Nghiên cứu phân lập, xác Định cấu trúc một số hợp chất và hoạt tính kháng khuẩn từ keo ong của một loài ong không ngòi Đốt Ở hoài Ân, bình Định (Đề Án thạc sĩ hoá lý thuyết và hoá lý)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN --- NGUYỄN THỊ MINH TRANG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ KEO ONG CỦA MỘT LOÀI ONG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

-

NGUYỄN THỊ MINH TRANG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT

SỐ HỢP CHẤT VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ KEO

ONG CỦA MỘT LOÀI ONG KHÔNG NGÒI ĐỐT

Ở HOÀI ÂN, BÌNH ĐỊNH

ĐỀ ÁN THẠC SĨ HÓA LÝ THUYẾT VÀ HÓA LÝ

Bình Định – Năm 2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

NGUYỄN THỊ MINH TRANG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ KEO ONG CỦA MỘT LOÀI ONG KHÔNG NGÒI ĐỐT

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Diệp Thị Lan Phương

Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong đề án này trung thực và chưa từng công bố dưới bất kỳ hình thức nào

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Học viên

Nguyễn Thị Minh Trang

LỜI CẢM ƠN

Đề án này được hoàn thành tại Khoa Khoa học Tự nhiên - Trường Đại học Quy Nhơn Trong thời gian thực hiện đề án, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo tâm huyết, nhiệt tình của thầy cô, gia đình

và bạn bè

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Diệp Thị Lan Phương,

đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành đề án tốt nghiêp

Em xin cảm ơn sự hỗ trợ một phần kinh phí từ đề tài Nghiên cứu ứng dụng

và Phát triển Công nghệ cấp Tỉnh năm 2023 , mã số 02-04-2023.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Quy Nhơn đã quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện

đề án

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn, các anh chị em tập thể lớp Cao học Hóa

lý thuyết và Hóa lý K25B trường ĐH Quy Nhơn đã luôn hỗ trợ, động viên trong suốt thời gian qua

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên giúp đỡ em hoàn thành đề án này

Mặc dù đã rất cố gắng trong thời gian thực hiện đề án, nhưng vì còn hạn chế về kiến thức cũng như thời gian, kinh nghiệm nghiên cứu nên không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự thông cảm và những ý kiến đóng góp quý báu từ quý thầy cô để đề án của em được hoàn thiện hơn

Em xin trân trọng cảm ơn!

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC HÌNH ii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Giới thiệu ong không ngòi đốt 5

1.2 Giới thiệu keo ong không ngòi đốt 7

1.3 Giới thiệu các lớp chất có trong mẫu hợp chất tự nhiên 8

1.3.1 Terpenoid 8

1.3.2 Steroid 9

1.3.3 Alkaloid 9

1.3.4 Flavonoid 10

1.3.5 Hợp chất phenol 11

1.4 Tổng quan một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài 12

1.4.1 Thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt 12

1.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong không ngòi đốt 19

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 22

2.1 Phương pháp nghiên cứu 22

2.1.1 Phương pháp xử lý mẫu 22

2.1.2 Phương pháp chiết mẫu keo ong không ngòi đốt 22

2.1.3 Phương pháp hóa lý nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH của keo ong không ngòi đốt 24

2.1.4 Phương pháp định tính các lớp chất có trong keo ong không ngòi đốt 26

2.1.5 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất 26

2.1.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 29

2.2 Hóa chất và thiết bị 29

2.2.1 Hóa chất 29

2.2.2 Thiết bị 29

2.3 Thực nghiệm 30

2.3.1 Nguyên liệu 30

2.3.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH từ keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 31

2.3.3 Định tính các lớp chất có trong keo ong không ngòi đốt 33

2.3.4 Tạo cao chiết EtOAc và đánh giá sơ bộ thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 34

2.3.5 Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ cao chiết EtOAc của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni ở Hoài Ân, Bình Định 35

2.3.6 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao chiết EtOH của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 38

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH 39

3.2.1 Phương pháp ngâm chiết 39

3.2.2 Phương pháp chiết siêu âm 44

3.3 Định tính các lớp chất chính có trong keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 50

3.3.1 Phát hiện triterpenoid 50

3.3.2 Phát hiện Steroid 51

3.3.3 Phát hiện alkaloid 51

3.3.4 Phát hiện flavonoid 52

3.3.5 Phát hiện các hợp chất phenol 52

3.2.6 Phát hiện Coumarin 53

3.4 Tạo cao chiết EtOAc và đánh giá sơ bộ thành phần hóa học cao chiết EtOAc 54

3.5 Kết quả phân lập hợp chất từ cao chiết EtOAc 57

3.6 Xác định cấu trúc của 2 hợp chất phân lập 60

3.6.1 Xác định cấu trúc của hợp chất 1 60

3.6.2 Xác định cấu trúc của hợp chất 2 73

3.7 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn cao chiết EtOH của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 82

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO 86

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide (CH3)2SO DEPT Distortionless Enhancement

by Polarisation Transfer

Kỹ thuật ghi phổ hỗ trợ cho 13C NMR, xác định số proton đính với carbon các bậc khác nhau

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thể HMBC Heteronuclear Multiple Bond

HSQC Heteronuclear Single

Quantum Coherence

Phổ tương tác trực tiếp Hydrogen – Carbon

NOESY Nuclear Overhauser Effect

Spectroscopy

Phổ hiệu ứng hạt nhân Overhauser

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng bên ngoài của ong thợ không ngòi đốt 5

Hình 1.2 Quá trình hình thành keo ong không ngòi đốt 7

Hình 1.3 Cấu tạo một số hợp chất terpenoid 8

Hình 1.4 Cấu tạo của một số hợp chất alkaloid 10

Hình 1.5 Bộ khung của flavonoid 10

Hình 1.6 Cấu tạo của một số hợp chất flavonoid 11

Hình 1.7 Cấu tạo của một số hợp chất phenol 12

Hình 2.1 Mẫu sắc ký bản mỏng 27

Hình 2.2 Mẫu keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni ở Ân Tín, Hoài Ân 30

Hình 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ khối lượng mẫu (g) với thể tích EtOH (mL) 31

Hình 2.4 Thiết bị chiết siêu âm dùng trong thí nghiệm 32

Hình 2.5 Cao chiết EtOAc tẩm silica gel 36

Hình 2.6 Sắc ký cột cao chiết EtOAc của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 36

Hình 3.1 Bột keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni thu ở Ân Tín, Hoài Ân 38

Hình 3.2 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ bột keo ong (g) : thể tích EtOH (mL) đến hiệu suất thu cao chiết EtOH trong ngâm chiết 41

Hình 3.3 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hiệu suất thu cao chiết EtOH 43

Hình 3.4 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ bột keo ong (g) : thể tích EtOH (mL) đến hiệu suất thu cao chiết EtOH trong chiết siêu âm 46

Hình 3.5 Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất thu cao chiết EtOH 47

Hình 3.6 Kết quả định tính triterpenoid 50

Hình 3.7 Kết quả định tính steroid 51

Hình 3.8 Kết quả định tính alkaloid 52

Hình 3.9 Kết quả định tính flavonoid 52

Hình 3.10 Kết quả định tính các hợp chất phenol 53

Hình 3.11 Kết quả định tính coumarin 53

Hình 3.12 Dịch chiết EtOH của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 54

Hình 3.13 Cao chiết EtOH của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 54

Hình 3.14 Chiết keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni với dung môi EtOAc 55

Hình 3.15 Cao chiết EtOAc của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 55

Hình 3.16 Sơ đồ tạo cao chiết EtOAc của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 56

Hình 3.17 TLC của cao chiết EtOAc hiện màu với Ce(SO4)2 57

Hình 3.18 2 chất (1) và (2) phân lập được 58

Hình 3.19 TLC của hợp chất 1 hiện dưới đèn UV (a) và với thuốc hiện Ce(SO4)2 (b) 59

Hình 3.20 TLC của hợp chất 2 hiện dưới đèn UV và với thuốc hiện Ce(SO4)2 59

Hình 3.21 Sơ đồ phân lập từ cao chiết EtOAc của keo ong không ngòi đốt Tetragonula pagdeni 60

Hình 3.22 Phổ 1H NMR của chất 1 trong CDCl3 (600 MHz) 61

Hình 3.23 Phổ giãn 1H NMR của chất 1 trong CDCl3 (600 MHz) 62

Hình 3.24 Phổ 13C NMR của chất 1 trong CDCl3 (125 MHz) 63

Hình 3.25 Phổ giãn 13C NMR của chất 1 trong CDCl3 (125 MHz) 63

Hình 3.26 Phổ HSQC của chất 1 64

Hình 3.27 Phổ giãn HSQC của chất 1 65

Hình 3.28 Phổ giãn HMBC-1 của chất 1 67

Hình 3.29 Phổ giãn HMBC-2 của chất 1 68

Hình 3.30 Phổ giãn HMBC-3 của chất 1 69

Hình 3.31 Phổ giãn HMBC-4 của chất 1 70

Hình 3.32 Phổ NOESY của chất 1 71

Hình 3.33 Phổ giãn NOESY của chất 1 72

Hình 3.34 Phổ khối lượng của chất 1 72

Hình 3.35 Cấu trúc phân tử của hợp chất 1 phân lập 73

Hình 3.36 Phổ 1H NMR của chất 2 trong CDCl3 (500 MHz) 74

Hình 3.37 Phổ giãn 1H NMR của chất 2 trong CDCl3 kéo giãn đoạn 2,5 – 1,5 ppm 75

Hình 3.38 Phổ giãn 1H NMR của chất 2 trong CDCl3 kéo giãn đoạn 1,7 – 0,9 ppm 76

Hình 3.39 Phổ 13C NMR của chất 2 trong CDCl3 76

Hình 3.40 Phổ giãn 13C NMR của chất 2 trong CDCl3 (125MHz) 77

Hình 3.41 Phổ DEPT của chất 2 77

Hình 3.42 Phổ giãn DEPT của chất 2 78

Hình 3.43 Phổ MS của chất 2 81

Hình 3.44 Cấu trúc phân tử của hợp chất 2 phân lập 81

Hình 3.45 Hình ảnh đĩa thạch thử nghiệm ức chế vi sinh vật 83

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột keo ong và thể tích EtOH đến hiệu suất thu cao chiết trong ngâm chiết 40Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hiệu suất thu cao chiết EtOH 42Bảng 3.3 Ảnh hưởng của dung môi ngâm chiết đến hiệu suất thu cao chiết 44Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ khối lượng mẫu và thể tích dung môi EtOH đến hiệu suất thu cao chiết trong chiết siêu âm 45Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất thu cao chiết 47Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các dung môi siêu âm đến hiệu suất thu cao chiết 48Bảng 3.7 So sánh các yếu tố ảnh hưởng của cả 2 phương pháp 49Bảng 3.8 Kết quả định tính các lớp chất có mặt trong trong keo ong không ngòi đốt 54Bảng 3.9 Số liệu phổ 1H NMR, 13C NMR của chất 1 66Bảng 3.10 Số liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của chất 2 và số liệu tham khảo 79Bảng 3.11 Kết quả kháng vi sinh vật và nấm của cao chiết EtOH 82

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Các loài ong nói chung như: ong mật, ong ruồi, ong lỗ, và ong không ngòi đốt (hay còn gọi là ong dú) nói riêng thường được phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới 1 Các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng: bên cạnh mật ong thì chế phẩm keo ong có chứa nhiều hợp chất tự nhiên có giá trị cao Keo ong là sản phẩm có giá trị được sử dụng từ rất lâu trên thế giới để điều trị bệnh, giúp tăng cường sức khỏe, phòng chống bệnh tật Hiện nay, keo ong được dùng nhiều ở các nước Mỹ, Nhật, Châu Âu trong thành phần thực phẩm chức năng để tăng cường sức khỏe, phòng chống các bệnh như tim mạch, tiểu đường, viêm nhiễm hay ung thư Tại Việt Nam, đã có nhiều sản phẩm như siro, viên nang, thuốc xịt họng, nước súc miệng đều nhập từ Brazil, Úc, Nhật… với thành phần có chứa keo ong

Thành phần hóa học của keo ong rất đa dạng, từ tìm kiếm ở cơ sở dữ liệu

có hệ thống, 241 hợp chất đã được xác định trong keo ong lần đầu tiên từ năm

2000 đến năm 2012 và chúng thuộc các nhóm chất như flavonoid, phenylpropanoids, terpenoid, stilben, lignan, coumarin và các dẫn xuất prenylate của chúng 2

Gần đây, các nhà khoa học đã có nhiều quan tâm, nghiên cứu về keo ong không ngòi đốt vì các loài ong này phong phú về mặt số lượng loài và có nhiều hoạt tính vượt trội: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống oxy hóa, chống ung thư… và được mệnh danh “kháng sinh tự nhiên” 3,4, 5, 6, 7 Tuy nhiên

ở Việt Nam mới chỉ có vài nghiên cứu về sản phẩm này Keo ong không ngòi đốt có thành phần hóa học rất đa dạng và có sự khác nhau do phụ thuộc vào khu vực địa lý, thổ nhưỡng, loài ong và nguồn thực vật cung cấp thức ăn xung quanh đàn ong Các nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt còn rất ít, đặc biệt là ở Việt Nam, theo tìm hiểu của chúng tôi chỉ có một số

nghiên cứu về keo ong không ngòi đốt Trigona minor ở Bến Tre, với thành

phần là các triterpene, lignan 8,9,10, loài Lisotrigona với thành phần chính là các

triterpene, flavonoid và xanthone 11,12 và gần đây là nghiên cứu keo ong không

ngòi đốt Homotrigona apicalis, Tetragonula iridipennis cho thấy có chứa các

hợp chất sesquiterpene, triterpene, flavonoid, xanthone 13,14…

Hiện nay, ở Bình Định, nghề nuôi ong không ngòi đốt đã bắt đầu quan tâm bởi sản phẩm ong không ngòi đốt được đánh giá là có giá trị hơn so với ong mật 15 Ở huyện Hoài Ân, thuộc tỉnh Bình Định, người dân đã thu thập loài ong không ngòi đốt từ tự nhiên và nhân đàn nuôi với quy mô ngày một mở rộng Cụ thể, đã có một số hộ gia đình phát triển nghề nuôi ong không ngòi đốt được công nhận là “Hộ phát triển kinh tế nông thôn của xã, huyện”, ví dụ hộ của anh Tô Vũ Thành Tín, Nguyễn Vũ… Mặc dù, ong không ngòi đốt được người dân quan tâm, nhưng theo tìm hiểu của chúng tôi, còn rất ít nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học về các chế phẩm của loài ong này Vì vậy, nhằm góp phần vào việc nghiên cứu xác định thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của keo ong không ngòi đốt ở tỉnh Bình Định nói riêng và ở Việt Nam

nói chung, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc một

số hợp chất và hoạt tính kháng khuẩn từ keo ong của một loài ong không ngòi đốt ở Hoài Ân, Bình Định"

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập hợp chất, xác định cấu trúc của một số hợp chất phân lập được

và hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết keo ong không ngòi đốt ở Hoài Ân, Bình Định

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: keo ong không ngòi đốt ở Hoài Ân, Bình Định

- Phạm vi nghiên cứu: Phân lập, xác định cấu trúc của một số hợp chất và

hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH keo ong không ngòi đốt ở Hoài Ân, Bình Định

4 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH theo phương pháp ngâm chiết, chiết siêu âm, khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết EtOH

- Định tính các lớp chất có trong keo ong không ngòi đốt

- Tạo cao chiết EtOAc và đánh giá sơ bộ thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt

- Phân lập một số hợp chất từ cao chiết EtOAc của keo ong không ngòi đốt ở Hoài Ân, Bình Định

- Xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất phân lập được từ keo ong không ngòi đốt

5 Phương pháp nghiên cứu

- Tổng hợp và thu thập tài liệu liên quan đến đề tài

- Phương pháp phân lập

+ Phương pháp ngâm chiết (chiết gián đoạn), phương pháp chiết siêu âm

và phương pháp chiết phân đoạn để chiết các chất ra khỏi mô thực vật (keo ong)

+ Phân lập hợp chất sử dụng các phương pháp sắc ký kết hợp như sắc ký cột, sắc ký bản mỏng để tinh chế hợp chất

- Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất phân lập

Các phương pháp vật lý hiện đại như: Phương pháp phổ MS, NMR 1 chiều (1H NMR, 13C NMR, DEPT …) và 2 chiều (NOESY, HSQC, HMBC…) để xác định cấu trúc chất phân lập

- Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Sử dụng các phương pháp thường quy kháng khuẩn trên các chủng VSV

và nấm kiểm định theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Việc định tính các lớp chất nhằm tìm hiểu sơ bộ các lớp chất có trong keo

ong không ngòi đốt, từ đó định hướng chiết tách phân lập hợp chất sau này

Việc phân lập và xác định được cấu trúc hợp chất là một đóng góp mới về thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt, tạo cơ sở cho các nghiên cứu sau này

Ngoài ra, việc phân tích cấu trúc phổ của hợp chất và định tính các lớp chất có thể giúp cho công tác giảng dạy, học tập và thực hành môn Hóa học các hợp chất thiên nhiên, môn Hóa lý các hợp chất thiên nhiên và ứng dụng, môn Các phương pháp phổ ứng dụng trong Hóa học cho sinh viên và học viên Cao học ngành Hóa học Ngoài ra, thông qua khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật

và nấm kiểm định của cao EtOH có thể định hướng tạo các chế phẩm có giá trị

từ nguồn keo ong không ngòi đốt: nước súc miệng, xịt họng, kem bôi vết thương Vì vậy, đề tài có ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu ong không ngòi đốt

Ong không ngòi đốt hay còn gọi ong Dú, ong Rú có tên tiếng Anh là

Stingless bee Ong không ngòi đốt là côn trùng biến thái hoàn toàn, thuộc bộ

bộ cánh màng (Hymenoptera), họ ong (Apidae), tộc ong không ngòi đốt (Meliponini) 16, 17

Hình thái bên ngoài của ong không ngòi đốt có ba phần chính trên cơ thể gồm: đầu, ngực và bụng Các bộ phận quan trọng trên đầu bao gồm râu, mắt kép, mắt đơn và hàm dưới Hai đôi cánh và ba đôi chân gắn liền với ngực Chân sau của hầu hết những con ong thợ không đốt có hình ống (giỏ phấn hoa) để thu thập và vận chuyển phấn hoa cũng như các vật liệu khác Phần bụng không

có khả năng chích đốt Hầu hết các bộ phận bên ngoài của ong đốt đều được bao phủ bởi lông 18

Hình 1.1 Hình dạng bên ngoài của ong thợ không ngòi đốt

Ong không ngòi đốt là những con côn trùng có tổ chức xã hội lớn nhất

trên trái đất với hơn 619 loài đã được xác định có nguồn gốc từ châu Phi được tìm thấy ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là Trung và Nam Mỹ, Châu Phi, Úc và Đông Nam Á 16,19,20, Trong đó có khoảng 244 loài ở Brazil 21,

14 loài ở Australia, Mexico được ghi nhận có 46 loài 22, tại châu Phi là 26 loài,

9 loài đã được tìm thấy ở Ghana 16 và 43 loài đã được tìm thấy tại châu Á, trong

đó có Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ, Malaysia, Lào… chúng được ghi nhận thuộc

hai chi là Lisotrigona và Trigona 8, 19 Đặc biệt, ở Việt Nam theo các tài liệu trước đây, ong không ngòi đốt có khoảng 14-15 loài đã tìm thấy được phân chia

thuộc hai chi Trigona và Lisotrigona 1, 23 Riêng ở Bình Định đã phát hiện có 7-8 loài ong không ngòi đốt khác nhau và được nuôi tại các huyện Hoài Ân, Hoài Nhơn, Vân Canh, Tuy Phước, An Lão… với số lượng khá lớn

Ong không ngòi đốt ở Việt Nam là loài ong lấy mật, nhưng ít có trong tự nhiên và là loài khó nuôi So với các giống ong khác như ong ruồi, ong khoái, ong mật, ong không ngòi đốt có kích cỡ nhỏ hơn khá nhiều, khoảng bằng 1/2 đến 2/3 Thông thường chúng làm tổ trong các hốc cây, khe đá, hốc tường nhà, tường bao hoặc trong tổ mối, trong ống tre, các cây to lớn vùng nhiệt đới, tổ lớn nhất có kích cỡ khoảng 20-25 cm x 30-40 cm 17 Cấu trúc tổ có 5 dạng chủ yếu: không có vòi, trứng rời rạc; có vòi trứng rời rạc; có vòi, làm tổ dưới đất; không vòi trứng bánh tầng và có vòi trứng bánh tầng 16, 17

Ong không ngòi đốt là loài sống hoang dã, tính hiền, không gây hại hay chích đốt người, vật nuôi như những loài ong khác, mà chúng chỉ bám cắn khi

bị phá tổ Nguồn thực phẩm của ong không ngòi đốt từ thảm thực vật tự nhiên,

do đó, người nuôi không cần can thiệp vào, bởi bản thân ong không ngòi đốt không ăn đường mà lấy phấn các loài hoa, mật hoa, nhựa cây, nước và sáp, kể

cả hoa cỏ dại nhỏ nhất Tuy nhiên ong không ngòi đốt chỉ thích hợp với thời tiết có nhiệt độ từ 28 - 34oC Nếu thời tiết quá nóng hoặc lạnh, nắng, mưa bất thường dễ làm cho đàn ong nhiễm bệnh và chết hàng loạt Ong cũng rất mẫn cảm với mùi hôi của phân gia súc, gia cầm, nước thải, thuốc bảo vệ thực vật và thậm chí cả tiếng ồn Kẻ thù của ong không ngòi đốt là các động vật săn mồi những con ong không ngòi đốt kiếm ăn trở về tổ của chúng như kiến, nhện, cóc, thằn lằn, bướm sáp, ruồi lưng gù… Ngoài ra, con người cũng là một trong

những kẻ thù nghiêm trọng của chúng Ngoài việc 'ăn cắp' các sản phẩm từ tổ ong của chúng, con người còn đốt cháy tổ và đàn ong, cắt và tách tổ của chúng thông qua việc khai thác gỗ và gỗ xẻ dẫn đến việc phá hủy môi trường sống của chúng Con người cũng phun thuốc trừ sâu nguy hiểm vào môi trường và trên cây trồng, giết chết ong không ngòi đốt hoặc làm ô nhiễm nguồn thức ăn của chúng 16

1.2 Giới thiệu keo ong không ngòi đốt

Keo ong là hỗn hợp nhựa tự nhiên do ong thu thập từ nhựa cây trộn với tuyến nước bọt của ong và thêm sáp ong tạo nên hỗn hợp phức tạp, có thành phần thay đổi, mang lại những đặc điểm độc đáo cho sản phẩm này 24, 25

Hình 1.2 Quá trình hình thành keo ong không ngòi đốt

Ong không ngòi đốt sử dụng keo ong như là xi măng để bịt kín các vết nứt hoặc không gian trống để hàn kín tổ, giúp bảo quản mật ong, bảo vệ sự phát triển của ấu trùng và trứng khỏi sự tấn công của các sinh vật khác xâm hại và các mối đe dọa về thời tiết như gió, mưa làm ong dễ nhiễm bệnh

Keo ong có thành phần hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng, nó phụ thuộc vào vùng địa lý, nguồn thực vật và tùy vào loài ong Hầu hết keo ong bao gồm 50% nhựa (được tạo thành từ flavonoid và các phenolic acid liên quan), 30% sáp, 10% tinh dầu, 5% phấn hoa và 5% các hợp chất hữu cơ khác 26 Keo ong là một hỗn hợp rất phức tạp và thành phần của nó thay đổi tùy theo nguồn gốc của nó Hàng trăm hợp chất hóa học đã được xác định từ keo ong Các nhóm hóa chất chính có trong keo ong là flavonoid, phenolic và các hợp chất thơm đa dạng Keo ong cũng chứa một số thành phần dễ bay hơi và sáp ong 27, 28

1.3 Giới thiệu các lớp chất có trong mẫu hợp chất tự nhiên

Các nhóm chất thường gặp trong mẫu hợp chất tự nhiên phải kể đến là carbohydrate, terpenoid, steroid, alkaloid, flavonoid, hợp chất phenol, tanin 29,

30

1.3.1 Terpenoid

Terpenoid là dẫn xuất chứa oxy của terpene do có các nhóm chức như hydroxyl, carbonyl, ester, carboxyl,

Hình 1.3 Cấu tạo một số hợp chất terpenoid

Terpenoid tập trung nhiều ở các bộ phận khác nhau của cây như lá, thân, hoa, quả, rễ,… Nói chung terpenoid thường có trong tinh dầu của thực vật Hầu hết các terpenoid là những hợp chất ít phân cực nên tan tốt trong các dung môi kém phân cực: ether dầu hỏa, hexane, diethyl ether, chloroform Không có phương pháp đặc trưng nào chỉ để tách riêng terpenoid ra khỏi bột mẫu vật mà phương pháp thường sử dụng là dùng dung môi hữu cơ để chiết chúng và tiếp theo dùng phương pháp sắc ký để phân lập từng chất riêng biệt

1.3.2 Steroid

Steroid là những hợp chất có bộ khung 4 vòng của cyclopenta[a]phenantren với 3 vòng 6 cạnh và 1 vòng 5 cạnh Kí hiệu chữ cái

ở các vòng và quy luật đánh số các nguyên tử trong hợp chất steroid như sau:

+ 4 vòng trong bộ khung được kí hiệu bằng các chữ cái in A, B, C, D + Các nguyên tử carbon được đánh số theo thứ tự từ vòng A→B→C→D

Hình 1.1 Bộ khung của steroid

Steroid được tách chiết từ tủy sống và mật của động vật có sừng, từ dịch thuỷ phân kiềm của sự lên men, từ dầu thực vật, mỡ động vật, từ chất thải của công nghiệp giấy, từ loài thực vật khác nhau hoặc tổng hợp từ các nguyên liệu không phải nguồn gốc thiên nhiên

1.3.3 Alkaloid

Alkaloid nhóm hợp chất hữu cơ thiên nhiên chứa nitrogen, thường có nguồn gốc thực vật Alkaloid có nhiều trong các cây họ Cà, họ Thuốc phiện, vv Alkaloid là những base yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ như muối của nitric acid, malic acid, succinic acid,…, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin; Đa số alkaloid là chất rắn, không màu, một số

ít ở thể lỏng, tan trong ethanol, không tan hoặc ít tan trong nước Việc chiết xuất alkaloid cần phải tán nhỏ dược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những dung dịch kiềm trung bình hoặc kiềm mạnh

Alkaloid gồm có alkaloid không chứa dị vòng nitrogen và alkaloid có chứa

dị vòng nitrogen (pyrrolidine, pyridine, pyperidine, quinoline, isoquinoline )

vinblastine kurchessine

Hình 1.4 Cấu tạo của một số hợp chất alkaloid

1.3.4 Flavonoid

Flavonoid (bắt nguồn từ tiếng Latin flavus nghĩa là màu vàng, màu của

flavonoid trong tự nhiên) là nhóm hợp chất phenolic đa vòng, được tìm thấy rộng rãi trong thực vật Phần lớn các flavonoid có màu vàng, một số có màu xanh, tím, đỏ và cũng có một số flavonoid lại không có màu

Flavonoid có cấu tạo cơ bản là diphenylpropane, nghĩa là 2 vòng benzene nối với nhau qua một dây có 3 nguyên tử carbon, nên thường được gọi là C6-C3-C6 Một số trường hợp flavonoid có mạch 3 nguyên tử carbon hở, đa số mạch 3 nguyên tử carbon đóng vòng tạo nên dị vòng chứa oxygen

Hình 1.5 Bộ khung của flavonoid

Không có một phương pháp chung nào để chiết xuất các hợp chất flavonoid vì chúng rất khác nhau về độ tan Các flavonoid glycoside thường dễ tan trong các dung môi phân cực Các flavonoid aglycone dễ tan trong dung

Capsaicin tách từ quả ớt Nicotine Piperine

môi kém phân cực Các dẫn xuất của flavone, flavonol có nhóm -OH tự do ở vị trí C7 tan được trong dung dịch kiềm loãng Dựa trên cơ sở này có thể chọn dung môi chiết thích hợp

Các hợp chất phenol được chia thành nhiều nhóm và gọi tên tổng quát theo

số carbon của hợp chất Ví dụ: hợp chất loại C6C1, C6C2, C6C3

Phenylpropanoid là nhóm những hợp chất có bộ khung cơ bản gồm vòng benzene liên kết trực tiếp với một dây có 3 carbon (C6C3) Hầu hết các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học

Phenylpropanoid cũng là thành phần của tinh dầu Số lượng tinh dầu loại này trong tự nhiên không nhiều và phổ biến bằng tinh dầu terpenoid nhưng chúng có giá trị kinh tế cao và có nhiều ứng dụng cho cuộc sống

Hợp chất phenol có tính phân cực từ trung bình đến mạnh, tùy theo hợp chất có mang ít hoặc nhiều nhóm -OH, -COOH… Vì vậy, muốn chiết tách các hợp chất này ra khỏi bột mẫu vật, cần sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần như benzene, diethyl ether, chloroform, EtOAc, EtOH,…

Cardenolide Bufadienolide

Cinnamoyl-galloyl-hexoside

Hình 1.7 Cấu tạo của một số hợp chất phenol

Ngoài ra, hợp chất phenol có mang nhóm -OH nên có thể dùng dung dịch kiềm loãng hoặc muối carbonate loãng để chiết chúng ra khỏi bột mẫu vật, tiếp theo acid hóa để thu được tủa Nếu hàm lượng ít không đủ cho tủa thì có thể chiết dung dịch đó bằng dung môi hữu cơ

1.4 Tổng quan một số công trình nghiên cứu liên quan đến đề tài

1.4.1 Thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt

1.4.1.1 Nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, các nghiêu cứu về thành phần hóa học của keo ong mật Apis mellifera có từ rất lâu Các nghiên cứu đã chỉ ra thành phần hóa học của keo

ong mật rất đa dạng, chứa nhiều nhóm chất như flavonoid, triterpenoid, phenolic Trong khi đó, các nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt chủ yếu bắt đầu từ thế kỷ 21 Các nhà khoa học đã quan tâm đến keo ong không ngòi đốt do sự đa dạng về loài, cũng như có sự đa dạng về mặt địa lý, thực vật

Dựa trên tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về keo ong không ngòi đốt, các nghiên cứu về thành phần hóa học keo ong không ngòi đốt được chỉ ra như sau:

Năm 2014, nghiên cứu keo ong không ngòi đốt Tetragonula carbonaria

tại Australia, nhóm tác giả đã phân lập được 6 hợp chất C-flavanone gồm

cryptostrobin (1), stroboponin (2), cryptostrobin 7-methyl ether (3), pinostrobin (4), pinocembrin (5) và 6-desmethoxymatteucinol (6) và 1 hợp chất diterpene

là abietic acid (7) 31

Nghiên cứu về keo ong không ngòi đốt Melipona fasciculata Brazil, đã

phát hiện được 11 hợp chất thuộc nhóm phenolic và tannin thủy phân, trong đó

có các dẫn xuất galloyl glucose như valoneic acid dilactone (8), hexahydroxydiphenic acid (HHDP) glucose (9) và corilagin (10)… các hợp

chất này chịu trách nhiệm cho hoạt tính chống oxy hóa của keo ong này 32

(10)

Ngoài ra, nghiên cứu keo ong không ngòi đốt Melipona orbignyi ở Brazil,

nhóm nghiên cứu đã xác định các hợp chất phenolic như benzoic acid, dihydrocinnamic acid, cinnamic … có khả năng kháng khuẩn, chống oxy hóa

và gây độc tế bào 3

Năm 2015, các nhà khoa học Thái Lan đã phân lập được hai hợp chất

α-mangostin (11) và γ- α-mangostin (12) từ keo ong không ngòi đốt Tetragonula

pagdeni 33 Một nhóm nghiên cứu khác của Bankova, nghiên cứu 2 loại keo ong

không ngòi đốt Tetragonula laeviceps và Tetrigona melanoleuca đã công bố

phát hiện ra 6 hợp chất xanthone gồm α-mangostin, γ-mangostin, mangostanin

(13), 8-deoxygartanin (14), gartanin (15), garcinone B (16) và một số triterpene

khác như dipterocarpol, 3-O-acetyl ursolic acid, ocotillone I, ocotillone II, hỗn

hợp ursolic và oleanolic acid, cabralealactone 34

Nghiên cứu keo ong không ngòi đốt Tetragonula biroi ở Philipine, nhóm

tác giả đã phân lập được 4 hợp chất flavonoids là propolin A, propolin E, propolin H và glyasperin A 35

Từ cao chiết EtOH keo ong Trigona apicalis ở Malaysia, năm 2016, các

nhà khoa học đã xác định được các hợp chất flavonoid như: myricetin (17), quercetin (18), naringin (19), hesperetin (20), kaempferol (21) và baicalein (22), hợp chất phenolic acid: Gallic acid bằng phương pháp HPLC 36

Năm 2017, H.F dos Santos và cộng sự đã nghiên cứu keo ong không ngòi

đốt Melipona orbignyi và phát hiện ra các hợp chất flavanone và flavanonol

bằng phương pháp HPLC kết hợp với phổ khối MS Có 14 chất được định danh, trong đó có aromadendrin (24), naringenin (25) đã được phát hiện ở keo ong

không ngòi đốt Melipona interrupta và Melipona seminigra 37 Ngoài ra, khi

nghiên cứu về loài Melipona quadrifasciata anthidioides nhóm nghiên cứu của

H.F dos Santos cũng phát hiện ra các hợp chất flavonoid: aromadendrin,

naringenin, methyl aromadendrin và các dẫn chất glucoside của gallic,

cinnamic acid và p-coumarinic acid trong đó có cinnamoyl-galloyl-hexoside và

coumaroyl-galloyl-hexoside 38, còn nhóm nghiên cứu của T Bonamigo đã phát hiện các hợp chất flavonoid như quercetin, luteolin và apigenin 39.

Nghiên cứu thành phần hóa học của 2 loại keo ong không ngòi đốt là

Melipona quadrifasciata và Scaptotrigona bipunctata Brazil, ngoài việc xác

định được các hợp chất flavonoid, Pasa và cộng sự đã phát hiện các alkaloids

là các hợp chất chưa từng được phát hiện từ keo ong mật, có chứa khung

piperidine như lobeline (26), lobelanidine (27), lenobanonoline (28), norlobelin (29) và norlebelanidine (30) bằng phương pháp HPLC/MS 40 Đây là nghiên cứu đầu tiên phát hiện ra alkaloid từ keo ong

(30)

Lần đầu tiên các loại keo ong không ngòi đốt ở Ấn độ được nghiên cứu về thành phần và hoạt tính, nhằm giúp thương mại hóa keo ong không ngòi đốt ở nước này Có rất nhiều các hợp chất được phân lập, trong đó có một số

flavonoid: quercetin (18), naringin (19), kaempferol (21), chrysin (31), và galangin (32) 41

Mới đây, tháng 12/2023, Rico Ramadhan và cộng sự đã phân lập được 3

hợp chất flavonoids từ keo ong Tetragonula biroi ở Indonesia là

3’-O-methyldiplacone (33), Nymphacol A (34) và 5,7,3’,4’-tetrahydroxy-6-geranyl flavonol (35) 42

1.4.1.2 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về thành phần hóa học của keo ong không ngòi đốt còn rất hạn chế

Trong các hợp chất tìm thấy ở keo ong không ngòi đốt của Việt Nam thì các hợp chất triterpenoid là nhóm hợp chất thường gặp nhất, chúng được phát hiện hay phân lập từ các loài ong không ngòi đốt khác nhau Năm 2017, các nhà khoa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh đã

nghiên cứu chiết xuất ethanol của keo ong không ngòi đốt Bến Tre Trigona Minor có hoạt tính gây độc tế bào ưu việt đối với tế bào ung thư tuyến tụy

PANC-1 ở người trong môi trường thiếu dinh dưỡng, với giá trị PC50 là 14,0 µg/mL Ngoài ra, nhóm tác giả còn phân lập được 16 triterpenoid, trong đó có

5 hợp chất lần đầu tiên phân lập được keo ong không ngòi đốt (36-40) 8

Năm 2018, nhóm tác giả của Nguyễn Xuân Hải nghiên cứu keo ong không

ngòi đốt Trigona minor từ cao chiết CHCl3 phát hiện hợp chất mới alkylphenol

(41) và từ cao chiết EtOH xác định 4 hợp chất lignan là (+)-isolariciresinol (42), 5-methoxy-(+)-isolariciresinol (43), (+)-lyoniresinol (44), và 6-(4- hydroxy-3- methoxyphenyl)-3,7-dioxabicyclo[3.3.0] octan-2-one (45)10

+ Năm 2018, công bố các kết quả ban đầu trên tạp chí Dược học, từ keo

ong không ngòi đốt Lisotrigona furva Engel ở Bình Định đã phân lập được 3

hợp chất xanthone 9-hydroxycalabaxanthone, cochinchinone I và cochinchinone J

+ Năm 2019, nhóm đã nghiên cứu mẫu keo ong không ngòi đốt

Lisotrigona cacciae thu tại Hoài Ân, Bình định và đã phân lập được 18 hợp

chất bao gồm liquiritigenin, (3R)-7,4’-dihydroxyhomoisoflavane, dihydroxy-5-methoxyhomoisoflavane; 10,11-dihydroxydracaenone C,

(3S)-7,4’-cochinchinone G, 7-geranyloxy-1,3-dihydroxyxanthone, (3S)-7,4’-cochinchinone A,

α-mangostin, garcinone B, cycloartenon, lupeol và hỗn hợp resorcinols Kết quả công bố trên tạp chí quốc tế PLoS One năm 2019 11

+ Năm 2021, bên cạnh nghiên cứu kể trên, nhóm nghiên cứu đã phân lập

được một số hợp chất từ keo ong không ngòi đốt Lisotrigona furva bao gồm

δ-tocotrienol, 3 triterpene: (13E,17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3β-ol,

hydroxypopanon, mangiferolic acid; 4 xanthone Cochinchinon A, Hydroxycalabaxanthone, Cochinchinon I, Cochinchinon J Các kết quả nghiên cứu trên đã được công bố trên tạp chí quốc tế Fitoterapia năm 202112

9-+ Mới đây, năm 2023, nhóm tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của

29 hợp chất từ 2 loài keo ong Homotrigona apicalis và Tetragonula iridipennis ở Bình Định và công bố trên 2 tạp chí Life và Natural Product

Communications13,14

1.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn của keo ong không ngòi đốt

Keo ong không ngòi đốt có tác dụng kháng khuẩn do ức chế sự tăng trưởng

và sự gia tăng vi khuẩn Tác dụng kháng khuẩn của keo ong phụ thuộc vào loài

và các thành phần của nó có thể thúc đẩy làm tăng tính thấm màng và ức chế

sự di chuyển của vi khuẩn 43

Năm 2017, nghiên cứu về chiết xuất hydroalcohol của keo ong Melipona orbignyi tại Brazil cho thấy tác dụng kháng khuẩn Khả năng kháng khuẩn là

do các hợp chất phenolic có trong keo ong có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào chất, ức chế tổng hợp các nucleic acid của vi khuẩn Gram âm và Gram dương, ức chế sự tổng hợp ATP và sự gián đoạn vận chuyển điện tử Ngoài ra, các hợp chất flavonoid trong keo ong cũng hình thành phức hợp với protein thông qua liên kết hydrogen và hoạt động kháng khuẩn của chúng có liên quan đến sự ức chế của các chất kết dính vi khuẩn, enzyme và vận chuyển protein Kết quả cho thấy, khả năng ức chế các khuẩn Gram dương nhạy cảm hơn các

chủng Gram âm, khả năng này có thể được sắp xếp: S.aureus > E faecalis > E coli >P aeruginosa > C neoformans > C albicans, trong đó nồng độ diệt khuẩn tối thiểu dao động từ 8,50 ± 0,28 mg/mL đối với khuẩn S.aureus Đây

là các chủng vi sinh vật gây ra các bệnh nhiễm trùng thông thường ở đường tiết niệu, viêm phổi, nhiễm trùng vết thương, nhiễm trùng đường tiêu hóa và nhiễm

trùng da Ngoài ra, keo ong Melipona orbignyi cũng cho thấy tác dụng chống

lại tất cả các vi sinh vật kháng thuốc kháng sinh 37

Khả năng kháng khuẩn của keo ong Tetragonisca fiebrigi Brazil cũng cho

kết quả chống lại các khuẩn Gram dương nhạy cảm hơn các khuẩn Gram âm,

cụ thể: S aureus > S cholermidis > E faecalis > P mirabilis > K pneumonia

> P aeruginosa, trong đó nồng độ diệt khuẩn tối thiểu dao động từ 1,50 ± 0,14 mg/mL đối với khuẩn S.aureus và 15,50 ± 0,29 mg/mL đối với P aeruginosa

43 Tương tự, nghiên cứu thực nghiệm chiết xuất keo ong Trigona sp ở Ấn Độ

cũng có hoạt tính kháng khuẩn đối với cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, trong đó chiết xuất keo ong được đánh giá là nhạy cảm hơn với Gram dương,

chủng vi khuẩn nhạy cảm nhất là S aureus và K pneumoniae 44

Nấm C albicans là vi sinh vật cộng sinh, sống trong niêm mạc miệng và

các vị trí giải phẫu khác Tuy nhiên, trong những trường hợp nhất định, vi sinh vật này có thể gây nhiễm trùng cơ hội cấp tính hoặc toàn thân, thường nghiêm

trọng và khó kiểm soát Keo ong không ngòi đốt Melipona fasciculata được xác định là có khả năng ức chế C albicans Vì vậy, các sản phẩm từ keo ong

không ngòi đốt này có thể sử dụng là chất hỗ trợ điều trị bệnh nấm miệng và

các nhiễm khuẩn niêm mạc miệng khác do C albicans gây ra 45

Năm 2015, nghiên cứu về keo ong không ngòi đốt Brazil Tetragonisca fiebrigi cho thấy, chiết xuất keo ong có tác dụng kháng nấm đối với C glabrata

và C albicans do sự có mặt của diterpene, triterpene, acid thơm và các hợp chất phenolic

Theo đó, nhiều hợp chất phenolic từ keo ong không ngòi đốt tại Brazil có khả năng ức chế sự tăng trưởng nấm bằng cách tương tác với huyết tương hoặc màng ti thể của nấm, keo ong điều khiển cơ chế hoại tử nấm bao gồm sự acid hóa không bào và sự thay đổi trong vận chuyển electron ty thể, dẫn đến cơ chế gây chết tế bào theo chương trình, quá trình này diễn ra kéo dài và lặp lại, kết quả là nấm bị hoại tử 43

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu được cấp đông tủ lạnh, sau đó nghiền, làm nhỏ để nghiên cứu

2.1.2 Phương pháp chiết mẫu keo ong không ngòi đốt

Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi mẫu vật Các kỹ thuật đều xoay quanh 2 phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng 29

2.1.2.1 Chiết lỏng - lỏng

Nguyên tắc căn bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng không hòa tan vào nhau Hằng số phân bố của một chất tan cho biết khả năng hòa tan của chất này đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, được biểu diễn bằng hằng số phân bố K

a b b

C

K =C

Ca là nồng độ chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng

Cb là nồng độ chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng

Mục đích của sự chiết bằng dung môi là để sơ bộ tinh chế hóa một hợp chất nào đó Nếu một chất tan X hoặc những chất tương đồng với chất X này

có hằng số phân bố lớn còn các tạp chất bản cũng như các chất khác có cấu trúc không tương đồng với X lại có hằng số phân bố nhỏ thì có thể áp dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng để cô lập chất X và các chất tương đồng với nó

2.1.2.2 Chiết rắn – lỏng

Phương pháp chiết rắn – lỏng dùng rất phổ biến trong nghiên cứu về hợp chất tự nhiên Các phương pháp chiết rắn - lỏng có thể là lắc, chiết ngấm kiệt, chiết ngâm dầm, chiết soxhlet, chiết siêu âm, microwave… Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 phương pháp:

a/ Phương pháp chiết gián đoạn (ngâm chiết)

Ngâm chiết là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật Sản phẩm thu được của quá trình ngâm chiết là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi Dung dịch này được gọi là dịch chiết Có

ba quá trình quan trọng đồng thời cùng xảy ra trong ngâm chiết là:

- Sự hòa tan của chất tan vào dung môi;

- Sự khuếch tán của chất tan trong dung môi;

- Sự dịch chuyển các phân tử chất tan qua vách tế bào keo ong

Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, thời gian, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột keo ong ) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình ngâm chiết Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại hoạt chất mà chọn cho thích hợp

Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, các hợp chất polyphenol ) thì phải sử dụng các dung môi phân cực

Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, triterpene và steroid tự do ) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực Trên thực tế, alcohol với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng Alcohol có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm, ngoài ra còn

có thể dùng các dung môi khác như methanol, acetone, dichloromethane, hexane…

b/ Phương pháp chiết bằng sóng siêu âm (gọi tắt chiết siêu âm)

Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phần

tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (16 - 20 kHz) Ngoài ra, sóng siêu âm có bản chất là sóng dọc hay sóng nén, nghĩa là trong trường siêu âm các phần tử dao động theo phương cùng với phương truyền của sóng

Thiết bị phát sóng siêu âm cũng phải gồm có 3 phần tối cần thiết sau:

Bộ phận chuyển phần lớn điện năng thành dòng điện xoay chiều tần số cao để vận hành bộ phận biến đổi

Bộ phận biến đổi chuyển dòng điện xoay chiều tần số cao thành những dao động Phần lớn thiết bị phát sóng siêu âm ngày nay sử dụng kỹ thuật áp điện Hình dạng và kích thước của bộ phận này phụ thuộc vào tần số làm việc,

bộ phận 20 kHz có chiều dài gấp đôi bộ phận 40 kHz Năng lượng qua bộ biến đổi sẽ chuyển ngược lại thành bình phương tần số dao động, vì vậy thiết bị năng lượng cao tần số thấp được chú trọng Bộ phận biến đổi nối với hệ thống truyền sóng thông qua một thiết bị phụ

Hệ thống truyền sóng sẽ truyền những dao động vào trong lòng chất lỏng Trong thiết bị phát sóng siêu âm dạng bể, bộ phận biến đổi được gắn ở đáy bể

và truyền trực tiếp dao động vào chất lỏng trong bồn Tuy nhiên, đối với thiết

bị năng lượng cao (thiết bị dạng thanh/que) dao động được khuyếch đại và truyền vào môi trường lỏng nhờ thiết bị trung gian gắn với bộ phận biến đổi Theo thời gian, đầu của bộ phận trung gian này có thể bị mòn và bị giảm chiều dài cần thiết vì vậy người ta phải lắp đầu có thể tháo gỡ được

2.1.3 Phương pháp hóa lý nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết EtOH của keo ong không ngòi đốt

Mặc dù các phương pháp xử lý có ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu suất thu cao chiết của keo ong Tuy nhiên, trong quá trình trích ly có nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết của keo ong như: Nguyên liệu, dung môi, thời gian trích ly

- Nguyên liệu

Kích thước của nguyên liệu: Độ mịn của nguyên liệu ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết Kích thước nguyên liệu càng nhỏ thì bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu với dung môi càng lớn, do đó hiệu suất thu cao chiết sẽ tăng lên

Khi nguyên liệu càng nhỏ thì quá trình thẩm thấu của dung môi vào nguyên liệu sẽ nhanh hơn Ngoài ra, với kích cỡ và hình dạng thích hợp thì quá trình chuyển động của các phân tử trong dung môi sẽ dễ dàng hơn Tuy nhiên, trong thực tế, nếu xay nguyên liệu quá mịn sẽ gây ra một số quá trình bất lợi cho quá trình chiết xuất như:

+ Khi ngâm nguyên liệu vào dung môi, bột mịn bị dính bết vào nhau, tạo thành dạng bột nhão, vón cục Do đó, sẽ khó khuấy trộn giữa nguyên liệu

và dung môi, quá trình chiết xuất xảy ra bị chậm lại Mặt khác, vì bột mịn bị dính bết vào nhau nên khi rút dịch chiết, dịch chiết bị chảy chậm hoặc không chảy được (gọi là hiện tượng tắc thiết bị)

+ Khi bột nguyên liệu quá mịn, nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp; gây khó khăn cho quá trình tinh chế, bảo quản

Vì vậy, vần lựa chọn độ mịn của dược liệu sao cho thích hợp, tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể, tùy thuộc vào nguyên liệu, dung môi, phương pháp chiết xuất,…

- Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi

Với khối lượng nguyên liệu ban đầu cố định, trong khi lượng dung môi ngày càng tăng lên, quá trình trích ly sẽ diễn ra nhanh chóng và lượng chất còn lại trong bã sẽ giảm Tuy nhiên, nếu lượng dung môi quá lớn cũng không làm tăng sự thẩm thấu của dung môi vào nguyên liệu, khi lượng dung môi đạt tới một thể tích nhất định thì hiệu suất cao chiết thu được sẽ không thay đổi, nếu tiếp tục tăng thể tích dung môi lên nữa thì chúng ta sẽ làm cho dung môi bị hao phí

hiệu suất thu cao chiết cũng không tăng đáng kể mà làm cho chúng ta tốn kém

về mặt thời gian

2.1.4 Phương pháp định tính các lớp chất có trong keo ong không ngòi đốt

Xác định được các lớp chất có thể có trong keo ong không ngòi đốt bằng phương pháp định tính, sử dụng các thuốc thử tương ứng các lớp chất

2.1.5 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất

2.1.5.1 Phương pháp phân lập

Sắc ký là phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp dựa trên sự phân bố không đồng đều của chúng giữa hai pha, một pha không chuyển động (gọi là pha tĩnh) và một pha chuyển động (gọi là pha động) 29

a/ Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)

Sắc ký bản mỏng gồm pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, pha tĩnh là chất hấp phụ (thường là siliaca gel hoặc aluminum oxide) được tráng thành lớp mỏng trên tấm nhôm hoặc kính Khi pha động chuyển động trên pha tĩnh kéo các chất di chuyển với những tốc độ khác nhau làm chúng dịch chuyển những đoạn đường khác nhau, sự khác nhau này đặc trưng bằng giá trị

Rf

* Các bước thực hiện sắc ký bản mỏng

- Sắc ký lớp mỏng được thực hiện với bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715), dày 0,25 mm, được cắt với chiều rộng thích hợp, dùng bút chì kẻ nhẹ một đường ngang cách mép dưới (tuyến xuất phát) khoảng 1cm, mép trên (tuyến dung môi) khoảng 0,2 - 0,3 cm Bản mỏng phải được sấy khô trước khi dùng

- Cho dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp vào bình triển khai sắc ký, rồi đậy kín bình, để yên cho dung môi trong bình ổn định

- Mẫu chất được pha loãng trong dung môi thích hợp, dùng mao quản nhỏ đưa chất lên bản mỏng sao cho vết chấm nhỏ và tròn ở tuyến xuất phát

- Dùng máy sấy sấy nhẹ để đuổi hết dung môi khỏi vệt chấm rồi đặt bản mỏng thẳng đứng hoặc lệch 75o so với phương nằm ngang vào bình triển khai sắc ký, chú ý sao cho dung môi trong bình triển khai nằm dưới vạch xuất phát

và đi lên đều Tiến hành triển khai sắc ký đến khi dung môi chạm đến vạch mép trên thì lấy bản mỏng ra

- Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc hiện là dung dịch cerium(IV)sulfate trong acid H2SO4, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

Hình 2.1 Mẫu sắc ký bản mỏng

Cách tính: Rf =

0

L L(1) : Tuyến dung môi; (2): Vạch xuất phát

L : là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vệt

L0 : là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tuyến dung môi

b/ Sắc ký cột (Column chromatography - CC)

Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh thường là các hạt có kích thước lớn (50 - 150 µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt ở phía trên Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần phía dưới cột, được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra cột Sắc ký cột

có ưu điểm là các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với lượng lớn mẫu chất

Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng

để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp Sau khi chọn hệ dung môi phù hợp,

có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau Dung môi để giải

ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn Bởi

vì silica gel tráng trên bản mỏng có kích cỡ nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên bằng áp lực lớn nên có độ chặt khít cao Trong khi đó, silica gel được dùng trong sắc ký cột với cỡ hạt lớn hơn lại được nạp vào ở áp suất thường nên có tính lỏng lẻo hơn

Theo dõi quá trình giải ly cột: Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu,

quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau, đang tách xa nhau ra Theo dõi các dãy màu

và hứng chúng khi được giải ly ra khỏi cột Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau

Phương pháp thông dụng nhất lấy dung dịch giải ly trong những lọ có đánh

số thứ tự Dung dịch trong những lọ hứng này sẽ được sắc ký trên cùng một bản mỏng Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn Đuổi dung môi ở áp suất thấp các phân đoạn này sẽ cho cao của phân đoạn đó

2.1.5.2 Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất phân lập

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại