Nghiên cứu vi khuẩn salmonella phân lập từ mẫu thu tại một số bếp Ăn tập thể Ở hà nội và Đánh giá khả năng kháng kháng sinh của các chủng phân lập Được (tt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐINH THU MINH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN SALMONELLA PHÂN LẬP TỪ MẪU THU TẠI MỘT SỐ BẾP ĂN TẬP THỂ Ở HÀ NỘI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐINH THU MINH

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN SALMONELLA PHÂN LẬP TỪ MẪU THU

TẠI MỘT SỐ BẾP ĂN TẬP THỂ Ở HÀ NỘI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG PHÂN LẬP ĐƯỢC

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI, 2024

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

PGS TS Phạm Thế Hải

Phản biện 1: TS Võ Viết Cường

Phản biện 2: TS Nguyễn Thị Giang

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại Khoa Sinh Học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồi 10 giờ 30 phút ngày 30 tháng 12 năm 2024

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin – Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nộ

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngộ độc thực phẩm là hiện tượng xảy ra khi con người tiêu thụ thức ăn hoặc nước uống bị nhiễm vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng, hoặc các chất hóa học có hại Các triệu chứng lâm sàng phổ biến bao gồm đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, tiêu chảy, sốt, và đau đầu Trong những trường hợp nghiêm trọng, người bệnh có thể bị tiêu chảy, mất nước, truỵ tim mạch hoặc sốc nhiễm khuẩn Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hàng năm toàn cầu ghi nhận khoảng 600 triệu trường hợp mắc bệnh liên quan đến thực phẩm, trong đó có khoảng 420.000 ca tử vong, với 30% số ca tử vong xảy ra ở trẻ em dưới 5 tuổi

Vi sinh vật được xác định là nguyên nhân chính dẫn đến các vụ ngộ độc thực

phẩm, với các tác nhân thường gặp như Escherichia coli, Salmonella spp.,

Staphylococcus aureus hay Campylobacteria Đặc biệt, tại các quốc gia có thu nhập

trung bình và thấp, vấn đề thực phẩm không an toàn gây thiệt hại khoảng 110 tỷ USD mỗi năm do chi phí y tế và mất năng suất lao động Trong số các tác nhân vi

sinh vật, Salmonella spp là một trong các tác nhân chính gây ngộ độc thực phẩm

nghiêm trọng

Tại Việt Nam, trong giai đoạn từ năm 2021 đến 2023, đã ghi nhận nhiều

trường hợp ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella gây ra, đặc biệt liên quan

đến các sản phẩm thịt và trứng Một nghiên cứu tại thành phố Huế cho thấy, trong

số các mẫu thịt heo được thu thập từ các chợ, tỷ lệ nhiễm Salmonella lên đến 50%, với chợ Bến Ngự có tỷ lệ cao nhất là 60% Tại tỉnh Hậu Giang, khảo sát trên đàn thủy cầm (vịt, vịt xiêm, ngỗng) cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở mẫu thịt là 32,76%, vỏ trứng 13,73% và lòng đỏ trứng 0,13%

Đáng lo ngại hơn, vi khuẩn này còn thể hiện khả năng kháng kháng sinh, làm phức tạp quá trình điều trị và tăng nguy cơ bùng phát các vụ ngộ độc thực phẩm

nghiêm trọng Để điều trị bệnh ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn gây ra thì kháng sinh

đã được đưa vào điều trị cho các bệnh nhân Tuy nhiên, lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy hải sản cũng như tình trạng sử dụng kháng sinh mà không cần bất kỳ đơn thuốc nào là một trong những yếu tố góp phần lây lan tình trạng kháng kháng sinh tại Việt Nam

Để giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm do Salmonella, cần tăng cường các

biện pháp vệ sinh an toàn thực phẩm trong quá trình sản xuất, chế biến và tiêu thụ Ngoài ra, việc giám sát và kiểm soát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi cũng đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế sự phát triển của các chủng

Salmonella kháng thuốc Do đó, khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella cũng như đánh giá

khả năng mẫn cảm với các kháng sinh phổ biến của các chủng phân lập được là cần

thiết để kiểm soát tình trạng ngộ độc thực phẩm do Salmonella cũng như góp phần

giúp các bác sỹ đưa ra được các phác đồ điều trị bệnh hiệu quả Từ thực tế trên,

chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu vi khuẩn Salmonella phân lập từ mẫu thu tại

một số bếp ăn tập thể ở Hà Nội và đánh giá khả năng kháng kháng sinh của các chủng phân lập được” hướng đến việc đề xuất giải pháp kiểm soát tỷ lệ nhiễm vi

khuẩn trên tại đơn vị nghiên cứu

2 Mục đích nghiên cứu:

- Đánh giá tỷ lệ nhiễm Salmonella spp trên thực phẩm, vật dụng chế biến và

mẫu phân cán bộ nghi ngờ bị ngộ độc thực phẩm tại một số bếp ăn tập thể trên địa bàn Hà Nội;

- Đánh giá tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được

3 Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Salmonella là một loại vi khuẩn sống hoại sinh trong đường tiêu hoá của người

và động vật, có khả năng lây truyền giữa người và gia súc Nghiên cứu tình trạng

nhiễm khuẩn Salmonella và đánh giá tính kháng kháng sinh của chúng sẽ cung cấp các thông tin về tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thực phẩm tại địa điểm nghiên cứu, loại thực phẩm phổ biến có tỷ lệ nhiễm Salmonella cao và đặc biệt là tính kháng kháng

sinh của các chủng phân lập được Kết quả nghiên cứu nhằm tạo cơ sở khoa học, từ

đó đưa ra các đề xuất, giải pháp kiểm soát tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp tại đơn vị nghiên cứu cũng như đề xuất các loại thực phẩm có nguy cơ nhiễm Salmonella

cao từ đó có biện pháp kiểm soát đảm bảo an toàn thực phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm là tình trạng gây ra khi ăn hoặc uống phải thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn, nhiễm độc Các triệu chứng phổ biến khi người bệnh mắc phải

là đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, tiêu chảy, sốt, đau đầu Bệnh nặng có thể dẫn đến hiện tượng tiêu chảy ra máu, mất nước, truỵ tim mạch và sốc nhiễm khuẩn Có 3 nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm chính đó là (1) tác nhân sinh học (vi khuẩn, virus, ký sinh trùng và nấm mốc); (2) tác nhân hóa học (thuốc bảo vệ thực vật, thực phẩm chứa chất phụ gia độc hại); (3) tác nhân vật lý (các dị vật như mảnh thủy tinh, kim loại, nhựa, hoặc sạn cát) Trong 3 nguyên nhân trên, vi sinh vật được cho là nguyên nhân chính gây nên các vụ ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam và trên thế giới [47]

1.2 Nhiễm khuẩn, nhiễm độc thực phẩm do Salmonella spp

1.2.1 Phân loại

Salmonella là trực khuẩn Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, kỵ khí tùy

tiện Salmonella được chia thành hai loài phân loại: Salmonella bongori và

Salmonella enterica, với loài thứ hai chứa tất cả các phân loài Salmonella liên quan

đến y tế

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Hình thái và đặc điểm nuôi cấy: Salmonella spp là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình từ 2 – 5 µm, di chuyển bằng tiên mao trừ Salmonella

45oC, nhiệt độ lý tưởng là từ 35oC – 37oC và phạm vi pH tối ưu là từ 6,5 – 7,5 Một

số chủng thậm chí có thể phát triển ở pH thấp 3,7 Salmonella spp là vi khuẩn kỵ

khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ [56]

1.2.3 Cấu trúc kháng nguyên

Salmonella spp có ba loại kháng nguyên gồm kháng nguyên thân O, kháng

nguyên lông H và kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn (Sal Typhi) có kháng nguyên V (Virulence) là yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên trong tế bào bạch cầu [21,38]

1.2.3.1 Kháng nguyên thân O

Lypopolysaccharide (LPS) là thành phần cơ bản cấu trúc nên màng ngoài của thành phần tế bào vi khuẩn LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng: vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipide A

1.2.3.2 Kháng nguyên lông H

Kháng nguyên lông H là một protein không chịu nhiệt, kém bền vững so với kháng nguyên thân O và nằm ở phần lông của vi khuẩn Kháng nguyên H bị phá huỷ ở 60°C trong 1 giờ, dễ bị phá huỷ bởi cồn, acide yếu Kháng nguyên H không giúp ích trong việc tạo miễn dịch phòng bệnh, nhưng có ý nghĩa trong việc xác định giống loài vi khuẩn [15]

1.2.4 Các yếu tố độc lực

Vi khuẩn Salmonella spp có thể tiết ra 2 loại độc tố: Ngoại độc tố và nội độc

tố Nội độc tố của Salmonella spp rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn

loét; độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật Ngoại độc tố tác động vào

thần kinh và ruột chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí [16]

1.2.5 Tính chất sinh hóa

Vi khuẩn Salmonella spp lên men đường glucose và sinh khí, không lên men

lactose, saccharose H2S (+), indol, urease (-), Simmon (-), lysine decarboxylase, oxydase (-) và catalase (+)

1.2.6 Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella trên thực phẩm

Tình trạng kháng kháng sinh làm tăng khả năng gây bệnh của vi khuẩn lên gấp nhiều lần khi vi khuẩn đã có sẵn các yếu tố gây bệnh Việc sử dụng rộng rãi thuốc kháng sinh để phòng, chữa bệnh và kích thích chăn nuôi gia súc, gia cầm; bảo quản cây, rau, quả; xử lý môi trường; đã tạo ra nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc, mang plasmid kháng kháng sinh tồn tại lâu dài trong cơ thể con người, vật nuôi và môi trường

Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và của Salmonella nói

riêng, luôn thay đổi; phụ thuộc vào từng địa điểm và thời điểm làm kháng sinh đồ khác nhau thì cho kết quả cũng khác nhau

Khả năng kháng thuốc của Salmonella được chia thành hai loại chính:

- Kháng tự nhiên: nhờ cấu trúc màng ngoài và khả năng tiết enzyme như

β-lactamase mà một số chủng của vi khuẩn Salmonella có khả năng làm giảm hiệu quả

thâm nhập hoặc phá hủy các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam [32]

- Kháng thu được: là tính kháng thuốc xuất hiện do vi khuẩn tiếp xúc nhiều lần với kháng sinh hoặc nhận gen kháng thuốc từ vi khuẩn khác

1.2.7 Tình hình dịch tễ và tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella spp

1.2.7.1 Tình hình dịch tễ của vi khuẩn Salmonella trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có tới 1/10 dân số thế giới, khoảng 600 triệu người mắc bệnh do tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm, và hàng năm có 420.000 người tử vong, 30% trong số đó là trẻ em dưới 5 tuổi [57] Đặc biệt, ở những nước thu nhập trung bình và thấp, tỷ lệ này lên đến 40% với 125.000 ca tử vong hàng năm Tại Hoa Kỳ, Hệ thống Giám sát Bùng phát Dịch bệnh do Thực phẩm

(Foodborne Disease Outbreak Surveillance System - FDOSS) ước tính rằng mỗi năm có khoảng 48 triệu người mắc các bệnh liên quan đến thực phẩm, tương

đương với 1/6 dân số quốc gia

Đối với các tác nhân vi khuẩn thì Salmonella được đánh giá là nguyên nhân thứ hai trong các vụ nhiễm độc thực phẩm sau Campylobacter, là một vi sinh vật

gây ra gánh nặng bệnh tật toàn cầu do thực phẩm, đặc biệt là các bệnh liên quan đến thực phẩm có nguồn gốc động vật [33] Các vi khuẩn này chủ yếu tồn tại trong

thịt gia cầm sống, thịt sống, trứng và các sản phẩm chế biến từ chúng Salmonella

phát triển mạnh trong môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng và nước dồi dào,

vì vậy, thịt và gia cầm là các sản phẩm lý tưởng để vi khuẩn này sinh sôi Ngoài ra, rau quả cũng có thể bị nhiễm vi khuẩn này nếu bị tiếp xúc với phân động vật, tạo

điều kiện cho Salmonella phát triển Hàng năm, trên toàn thế giới có khoảng 200 triệu đến hơn 1 tỷ ca nhiễm trùng do Salmonella gây ra, chiếm 85% các bệnh liên

quan đến thực phẩm

1.2.7.2 Tình hình dịch tễ của vi khuẩn Salmonella tại Việt Nam

Tại Việt Nam, trong giai đoạn 2017 - 2019, cả nước ghi nhận tổng cộng 65 vụ ngộ độc thực phẩm tại bếp ăn tập thể làm 2.801 người mắc bệnh, 2.709 người phải nhập viện Không có trường hợp tử vong nào được báo cáo Trung bình mỗi năm cả nước xảy ra 22 vụ ngộ độc thực phẩm, làm 934 người mắc bệnh, 903 người nhập viện do ngộ độc thực phẩm [1]

Về mặt dịch tễ học, Salmonella là nguyên nhân gây ra khoảng 33% các vụ ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam Đáng lo ngại, vi khuẩn này còn thể hiện khả năng

kháng kháng sinh, làm phức tạp quá trình điều trị và tăng nguy cơ bùng phát các vụ

ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng

1.2.7.3 Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella

Kháng sinh đã được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi gia súc và gia cầm với nhiều mục đích khác nhau, từ phòng bệnh đến điều trị Tuy nhiên, việc lạm dụng và

sử dụng kháng sinh trong thời gian dài đã dẫn đến sự phát triển của tình trạng kháng kháng sinh ở vi khuẩn Đặc biệt, vi khuẩn gram âm gây bệnh đang trở thành một thách thức lớn, không chỉ đối với người bệnh mà còn đối với toàn xã hội

Tình trạng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella được phân

lập trong cộng đồng như thực phẩm, móng tay, dụng cụ chế biến và mẫu phân đã được báo cáo trên toàn cầu Đặc biệt, tỷ lệ các chủng đề kháng với tetracycline, ampicillin và chloramphenicol ngày càng phổ biến [40, 19, 56] Do việc sử dụng kháng sinh tràn lan cho gia súc, gia cầm để kích thích tăng trưởng và ngăn ngừa bệnh

tật đã làm tăng nhanh chóng các chủng Salmonella kháng thuốc ở người và động

vật, điều này trở thành vấn đề nghiêm trọng đối với sức khỏe toàn cầu [61]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và đối tượng nghiên cứu

- Địa điểm: 02 bếp ăn tập thể trên địa bàn thành phố Hà Nội: Công ty X và

Công ty Y

- Đối tượng nghiên cứu: 756 mẫu thực phẩm, bao gồm các mẫu thực phẩm

(617), tăm bông dụng cụ rửa chén (77), bề mặt bàn ăn (25), tăm bông từ tay của người chế biến thực phẩm (34), mẫu phết trực tràng (26) và mẫu phân (2)

2.2 Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng

Để xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella và tình trạng kháng kháng sinh tại địa

điểm nghiên cứu, quy trình thực hiện gồm các bước sau:

(1) Thu thập các mẫu tại địa điểm nghiên cứu;

(2) Phân lập vi khuẩn trong các mẫu bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc; (3) Định danh loài vi khuẩn bằng hệ thống Vitek2 Compact kết hợp kỹ thuật PCR, giải trình tự gen;

(4) Đánh giá tỷ lệ nhiễm Salmonella trong các mẫu đã phân lập

(5) Đánh giá tỷ lệ kháng kháng sinh của Salmonella trong các mẫu đã phân

n: Số mẫu thực phẩm cần thu thập tối thiểu

P: Tỉ lệ ước đoán lấy từ nghiên cứu trước đây hoặc từ nghiên cứu thử

d: Sai số tỉ lệ phát hiện so với tỷ lệ thực, chọn d = 0,05

ɛ: Mức sai số tương đối chấp nhận Ở đây sử dụng mức sai số 0,1 (tương ứng 10%)

Z1-α/2: là giá trị mong muốn chuẩn, được tính dựa trên mức ý nghĩa thống kê

Ở đây Z1-α/2 = 1,96 với mức ý nghĩa thống kê là 5%

Theo báo cáo của các nghiên cứu trước đây, E coli và Salmonella có tỷ lệ

nhiễm cao nhất trên thực phẩm đã được báo cáo Do đó, chúng tôi dựa trên tỷ lệ

nhiễm của E coli và Salmonella để tính cỡ mẫu nghiên cứu

Với Salmonella spp.: Theo khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella trên thực phẩm ở

Việt Nam dao động từ 25% đến 60,8%, do đó chúng tôi lấy tỷ lệ nhiễm trung bình

là 42,5%, lấy P = 0,425 Do vậy cỡ mẫu thu thập tối thiểu là 375 mẫu [13]

Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ chủ yếu tập trung trên nhóm thực phẩm tươi sống, một số ít nghiên cứu trên bàn tay và dụng cụ chế biến Trong khi đó nhóm nghiên cứu làm trên 4 nhóm mẫu gồm: mẫu thực phẩm sống, thực phẩm chín, mẫu dụng cụ, mẫu phết bàn tay người chế biến và mẫu phân của người nghi ngộ độc thực phẩm Do đó nhằm đảm bảo cỡ mẫu nghiên cứu chúng tôi lấy thêm gấp đôi so với cỡ mẫu ban đầu

Dự kiến cỡ mẫu tối thiểu là 700-800 mẫu

Cách thức lấy mẫu: Tiến hành lấy mẫu bốc thăm ngẫu nhiên, tại mỗi điểm nghiên cứu, mẫu được thu trong 15 ngày theo hình thức cách ngày và thu liên tục trong vòng 30 ngày

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu:

Quy trình lấy mẫu tuân theo TCVN 10780-1:2017 (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2017) (ISO 6579-1:2017) Tất cả các mẫu thu thập đều được lấy vào buổi sáng

các ngày khác nhau để đảm bảo thời gian đồng nhất về thời điểm lấy cũng như thời gian xử lý mẫu ở các chu trình phía sau Mẫu sau khi lấy được bảo quản trong hộp vận chuyển mẫu ở 4oC đến 10oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong khoảng

1 giờ

2.2.3 Phương pháp bao gói, vận chuyển mẫu

Phương pháp bao gói, vận chuyển được thực hiện theo TCVN 8129:2019 (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2019) (ISO 18593:2018)

2.2.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn Salmonella spp từ mẫu thực phẩm, mẫu

dụng cụ, bàn tay người chế biến và mẫu phết trực tràng

Quy trình nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn Salmonella spp được thực

hiện theo được thực hiện theo TCVN 10780-1:2017 (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2017) (ISO 6579-1:2017)

Bước 1: Tăng sinh chọn lọc

Chuyển 0,1 ml dịch cấy tăng sinh thu được vào ống chứa 10 ml canh thang RSV ủ ở 42o trong 24 giờ hoặc chuyển 1 ml dịch cấy trong môi trường RSV thu được vào ống có chứa 10 ml canh thang MKTTn, ủ ở 41,5oC trong 24 giờ

Bước 2: Phân lập

+ Dùng que cấy vô trùng quấy vòng canh thang tăng sinh chọn lọc, rồi cấy ria lên mỗi đĩa thạch chọn lọc CHROMagarTM Salmonella (mỗi mẫu cấy trên 3 đĩa) Sau

khi cấy, lật ngược các đĩa sao cho đáy hướng lên trên vào ủ ở 37oC ± 1oC trong 24

± 3h Lưu ý: để que cấy thẳng đứng, chỉ nhúng đầu que cấy xuống canh thang tăng sinh

+ Sau khi ủ 24 ± 3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình

có thể nghi ngờ là Salmonella spp., và các khuẩn lạc không điển hình Các khuẩn lạc