MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CỦA CUCURMIN TRONG VIỆC LÀM GIẢM CHỨNG LOÃNG XƯƠNG DO GLUCOCORTICOID (GIO)

MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CỦA CUCURMIN TRONG VIỆC LÀM GIẢM CHỨNG LOÃNG XƯƠNG DO GLUCOCORTICOID (GIO)MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CỦA CUCURMIN TRONG VIỆC LÀM GIẢM CHỨNG LOÃNG XƯƠNG DO GLUCOCORTICOID (GIO)

MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT

1

1.1 NGUYÊN NHÂN

1 GIỚI THIỆU KHÁI QUÁT

3

Các glucocorticoid (GC) đã được sử dụng rộng rãi

trong các liệu pháp điều trị các bệnh: hen suyễn,

viêm khớp dạng thấp, cấy ghép nội tạng, ung thư

và các rối loạn tự miễn dịch do tính chống viêm

và điều hòa miễn dịch của chúng.

Tuy nhiên, việc sử dụng GC trong thời gian

dài có khả năng gây ra giảm mật độ khoáng

của xương (BMD) và độ bền xương, do đó

dẫn đến loãng xương, và thậm chí gãy xương.

Dexamethasone

(Dex)

1.1 NGUYÊN NHÂN

1 GIỚI THIỆU KHÁI QUÁT

Tái tạo xương là một quá trình cân bằng chức năng hoàn

hảo giữa sự tái hấp thu xương chính qua trung gian tế

bào hủy xương và sự hình thành xương mới do nguyên

bào xương gây ra

Loãng xương có liên quan đến tế bào hủy xương và nguyên bào xương

Loãng xương là do tốc độ hấp thụ xương cao hơn so với

tốc độ hình thành xương

4

 Quá trình apoptosis (chết rụng) của

nguyên bào xương.

 Tế bào hủy xương, cũng như sự kéo

dài tuổi thọ của tế bào hủy xương.

Cần phải làm giảm tuổi thọ của tế bào hủy xương, hoặc ngăn chặn quá trình apoptosis của nguyên bào xương, hoặc cả hai.

1 GIỚI THIỆU KHÁI QUÁT

5

1.1 NGUYÊN NHÂN

Curcumin là một hoạt chất được chiết xuất từ thân rễ

của cây nghệ (Curcumin longa L.) có các hoạt động dược

lý rộng rãi như chống viêm, chống oxy hóa, chống ung

thư, bảo vệ thần kinh và chống bệnh lao.

Các nghiên cứu trước đó đã chứng minh rằng

curcumin có thể bảo vệ chuột chống lại chứng loãng

xương do cắt buồng trứng bằng cách tăng cường

BMD, tăng sức bền cơ học và ngăn ngừa mất xương.

1.2 HỢP CHẤT ĐỀ CỬ

1 GIỚI THIỆU KHÁI QUÁT

6

1 GIỚI THIỆU KHÁI QUÁT

1.3 CƠ SỞ NGHIÊN CỨU TRƯỚC

Theo báo cáo, curcumin có thể cải thiện sự luân chuyển xương và nâng cao chỉ số BMD ở chuột chuyển gen APP/PSI Ngoài ra, curcumin đã được chứng minh là có tác dụng ngăn chặn mạnh mẽ sự tiêu xương của tế bào hủy xương bằng cách kích thích quá trình chết rụng của tế bào hủy xương,

ức chế hoạt động của tín hiệu

RANK/RANKL, và ức chế sự biệt hóa

(Differentiation) - con đường hình thành tế bào hủy xương

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

Cắt đứt PARP Caspase-3

Bax/Bcl-2

Cytochrome c

Kích

hoạt

Bax: Protein pro-apoptotic

P-ERK: phosphoryl

hóa (kích hoạt) Kinase điều tiết tính hiệu ngoại bào (ERK) giúp bảo vệ nguyên bào xương khỏi apoptosis

2.1 TÓM TẮT CƠ CHẾ

8

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VITRO

Nguyên bào xương đã được nuôi cấy và xử

lý trước có hoặc không có các nồng độ curcumin khác nhau (0.5, 1 và 2 µmol/L) trong 2 giờ, sau đó tiếp xúc với 1 µmol/L Dex trong 6 giờ.

9

Phân tích Western Blot

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VITRO

Tổng Protein mỗi mẫu

Lượng protein bằng nhau mỗi mẫu

Các dải tổng được quan sát

bằng giải pháp phát quang

tăng cường, cường độ dải

được đo bằng máy

Cô lập,

kiểm tra để qua đêm

Sữa không béo 5%

Các đốm màu trên màng

1 Rửa qua muối đệm Tris với Tween 20

2 Ủ với kháng thể IgG-HRP

Bax/BCL-2 Caspase-3 PARP

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VITRO

Curcumin có xu hướng chống lại tác

động của Dex gây ra trên nguyên bào

xương:

 Giảm đáng kể Bax, tăng đáng kể Bcl-2

 Sự kích hoạt Pro-Caspase-3 giảm

 Sự cắt đứt protein PARP giảm

11

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VITRO

Mức độ phosphoryl hóa

Curcumin làm tăng mức độ phosphoryl hóa ERK thành p-ERK

→ Làm tăng sự kích hoạt tín hiệu ERK giúp chống lại hoạt động

của apoptosis

12

Phương pháp nhuộm Hoechst sử dụng kính hiển vi tiêu điểm quét laze.

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

Các tác nhân tương ứng từng mẫu

Cố định 20 phút, rửa hai lần bằng nước muối đệm phốt phát (PBS)

Ủ trong dung dịch Hoechst

33258 (0,5 mL)

ở nhiệt độ phòng

Rửa bằng PBS

Chuyển lên các lam (kính) bằng

chất khử huỳnh quang (Solarbio)

và được quan sát dưới kính hiển

vi tiêu điểm quét laze.

13

Phương pháp nhuộm Hoechst sử dụng kính hiển vi tiêu điểm quét laze.

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VITRO

 Các mũi tên chỉ ra các nguyên bào xương bị apoptosis (màu xanh rất sáng)

 Mật độ các đốm trắng sáng tỉ lệ nghịch với nồng độ curcumin điều trị

14

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VIVO

CONTROL Cung cấp một lượng tương đương natri cacboxymethylcellulose 0,5% (CMC-Na) trong 60 ngày

DEX Chuột được tiêm dưới da tiêm 0,1 mg/kg Dex mỗi ngày trong 60 ngàyDEX + CUR Chuột nhiễm Dex được cho uống 100 mg/kg curcumin mỗi ngày trong 60 ngày

15

độ PIXImus II Phép đo chỉ giới hạn ở khu vực gần xương đùi của chuột.

Pro-vehicle: trước dùng dược

Post-vehicle: sau dùng dược

Curcumin làm tăng đáng kể BMD ở xương đùi chuột so với chuột bị nhiễm Dex

16

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch

liên kết enzym (ELISA)

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VIVO

Sau khi đo BMD, máu ngoại vi được thu thập để đánh giá mức độ b-ALP và CTX bằng Bộ dụng cụ ELISA Rat b- ALP và Bộ dụng cụ ELISA Rat CTX Độ hấp thụ được đọc

ở bước sóng 450 nm trong một đầu đọc Microplate.

 b-ALP: phosphat kiềm trong xương là dấu hiệu của

sự hình thành xương

 CTX: liên kết chéo collagen ở đầu tận cùng cacboxy

- chuỗi peptit bị phân tách bởi tế bào hủy xương trong quá trình hấp thụ xương, dùng đánh giá mức

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VIVO

Thử nghiệm uốn cong ba điểm

trên xương đùi của chuột

Tải lực tối đa Độ cứng

Curcumin tăng cường tải lực tối đa và độ cứng của xương đùi chuột so với chuột Dex

18

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VIVO

Phương pháp nhuộm H&E

Các mô xương đùi được khử nước qua etanol Sau đó được cố định sau trong

dimethylbenzene và giữ trong dimethylbenzene-parafin ở 60°C Sau khi nhúng vào

parafin, các phần được cắt và đặt lên các phiến kính và được làm khô trong buồng

60°C Sau khi khử trùng bằng etanol, các phần được ngâm theo trình tự với

hematoxylin, nước và etanol clohydric 1% Sau khi nhuộm bằng eosin, các lát được

khử nước qua etanol, và sau đó được thấm xylen Cuối cùng, các lát được gắn vào

bảng nhựa và quan sát dưới kính hiển vi

19

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VIVO

Phương pháp nhuộm H&E

Xương có cấu trúc trabecular

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VIVO

Các mô xương đùi được thẩm thấu trong 0,1% Triton X-100 Sau khi rửa bằng muối đệm photphat (PBS) ba lần, các mô được chặn bằng H2O2 3% ở nhiệt độ phòng Phản ứng TUNEL được thực hiện bằng Bộ phát hiện tế bào chết tại chỗ Sau đó, các phần được hình dung bằng diaminobenzidine và nhuộm bằng hematoxylin Cuối cùng, các tế bào bị apoptosis được quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh

Xét nghiệm nhuộm nhãn (TdT) qua trung gian dUTP (TUNEL)

21

2 CURCUMIN NGĂN CHẶN APOPTOSIS

2.1 MÔ HÌNH IN-VIVO

 Nâu: nguyên bào xương dương tính với TUNEL → Bị apoptosis

 Xanh: nguyên bào xương âm tính với TUNEL → Không bị apoptosis

Xét nghiệm nhuộm nhãn (TdT) qua

trung gian dUTP (TUNEL)

Curcumin giúp ngăn chặn hiệu quả quá trình apoptosis đối với nguyên bào xương

22

3 TỔNG KẾT

Mô hình nghiên cứu trên đã chứng minh rằng curcumin có thể cải thiện GIO bằng cách bảo vệ các nguyên bào xương khỏi quá trình apoptosis, có liên quan trực tiếp đến kích hoạt con đường ERK Điều đó cho thấy rằng curcumin có thể là một loại thuốc đầy hứa hẹn để phòng ngừa và điều trị GIO

23

CÁM ƠN THẦY CÔ

VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE VÀ

GÓP Ý