độc tố botulinum

Tất cả các type độc tố đều có cấu trúc phân tử khá tương tự nhau Độc tố thần kinh được tổng hợp thành một chuỗi đơn polypeptide có khối lượng phân tử xấp xỉ khoảng 150 kDa, chuỗi polypeptide này sau đó được phân cắt bởi protease tại vòng

lặp được hình thành bởi liên kết disulfide, sự phân cắt này tạo nên độc tố botulinum trưởng thành có hoạt tính [11] Lúc này cấu trúc độc tố gồm hai phần, một miền chuỗi nhẹ LC (Light Chain) có khối lượng phân tử khoảng 50 kDa và một miền chuỗi nặng

HC (Heavy Chain) có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa (hình 3)

Vùng chuỗi nặng có 2 miền chức năng, một miền ở đầu amino N gọi là miền

HN và một miền ở vùng carboxyl C gọi là miền HC Phần HC có chức năng chính là vùng trung gian cho liên kết với các vùng không myelin của tế bào thần kinh Vùng

HC chịu trách nhiệm với liên kết đặc hiệu polysialoganglioside trên các tế bào thần kinh Vùng HN có chức năng trong quá trình chuyển hóa miền chuỗi nhẹ của độc tố botulinum vào trong túi nội bào vào tế bào chất Khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, vùng chuỗi nhẹ LC thể hiện chức năng của một protease khi phân cắt các protein đặc hiệu trong tế bào thần kinh [46]

Hình 3: Cấu trúc phức hệ độc tố thần kinh [46]

1.1.3.2 Cơ chế gây độc của độc tố botulinum

Sau khi đi qua hàng rào biểu mô ruột, BoNTs xâm nhập dịch ngoại bào và đi vào hệ tuần hoàn máu nhưng không vượt qua được hàng rào máu não Vùng HC của độc tố botulinum sẽ liên kết với vùng polysialoganglioside trên các tế bào thần kinh Tiếp đó vùng HC tiếp tục liên kết với các vùng bên trong túi synap của synaptotagmin

(syt) (đối với độc tố nhóm B1, D, C, G) và protein xuyên màng túi synap SV2 (đối với độc tố nhóm A1, E) Hai vị trí liên kết của vùng HC độc tố với vùng PSG và syt/SV2 trên tế bào thần kinh là độc lập với nhau Độc tố botulinum được vận chuyển vào trong túi synap vào trong tế bào chất của tế bào thần kinh Vùng HN có nhiệm

vụ chuyển vị trí vùng chuỗi nhẹ thông qua bơm proton ATP trên các túi synap, dẫn đến sự tiếp xúc của vùng chuỗi nhẹ vào trong bào tương Vùng HN và vùng chuỗi nhẹ sau đó được phân cắt liên kết disulfide thông qua hoạt động của enzyme NADPH-thioredoxin reductase-thiorerdoxin và giải phóng vùng chuỗi nhẹ vào tế bào chất Tại

tế bào chất, vùng chuỗi nhẹ sẽ tương tác và phân cắt với các cơ chất đặc hiệu của chúng, với BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F và BoNT/G phân tách VAMP (protein màng liên kết với túi) và BoNT/A, BoNT/E phân tách SNAP 25 (liên kết với khớp thần kinh protein 25 kDa) BoNT/C phân cắt cả hai protein này Cả hai protein VAMP và SNAP đều đóng vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền tín hiệu thần kinh [46] Tổn thương do độc tố botulinum gây ra dẫn đến làm tê liệt hoạt động dẫn truyền tín hiệu của các tế bào thần kinh Thời gian tê liệt phụ thuộc vào thời gian tồn tại của vùng chuỗi nhẹ độc tố trong tế bào Độc tố nhóm A có thời gian phân hủy dài nên gây ra ngộ độc nặng hơn so với các độc tố nhóm khác [46]

Hình 4: Cơ chế phân tử gây bệnh của độc tố botulinum [44]

1.2 Phương pháp phát hiện vi khuẩn Clostridium botulinum và độc tố thần

kinh botulinum

Việc chẩn đoán nhanh khi bị ngộ độc botulinum sẽ giúp xác định phương pháp điều trị thích hợp, làm tăng khả năng sống sót của bệnh nhân sau khi nhiễm độc Các chẩn đoán dựa trên triệu chứng của bệnh nhân mắc phải thường gặp khó khăn khi dẫn đến chẩn đoán nhầm với các triệu chứng của các bệnh khác nhau như nhược cơ hay đột quỵ Để xác định chính xác độc tố trong các mẫu dịch của người bệnh và thực phẩm ngộ độc, cần áp dụng các phương pháp xét nghiệm chuyên sâu và thiết bị phân tích hiện đại, đảm bảo độ chính xác cao và đưa ra biện pháp xử lý kịp thời Các

phương pháp phát hiện dựa trên sự có mặt của vi khuẩn Clostridium botulinum và

độc tố thần kinh botulinum Các phương pháp này bao gồm các phương pháp vi sinh, các phương pháp miễn dịch hay các phương pháp liên quan đến sinh học phân tử Với

phương pháp vi sinh tiêu biểu như nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum từ nền mẫu, phương pháp miễn dịch nhằm tách chiết độc tố thông qua

kháng thể đặc hiệu như các phương pháp ELISA, kết tủa miễn dịch Phương pháp

sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật PCR xác định gen của vi khuẩn Clostridium botulinum

1.2.1 Xác đinh sự có mặt của vi khuẩn Clostridium botulinum

Việc xác định sự có mặt của Clostridium botulinum trong mẫu thực phẩm có thể

được tiến hành thông qua nuôi cấy phân lập hoặc PCR

Phương pháp thường sử dụng để xác định sự có mặt của C botulinum là nuôi cấy vi sinh Vi khuẩn C botulinum được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy đặc biệt như các môi trường nuôi cấy có chọn lọc Tại Việt Nam việc phát hiện vi khuẩn C Botulinum tiến hành theo tiêu chuẩn phát hiện do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm quy

định (TCVN 9049:2012) Vi khuẩn sẽ phát triển thành các khuẩn lạc trên môi trường

canh thang nhờ đó xác định sự có mặt của C botulinum thông qua sự phát triển khuẩn

lạc Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế là yêu cầu môi trường phân lập

cụ thể, các điều kiện nuôi cấy nghiêm ngặt, cần yêu cầu làm giàu bằng môi trường nuôi cấy lỏng [33]

Hình 5: Môi trường nuôi cấy C botulinum [1]

Ngoài ra, các phương pháp phát hiện DNA của vi khuẩn cũng được phát triển

Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện các gen độc tố bot hoặc cDNA giúp xác định sự có mặt của vi khuẩn C botulinum Các phương pháp như real time-PCR,

LAMP, PCR lồng giúp tăng độ nhạy của phát hiện Hạn chế của PCR là yêu cầu làm giàu vi khuẩn từ các mẫu thực phẩm và chỉ xác định được sự có mặt của gen vi khuẩn, không xác định được sự tồn tại và hoạt động của độc tố trong các mẫu nhiễm độc và đôi khi bị dương tính giả do sự có mặt của DNA mà không có vi khuẩn [33]

1.2.2 Các phương pháp xác định sự có mặt của độc tố thần kinh botulinum

Như đã trình bày ở mục 1.1.3.1, độc tố thần kinh botulinum là một dạng phức

hợp protein có khả năng đi vào tế bào thần kinh Chuỗi nhẹ của độc tố là một enzyme

có khả năng phân cắt phức hệ dẫn truyền acetylcholine, dẫn đến liệt cơ, suy hô hấp…

Để xác định sự có mặt của độc tố thần kinh, người ta có thể xác định sự có mặt của

độc tố hoặc hoạt tính enzyme của chuỗi nhẹ, điều này được thực hiện bởi các phương

pháp phát hiện in vivo và in vitro khác nhau

1.2.2.1 Mouse bioassay

Mouse bioassay là thí nghiệm nhằm xác nhận hoạt động của độc tố thần kinh botulinum, được sử dụng rộng rãi và là phương pháp phát hiện được coi là chuẩn vàng [55] Các mẫu nghi ngờ có chứa độc tố được tiêm vào trong phúc mạc của chuột Chuột được tiêm sau đó được theo dõi các triệu chứng sau 48 giờ sau tiêm Các triệu chứng bao gồm eo hẹp, liệt chi tử vong do liệt hô hấp [7] Các mẫu nghi ngờ nhiễm độc tố được xác định độ pha loãng tối đa dẫn đến tử vong và độ pha loãng tối thiểu

dẫn đến không tử vong nhằm xác định lượng độc tố trong mẫu Thử nghiệm sinh học chuột được sử dụng để phân tích các nền mẫu phức tạp với độ nhạy cao lên đến 10 pg/ml và có thể phát hiện được độc tố hoạt động về chức năng [5] Tuy nhiên, thử nghiệm này có một số nhược điểm như thời gian dài, yêu cầu cho thử nghiệm trên chuột thường mất từ 4 đến 6 ngày, đòi hỏi cơ sở vật chất và các kỹ thuật viên được đào tạo, thử nghiệm chỉ áp dụng ở quy nhỏ và cuối cùng là liên quan đến các vấn đề đạo đức nghiên cứu trên động vật sống [5] Những hạn chế này dẫn đến sự phát triển của các phương pháp phát hiện độc tố thay thế

1.2.2.2 Các phương pháp phát hiện khác

Các phương pháp phát hiện khác nhau được phát triển nhằm khắc phục một số hạn chế của thử nghiệm sinh học trên chuột, các phương pháp thay thế này cho phép xác định sự có mặt của độc tố trong mẫu mục tiêu Phần lớn các thử nghiệm thay thế được phát triển dựa trên phương pháp miễn dịch liên kết kháng nguyên - kháng thể Một số phương pháp tiêu biểu có thể kể đến như ELISA, phát hiện bằng cảm biến sinh học, FRET hay thông qua Endopeptidase kết hợp phân tích khối phổ Ưu điểm của các phương pháp này là có độ nhạy cao (ELISA có độ nhạy phát hiện độc tố có nồng độ 2 pg/ml, FRET cho độ nhạy phát hiện 60 pg/ml, Endopeptidase kết hợp phân tích khối phổ cho độ nhạy 100 fg/ml) và thời gian phân tích ngắn (trong khoảng 6 giờ) [24] Tuy nhiên, các phương pháp này có hạn chế là yêu cầu độc tố phải được làm giàu và có độ tinh khiết cao

1.3 Kháng thể miền đơn – nanobody

1.3.1 Giới thiệu chung về nanobody

Vào đầu những năm 1990, các loài lạc đà, lạc đà không bướu được phát hiện là

có khả năng sản xuất ra một loại phân tử kháng thể globulin miễn dịch chỉ chứa chuỗi nặng [17], khác với kháng thể thông thường chứa hai vùng chuỗi nặng và chuỗi nhẹ Cấu trúc phân tử kháng thể chỉ chuỗi nặng này cũng được phân lập ở một số loài cá sụn sau đó [16] Các kháng thể chỉ chuỗi nặng này thiếu vùng chuỗi nhẹ, có cấu trúc bao gồm hai miền bảo tồn là CH2 và CH3, một vùng liên kết kháng nguyên biến đổi

gọi là VHH [48] Vùng VHH được sản xuất dựa trên công nghệ protein tái tổ hợp được gọi là kháng thể miền đơn hay nanobody Từ nanobody được đặt dựa trên đặc tính nhỏ gọn về kích thước của chúng, với chiều dài 4nm và chiều rộng là 2,5 nm cùng với khối lượng phân tử là 15 kDa [28], [50] So sánh với cấu trúc của một kháng thể thông thường có hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ, nanobody có kích thước nhỏ hơn gấp 10 lần (hình 6)

Hình 6: Cấu trúc và kích thước của nanobody so sánh với kháng thể truyền thống

của kháng thể truyền thống chỉ tương tác với bề mặt bên ngoài trung tâm hoạt động [10], [58]

Mặc dù kích thước nhỏ gọn, nanobody được chứng minh là có ái lực bằng hoặc cao hơn với kháng nguyên mục tiêu so với kháng thể thông thường Kích thước nhỏ gọn của nanobody cũng cho phép các phân tử này có thể xâm nhập dễ dàng vào các

mô đích mong muốn, tiêu biểu là hàng rào máu não [47] Hơn thế nữa, việc thiếu đi chuỗi nhẹ sẽ giảm vào khả năng tạo các phản ứng miễn dịch không mong muốn trong các thử nghiệm lâm sàng Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng nanobody có tính bền nhiệt và ổn định, khi vùng CDR3 có khả năng tái tạo sau khi biến tính Nanobody có khả năng hòa tan cao và chống lại các thay đổi bất thường về pH, thích hợp sử dụng nanobody như thuốc qua con đường uống hoặc tiêm phúc mạc [27] Ngoài ra, các nanobody có thể được tổng hợp dễ dàng nhờ vào các hệ thống biểu hiện bậc thấp khi không yêu cầu các biến đổi sau dịch mã, có cấu trúc nhỏ gọn, có thể dung hợp với các phân tử như His-tag hay GFP, phục vụ cho mục đích tinh sạch Trong những năm gần đây nghiên cứu về nanobody ngày càng được quan tâm, trong đó nổi bật là các nghiên cứu về nanobody chống lại ung thư, bệnh tự miễn… [28]

1.3.2 Nanobody A8

Nhờ những đặc tính nổi bật và chức năng như một kháng thể nội bào, nanobody

đã được nhắm đến là một phân tử điều trị cho các bệnh liên quan đến tế bào thần kinh, tiêu biểu như nhiễm độc thần kinh botulinum Một số nghiên cứu đã tổng hợp và sàng lọc được những nanobody có khả năng gắn đặc hiệu và ức chế botulinum type A và type B [56], [31], [32] các nghiên cứu về botulinum type E [3], [57], type C và D [18] Các nanobody được nghiên cứu nhắm đích tới miền chuối nặng HC và miền chuối nhẹ LC của độc tố thần kinh botulinum Một số báo cáo đã thử nghiệm khả

năng trung hòa độc tố của nanobody trong các điều kiện in vivo [36], [37] Các nghiên

cứu này đều chỉ ra khả năng trung hòa độc tố của nanobody và tiềm năng ứng dụng của chúng trong việc phát triển các phân tử ức chế độc tố Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cũng đang phát triển liệu pháp kháng độc bằng nanobody sử dụng công nghệ RNA [38], [40]

Alc-B8 (viết tắt là A8) cho thấy tiềm năng trong việc trung hòa hoạt động miền

LC của BoNT/A [31], [56] Nanobody A8 được chứng minh là có ái lực cao với miền

LC của BoNT/A với Kd ~1 nM [57] Các nghiên cứu về cấu trúc cho thấy nanobody này có thể liên kết trực tiếp với trung tâm hoạt động vùng chuỗi nhẹ LC của độc tố botulinum, cụ thể nanobody A8 liên kết với vùng α-exosite của miền LC (α-exosite

là vùng liên kết chính của SNAP25 và miền LC), việc liên kết tại vị trí α-exosite này của nanobody tạo ra sự cạnh tranh liên kết với SNAP25, làm ức chế hoạt tính phân cắt của miền LC (hình 7) [31] Ngoài ra nanobody A8 cũng được thử nghiệm trung hòa hoạt động của LC của BoNT/A trong tế bào thần kinh và giúp phục hồi chức năng hoạt động cơ của chuột được tiêm BoNT/A [37] Dựa trên một số đặc tính trên, nanobody A8 được xem là một phân tử tiềm năng trong nghiên cứu phát triển các phương pháp phát hiện và trung hòa độc tố botulinum

Hình 7: Alc-B8 liên kết với vùng chuỗi nhẹ LC của độc tó botulinum

1.4 Các phương pháp đánh giá khả năng tương tác của nanobody

Nanobody có vai trò và chức năng tương tự với một kháng thể Để có thể đánh giá khả năng tương tác của kháng thể với kháng nguyên đích, một số phương pháp tiêu biểu được thực hiện như: Western blotting, ELISA, SPR, ITC, IP… Trong đó ELISA và Western blotting là hai phương pháp được sử dụng phổ biến và rộng rãi nhất

1.4.1 ELISA

Xét nghiệm miễn dịch liên kết với enzyme, viết tắt là ELISA là một trong những phương pháp phổ biến hiện nay để xác định khả năng tương tác của kháng thể với kháng nguyên ELISA sử dụng một enzyme liên hợp kháng thể nhằm phát hiện sự có mặt của một kháng nguyên đích cụ thể Có 3 phương pháp ELISA chính thường được

sử dụng là ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp và ELISA sandwich [41] Đối với ELISA trực tiếp và gián tiếp, các mẫu nghi ngờ nhiễm độc được phủ lên bề mặt giếng của đĩa ELISA, các đĩa này được tổng hợp bởi các vật liệu đặc biệt, cho phép kháng nguyên trong mẫu hấp thụ trên bề mặt đĩa Sau đó, các phần không được hấp thụ trên

bề mặt được xử lý với dung dịch chặn, thường là albumin huyết thanh bò (BSA) hoặc skimmilk, các thành phần này được thêm vào để ngăn chặn bất kỳ liên kết không đặc hiệu nào trong bước tiếp theo khi ủ với kháng thể Sau khi chặn, kháng thể chính đặc hiệu với kháng nguyên được thêm vào nhằm tạo liên kết với kháng nguyên đích Trong trường hợp ELISA trực tiếp, kháng thể này được liên hợp với một enzyme, khi thêm chất nền của nó sẽ tạo ra tín hiệu đổi màu có thể đo được Với ELISA gián tiếp, một kháng thể thứ cấp liên hợp enzyme được sử dụng để tạo ra phản ứng liên kết Kháng thể này liên kết với phần Fc của kháng thể chính nên không cần phải đặc hiệu với kháng nguyên Trong ELISA sandwich, kháng thể bắt giữ được phủ lên các bề mặt giếng của đĩa ELISA, các kháng thể bắt giữ liên kết đặc hiệu với kháng nguyên

và theo thứ tự các lớp liên hợp kháng nguyên, kháng thể chính và kháng thể thứ cấp

Hình 8: Phương pháp ELISA [24]

1.4.2 Western blotting

Western blotting là một trong những phương pháp được sử dụng để đánh giá khả năng tương tác giữa kháng thể và protein quan tâm [23] Trong đó, protein hay kháng nguyên quan tâm được phân tách bằng điện di SDS-PAGE, các protein được phân tách theo trọng lượng phân tử Sau đó protein được chuyển lên màng (màng Nitrocellulose hay màng PVDF) thông qua lực điện trường, tại đây trên màng có các

lỗ nhỏ giúp gắn và giữ các protein lại đúng với vị trí trên bản gel Sau khi hoàn tất chuyển màng, màng tiếp tục được ủ với kháng thể gắn nhãn đặc hiệu Sau khi ủ, các kháng thể không liên kết được rửa sạch và chỉ có những kháng thể liên kết với protein hay kháng nguyên được giữ lại Kháng thể sau đó được phát hiện bằng các phương pháp khác nhau như sử dụng enzyme, huỳnh quang hoặc phóng xạ Kháng thể liên kết sẽ cho tín hiệu xuất hiện một dải băng Độ dày và đậm của băng thể hiện lượng protein có mặt trên màng Phương pháp này cho phép xác định khả năng tương tác của kháng thể và protein quan tâm, ngoài ra Western blotting cũng cho phép phát hiện khối lượng phân tử và sự hiện diện của protein có trong mẫu phân tích

Hình 9: Phương pháp Western blotting

Ngoài hai phương pháp phổ biến để đánh giá khả năng tương tác protein- protein

là ELISA và Western bloting, một số phương pháp khác cũng được sử dụng như SPR

hay ITC Trong phương pháp SPR, sự liên kết các phân tử được theo dõi và đo lường thông qua thay đổi quang học, phương pháp SPR cho phép xác định được hằng số liên kết và hằng số phân ly Kd của các tương tác protein Đối với ITC, phương pháp này xác định nhiệt lượng thay đổi trong quá trình tương tác các protein, phương pháp ITC cho phép xác định hằng số phân ly Kd, entropy và enthalpy trong quá trình liên kết [10]

1.5 Phương pháp làm giàu độc tố

Trong các phương pháp phát hiện sự có mặt của độc tố sinh học, một trong những yêu cầu đầu tiên hướng đến là làm giàu độc tố, phân lập được độc tố trong hỗn hợp các mẫu nền Các phương pháp làm giàu độc tố phổ biến như tách chiết độc tố bằng phương pháp hóa học hay miễn dịch Ví dụ về một số nghiên cứu làm giàu có thể kể đến như làm giàu độc tố ricin, ustiloxins,aflatoxin B1 [26], [43], [60]

Bước làm giàu trong phát hiện độc tố botulinum là rất quan trọng khi các thử nghiệm thông thường không thể phát hiện với độc tố nồng độ rất nhỏ, ngoài ra các protein ngoại lai, các protease không đặc hiệu trong mẫu cũng gây ảnh hưởng độ nhạy

và chẩn đoán giả đến các phương pháp phát hiện Việc làm giàu độc tố giúp cho nồng độc tố tăng cao phù hợp với các phương pháp phát hiện, giúp tăng độ nhạy và độ chính xác, đảm bảo phát hiện bệnh được sớm Các phương pháp làm giàu độc tố botulinum hiện nay là làm giàu qua phương pháp cô đặc độc tố, tách và thu nhận độc

tố khỏi nền mẫu, trong đó phương pháp làm giàu độc tố dựa trên các phân tử sinh học

ai lực cao giúp tách độc tố đang được phát triển và nghiên cứu rộng rãi Một số phương pháp làm giàu có thể kể đến như ELISA, biosensor hay kết tủa miễn dịch (IP) Các phân tử ái lực cao (kháng thể, aptamer, peptide…) với độc tố sẽ được gắn

cố định lên các giá thể (đĩa Polystyrene, hạt từ, Chip) bằng các phương pháp khác nhau (liên kết thông qua streptavidin-biotin, liên kết NHS-EDC với bề mặt đã chức năng hóa ) phân tử ái lực có nhiệm vụ thu giữ độc tố từ nền mẫu lâm sàng, nền mẫu thực phẩm, các thành phần khác không liên kết sẽ được rửa khỏi giá thể Sau quá trình làm giàu, độc tố được sẽ được phát hiện bằng các phân tích như endopetidase,

khối phổ… Các nghiên cứu chỉ ra khả năng phát hiện độc tố trong mẫu lâm sàng với

độ nhạy cao (nhạy hơn so với thử nghiệm mouse bioassay), thời gian phát hiện giảm xuống vài giờ [25]

Với các giá thể, nhiều nghiên cứu hiên nay lựa chọn các giá thể là các hạt nano

có từ tính [25], [29], [45] Các hạt từ này được chức năng hóa bề mặt và gắn kết với phân tử sinh học đặc hiệu Khi các phân tử này nhận diện và liên kết được độc tố, các hạt từ có thể dễ dàng tách ra khỏi nền mẫu khi sử dụng từ trường Nhờ các đặc tính linh hoạt và ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố gây nhiễu trong nền mẫu, việc sử dụng hạt

từ làm tăng giới hạn phát hiện của các kỹ thuật phân tích tiếp theo [51] Với các phân

tử sinh học ái lực cao với botulinum, các kháng thể đơn dòng ưu tiên đươc lựa chọn nhờ tính đặc hiệu và ái lực cao Trong đó nhờ các tính chất đặc biệt như độ bền cao với pH và nhiệt, ái lực cao và dễ dàng sản xuất, nanobody nổi lên như một trong những phân tử tiềm năng ứng dụng trong các mục đích làm giàu độc tố

Một số nghiên cứu đã sử dụng nanobody làm kháng thể bắt giữ nhằm mục đích làm giàu độc tố botulinum đã được phát triển, cụ thể là các nanobody hướng mục tiêu chuỗi nặng của độc tố botulinum C và D [18] Trong nghiên cứu này, Harmsen và cộng sự đã tổng hợp được các đa phân tử nanobody có ái lực cao (Kd< 0,1 nM) với độc tố botulinum type C, D, các đa phân tử này có khả năng phân biệt các type độc

tố khác nhau Nhóm tác giả sử dụng phương pháp làm giàu dựa trên hạt từ và phát hiện thành công botulinum dạng tái tổ hợp và dạng tự nhiên bằng phát hiện dựa trên phân tích khối phổ, trong đó botulinum type D có thể phát hiện với độ nhạy là 0.013 ng/ml Nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng phát triển của nanobody ứng dụng trong làm giàu độc tố type C và D Tuy nhiên chưa có công bố và nghiên cứu về sử dụng nanobody nhằm làm giàu độc tố trên type A và B trên thế giới

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Plasmid pET28a-A8 được đặt tổng hợp ở GenScript Biotech (USA) chứa vector

pET28a (+) và trình tự được tối ưu hóa codon nanobody A8 (Genbank:FJ643070.1)

Có 2 loại chuỗi nhẹ độc tố botulinum Lc-BoNT/A được sử dụng: i) được cung cấp bởi viện Y sinh Nhiệt Đới thuộc trung tâm Nhiệt Đới Việt-Nga với kích thước 70 kDa chứa trxA và ii) chuỗi nhẹ độc tố Lc-BoNT/A được biểu hiện từ plasmid mua từ

Addgene (Plasmid #31602) với kích thước 50 kDa Dịch chiết nuôi cấy C botulinum

đã khử độc bằng nhiệt và DTT được cung cấp bởi viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh

thực phẩm Chủng E coli BL21 (DE3) RIL từ Novagen (USA)

GangNam-STAIN™ Prestained Protein Ladder, iNtRON (South-Korea); 1 kb DNA Ladder (Clever(UK)); Gotag Mastermix (Promega, M7122); Agarose (Biobasic, AB0013-50); RedSafe (Intron, 21141); kháng sinh Kanamycin (Biobasic, P5030310); kháng sinh Cloramphenicol (Biobasic, OA031170; His-Tag Monoclonal antibody (Prointech, Cat 66005-1-Ig); Goat Anti-Mouse IgG AP (Prointech, Cat

SA00002-1); Clostridium botulinum C botulinum BoNT-A Light Chain Polyclonal

Antibody (R&D systems, cat PA5-48053); Goat anti-Llama IgG H&L (HRP) (Abcam); Anti-Mouse HRP (Prointech, Cat SA00001-1)

Các hóa chất đều được mua từ các hãng uy tín và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử

Bộ Hóa chất biotin EZ-Link™ Sulfo-NHS-Biotinylation Kit (Thermo scientific, Cat 21425) Hạt từ Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin T1 (Invitrogen, Cat 65601)

Cấu trúc và trình tự axit amin của nanobody A8 được trình bày ở Hình 10

MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNID QNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLALVPRGSRHVQLQQ SGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSIYAMGWYRQAPGKQRELVAAISSYGSTNYADSVKG RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNADIATMTAVGGFDYWGQGTQVTVSSEPK TPKPQPGGGGSGGGGS

Hình 10: Cấu trúc plasmid pET28a-A8 và trình tự amino acid của nanobody A8

mM; Tween 0,05%; pH 7,4 PBS-T 0,01% NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 10 mM; KH2PO4 1,8

mM; Tween 0,01%; pH 7,4 PBS-T 0,005% NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 10 mM; KH2PO4 1,8

mM; Tween 0,005%; pH 7,4

PBS-skim milk 5% NaCl 137 mM; KCl 2,7mM; Na2HPO4 10 mM; KH2PO4 1,8

mM; Skim milk 0,01%; pH 7,4 Đệm lysis Tris 20mM; NaCl 500mM; glycerol 10%; imidazole 20mM Đệm Running buffer Tris 25 mM; Glycine 192 mM; SDS 3,4 mM; pH 8,3

Đệm nhuộm SDS-PAGE Comasie blue 0,25% w/v; methanol 40% v/v; Acetic Acid 7%

v/v Đệm tẩy SDS-PAGE Methanol 40%; Axit Axetic 7%

Đệm cơ chất AP Tris 100 mM; NaCl 100 mM; MgCl2 5mM

Đệm cân bằng Ni-NTA Na3PO4 20 mM; NaCl 300 mM; imidazole 10 mM

Đệm rửa Ni-NTA Na3PO4 20 mM; NaCl 300 mM; imidazole 25 mM

Đệm rửa giải Ni-NTA Na3PO4 20 mM; NaCl 300 mM; imidazole 250 mM

Đệm lưu trữ protein NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; Na2HPO4 10 mM; KH2PO4 1,8

mM; glycerol 10%; pH 7,4

2.3 Máy móc và trang thiết bị

Các máy móc và thiết bị nghiên cứu chính bao gồm: Máy lắc vortex (Cleaver Scientific, Anh); máy điện di đứng SDS-PAGE (Cleaver Scientific, Anh); máy điện

di ngang (Mupid Exu, Nhật Bản); máy đo quang phổ UV-Visible (Thermo Fisher Scientific); tủ hút (Bioair); máy lắc ổn nhiệt (Sartorius, Đức), máy lắc tròn (Biobase); máy ly tâm lạnh (Dynamica, Anh); máy ly tâm Z207A (Hermel, Đức); máy quang phổ nanodrop (Thermo Fisher Scientific); máy đọc ELISA (Allsheng) Cột sắc ký ái lực Ni-NTA từ hãng Thermo Fisher Scientific (Mỹ), cột loại muối PD10 từ hãng Cytival (Mỹ) và các thiết bị của phòng thí nghiệm Hóa sinh và Sinh học phân tử, trường Đại học Khoa học Tự nhiên

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Quy trình nghiên cứu tổng quát chung thể hiện ở hình 11:

Hình 11: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

2.4.2 Phương pháp biến nạp

Vector tái tổ hợp chứa đoạn gen mã hóa trình tự nanobody A8 được biến nạp vào

E coli BL21(DE3) RIL Trình tự nanobody A8 được dạng dung hợp với thioredoxin (Trx) và 6x-Histidin ở đầu amin Tế bào khả biến E coli chủng BL21(DE3) RIL (bảo

quản ở -80°C) được lấy ra để trên đá 10-20 phút cho tan dần Hỗn hợp plasmid được

bổ sung vào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám trên thành

tế bào, sau đó được sốc nhiệt ở 42°C trong 45 giây và được chuyển ngay trên đá 5 phút 700 µl môi trường LB lỏng được bổ sung vào hỗn hợp biến nạp Mẫu sau đó được giữ trong tủ ấm 37°C trong 10 phút và lắc ở tốc độ 120 vòng/phút, 37°C trong 45-50 phút Hỗn hợp biến nạp được ly tâm ở tốc độ 2300 rpm trong thời gian 10 phút

để loại bớt dịch nổi và được cấy trải trên đĩa petri có môi trường LB đặc chứa 50 µg/ml kanamycin, 34 μg/ml chloramphenicol, nuôi trong tủ ấm 37°C qua đêm