NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG CỦA CAO KHÔ THĂNG THANH GIÁNG TRỌC TRÊN MÔ HÌNH BỆNH THẬN MẠN CẮT 5/6 THẬN CHUỘT

NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG CỦA CAO KHÔ THĂNG THANH GIÁNG TRỌC TRÊN MÔ HÌNH BỆNH THẬN MẠN CẮT 5/6 THẬN CHUỘT NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG CỦA CAO KHÔ THĂNG THANH GIÁNG TRỌC TRÊN MÔ HÌNH BỆNH THẬN MẠN CẮT 5/6 THẬN CHUỘT NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG CỦA CAO KHÔ THĂNG THANH GIÁNG TRỌC TRÊN MÔ HÌNH BỆNH THẬN MẠN CẮT 5/6 THẬN CHUỘT NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG CỦA CAO KHÔ THĂNG THANH GIÁNG TRỌC TRÊN MÔ HÌNH BỆNH THẬN MẠN CẮT 5/6 THẬN CHUỘT NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG CỦA CAO KHÔ THĂNG THANH GIÁNG TRỌC TRÊN MÔ HÌNH BỆNH THẬN MẠN CẮT 5/6 THẬN CHUỘT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ HỌC VIỆN Y DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN VIỆT NAM NGUYỄN THỊ DIỆU LINH NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG CỦA CAO KHÔ “THĂNG THANH GIÁNG TRỌC” TRÊN MÔ HÌNH BỆNH T

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chất liệu nghiên cứu

2.1.1 Công thức cao khô “thăng thanh giáng trọc”

Bảng 2.1 Thành phần bài thuốc “thăng thanh giáng trọc”

STT Tên vị thuốc Tên khoa học [50], [51] Hàm lƣợng (g)

1 Thổ phục linh Rhizoma Smilacis glabrae 10g

2 Đan sâm Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae 10g

4 Hoa hoè Flos Styphnolobii japonici imaturi 10g

5 Hoàng kỳ Radix Astragali membranacei 10g

6 Rau má Herba Centellae asiaticae 10g

7 Cốt khí Radix Polygoni cuspidati 10g

8 Bán hạ (chế) Rhizoma Pinelliae 5g

9 Trần bì Pericarpium Citri reticulatae perenne 5g

10 Trúc nhự Caulis Bambusae in Taeniis 5g

14 Ngưu tất Radix Achyranthis bidentatae 5g ng 105 g

Chất liệu nghiên cứu là cao khô “thăng thanh giáng trọc” do Viện nghiên cứu

Y Dược Bách Thảo Dược sản xuất từ bài thuốc “thăng thanh giáng trọc”, với các dược liệu đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V và tiêu chuẩn cơ sở Thành phần của bài thuốc này được trình bày chi tiết trong bảng 2.1.

Tỷ lệ bào chế cao khô “thăng thanh giáng trọc” là 10:1, nghĩa là từ 10g dược liệu khô sẽ tạo ra 1g cao khô Với tổng 105g dược liệu khô, bài thuốc này sẽ bào chế ra 10,5g cao khô.

Quy cách đóng gói: 10kg trong 2 lần túi PE (thêm túi nhôm hàn kín)

Liều dùng trên lâm sàng: 2 ngày/thang

Hạn d ng của thuốc: 6 tháng kể từ ngày sản xuất

Tiêu chuẩn chất lượng thuốc bao gồm tiêu chuẩn cơ sở và tiêu chuẩn dược điển Việt Nam Để đảm bảo hiệu quả và an toàn, thuốc cần được bảo quản trong bao bì kín, ở nơi khô ráo và nhiệt độ không vượt quá 30℃.

2.1.2 Quy ƣớc tính liều cho động vật nghiên cứu

Theo kinh nghiệm lâm sàng, bài thuốc được áp dụng cho bệnh nhân trong 2 ngày với liều cao khô 10,5g Liều sử dụng dự kiến là 5,25g/người/ngày, tương đương 0,105g/kg/ngày Quy đổi ra liều tác dụng cho chuột nhắt trắng là 1,26g/kg/ngày và cho chuột cống trắng là 0,735g/kg/24h Cao khô "thăng thanh giáng trọc" được hòa tan trong nước cất thành hỗn dịch và được cho chuột uống qua kim cong đầu chuyên dụng.

Động vật nghiên cứu

Nghiên cứu độc tính cấp đã được thực hiện trên chuột nhắt trắng chủng Swiss, bao gồm cả hai giống, với trọng lượng từ 18 đến 22g, được nuôi trong điều kiện thí nghiệm trong vòng 7 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu.

Các chuột thí nghiệm được cung cấp bởi Ban động vật – Học viện Quân y, bao gồm những con khỏe mạnh với lông mượt, mắt trong, hậu môn khô, và hoạt động bình thường Động vật được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn về ánh sáng (12 giờ sáng/12 giờ tối), nhiệt độ 25 ± 2 o C, với thức ăn chuyên dụng cho nghiên cứu và nước sạch đã đun sôi để nguội Trước khi tiến hành nghiên cứu, các chuột được nuôi dưỡng ổn định trong phòng thí nghiệm ít nhất 1 tuần.

2.2.2 Tác dụng của cao khô “thăng thanh giáng trọc”

Nghiên cứu tác dụng của cao khô “thăng thanh giáng trọc” được tiến hành trên chuột cống trắng chủng Wistar, giống đực, trưởng thành, khoẻ mạnh, trọng lượng từ 200 – 250g

Các chuột thí nghiệm được cung cấp bởi Ban động vật - Học viện Quân y, bao gồm những con chuột khỏe mạnh với lông mượt, mắt trong, hậu môn khô, và hoạt động bình thường Chúng được nuôi dưỡng trong điều kiện tiêu chuẩn với thời gian sáng tối 12 giờ, nhiệt độ 25 ± 2 độ C, thức ăn chuyên dụng cho động vật nghiên cứu, và nước sạch được đun sôi để nguội Các động vật này được ổn định trong phòng nuôi ít nhất một tuần trước khi tiến hành nghiên cứu.

2.3 Phương tiện máy móc, hoá chất nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.3.1 Thuốc và hoá chất dùng trong nghiên cứu

- Natri pentobarbital: Thuốc để gây mê chuột

- Các hóa chất x t nghiệm sinh hóa của hãng MEDIA, sản xuất tại Italia

- Hóa chất x t nghiệm huyết học của hãng Human, Đức

- Heparin Injection BP 5000IU/ml (Sintez Joint Stock Company, Nga): Thuốc chống đông máu để bảo quản máu xét nghiệm

2.3.2 Máy móc và dụng cụ phục vụ nghiên cứu

- Máy x t nghiệm sinh hoá Biochemical Systems International Srl, Italia, model 3000 Evolution

- Máy phân tích huyết học Humancout 30TS, hãng Human, Đức, sử dụng phần mềm phân tích huyết học dành cho chuột thí nghiệm

- Máy ly tâm lạnh Universal 320 (Hettich - Đức)

- Cân phân tích 10 -4 , model CP224S (Sartorius - Đức)

- Cân điện tử 2200g độ chính xác 0,01g (HL-Nhật Bản)

Hệ thống Powerlab của ADInstruments (Úc) sử dụng phần mềm LabChart phiên bản 8.0.0 và các thiết bị ngoại vi để đo huyết áp chuột thông qua phương pháp quấn đuôi, bao gồm bao áp lực, đầu đo huyết áp và bộ khuếch đại ML 125 NIBP.

- Tủ sưởi được kiểm soát nhiệt độ để làm ấm động vật (Ugo Basille, )

Kim cong đầu tù chuyên dụng cho chuột uống thuốc tại Nhật Bản có hai loại: một loại dành cho chuột cống với ống cho ăn 16 gauge, dài 7,62 cm, và một loại dành cho chuột nhắt với ống cho ăn 20 gauge, dài 3,81 cm.

- Ống mao quản thủy tinh d ng để lấy máu chuột ((Brand Micro-haematocrit Capillary Tubes, đường kính trong 1.15 0.05 mm, đường kính ngoài khoảng 1,5 mm)

- Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ

- Các thiết bị làm tiêu bản mô bệnh học

- Một số thiết bị và dụng cụ nghiên cứu khác

Hình 2.1 áy xét nghiệm sinh hoá Hình 2.2 Cân điện t

Hình 2.3 Kim cong đầu t Hình 2.4 Máy xét nghiệm huyết học

2.3.3 Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

2.3.3.1 Phương pháp đo huyết áp, nhịp tim chuột

Hình 2.5 Đo huyết áp đuôi chuột bằng hệ thống Powerlab cùng các thiết bị ngoại vi

Tiến hành đo huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương ở chuột bằng hệ thống đo huyết áp đuôi chuột không xâm lấn Chuột được hạn chế vận động trong 10 - 20 phút/ngày trong 5 ngày trước khi ghi huyết áp để làm quen với điều kiện đo Kỹ thuật quấn đuôi (tail-cuff technique) được sử dụng để ghi huyết áp ở gốc đuôi chuột Để phát hiện tốt hơn xung động mạch, chuột được sưởi ấm trong 30 phút ở 28°C Thiết bị đo huyết áp được đặt chính xác tại gốc đuôi, cách bao áp lực 2 cm Để giảm thiểu căng thẳng, tất cả các phép đo được thực hiện bởi cùng một người trong môi trường yên tĩnh và vào cùng một thời điểm trong ngày Kết quả huyết áp được ghi lại và phân tích bằng hệ thống Powerlab và phần mềm Labchart Pro, hiển thị diễn biến nhịp mạch và huyết áp theo thời gian Huyết áp được xác định trong khoảng thời gian bơm và xả hơi tại vòng bít đuôi chuột.

Chuột được sưởi ấm trong tủ sưởi

Ugo Basille đã cải tiến phương pháp phát hiện xung động mạch đuôi bằng cách sử dụng cảm biến vòng bít kết nối với bộ khuếch đại ML 125 NIBP Kỹ thuật quấn đuôi (tail-cuff technique) được áp dụng để đo huyết áp chuột, sử dụng hệ thống đo huyết áp không xâm lấn của ADInstrument (New Zealand) Huyết áp tối đa được xác định tại thời điểm bắt đầu mất nhịp mạch, trong khi huyết áp tối thiểu được xác định khi mạch nhịp trở lại.

Huyết áp trung bình của chuột theo công thức [54]:

HA trung bình = HA tâm trương + 0,412 (HA tâm thu - HA tâm trương)

2.3.3.2 Cách lấy nước tiểu đánh giá

Thể tích nước tiểu được đo lường tại hai thời điểm quan trọng: To (trước khi uống thuốc) và Tc (sau khi uống thuốc vào ngày cuối), vào lúc 7h30 sáng Trong ngày đánh giá, mỗi con chuột được đặt vào một chuồng riêng biệt có khay hứng để thu thập nước tiểu vào một cốc.

2.3.3.3 Kỹ thuật cho chuột uống cưỡng bức

Mẫu thử được chuẩn bị bằng cách sử dụng bơm tiêm chuyên dụng của Nhật Bản, bao gồm xilanh và kim đầu tù, phù hợp cho việc cho uống thuốc cho chuột nhắt hoặc chuột cống, tùy thuộc vào loại động vật cần điều trị.

Để bắt chuột ra khỏi chuồng, hãy dùng tay phải nắm đuôi chuột một cách nhẹ nhàng và đặt chuột lên vỉ lưới Kéo nhẹ chuột về phía sau để chuột bám vào vỉ lưới Sử dụng ngón trỏ và ngón cái của tay trái để nắm da gáy gần đầu chuột, đồng thời ôm nhẹ thân chuột và kẹp đuôi chuột giữa các ngón tay còn lại để cố định chuột.

Để cho chuột uống thuốc, bạn cần cầm bơm tiêm một cách nhẹ nhàng, đưa kim vào miệng và đẩy sâu khoảng 2/3 chiều dài kim vào dạ dày Sau đó, bơm mẫu thử vào dạ dày chuột theo liều lượng đã xác định.

2.3.3.4 Kỹ thuật lấy mẫu máu

Để bắt chuột ra khỏi chuồng, bạn cần dùng tay phải nắm chắc đuôi chuột và nhẹ nhàng đặt chuột lên vỉ lưới Kéo nhẹ chuột về phía sau để nó bám vào vỉ lưới Sử dụng ngón trỏ và ngón cái của tay trái để tóm da gáy sát phía đầu chuột, đồng thời ôm nhẹ thân chuột và kẹp đuôi chuột vào giữa các ngón tay còn lại để cố định chuột.

- Chuột được gây mê ngắn bằng Ketamin 90 mg/ml/kg tiêm phúc mạc

Ngón giữa tay phải nhẹ nhàng đẩy để làm căng da quanh mắt, trong khi ngón trỏ và ngón cái cùng tay đó giữ ống mao quản thủy tinh Sau đó, ống mao quản được đâm qua da ngay dưới mắt, vào vị trí đám rối mạch dưới mắt với góc chếch 30 độ so với mũi.

Để lấy máu, hãy nhẹ nhàng ấn ngón tay cái vào vị trí tổ chức mô dưới mắt cho đến khi đâm thủng Giữ chắc chuột và ống lấy máu, máu sẽ chảy qua ống mao dẫn thủy tinh vào ống lấy máu.

Sau khi thu thập đủ lượng máu cần thiết, ống mao dẫn sẽ được rút ra nhanh chóng Tiếp theo, cần ấn nhẹ vào vùng lấy máu để cầm máu và sát khuẩn nhẹ nhàng bằng bông cồn vô khuẩn để đảm bảo vệ sinh.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ tháng 04/2024 đến tháng 10/2024

Bộ môn Dược lý, Viện Đào tạo Dược, Học viện quân y

Khoa giải phẫu bệnh và pháp y, Bệnh viện Quân y 103.

Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp của cao khô “thăng thanh giáng trọc”

Nghiên cứu xác định LD 50 của cao khô “thăng thanh giáng trọc” trên chuột nhắt trắng thông qua phương pháp Litchfield-Wilcoxon, tuân thủ theo hướng dẫn của Bộ Y tế và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).

2.5.1.1 Thăm dò liều ban đầu

Nghiên cứu sử dụng chuột nhắt trắng chủng Swiss 03 với trọng lượng 20,0 ± 2,0g, được cho uống cao khô “thăng thanh giáng trọc” ở các liều 3,0g/kg, 6,0g/kg và 12,0g/kg, mỗi liều với thể tích 0,2mL/10g/lần, thực hiện 3 lần Trước khi uống thuốc, chuột được nhịn ăn trong 12 giờ nhưng vẫn được cung cấp nước đầy đủ Tình trạng của chuột được đánh giá trong vòng 72 giờ và 7 ngày sau khi uống mẫu thử để xác định các liều thử nghiệm chính thức.

Chuột nhắt trắng chủng Swiss được chia thành 5 lô, mỗi lô gồm 10 con, và được cho uống cao khô “thăng thanh giáng trọc” với liều lượng 0.2ml/10g thể trọng/lần, tối đa 3 lần trong 24 giờ, cách nhau ít nhất 3 giờ Thời gian uống thuốc thường là vào lúc 8 giờ, 11 giờ và 14 giờ trong ngày, và chuột được nhịn ăn 12 giờ trước khi uống nhưng vẫn được cung cấp nước đầy đủ Tình trạng sức khỏe của chuột được đánh giá trong 72 giờ và sau 7 ngày kể từ khi uống mẫu thử.

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng của cao khô “thăng thanh giáng trọc”

2.5.2.1 Phương pháp gây mô hình bệnh thận mạn trên chuột

Tiến hành gây mô hình bệnh thận mạn tính trên chuột cống trắng theo phương pháp mô tả bởi Lu, J R và cộng sự (2014), có sửa đổi [55]

Chuột được tiến hành phẫu thuật trong điều kiện vô tr ng Quá trình phẫu thuật được tiến hành thành 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Cắt bỏ 2/3 thận trái

Chuột được gây mê bằng natri pentobarbital với liều 50 mg/kg trọng lượng cơ thể, sau đó được đặt nằm nghiêng trên bàn mổ có đệm ấm Vùng mổ được cạo lông và sát trùng bằng dung dịch betadine 10% Tiến hành rạch da theo đường chéo song song với xương sườn bên trái, bóc tách cân cơ và tổ chức liên kết để bộc lộ thận trái Cẩn thận tránh chạm vào tuyến thượng thận, một sợi chỉ chờ 4,0 được đặt dưới động mạch thận Sử dụng nũng kim luồn (400 âm) để thắt tạm thời động mạch thận, sau đó cắt bỏ 1/3 cực trên và 1/3 cực dưới của thận trái bằng dao điện Sau khi kiểm soát chảy máu, vùng mổ được rửa sạch và khâu lại theo lớp Cuối cùng, chuột được đưa vào chuồng ủ ấm và theo dõi cho đến khi tỉnh táo trở lại.

Giai đoạn 2: Cắt bỏ toàn bộ thận phải

Sau 15 ngày hồi phục từ ca mổ cắt bỏ 2/3 thận trái, chuột đã sẵn sàng cho phẫu thuật cắt bỏ toàn bộ thận phải Quá trình bắt đầu bằng việc gây mê cho chuột, sát trùng vùng phẫu thuật, và rạch da theo đường chéo song song với xương sườn bên phải để bộc lộ thận phải ra khỏi bao xơ thận, tương tự như phương pháp thực hiện ở giai đoạn trước.

1 Sau đó, bộc lộ và luồn sợi chỉ 4,0 qua cuống thận bằng dụng cụ tự tạo Tiến hành thắt chặt cuống thận bao gồm cả động mạch, tĩnh mạch thận và niệu quản Cuối cùng thận phải được cắt bỏ bằng phương pháp cắt ngang các mạch máu và niệu quản ngay sát thận, xa chỗ thắt chỉ Khâu tổ chức liên kết, cân cơ thành bụng, lưng theo lớp; khâu da và sát trùng tại chỗ bằng dung dịch betadine 10% Sau phẫu thuật, chuột được đưa vào chuồng ủ ấm và theo dõi sau mổ đến khi động vật tỉnh táo trở lại Sau mổ 7 ngày, chuột có thể đưa trở lại nuôi chung với các chuột khác trong nhóm

Các chuột được tiến hành phẫu thuật giai đoạn 1 và 2 tương tự như phẫu thuật gây mô hình, nhưng chỉ dừng lại ở bước bóc tách cân cơ và tổ chức liên kết để bộc lộ thận mà không làm tổn thương nhu mô thận Sau đó, các bác sĩ khâu lại tổ chức liên kết, cân cơ thành bụng và lưng theo lớp, sau đó khâu da và sát trùng bằng dung dịch betadine 10% Phản ứng thích nghi với việc cắt bỏ thận dẫn đến phần thận còn lại phì đại, gia tăng lọc cầu thận, và theo thời gian có thể tiến triển thành protein niệu, tăng ure, creatinin máu, tăng huyết áp, cùng với xơ hóa thận, xơ cứng cầu thận và sẹo ống kẽ thận.

Tiêu chuẩn xác định chuột đã mắc bệnh thận mạn sau phẫu thuật giai đoạn 2 được đánh giá 15 ngày sau phẫu thuật bao gồm: chuột sống, vết mổ khô và liền sẹo tốt, cùng với ít nhất một trong các biểu hiện của suy chức năng thận như ure máu, creatinin máu, hoặc protein niệu 24h tăng trên hoặc bằng 1,5 lần so với mức trước phẫu thuật.

2.5.2.2 Phương pháp nghiên cứu tác dụng của cao khô “thăng thanh giáng trọc” trên mô hình bệnh thận mạn ở chuột

Nghiên cứu bao gồm 50 con chuột, được chia thành 5 lô, mỗi lô gồm 10 con Trong đó, 10 con chuột chứng phẫu thuật được đưa vào lô chứng PT, còn 40 con chuột gây mô hình bệnh thận mạn được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10 con.

Lô 1 (chứng PT): PT không cắt thận + uống nước cất

Lô 2 (mô hình): PT cắt 5/6 thận + uống nước cất

Lô 3 (tham chiếu): PT cắt 5/6 thận + uống enalapril liều 10mg/kg/ngày

Lô 4 (TTGT-1): PT cắt 5/6 thận + uống TTGT liều 0,735 g/kg/24h

Lô 5 (TTGT-2): PT cắt 5/6 thận + uống TTGT liều 1,47 g/kg/24h

Trong nghiên cứu này, các lô chuột được chia thành các nhóm để uống mẫu thử, thuốc tham chiếu hoặc nước cất trong vòng 60 ngày Mục tiêu là đánh giá tác dụng của cao khô “thăng thanh giáng trọc”.

Chỉ tiêu quan sát

2.6.1 Chỉ tiêu quan sát độc tính cấp của cao khô “thăng thanh giáng trọc”

Thông qua các triệu chứng bất thường xảy ra ngay sau khi uống thuốc trong vòng 72 giờ:

- Tình trạng chung của chuột: Hoạt động, vận động, thần kinh thực vật, tình trạng hô hấp, ăn uống, chất thải

- Quá trình diễn biến bắt đầu và có dấu hiệu nhiễm độc (như nôn, co giật, kích động, bài tiết…)

- Khả năng, thời gian hồi phục và số lượng chuột chết

Quan sát các biểu hiện nhiễm độc muộn và khả năng hồi phục là rất quan trọng Tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống cao khô “thăng thanh giáng trọc” Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được thực hiện tương tự như trong giai đoạn trước đó.

2.6.2 Chỉ tiêu quan sát tác dụng của cao khô “thăng thanh giáng trọc”

Tình trạng chung của chuột: Biểu hiện lông, hoạt động, ăn uống và các dấu hiệu bất thường được theo dõi hàng ngày

Tỷ lệ chuột sống/chết

Chỉ số huyết áp chuột

Chỉ số công thức máu: Số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, hematocrit

Chỉ số sinh hoá máu: Ure, creatinine huyết thanh

Chỉ số xét nghiệm nước tiểu: Số lượng nước tiểu 24h, protein niệu

Chỉ tiêu cân nặng thận chuột, mô bệnh học thận chuột.

Chỉ tiêu đánh giá kết quả

2.7.1 Chỉ tiêu đánh giá kết quả độc tính cấp của cao khô “thăng thanh giáng trọc”

Tất cả chuột chết sẽ được mổ để đánh giá tổn thương và xác định nguyên nhân gây độc Mục tiêu là tìm liều cao nhất không gây chết chuột, liều thấp nhất gây chết 100% chuột, cùng với các liều trung gian và số chuột chết ở các liều này Dựa vào dữ liệu thu thập được, một đồ thị tuyến tính sẽ được xây dựng (sử dụng giấy probit hoặc phần mềm Excel) để xác định LD 50 của mẫu thử.

Nếu không có chuột chết, xác định liều dung nạp tối đa của chuột

2.7.2 Chỉ tiêu đánh giá tác dụng của cao khô “thăng thanh giáng trọc”

Cân nặng của chuột được ghi nhận ngay sau phẫu thuật giai đoạn hai, sau đó vào 15 ngày và 60 ngày sau khi uống thuốc Việc cân chuột được thực hiện bằng cân chính xác với độ chính xác 10^-2 g.

The evaluation of kidney function was conducted through blood urea, serum creatinine, and 24-hour urine protein tests using Biochemical Systems International Srl's biochemical analyzer The 24-hour urine volume was measured with a 25ml burette, with precision to 0.01ml Assessments were performed at three key time points: prior to surgery, 15 days after the second surgery, and 60 days post-medication.

Huyết áp tối đa và huyết áp tối thiểu được đo bằng Hệ thống Powerlab (ADInstruments – Australia) kết hợp với thiết bị đo huyết áp đuôi chuột không xâm lấn từ ADInstrument (New Zealand) và phần mềm LabChart v8.0.0 Các chỉ số này được đánh giá tại ba thời điểm: trước phẫu thuật, 15 ngày sau phẫu thuật lần 2 và sau khi uống thuốc 60 ngày.

Số lượng hồng cầu, huyết sắc tố và hematocrit được đo bằng máy xét nghiệm huyết học Humancout 30TS của hãng Human, Đức, với phần mềm phân tích huyết học dành cho chuột thí nghiệm Đánh giá được thực hiện sau 60 ngày sử dụng thuốc.

Sau 60 ngày sử dụng thuốc và nước cất, tất cả các chuột được mổ lấy thận để đánh giá cân nặng thận 30% số chuột được tiến hành làm tiêu bản mô bệnh học Thận chuột được cố định trong formalin 10%, trải qua các bước khử nước bằng ethanol và acetone, sau đó được đúc parafin Tiêu bản được cắt dày 4µm, nhuộm hematoxylin-eosin (HE) và quan sát dưới kính hiển vi để đánh giá tổn thương mô bệnh học thận.

Xử lý số liệu

Các số liệu trong nghiên cứu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (Mean ± SD) Phân tích so sánh thống kê được thực hiện bằng phương pháp test T-student thông qua phần mềm SPSS 20.0 Sự khác biệt giữa các nhóm được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

Sai số và biện pháp khắc phục sai số

Các phương pháp được sử dụng nhằm giảm thiểu sai số trong quá trình thu thập, phân tích và xử lý dữ liệu bao gồm việc áp dụng các kỹ thuật kiểm tra chất lượng dữ liệu, sử dụng phần mềm phân tích đáng tin cậy và thực hiện các quy trình chuẩn hóa Những biện pháp này giúp đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của thông tin thu thập được.

- Động vật nghiên cứu được lựa chọn tương đối đồng đều, khỏe mạnh, không có dị tật hay dấu hiệu bất thường

- Thời gian thực hiện các bước thí nghiệm giữa các lô chuột là thống nhất cùng một thời điểm

Dữ liệu được thu thập một cách chính xác và cẩn thận thông qua các thiết bị và máy móc tại phòng thí nghiệm được chuẩn hóa, đảm bảo độ chính xác cao.

- Xử lý số liệu bằng phần mềm chuyên dụng trên máy tính Lưu trữ số liệu, thông tin bằng sổ ghi chép, chụp ảnh.

Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu được thông qua Hội đồng bảo vệ đề cương Học viện Y Duợc học cổ truyền Việt Nam

Nghiên cứu được triển khai theo đúng đề cương đã được phê duyệt

Nghiên cứu được tiến hành trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng, với số lượng động vật trong các thí nghiệm được giới hạn ở mức tối thiểu, nhằm đảm bảo độ tin cậy của kết quả và khả năng xử lý thống kê Chúng tôi cam kết tính trung thực trong việc xử lý số liệu.

Những chuột chết trong quá trình làm thí nghiệm (nếu có) và số chuột sau khi thí nghiệm hoàn thành đều được xử lý theo đúng quy định

Việc lựa chọn động vật thí nghiệm, cũng như điều kiện nuôi dưỡng và chăm sóc, phải tuân thủ nghiêm ngặt theo “Hướng dẫn nội dung cơ bản thẩm định kết quả nghiên cứu tiền lâm sàng thuốc tân dược, thuốc cổ truyền, vắc xin và sinh phẩm y tế” do Bộ Y tế ban hành.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của cao khô “thăng thanh giáng trọc”

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá th nghiệm thăm dò liều ban đầu

Kết quả theo dõi trong 72 giờ đầu

Kết quả theo dõi từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7

Chuột 1 3,0 Sau uống thuốc chuột giảm vận động, ăn uống, sau khoảng 6-8h chuột nhanh chóng trở về trạng thái bình thường, đi ngoài phân bình thường, không có chuột nào chết cũng như có biểu hiện độc tính

Các chuột hoạt động, vận động bình thường, đi ngoài phân bình thường, không có chuột nào chết cũng như có biểu hiện độc tính

Bảng 3.1 cho thấy, khi chuột được uống cao khô “thăng thanh giáng trọc” với liều lượng 3,0g/kg, 6,0g/kg và 12,0g/kg (0,2mL/10g/lần x 3 lần, tức 60mL/kg), chúng có biểu hiện giảm vận động và ăn uống Tuy nhiên, sau khoảng 6 - 8 giờ, chuột nhanh chóng trở lại trạng thái bình thường, đi ngoài phân bình thường, và không có trường hợp nào tử vong hoặc biểu hiện độc tính.

72h sau uống thuốc, không có chuột thí nghiệm nào bị chết

Sau 7 ngày uống thuốc cho thấy các chuột hoạt động, vận động bình thường, đi ngoài phân bình thường, không có chuột nào chết cũng như có biểu hiện độc tính

Chưa ghi nhận biểu hiện độc tính ở chuột với các mức liều uống đã thử nghiệm Do đó, liều thử chính thức được xác định ở các mức tương đương hoặc cao hơn so với liều đã sử dụng trong các thử nghiệm thăm dò trước đó.

3.1.2 Kết quả thử nghiệm độc tính cấp

Thử nghiệm chính thức được tiến hành trên 5 lô chuột, mỗi lô gồm 10 con, với các mức liều mẫu thử là 6g, 12g, 18g, 24g và 30g Chuột được cho uống với thể tích 0,2ml/10g mỗi lần, thực hiện 10 lần.

3.1.2.1 Kết quả lên tình trạng chung của chuột

Tiến hành theo dõi liên tục và đánh giá tình trạng chuột sau khi uống mẫu thử, chú trọng vào các biểu hiện nhiễm độc sớm như tình trạng chung, diễn biến và dấu hiệu nhiễm độc, khả năng hồi phục, cũng như số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ Đồng thời, tiếp tục theo dõi đến hết ngày thứ 7 sau khi uống để đánh giá các biểu hiện nhiễm độc muộn và khả năng hồi phục của chuột.

Bảng 3.2 Kết quả về tình trạng hoạt động, vận động của chuột

Liều dùng (g/kg thể trọng)

Tình trạng hoạt động, vận động bình thường sau 72 giờ

Tình trạng hoạt động, vận động bình thương sau 7 ngày

Sau 72 giờ, tất cả chuột trong các lô đều hoạt động bình thường, không có dấu hiệu kích thích hay ức chế thần kinh, và không có biểu hiện tổn thương thần kinh vận động Sau 7 ngày, tình trạng này tiếp tục duy trì, với tất cả chuột vẫn hoạt động bình thường, không có dấu hiệu bất thường nào liên quan đến thần kinh.

Bảng 3.3 Kết quả về ảnh hưởng tới thần kinh thực vật

Liều dùng (g/kg thể trọng)

Tình trạng thần kinh thực vật bình thường sau 72 giờ

Tình trạng thần kinh thực vật bình thường sau 7 ngày

Sau 72 giờ và 7 ngày thử nghiệm, tất cả các lô chuột không cho thấy dấu hiệu ảnh hưởng của chế phẩm lên hệ thần kinh thực vật Không có chuột nào gặp tình trạng ra mồ hôi hay khô đỏ da, và đồng tử mắt của chúng vẫn bình thường, không có biểu hiện co hoặc giãn.

Bảng 3.4 Kết quả về ảnh hưởng tới tình trạng hô hấp

Liều dùng (g/kg thể trọng)

Tình trạng hô hấp bình thường sau

Tình trạng hô hấp bình thường sau

Sau 72 giờ, tất cả các lô chuột đều có tình trạng hô hấp bình thường, không ghi nhận biểu hiện khó thở, tím tái hay ho Đến ngày thứ 7, tình trạng hô hấp của tất cả các lô chuột vẫn duy trì bình thường, không xuất hiện dấu hiệu bất thường nào.

Bảng 3.5 Kết quả về ảnh hưởng tới tình trạng ăn uống của chuột

Liều dùng (g/kg thể trọng)

Tình trạng ăn uống bình thường sau 72 giờ

Tình trạng ăn uống bình thường sau 7 ngày

Sau 72 giờ, tất cả các chuột ở các lô đều ăn uống bình thường mà không có dấu hiệu bỏ ăn hay tăng cường ăn uống Sau 7 ngày, tình trạng ăn uống của chuột vẫn duy trì ổn định, không có biểu hiện bất thường nào về việc bỏ ăn hoặc tăng lượng thức ăn.

Bảng 3.6 Kết quả về ảnh hưởng tới tình trạng chất thải của chuột

Liều dùng (g/kg thể trọng)

Tình trạng chất thải bình thường sau 72 giờ

Tình trạng chất thải bình thường sau 7 ngày

Sau 72 giờ, các chuột cho thấy tình trạng đi ngoài phân khuôn với màu sắc bình thường và hậu môn khô, không có dấu hiệu tấy đỏ Sau 7 ngày, tình trạng này vẫn tiếp tục, với phân khuôn bình thường và hậu môn vẫn khô, không có dấu hiệu viêm nhiễm.

Bảng 3.7 Kết quả về đánh giá những biểu hiện bất thường khác

Liều dùng (g/kg thể trọng)

Không có biểu hiện bất thường gì khác sau

Không có biểu hiện bất thường gì khác sau

Sau 72 giờ, tất cả các chuột trong các lô thí nghiệm không có biểu hiện bất thường nào, như đau quặn bụng hay ngứa Đến ngày thứ 7, tình trạng của chuột vẫn ổn định, không ghi nhận thêm triệu chứng bất thường nào khác.

* Kết quả theo dõi, đánh giá số chuột chết ở mỗi lô sau khi uống mẫu th

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.8

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá số chuột chết ở mỗi lô sau khi uống mẫu th

Liều dùng (g/kg thể trọng)

Số chuột sống/chết sau 72 giờ

Số chuột sống/chết sau 7 ngày

Bảng 3.8 cho thấy, việc cho chuột uống cao khô “thăng thanh giáng trọc” với các liều từ 6,0g/kg đến 30,0g/kg thể trọng (0,2mL/10g/lần × 3 lần, tức 60mL/kg) không gây tử vong sau 72 giờ Liều 30,0g/kg là mức tối đa cho phép pha chế mẫu thử để chuột uống Sau 7 ngày, tất cả chuột vẫn hoạt động, ăn uống bình thường và không có dấu hiệu tử vong.

Chuột đã được cho uống liều cao gấp 23,6 lần liều dự kiến mà không có trường hợp nào chết hay biểu hiện độc tính Điều này khẳng định cao khô “thăng thanh giáng trọc” an toàn trong thử nghiệm độc tính cấp.

Kết quả nghiên cứu tác dụng của cao khô “thăng thanh giáng trọc” trên mô hình bệnh thận mạn cắt 5/6 thận chuột

mô hình bệnh thận mạn cắt 5/6 thận chuột

3.2.1 Kết quả đánh giá tình trạng chung và c n n ng của chuột

Kết quả đánh giá cho thấy chuột ở các lô phẫu thuật mô hình có dấu hiệu xơ lông và lông sạm màu, đồng thời hoạt động và ăn uống giảm sút theo thời gian Trong khi đó, tình trạng chung của chuột ở các lô tham chiếu (dùng enalapril) và các lô dùng thuốc điều trị khác có sự cải thiện rõ rệt, với ít xơ lông hơn và hoạt động cùng ăn uống tốt hơn so với lô mô hình.

Kết quả đánh giá cân nặng của chuột được trình bày ở bảng 3.9

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của cao khô “thăng thanh giáng trọc” lên cân nặng chuột

Sau uống thuốc 60 ngày (c) Chứng PT

Sau phẫu thuật lần 2, trọng lượng chuột ở nhóm chứng PT là 198,08 ± 18,92, cao hơn so với nhóm mô hình có trọng lượng 196,36 ± 19,05, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Tương tự, trọng lượng chuột ở nhóm tham chiếu là 191,82 ± 18,62, nhóm TTGT-1 là 195,16 ± 17,63, và nhóm TTGT-2 là 193,95 ± 20,06, đều thấp hơn nhóm chứng PT, nhưng cũng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

Trọng lượng chuột trong nhóm tham chiếu là 191,82 ± 18,62, trong khi nhóm TTGT-1 có trọng lượng 195,16 ± 17,63 và nhóm TTGT-2 là 193,95 ± 20,06 Mặc dù nhóm mô hình có trọng lượng 196,36 ± 19,05, sự khác biệt giữa các nhóm không đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Nhóm TTGT-1 nặng hơn nhóm tham chiếu, nhưng sự khác biệt này cũng không có ý nghĩa thống kê Nhóm TTGT-2 có trọng lượng nhỏ hơn nhóm TTGT-1, nhưng sự khác biệt này vẫn không đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

Kết quả cho thấy tại thời điểm ban đầu, cân nặng chuột ở các lô là giống nhau (p >0,05) Các lô 2, 3, 4, 5, là những lô phẫu thuật cắt bỏ 5/6 thận, có xu hướng có cân nặng nhỏ hơn so với lô chứng PT (không cắt bỏ thận) Tuy nhiên, do trọng lượng thận cắt bỏ (khoảng 1g) chiếm tỷ lệ nhỏ so với tổng cân nặng chuột, nên chưa có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các lô PT cắt bỏ thận và lô chứng PT (p >0,05).

Sau 15 ngày từ phẫu thuật lần 2, trọng lượng chuột ở nhóm chứng PT đạt 208,21 ± 20,69, cao hơn so với nhóm mô hình 195,62 ± 19,55, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Nhóm tham chiếu có trọng lượng 189,82 ± 18,62, nhóm TTGT-1 là 194,95 ± 19,26, và nhóm TTGT-2 là 193,08 ± 18,98, đều thấp hơn nhóm chứng PT với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Tuy nhiên, nhóm tham chiếu và nhóm mô hình không có sự khác biệt thống kê (p > 0,05) Nhóm TTGT-1 và TTGT-2 có trọng lượng lần lượt là 194,95 ± 19,26 và 193,08 ± 18,98, đều lớn hơn nhóm tham chiếu nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Cuối cùng, trọng lượng của nhóm TTGT-2 thấp hơn nhóm TTGT-1, nhưng sự khác biệt này cũng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 15 ngày từ phẫu thuật lần 2, chuột ở các lô 2, 3, 4, 5 (phẫu thuật cắt bỏ thận) không có sự tăng cân, trong khi lô chứng PT lại tăng cân Sự giảm cân của chuột ở các lô phẫu thuật cắt bỏ 5/6 thận có ý nghĩa thống kê so với lô chứng PT với p < 0,05.

Sau 60 ngày điều trị, trọng lượng chuột ở nhóm chứng PT đạt 236,18 ± 19,54, cao hơn đáng kể so với nhóm mô hình với trọng lượng 193,95 ± 19,28 (p < 0,05) Trong khi đó, trọng lượng chuột ở nhóm tham chiếu là 218,32 ± 20,14, nhóm TTGT-1 là 215,91 ± 21,06, và nhóm TTGT-2 là 224,06 ± 21,65, đều thấp hơn nhóm chứng PT và có sự khác biệt thống kê (p < 0,05) Tuy nhiên, so với nhóm mô hình, trọng lượng ở nhóm tham chiếu và các nhóm TTGT không có sự khác biệt thống kê rõ ràng (p > 0,05).

Nhóm TTGT-1 có trọng lượng chuột trung bình là 215,91 ± 21,06, thấp hơn nhóm tham chiếu 218,32 ± 20,14, nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Trong khi đó, nhóm TTGT-2 có trọng lượng trung bình 224,06 ± 21,65, cao hơn nhóm tham chiếu, tuy nhiên, sự khác biệt cũng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) So sánh giữa hai nhóm TTGT cho thấy nhóm TTGT-2 nặng hơn nhóm TTGT-1 (224,06 ± 21,65 so với 215,91 ± 21,06), nhưng sự khác biệt này cũng không đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Sau 60 ngày sử dụng thuốc, cân nặng của chuột ở các nhóm uống thuốc đã tăng đáng kể so với trước khi điều trị (p 0,05 > 0,05

Mô hình (2) 5,68 ± 0,74 8,96 ± 0,98 10,56 ± 1,12 > 0,05 < 0,01 < 0,001 Tham chiếu (3) 5,81 ± 0,88 8,81± 1,01 8,24 ± 0,96 > 0,05 < 0,01 < 0,05 TTGT-1 (4) 5,48 ± 0,69 8,68 ± 0,92 8,59 ± 0,91 > 0,05 < 0,01 > 0,05 TTGT-2 (5) 5,92 ± 0,85 8,75 ± 0,93 7,90 ± 0,85 > 0,05 < 0,01 < 0,05

Trước phẫu thuật, nồng độ ure huyết thanh ở nhóm chứng PT là 5,72 ± 0,71, cao hơn nhóm mô hình (5,68 ± 0,74), nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Tương tự, nhóm tham chiếu có nồng độ 5,81 ± 0,88 và nhóm TTGT-2 là 5,92 ± 0,85 cũng cao hơn nhóm chứng PT, nhưng sự khác biệt không đạt ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Nhóm TTGT-1 có nồng độ ure huyết thanh 5,48 ± 0,69 thấp hơn nhóm tham chiếu, nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Nhóm TTGT-2 với nồng độ 5,92 ± 0,85 cao hơn nhóm tham chiếu và nhóm TTGT-1, nhưng sự khác biệt vẫn không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Từ các nhận xét trên cho thấy tại thời điểm trước phẫu thuật: nồng độ ure huyết thanh của chuột ở các lô là như nhau (p >0,05)

Sau 15 ngày phẫu thuật lần 2, nồng độ ure huyết thanh ở nhóm chứng PT là 5,88 ± 0,84, thấp hơn đáng kể so với nhóm mô hình có nồng độ 8,96 ± 0,98 (p < 0,05) Nhóm tham chiếu có nồng độ 8,81 ± 1,01, trong khi nhóm TTGT-1 và TTGT-2 lần lượt có nồng độ 8,68 ± 0,92 và 8,75 ± 0,93, đều cao hơn nhóm chứng PT với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Tuy nhiên, nồng độ ure huyết thanh ở nhóm tham chiếu, TTGT-1 và TTGT-2 đều nhỏ hơn nhóm mô hình, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Ngoài ra, nồng độ ure huyết thanh giữa nhóm TTGT-1 và TTGT-2 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 15 ngày từ phẫu thuật lần 2, nồng độ ure huyết thanh của chuột ở các lô 2, 3, 4, 5 (cắt bỏ thận) tăng đáng kể (p 0,05).

Sau 60 ngày điều trị, nồng độ ure huyết thanh ở nhóm chứng PT là 6,01 ± 0,98, thấp hơn đáng kể so với nhóm mô hình (10,56 ± 1,12) với p 0,05) Trong khi đó, nhóm TTGT-2 với nồng độ 7,90 ± 0,85 thấp hơn nhóm tham chiếu, cũng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p >0,05).

0,85 nhỏ hơn nhóm TTGT-1 là 8,59 ± 0,91, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p 0,05)

+ Nồng độ ure huyết thanh của chuột ở lô mô hình tăng cao so với các thời điểm trước (p