Tiểu luận - Chẩn đoán phân tử và liệu pháp gen - đề tài - Khuếch đại nucleic acid

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Phân tích

bệnh nhiễm

Chẩn đoán ung thư

Chẩn đoán tiền làm tổ, tiền thai

Chẩn đoán bệnh di truyền,phân tích biểu hiện gen

Xác định độ nhạy cảm

của một cá thể với

các tác nhân nhiễm nào đó

Khuếch đại nucleic acid

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Phát hiện biến đổi

di truyền ở người

 Trong các kĩ thuật khuếch đại khác nhau, thông tin

trình tự được sử dụng để thiết kế các mẫu dò

Phát hiện trình tự nucleic acid đặc biệt bằng các sự kiện

lai mẫu dò và một số kiểu khuếch đại khác

Quá trình khuếch đại chỉ là một phần của sự phân tích hoàn chỉnh

Một loại mẫu dò được sử dụng trong PCR

http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/mlpa.html

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

3/21/2016

Chuẩn bị mẫu

Khuếch đại

Phân tích định tính định lượngPhân tích Xác định trình tự

 Bước chuẩn bị mẫu là cần thiết, sao cho thích hợp với từng phương pháp

khuếch đại lựa chọn

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Kiểu phương pháp khuếch đại được chọn thường tùy thuộc vào trình tự

nucleic acid được phân tích

Phân loại (theo cơ chế hoạt động)

3/21/2016

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

http://www.drugdiscoveryonline.com/doc/third-wave-technologies-beckman-coulter-autom-0002

Kĩ thuật khuếch đại tín hiệu Invader Assay

Kĩ thuật khuếch đai mục tiêu LAMP

(Loop –mediated Isothermal Amplification)

 Phân tích kiểu gen thuận lợi hơn nhiều so với phân tích kiểu hình

 Khi sử dụng các cặp mồi bảo tồn cao, sự nhạy của PCR có thể phát hiện

nhiễm của môi trường vào mẫu

Mục tiêu chính của chuẩn bị mẫu

Giải phóng và ổn định các nucleic acid

Điều chỉnh nồng độ mẫu

Tách chất ức chế và đặt nucleic acid trong dung dịch bảo quản tương thích

Phương pháp tách chiết tối ưu phải sao cho tiện lợi, dễ dàng,

an toàn và có thể được tự động hóa

Các bước chuẩn bị mẫu

http://stratfeed.cra.wallonie.be/page/PCR_web_page.php

2 CHUẨN BỊ MẪU

-Yêu cầu:

+ có một mạch khuôn chất lượng cao

+ ngăn cản được ngoại nhiễm

Phụ thuộc vào đặc tính sinh vật và đặc tính vật lý của sản

phẩm

3/21/2016

2 CHUẨN BỊ MẪU

Huyết tương

Huyết thanh

Nước tiểuDịch ối Là nguồn acid nucleic dễ dàng khuếch đại khi được xử lý thích hợp

Kiểu mẫu sinh phẩm

có thể thu nhận

2 CHUẨN BỊ MẪU

Chất tẩy rửa Chất gây biến tính:

fomandehit…

 Nucleic acid sau đó được thu nhận, tủa hay giữ trên chất nền

 Số lượng vi khuẩn nhiễm ít thì cần tách các tác nhân ức chế sự khuếch

đại (bởi việc thêm phenol chloroform trong các bước tinh sạch) và cô đặc

mẫu bằng cách tủa với alcohol

2 CHUẨN BỊ MẪU

AmpFLSTR® Identifiler® Direct PCR

Amplification Kit & Prep-n- Go™

Buffer, for buccal swabs https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F553S

Phusion High-Fidelity PCR Kit

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/F130WH

Phire Plant Direct PCR Kit (without sampli được sử dụngng tools)

Hình ảnh một số bộ kit được sử dụng hiện nay

 Dựa vào sự ly giải tế bào bằng enzyme, gắn các nucleic acid vào

chất nền chứa các cột quay sử dụng kĩ thuật quay (li tâm), hay chân không

để rửa và thay đổi dung dịch đệm

3/21/2016

2 CHUẨN BỊ MẪU

Một cách khác, sử dụng hạt từ tính kết hợp với mẫu dò để bắt giữ nucleic acid,

sau đó tạo từ trường để thu gom các hạt khi đệm được thay đổi

Một phương pháp trực tiếp chuẩn bị mẫu dò là bắt giữ các vi sinh vật mục tiêu bằng phương pháp tách miễn dịch từ tính (immunomagenetic)

( Olavik ,1994) hay tiến hành lọc (Bej,1991), rửa các tế bào tách chiết và bổ sung trực tiếp vào ống PCR ,trong ống này chúng bị ly giải trước khi khuếch

đại

2 CHUẨN BỊ MẪU

Sự khuếch đại phân tử

Làm tăng nồng độ của mẫu chuyên biệt

hay mẫu dò

Làm gia tăng lượng tín hiệu để

dễ phát hiện

 Chuẩn bị mẫu là bước quan trọng cần thực hiện trước khi khuếch đại

và sau đó là bước phát hiện mục tiêu

3 KHUẾCH ĐẠI

3/21/2016

Gia tăng lượng tín hiệu giúp cho dễ phát hiện

3 KHUẾCH ĐẠI

 Kĩ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction): là kĩ thuật

cho phép nhân nhanh in vitro số lượng lớn một đoạn DNA

 Nguyên tắc: dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase nhân bản

một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide tương hợp với hai đầu 3’

của hai mạch đơn của đoạn DNA

3.1 Khuếch đại mục tiêu 3.1.1 Kĩ thuật PCR

3 KHUẾCH ĐẠI

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

Phương pháp PCR

3/21/2016

isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ved=0ahUKEwiJ3OfH88fLAhWJk5QKHZwiB8MQsAQILQ#img dii=b2edwXxocRD-3M%3A%3Bb2edwXxocRD-3M%3A%3BtBb_rAPGHeVUmM%3A&imgrc=b2 edwXxocRD-3M%3A

3.1 Khuếch đại mục tiêu 3.1.1 Kỹ thuật PCR

http://oceanexplorer.noaa.gov/explorations/04etta/background/dna/media/dna_1.html

Quy trình PCR

Nested PCR (PCR lồng)

Multiplex PCR (PCR phức)

3.1.1 Kĩ thuật PCR 3.1 Khuếch đại mục tiêu

Reverse-transcriptate PCR

 Một số phương pháp PCR cải tiến

Inverse PCR (PCR ngược)

Colony PCR

3.1.1 Kỹ thuật PCR 3.1 Khuếch đại mục tiêu

Quantitative real-time PCR

 Một số phương pháp PCR cải tiến

3/21/2016

3.1 Khuếch đại mục tiêu 3.1.1 Kĩ thuật PCR

Giám định hình

sựChẩn đoán bệnh

(HIV)

3.1 Khuếch đại mục tiêu 3.1.2 Kĩ thuật LAMP

LAMP (loop-mediated isothermal amplification): là một phương pháp dùng để

khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu mà không cần phải dùng tới máy luân nhiệt

Kĩ thuật LAMP

 Nguyên tắc: dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase nhân bản

một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide tương hợp với hai đầu 3’

của hai mạch đơn của đoạn DNA

http://www.myshared.ru/slide/766278/

3/21/2016

Thành phần

2 cặp mồi FIP và BIP

Đoạn DNA mục tiêu

Các bước tiến hành kĩ thuật LAMP

Đoạn mồi thứ nhất bám vào mạch

và DNA polymerase bắt đầu hoạt động

Đoạn mồi tiếp theo bám vào

di chuyển đến đoạn mới vừa được

tạo, DNA polymerase tiếp tục tạo

mạch mới tại vị trí mạch đầu tiên

Mồi ngược cũng tiến hành như trên Chú ý: mạch vừa được tạo sẽ trở thành mạch khuôn

Đoạn mạch sau khi tách và được mã hóa bởi

đoạn mồi sẽ cuộn lại tạo thành cấu trúc Loop.

Figure from Eiken LAMP webpage: http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html

http://www.slideshare.net/emwess92/attempt-1

3.1 Khuếch đại mục tiêu 3.1.2 Kĩ thuật LAMP

• Quá trình sẽ được lặp lại tạo thành các chuỗi dài hơn và

nối với nhau bởi các đoạn mồi Loop

Amplified Back Loops

Amplified Forward Loops

Multiple copies of The Target Gene

3.1 Khuếch đại mục tiêu 3.1.2 Kĩ thuật LAMP

LAMP PCR-Cần cặp mồi FIP và BIP

đặc hiệu - Chỉ cần một mồi đặc hiệu

- Điều kiện đẳng nhiệt - Cần phải luân nhiệt

- Sử dụng Bst polymerase - Sử dụng Taq polymerase

- Đơn giản, nhạy - Phức tạp

- Không phát hiện được từ hai nhân tố

gây bệnh trở nên

- Multiplex và Nested PCR phát hiện được nhiều hơn hai nhân tố gây

bệnh

- Tạo smear khi điện di,

do hình thành cấu trúc quả tạ - Tạo các vạch băng trên gel điện di

3.1 Khuếch đại mục tiêu

Sử dụng DNA ligase để nối hai đầu tận cùng của mẫu dò

nằm cạnh nhau trên DNA mục tiêu

https://udapbio.wikispaces.com/Alan+Y Phản ứng chuỗi nối ligase

(Ligase Chain Reaction –LCR)

3.2 Khuếch đại mẫu dò

3/21/2016

Kĩ thuật LCR

http://www.slideshare.net/SHBZaidi/ligase-chain-reactionlcr

3/21/2016

3.2 Khuếch đại mẫu dò

Biến tính: DNA mạch khuôn

sẽ được biến tính ở nhiệt độ 95 0C

Gắn mồi: tiến hành gắn mẫu dò vào đoạn DNA mạch khuôn ở 600 C

Nối: dùng enzyme ligase để nối các đoạn mẫu dò (600 C)

1

2

3

Các bước trong LCR

Sản phẩm LCR được xác định bằng cách sử dụng nhóm chức năng

Mẫu dò hình móc khóa(padlock probe)

Hệ thống khuếch đại theo kiểu vòng tròn xoay(rolling circle amplification –RCR/RCA)

Phát hiện các vòng chọn lọc được gắn, khuếch đại

Thuận lợi

 Dễ dàng phát hiện các vị trí

nucleotide đặc hiệu

 Không tốn thời gian

 Số lượng mẫu được phân tích lớn,

nhanh hơn so với sử dụng các

phương pháp nuôi cấy truyền thống

Khó khăn

 Phospho sẽ ức chế phản ứng khi chúng được thêm vào trước khi LCR xảy ra

 Bản coppy đôi khi xảy ra lỗi3.2 Khuếch đại mẫu dò

42 3/21/2016

3.2 Khuếch đại mẫu dò

Ứng dụng

Phát hiện

bệnh di truyền

Phát hiện virus

Phát hiện

vi khuẩn gây bệnh

Phát hiện trình tự mục tiêu khác

Khuếch đại các tín hiệu được tạo ra nhờ phát hiện trình tự mục tiêu

Phát hiện dựa vào DNA nhánh (bDNA)

Bắt giữ và gia tăng số vị trí gắn tiềm tàng

từ tín hiệu báo cáo cuối cùng tạo ra

Lượng DNA được xác định từ đường cong chia tỷ lệ

3.3 Khuếch đại tín hiệu

3.3 Khuếch đại tín hiệu Hoạt động của Branched DNA assay (bDNA)

3/21/2016

• Xác định chính xác genome virus có tính hỗn tạp cao như:

Human Immunodeficiency virus (HIV), Hepatitis B virus (HBV) và

Hepatitis C virus (HCV),…

• Định lượng viral loads (trên 500 IU/ml), trong khi PCR xác định được ở

50 IU/ml máu đối với HCV

3.3 Khuếch đại tín hiệu

 Ứng dụng của bDNA

Kĩ thuật Invader Assay

3/21/2016

3.3 Khuếch đại tín hiệu

 Khái niệm: là một hệ thống khuếch đại tín hiệu có thể xác

định số lượng chính xác các mục tiêu DNA và RNA

với độ nhạy cao

 Dựa trên sự phân tách phức tạp của một phức hợp

mẫu dò chồng lấp lên nhau

 Sự phân tách dẫn đến giải phóng các mẫu dò tín hiệu có thể

phát hiện trực tiếp hoặc gây ra phân tách của mồi được đánh dấu

huỳnh quang

Kĩ thuật Invader Assay cho SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)

 SNP ( đa hình đơn nucleotide ) là những biến thể trình tự DNA xảy ra khi một nucleotide trong trình tự bộ gen bị thay đổi

 Marker này thường được dùng để phân tích genome người và nhiều sinh vật khác Nhờ đột biến điểm tại một nucleotide trên genome

http://www.viagenefertility.com/Available-PGD-Technologies.php

3.3 Khuếch đại tín hiệu

Các giai đoạn của kĩ thuật Invader Assay cho SNP

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2771639/fig ure/F1/

3/21/2016

3.3 Khuếch đại tín hiệu

• Allele cụ thể phân chia trong một

phản ứng invadern nhờ enzym giới hạn

1

• Phản ứng nối tiếp khuếch đại tín hiệu

2

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2 771639/figure/F3/

3.3 Khuếch đại tín hiệu

Sơ đồ phân tán của kết quả kiểu gen đại diện

Điểm dữ liệu cho từng mẫu được vẽ dựa trên huỳnh quang

Được tạo ra bởi sự phân cắt của mỗi allele cụ thể

Đường chấm chấm cho biết khoảng tin cậy được xác định bởi cụm phân tích cho mỗi kiểu gen

Ứng dụng

https://biogeniq.ca/en/snp/

http://www.zsinhhoc.com/2013/07/nhiem-sac-the-dot-bien-cau-truc.html

3.3 Khuếch đại tín hiệu

Dùng cho sự đa hình nucleotide đơn

( SNP )

Phân tích đột biến hoang dại

ở các tỷ lệ lớn hơn 1/1000 (đột biến /wt )

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc 2007.Công nghệ sinh học trên người và động vật.

Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, tr 538-545

3/21/2016

3/21/2016 53

“ TRÍ TUỆ CỦA CON NGƯỜI TRƯỞNG THÀNH

TRONG TĨNH LẶNG, CÒN TÍNH CÁCH CỦA CON NGƯỜI TRƯỞNG THÀNH

TRONG BÃO TÁP“

Johann Wolfgang von Goethe

(1749-1832)

“ CỐ GẮNG LÀ TẤT CẢ NHỮNG GÌ CHÚNG TA PHẢI LÀM , CHO DÙ KẾT QUẢ CUỐI CÙNG LÀ THÀNH CÔNG HAY THẤT BẠI”

Robert Allen Thibodeau

(1926-1966)

DANH NGÔN

54 3/21/2016

CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN

ĐÃ CHÚ Ý LẮNG NGHE!