Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và Đánh giá tỷ lệ nhiễm epstein barr virus, human herpes 6 Ở người việt nam có bệnh lý dạ dày Đồng nhiễm helicobacter pylori

pylori là một trong số các vi khuẩn Gram âm có tần suất nhiễm cao lên đến một nửa dân số thế giới và được xác định là nguyên nhân chính gây ra bệnh lý dạ dày, bao gồm viêm dạ dày mạn tí

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG ANH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN

VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ NHIỄM EPSTEIN-BARR VIRUS, HUMAN HERPES-6 Ở NGƯỜI VIỆT NAM CÓ BỆNH LÝ DẠ DÀY

ĐỒNG NHIỄM HELICOBACTER PYLORI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG ANH HÀ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN

VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ NHIỄM EPSTEIN-BARR VIRUS, HUMAN HERPES-6 Ở NGƯỜI VIỆT NAM CÓ BỆNH LÝ DẠ DÀY

ĐỒNG NHIỄM HELICOBACTER PYLORI

Chuyên ngành: Di truyền học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ HUYỀN TRANG

PGS.TS NGUYỄN THỊ HỒNG VÂN

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng của người học trò, đầu tiên tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết

ơn chân thành nhất đến cô TS Trần Thị Huyền Trang và cô PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân, những người đã trực tiếp hướng dẫn cho tôi, dành nhiều thời gian, công sức chỉ bảo, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài

Tiếp đó, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học, cũng như các thầy cô giáo Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã đem đến cho học viên những bài giảng vô cùng tâm huyết

Tôi xin chân trọng cảm ơn GS Lê Hữu Song đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được tham gia nghiên cứu và thực hiện đề tài tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108; xin cảm ơn các anh chị ở Trung tâm Nghiên cứu Y học Việt Đức, Khoa Sinh học phân tử và Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 đã giúp đỡ tôi, hướng dẫn cho tôi từ những thao tác nhỏ nhất, giúp tôi có thêm kinh nghiệm và hoàn thiện kĩ năng trong phòng thí nghiệm của mình; cảm ơn bạn bè và những người em

đã cùng học tập và làm việc với tôi tại Trung tâm Nghiên cứu Y học Việt Đức đã luôn động viện, ủng hộ và hỗ trợ tôi

Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biểt ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân, những người luôn là nguồn động lực to lớn để tôi bước tiếp đi trên con đường của mình đã luôn ở bên quan tâm, cổ vũ, động viên tôi

Học viên

Hoàng Anh Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực, không sao chép và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ một công trình nào khác

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Dạ dày và các bệnh lý liên quan 3

1.1.1 Cấu tạo và chức năng dạ dày 3

1.1.2 Các bệnh lý dạ dày 4

1.2 Các yếu tố nguy cơ gây ra bệnh lý dạ dày 12

1.2.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori (H pylori) 13

1.2.2 Epstein-Barr virus 18

1.2.3 Human herpesvirus-6 (HHV-6) 22

1.3 Các phương pháp xét nghiệm phát hiện H pylori, EBV và HHV-6 25

1.3.1 Phương pháp mô bệnh học 25

1.3.2 Phương pháp nuôi cấy 25

1.3.3 Phương pháp miễn dịch 26

1.3.4 Phương pháp sinh hoá 27

1.3.5 Phương pháp Realtime PCR 27

1.3.6 Phương pháp Realtime PCR phát hiện EBV, HHV-6 trong những nghiên cứu trước 30

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.1 Nhóm ung thư dạ dày 31

2.1.2 Nhóm viêm dạ dày mạn 31

2.1.3 Nhóm loét dạ dày 32

2.2 Hoá chất và vật liệu nghiên cứu 32

2.2.1 Hoá chất nghiên cứu 32

2.2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Tách DNA từ mẫu mảnh sinh thiết dạ dày 35

2.3.2 Chẩn đoán phát hiện H pylori bằng PCR 35

2.3.3 Thiết kế phản ứng Realtime PCR phát hiện EBV và HHV-6 37

2.3.4 Phương pháp Realtime PCR phát hiện EBV và HHV-6 trên các

mẫu bệnh phẩm 38

2.3.5 Xử lý số liệu 39

2.4 Khía cạnh đạo đức của nghiên cứu 39

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 40

3.1 Tách DNA từ mảnh sinh thiết dạ dày 40

3.2 Chẩn đoán phát hiện H pylori bằng PCR 41

3.3 Thiết kế phản ứng Realtime PCR phát hiện EBV và HHV-6 43

3.3.1 Thiết kế mồi và đầu dò phát hiện EBV và HHV-6 43

3.3.2 Tối ưu phản ứng Realtime PCR phát hiện EBV và HHV-6 44

3.3.3 So sánh phương pháp Realtime PCR với bộ kit thương mại AllplexTM Meningitis-V1 Assay 46

3.4 Phương pháp Realtime PCR phát hiện EBV và HHV-6 trên các mẫu bệnh phẩm 47

3.5 Đánh giá tỷ lệ nhiễm H pylori, EBV và HHV-6 ở đối tượng nghiên cứu 48

3.5.1 Đặc điểm giới tính, tuổi của đối tượng nghiên cứu 48

3.5.2 Tình trạng đồng nhiễm của các tác nhân EBV, HHV-6 và H pylori 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 ACSS1 Acyl-Coa Synthetase Short-Chain Family Member 1

2 BLAST Basic Local Alignment Search Tool

3 bp Base pair

4 cagA cytotoxin-associated gene A

(Gen liên quan gây độc tế bào A)

5 Ct Threshold Cycle

6 DNA Deoxyribonucleic acid

7 EBERs EBV-encode RNAs

(RNA mã hoá EBV)

8 EBNA-1 Epstein Barr nuclear antigen-1

(Kháng nguyên nhân 1 của EBV)

9 EBV Epstein-Barr virus

10 FAM3B FAM3 Metabolism Regulating Signaling Molecule B

(Phân tử tín hiệu điều hoà chuyển hoá FAM3B)

11 GLOBOCAN Tổ chức Ung thư toàn cầu

12 H pylori Helicobacter pylori

13 HHV-4 Human herpesvirus-4

14 HHV-6 Human herpesvirus-6

15 IDT Intergrated DNA Technologies

16 IgG Immunoglobulin G

17 IgM Immunoglobulin M

18 IHH Indian hedgehog

19 LDD Loét dạ dày

20 LMP2A Epstein-Barr Virus Latent Membrane Protein 2A

(Protein màng tiềm ẩn 2A của EBV)

21 miR-BARTS microRNA encoded by the BamHI rightward transcripts

(microRNA mã hoá bởi trình tự phiên mã hướng phải của BamHI)

22 MST Mảnh sinh thiết

23 NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs

(Thuốc giảm đau chống viêm không streroid)

24 PCR Polymerase chain reaction

(Phản ứng chuỗi polyme)

25 RNA Ribonucleic acid

26 TRABD TraB domain containing

27 UTDD Ung thư dạ dày

28 VCA-p18 Viral Capsid Antigen p18

29 VDDM Viêm dạ dày mạn

30 WHO World Health Organization

(Tổ chức y tế thế giới)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thành phần phản ứng PCR chẩn đoán H pylori 36

Bảng 2 Trình tự các đoạn mồi được sử dụng 36

Bảng 3 Thành phần tối ưu phản ứng realtime PCR khuếch đại vùng gen đặc trưng của EBV và HHV-6 37

Bảng 4 Thành phần phản ứng Realtime PCR trên các mẫu DNA tách từ MST dạ dày 38

Bảng 5 Giá trị trung bình, giá trị lớn nhất - nhỏ nhất của nồng độ DNA và OD260/280 các mẫu DNA sau khi tách 40

Bảng 6 Kết quả xét nghiệm PCR chẩn đoán H pylori 41

Bảng 7 Thống kê kết quả xét nghiệm CLO test và PCR chẩn đoán H pylori 42

Bảng 8 Trình tự cặp mồi và đầu dò phát hiện EBV và HHV-6 được thiết kế 43

Bảng 9 Kết quả sau khi thực hiện phản ứng Realtime PCR xác định EBV và HHV-6 trên các mẫu bệnh phẩm 48

Bảng 10 Tình trạng nhiễm EBV, HHV-6 và H pylori phân bố theo giới tính 49

Bảng 11 Tình trạng nhiễm H pylori theo nhóm tuổi trên và dưới 55 tuổi 51

Bảng 12 Tình trạng nhiễm HHV-6 theo nhóm tuổi trên và dưới 55 tuổi 51

Bảng 13 Tình trạng nhiễm EBV theo nhóm tuổi trên và dưới 55 tuổi 52

Bảng 14 So sánh về phân bố nhóm tuổi trong một số nghiên cứu 53

Bảng 15 Tỷ lệ nhiễm EBV theo tình trạng nhiễm H pylori 54

Bảng 16 Tỷ lệ nhiễm HHV-6 theo tình trạng nhiễm H pylori 54

Bảng 17 Tỉ lệ nhiễm HHV-6 theo tình trạng nhiễm EBV 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc dạ dày 4

Hình 2 Hình ảnh ung thư dạ dày thể ruột [35] 9

Hình 3 Hình ảnh ung thư dạ dày thể lan tỏa [35] 10

Hình 4 Sơ đồ quá trình xâm nhập và sinh bệnh của H pylori [40] 15

Hình 5 Cấu trúc của vi khuẩn H pylori [28] 17

Hình 6 Cấu trúc của Epstein-Barr virus [61] 18

Hình 7 Bộ gen của Epstein–Barr virus 20

Hình 8 Tương tác gây bệnh giữa EBV và H pylori [24] 21

Hình 9 Cấu trúc vỏ của Human herpesvirus-6 [92] 23

Hình 10 Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 34

Hình 11 Hình ảnh điện đi của sản phẩm PCR gen 23S phát hiện H pylori 41

Hình 12 Trình tự mồi và đầu dò phát hiện EBV 43

Hình 13 Trình tự mồi và đầu dò phát hiện HHV-6 43

Hình 14 Tín hiệu thu được khi thực hiện phản ứng Realtime PCR xác định EBV và HHV-6 ở nhiệt độ 60°C 44

Hình 15 Kết quả chạy Realtime PCR phản ứng xác định EBV (hình a) và HHV-6 (hình b) với các số lượng bản sao khác nhau 45

Hình 16 Kết quả chạy Realtime PCR phản ứng xác định EBVvà HHV-6 bằng phản ứng Realtime PCR (a) và khi sử dụng kit thương mại Allplex™ Meningitis-V1 Assay (b) 46

Hình 17 Tỷ lệ tình trạng bệnh lý theo giới tính 48

Hình 18 Tỷ lệ tình trạng bệnh lý theo nhóm tuổi 50

Hình 19 Tỷ lệ nhiễm HHV-6, EBV và H pylori theo tình trạng bệnh lý 57

Hình 20 Số tác nhân nhiễm theo tình trạng bệnh lý 58

MỞ ĐẦU

Hiện nay, theo sự phát triển của xã hội hiện đại, tỷ lệ mắc các bệnh lý dạ dày

ở người trẻ ngày càng gia tăng Một vài nguyên nhân dẫn đến sự gia tăng này có thể

kể đến như: áp lực cuộc sống, chế độ sinh hoạt thiếu khoa học, sử dụng thuốc không qua chỉ định của bác sĩ Trong khi đó, dạ dày là một cơ quan cực kì quan trong trong quá trình tiêu hoá, khởi đầu cho giai đoạn thứ hai của quá trình tiêu hoá Đây là cơ quan có các đặc điểm sinh lý, sinh hoá, miễn dịch và hệ vi sinh độc đáo Viêm, loét

dạ dày tá tràng là những bệnh lý dạ dày mà nếu không được điều trị kịp thời sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng cuộc sống sau này Đồng thời, những căn bệnh này cũng rất dễ tiến triển thành ung thư dạ dày Ung thư dạ dày (UTDD) là loại ung thư khá phổ biến, thống kê theo GLOBOCAN năm 2022 có tỉ lệ mắc thứ năm và nguyên nhân gây tử vong thứ tư trong các bệnh ung thư

Quan điểm trước đây cho rằng dạ dày là cơ quan vô trùng bởi tính acid của nó

Tuy nhiên, sau khi Helicobacter pylori (H pylori) được phát hiện, người ta nhận ra

rằng dạ dày có một hệ vi sinh với hàng trăm loại vi khuẩn khác nhau và môi trường

pH < 4 trong dạ dày góp phần ngăn cản sự phát triển quá mức của các loại vi khuẩn [58] Việc xác định được các loại vi khuẩn gây bệnh trong dạ dày là một trong những

yếu tố góp phần hỗ trợ xây dựng các phác đồ điều trị thích hợp cho người bệnh H pylori là một trong số các vi khuẩn Gram âm có tần suất nhiễm cao lên đến một nửa

dân số thế giới và được xác định là nguyên nhân chính gây ra bệnh lý dạ dày, bao gồm viêm dạ dày mạn tính, loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ dày

Epstein-Barr virus (EBV) và human herpesvirus-6 (HHV-6) đều thuộc họ Herpesvirus, có khả năng gây nhiễm trùng tiềm ẩn trong cơ thể con người Có rất nhiều nghiên cứu đã mô tả về mối liên hệ giữa việc nhiễm Epstein-Barr virus với ung thư biểu mô dạ dày và u lympho dạ dày Tuy nhiên mối liên hệ giữa việc mắc EBV trên đối tượng bệnh nhân viêm dạ dày và loét dạ dày tá tràng hay sự đồng nhiễm của

EBV và H pylori trên các bệnh lý này vẫn chưa được khám phá rõ ràng [58] Các

nghiên cứu về HHV-6 có mặt ở các đối tượng bệnh nhân ung thư dạ dày, viêm dạ dày hay loét dạ dày, tá tràng cũng đang được bỏ ngỏ

Từ thực tế này cho thấy việc nghiên cứu đặc điểm và mối liên hệ của EBV,

HHV-6 và H pylori trên đối tượng bệnh nhân viêm, loét hoặc ung thư dạ dày là cần

thiết để hỗ trợ xây dựng các phác đồ điều trị các bệnh lý dạ dày hiệu quả Do đó, đề

tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr virus, human herpesvirus-6 ở người Việt Nam có bệnh lý dạ dày đồng nhiễm

Helicobacter pylori” được thực hiện với hai mục tiêu chính:

1 Xây dựng quy trình phát hiện Epstein-Barr virus và human

herpesvirus-6 trên đối tượng người Việt Nam có bệnh lý dạ dày nhiễm H pylori

bằng phương pháp sinh học phân tử

2, Đánh giá tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr virus và human herpesvirus-6 trên

đối tượng bệnh nhân có bệnh lý dạ dày nhiễm H pylori

Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu Y học Việt Đức – Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 Thời gian nghiên cứu từ tháng 4/2022 đến tháng 8/2024

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Dạ dày và các bệnh lý liên quan

1.1.1 Cấu tạo và chức năng dạ dày

Dạ dày là một phần của hệ tiêu hoá Cấu tạo của dạ dày được chia thành tám phần: tâm vị, đáy vị, thân vị, môn vị, thành trước dạ dày, thành sau dạ dày, bờ cong

Quá trình tiêu hóa bắt đầu ngay khi thức ăn vào dạ dày Thành dạ dày tiết ra một lượng lớn HCl và enzyme pepsin Điều này giúp tạo môi trường có độ pH rất thấp, trong khoảng từ 1 – 2, để phân giải protein thành các peptide nhỏ hơn Đồng thời, môi trường pH thấp hỗ trợ tiêu diệt vi khuẩn và virus xâm nhập qua thức ăn Khi

dạ dày co bóp, thức ăn được trộn với dịch vị, tạo thành hỗn hợp lỏng (nhũ trấp) Sau

đó môn vị mở ra để nhũ trấp chảy vào ruột non, nơi quá trình tiêu hóa và hấp thụ dưỡng chất tiếp tục diễn ra

Dạ dày là một cơ quan vô cùng quan trọng đối với sức khoẻ của con người Đây là bộ phận đảm nhiệm việc phân giải và hấp thụ các chất dinh dưỡng thiết yếu Vai trò này vô cùng quan trọng đối với sự ổn định của quá trình trao đổi chất và sự phát triển của cơ thể

Bên cạnh đó, dịch vị trong dạ dày là hàng rào bảo vệ mạnh mẽ của cơ thể khỏi các tác nhân gây hại có trong thực phẩm được tiêu hoá Các nghiên cứu cho thấy độ

pH thấp trong dạ dày giúp ngăn chặn sự sinh sôi của nhiều loại vi sinh vật gây bệnh,

từ đó bảo vệ sức khỏe con người [68] Mặt khác, sự thay đổi trạng thái giãn nở khác nhau giữa lúc đói và no của dạ dày giúp cơ thể nhận được tín hiệu đúng lúc để điều chỉnh chế độ ăn kịp thời và duy trì cân nặng phù hợp

Hình 1 Cấu trúc dạ dày 1.1.2 Các bệnh lý dạ dày

Bệnh lý dạ dày là một trong những nhóm bệnh phổ biến có của cuộc sống hiện đại Nhóm bệnh này có tác động nghiêm trọng đến sức khỏe và chất lượng sống của hàng triệu người trên thế giới [32] Trong đó, các bệnh lý thường gặp bao gồm viêm

dạ dày, loét dạ dày, và ung thư dạ dày Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra H pylori là loại vi

khuẩn chính gây ra viêm và loét dạ dày Tại các nước phát triển, tỷ lệ này dao động

từ 30-50%, trong khi ở các nước đang phát triển có thể lên đến 80% [42]

Những người có lối sống và chế độ ăn uống không lành mạnh, với nhiều muối, thịt chế biến, và ít chất xơ có nguy cơ mắc các bệnh viêm và loét dạ dày cao hơn Việc lạm dụng các chất kích ứng niêm mạc dạ dày, như thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) có thể làm gia tăng nguy cơ loét dạ dày [43] Theo một báo cáo

năm 2018, hơn 40 triệu người Mỹ bị ảnh hưởng bởi các bệnh lý dạ dày và đường tiêu hóa, với chi phí y tế liên quan lên tới khoảng 119,6 tỷ USD và hàng triệu lượt khám sức khỏe mỗi quý [1]

1.1.2.1 Viêm dạ dày

Viêm dạ dày là khi có sự xuất hiện của các biểu hiện viêm ở màng nhầy của

dạ dày [64] Màng nhầy của dạ dày là lớp trong cùng của thành dạ dày chứa các loại tuyến tiết ra dịch vị Nguyên nhân viêm dạ dày có thể chia làm 3 type A, B và C Các nguyên nhân liên quan đến cơ chế tự miễn được xếp vào tuýp A (Autoimmune) Cơ thể của bệnh nhân thuộc nhóm này có thể tự phát sinh kháng thể chống lại chính các

tế bào của dạ dày Mắc viêm dạ dày tuýp A thường có nguy cơ cao bị ung thư dạ dày Bên cạnh đó viêm dạ dày do ảnh hưởng của dược phẩm và hoá chất như rượu và thuốc chống viêm không steroid (NSAID) được xếp vào tuýp C (Chemical) NSAID làm giảm sản xuất prostaglandin, một chất giúp bảo vệ niêm mạc dạ dày, từ đó làm tăng nguy cơ viêm và loét dạ dày Trong khi đó, tuýp B (Bacteria) là viêm dạ dày có

căn nguyên do vi khuẩn và nguyên nhân gây viêm dạ dày do vi khuẩn H pylori chiếm

Viêm dạ dày cấp tính có thể tự khỏi sau vài ngày, với các triệu chứng bao gồm

ợ nóng, buồn nôn, nôn, đau âm ỉ và đầy bụng Những triệu chứng này có thể dễ nhầm lẫn với các bệnh lý khác như trào ngược dạ dày-thực quản hoặc viêm dạ dày ruột Viêm dạ dày mạn là tình trạng viêm niêm mạc dạ dày xảy ra từ từ và kéo dài trên một tháng, thậm là một số năm Đây là một trong những căn bệnh nguy hiểm kéo dài âm

ỉ suốt cuộc đời con người Viêm dạ dày mạn đặc trưng bởi sự xuất hiện của các tế bào viêm, chủ yếu là lympho bào và tương bào trong lớp đệm giữa các tuyến niêm mạc

Quá trình viêm bắt đầu với tổn thương tại các tuyến nông gần bề mặt niêm mạc, sau

đó dần phá huỷ và làm giảm đáng kể số lượng tuyến, dẫn đến tình trạng viêm teo Để đánh giá mức độ của viêm dạ dày mạn, hệ thống Sydney thường được sử dụng để đánh giá tổn thương mô bệnh học Gồm hai phân loại chính là: viêm mạn nông với hình ảnh thâm nhiễm nhiều các bào tương đơn nhân và bạch cầu mono chủ yếu ở phần ba trên vùng khe của niêm mạc dạ dày, các tuyến dạ dày và phía dưới bình thường; viêm mạn teo với định nghĩa là thương tổn có sự phối hợp biểu mô tuyến và các tuyến, tế bào tuyến xâm nhập toàn bộ chiều dày niêm mạc làm giảm thể tích và

bước tiến đáng kể sau khi phát hiện ra H pylori Tình trạng viêm mạn tính của niêm

mạc dạ dày có liên quan đến tình trạng viêm bạch cầu trung tính, chúng bị phụ thuộc

bởi độc tính của vi khuẩn H pylori trong dạ dày [87] H pylori là một vi khuẩn khó

bị tiêu diệt vì nó nằm ở lớp màng nhầy bao phủ niêm mạc dạ dày Ở vị trí này, thuốc không khuyếch tán tới được hoặc khuyếch tán tới ít với nồng độ thấp không đủ diệt

khuẩn Một nghiên cứu khác cho thấy, viêm dạ dày mạn tính do H pylori có liên quan

đến tình trạng viêm teo niêm mạc dạ dày, dẫn đến mất khả năng tiết axit và các enzyme tiêu hóa quan trọng Tình trạng này không chỉ làm giảm khả năng tiêu hóa

và hấp thu thức ăn mà còn làm tăng nguy cơ mắc các bệnh lý nghiêm trọng khác như loét và ung thư dạ dày [76]

Tỷ lệ viêm dạ dày thay đổi giữa các khu vực có điều kiện kinh tế - xã hội khác nhau Tỷ lệ này cao tới 50,8% ở các nước đang phát triển; trong khi đó ở các nước phát triển, tỷ lệ mắc viêm dạ dày chỉ là 34,7% [14][76] Một nghiên cứu ở các đối tượng bị viêm teo dạ dày cho thấy tỷ lệ mắc viêm teo dạ dày ở Trung Quốc và Nhật Bản cao hơn nhiều so với các khu vực khác trên thế giới, tương ứng với tỷ lệ ung thư [57] Ở Việt Nam chưa có theo dõi trên cộng đồng lớn, chưa có theo dõi dọc, chủ yếu số liệu

thống kê dựa trên những nghiên cứu rải rác trong các cộng đồng nhỏ Tỷ lệ nhiễm H pylori ở lứa tuổi từ 15-75 là 56 - 75,2% với xét nghiệm huyết thanh học và tỷ lệ nhiễm

trong các thể bệnh qua nội soi ở người lớn vào khoảng 53 - 89,5% tại một số bệnh viện

thành phố lớn [54] Tỷ lệ nhiễm H pylori trong các trường hợp viêm dạ dày mạn ở

miền Bắc Việt Nam từ 53 - 72,8%; ở thành phố Hồ Chí Minh là 64,7% [9]

Hệ thống phân loại loét dạ dày theo mô bệnh học thường dựa trên các đặc điểm

về mức độ tổn thương, diễn tiến và yếu tố nguyên nhân nhằm dễ dàng phát hiện tổn thương vi thể và điều chỉnh phác đồ điều trị Hệ thống này bao gồm: loét cấp tính, loét mạn tính, loét ác tính và loét do nguyên nhân đặc biệt Loét cấp tính được đặc trưng bởi tổn thương niêm mạc nông hoặc sâu đến lớp cơ niêm, hoại tử fibrin bề mặt niêm mạc, phù nề, xuất huyết trong niêm mạc hoặc dưới niêm mạc và có sự thâm nhập của bạch cầu đa nhân trung tính tại vùng tổn thương Loét mạn tính thường có

4 lớp đặc trưng: lớp hoại tử bề mặt với tích tụ fibrin và xác tế bào chết, lớp viêm cấp với tập trung bạch cầu đa nhân, lớp mô hạt viêm chứa mao mạch, nguyên bào sợi và lympho bào, lớp xơ hóa gồm mô sẹo thay thế cấu trúc tuyến bình thường Loét ác tính có đặc điểm mô bệnh học là rìa vùng loét gồ ghề không đều, thường mất tính đối xứng, đáy loét có tế bào ung thư, có sự thâm nhiễm ung thư vào các lớp niêm mạc,

cơ hoặc sâu hơn và có xuất hiện dị sản ruột hoặc tổn thương tiền ung thư xung quanh loét Đối với những trường hợp loét do nguyên nhân đặc biệt, những đặc điểm mô học thường thấy như phát hiện kháng thể tấn công tế bào thành dạ dày, nhiễm nấm hoặc lao, hội chứng Zollinger-Ellison tăng sản tuyến niêm mạc do tăng tiết gastrin

Trước đây người ta cho rằng việc tăng tiết axit trong dạ dày tá tràng cùng với các yếu tố khách quan như chế độ ăn uống hoặc tình trạng căng thẳng kéo dài được cho là nguyên nhân gây ra hầu hết các bệnh loét dạ dày tá tràng [9] Nhưng khi xác

định được sự nhiễm vi khuẩn H pylori và sử dụng không kiểm soát các loại thuốc

kháng viêm không steroid cũng là các yếu tố nguy cơ gây ra bệnh loét dạ dày tá tràng thì việc nhận thức về nguyên nhân gây loét dạ dày tá tràng cũng được nâng cao, dẫn tới sự ra đời của các liệu pháp điều trị mới với đáp ứng tốt hơn [9]

Theo ước tính trên toàn thế giới, tỷ lệ phổ biến của bệnh loét dạ dày tá tràng trong dân số được ước tính vào khoảng 5 - 10%, và tỉ lệ mắc mới là 0,1 - 0,3% mỗi năm [64] Loét dạ dày tá tràng vô căn là tình trạng loét dạ dày tá tràng không nhiễm

H pylori hoặc sử dụng thuốc kháng viêm không steroid, chiếm khoảng 20 – 40% các

ca loét dạ dày tá tràng ở Bắc Mỹ và lên đến 40% ở các nước châu Á [81] Tuy nhiên

tỷ lệ thực tế có thể thấp hơn so với ước tính do sự ra đời của các liệu pháp điều trị mới cũng sự hiểu biết thêm về nguyên nhân gây ra bệnh viêm loét dạ dày tá tràng [9] Ở châu Á, nhiều bài báo cáo ở các quốc gia như Trung Quốc, Ấn Độ cho thấy tỷ lệ mắc bệnh loét dạ dày tá tràng đang ngày càng giảm theo xu hướng ổn định Sự giảm tỷ lệ

mắc này đi cùng với việc giảm tỷ lệ mắc loét dạ dày tá tràng nguyên nhân do H pylori

[85] Theo Hội khoa học Tiêu hoá, tại Việt Nam có tới 26% dân số mắc bệnh viêm loét

dạ dày tá tràng, 70% dân số nước ta có nguy cơ mắc bệnh dạ dày và nguy cơ mắc viêm loét dạ dày ở nam giới gấp 4 lần so với nữ giới

1.1.2.3 Ung thư dạ dày

Ung thư dạ dày (UTDD) là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng thứ ba trên toàn thế giới, chủ yếu là do căn bệnh này thường chỉ được phát hiện khi bệnh nhân

đã ở giai đoạn nặng [15] Theo thống kê của GLOBOCAN cho đến năm 2022, đã có 660.175 ca tử vong do UTDD, UTDD có tần suất chẩn đoán cao thứ năm trong các loại ung thư và nguyên nhân tử vong liên quan đến ung thư cao thứ ba, chiếm 6,8% tổng số

ca tử vong do ung thư Nguyên nhân chính của UTDD là đa yếu tố, mặc dù vậy việc

nhiễm vi khuẩn H pylori đến hiện nay vẫn được coi là nguyên nhân thứ yếu [78]

UTDD là một trong số ít các loại ung thư có liên quan đến tác nhân truyền nhiễm [21]

UTDD có thể được phân loại theo mô học bằng cách sử dụng các hệ thống phân loại khác nhau; hai trong số phổ biến nhất là phân loại Lauren và phân loại của WHO Vào năm 1965, Lauren đã phát triển một hệ thống phân loại mô bệnh học dành cho ung thư biểu mô dạ dày với đặc điểm đơn giản và dễ áp dụng, được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sau này Hệ thống này chia tổn thương thành hai nhóm chính: thể ruột và thể lan tỏa, mỗi loại đều có đặc điểm hình thái riêng, khác biệt về dịch tễ học, cơ chế bệnh sinh cũng như yếu tố di truyền Ngoài ra, một dạng hiếm gặp không thuộc hai loại trên được gọi là thể không xác định hoặc thể hỗn hợp

+ Ung thư biểu mô dạ dày thể ruột: Các tế bào khối u dính vào nhau và có xu hướng tự sắp xếp thành hình ống hoặc dạng tuyến tương tự như các u tuyến phát sinh

ở những nơi khác trong đường ruột (do đó chúng được gọi là thể ruột) Thể ruột phổ biến hơn ở nam giới, thường gặp ở nhóm tuổi lớn hơn và có tiên lượng tốt hơn thể lan tỏa

Hình 2 Hình ảnh ung thư dạ dày thể ruột [35]

+ Ung thư biểu mô dạ dày thể lan tỏa: Ngược lại với ung thư biểu mô thể ruột, loại tổn thương này thiếu các phân tử kết dính nên các tế bào khối u phát triển riêng

lẻ và xâm lấn các mô lân cận mà không hình thành tuyến Các ung thư biểu mô liên kết kém, bao gồm cả ung thư biểu mô tế bào nhẫn theo phân loại của WHO tương ứng với thể lan tỏa của phân loại Lauren Tỷ lệ nam/nữ gần như nhau và thường gặp

ở người trẻ tuổi

Hình 3 Hình ảnh ung thư dạ dày thể lan tỏa [35]

Vào năm 2010, WHO đã giới thiệu một hệ thống phân loại chi tiết về mô học UTDD, không chỉ tập trung vào ung thư biểu mô tuyến mà còn bao gồm cả những dạng ung thư hiếm gặp hơn Đến năm 2019, hệ thống này được cập nhật với các thông tin mới về căn nguyên, cơ chế bệnh sinh, và tính không đồng nhất của các ung thư biểu mô liên kết kém, đồng thời mô tả thêm các biến thể hiếm như ung thư biểu mô tuyến phình vị [62] Về cơ bản, UTDD được chia thành 4 dạng chính: thể ống, thể nhú, thể nhầy, và thể liên kết kém (bao gồm ung thư tế bào nhẫn), cùng với một số biến thể hiếm gặp khác Quá trình phân loại chủ yếu dựa trên kiểu mô học chiếm ưu thế, mặc dù thường có sự hiện diện của các thành phần mô học ít phổ biến hơn [35]

+ Ung thư biểu mô tuyến ống: Đây là loại phổ biến nhất trong các dạng ung thư biểu mô dạ dày Về đại thể, loại này có xu hướng tạo thành khối u dạng polyp hoặc nấm Về mô học, nó được đặc trưng bởi các ống tuyến phình to, hợp nhất hoặc phân nhánh bất thường với nhiều kích thước, thường chứa chất nhầy, mảnh vụn và các tế bào viêm trong lòng ống Dạng này được chia thành ba mức độ biệt hóa

+ Ung thư biểu mô tuyến nhú: Đây là một biến thể phổ biến, thường xuất hiện

ở ung thư biểu mô dạ dày giai đoạn sớm, hay gặp ở người cao tuổi và ở phần trên dạ dày Loại này có liên quan đến di căn gan và tỷ lệ di căn hạch bạch huyết cao Hình thái mô học đặc trưng là các nhú biểu mô bao quanh một lõi xơ mạch ở trung tâm

+ Ung thư biểu mô tuyến nhầy: Chiếm khoảng 10% tổng số trường hợp, loại này có đặc điểm mô học với các hồ chất nhầy ngoại bào chiếm ít nhất 50% thể tích khối u Tế bào ung thư có thể hình thành cấu trúc tuyến hoặc các cụm tế bào không đều, đôi khi xen lẫn với các tế bào nhẫn nằm rải rác trong hồ chất nhầy

+ Ung thư biểu mô tế bào nhẫn và các dạng ung thư biểu mô kém liên kết khác: Loại này thường là hỗn hợp của các tế bào nhẫn và tế bào không nhẫn Các tế bào có tính liên kết kém, hình thái tương tự tế bào biểu mô, lympho và tương bào Tế bào ung thư thường tạo thành các tuyến phá hủy dạng dải hoặc giống như ren, thường đi kèm với tình trạng giảm sản ở thành dạ dày, và biểu hiện loét hoặc lõm trên bề mặt Khi khối u nằm ở vùng hang-môn vị, nó thường xâm lấn thanh mạc, mạch bạch huyết

Có sự chênh lệch về tỷ lệ mắc UTDD giữa các quốc gia với hơn 70% số ca UTDD là ở các nước đang phát triển Trong đó, các điểm nóng về tỷ lệ mắc UTDD tập trung ở ba khu vực bao gồm Đông Á, Đông Âu và Nam Mỹ [64] Nổi bật trong các điểm nóng này là Trung Quốc chiếm tới hơn 40% ca mắc UTDD trên toàn thế giới, có thể nguyên nhân là do kích cỡ dân số và các yếu tố lối sống [9] Trong khi đó

ở Mỹ, tỷ lệ mắc UTDD thấp hơn hẳn so với các quốc gia khác, số ca mắc mới UTDD

ở Mỹ chỉ khoảng 1,6% (Theo Viện Ung bướu Quốc gia Mỹ, 2016) Theo GLOBOCAL năm 2022, tại Việt Nam số ca mắc mới UTDD là 16.277, chiếm 9% số

ca ung thư mắc mới, đứng thứ năm sau ung thư vú và ung thư gan Đặc biệt, tuổi bệnh nhân UTDD đang dần trẻ hoá, đa phần dưới 40 tuổi chiếm tỷ lệ khoảng 20 – 25%

Hiện nay, tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong do UTDD đang được giảm dần nhờ điều kiện sống càng ngày được cải thiện và kết hợp với sự phát triển kinh tế Ở các khu vực có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao như ở các nước Đông Á (Hàn Quốc, Nhật Bản),

các chương trình tầm soát cũng làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do ung thư dạ dày Việc chẩn đoán sớm UTDD là một thách thức, vì các triệu chứng lâm sàng thường xuất hiện muộn trong quá trình phát triển UTDD, do đó các lựa chọn điều trị bị hạn chế rất nhiều [86] Đặc biệt ở giai đoạn di căn, tỷ lệ sống sót thường rất thấp, vì thế nhu cầu cấp thiết là xác định sớm và tìm ra nguyên nhân chính gây bệnh để xây dựng phương pháp điều trị thích hợp

1.2 Các yếu tố nguy cơ gây ra bệnh lý dạ dày

Yếu tố nguy cơ gây ra bệnh lý dạ dày là các yếu tố làm tăng khả năng mắc bệnh Các bệnh lý dạ dày từ lâu đã được xác định do nhiều yếu tố nguy cơ khác nhau Trong đó có những yếu tố có thể thay đổi được như môi trường sống, tình trạng hút thuốc lá, nhưng cũng có những yếu tố không thể thay đổi được như tuổi tác và tiền

sử bệnh của gia đình Ngoài các yếu tố này ra, việc nhiễm một số loại vi sinh vật cũng

là một nguyên nhân làm tăng nguy cơ mắc các bệnh lý dạ dày Việc tìm hiểu các yếu

tố nguy cơ gây ra bệnh lý dạ dày rất quan trọng vì nó giúp con người có thể đưa ra các phương án lựa chọn để có thể ngăn ngừa hoặc điều trị bệnh hiệu quả hơn Trước

khi vi khuẩn H pylori được phát hiện, các nhà khoa học và bác sĩ đã tin rằng các bệnh

dạ dày, đặc biệt là viêm loét dạ dày và tá tràng, chủ yếu do sự mất cân bằng acid gây

ra Quan niệm này dẫn đến việc hướng điều trị các bệnh dạ dày thường thông qua giảm tiết acid, bằng cách sử dụng thuốc kháng acid, thuốc kháng histamin H2, và thuốc ức chế bơm proton (PPI) Tuy nhiên, hiệu quả của các phương pháp điều trị này chỉ là tạm thời, vì bệnh nhân thường tái phát sau một thời gian ngắn ngừng thuốc Những phương pháp điều trị này không giải quyết được nguyên nhân gốc rễ của bệnh

và cũng không phòng ngừa được các biến chứng nguy hiểm như UTDD Mặt khác, việc cho rằng dạ dày là một môi trường quá khắc nghiệt để vi khuẩn có thể tồn tại đã khiến cho giới y học khó tin vào giả thuyết vi khuẩn có liên quan đến các bệnh lý này Khung cảnh khoa học vào thời điểm đó gần như đã đóng kín cánh cửa cho bất kỳ giả thuyết nào liên quan đến vi khuẩn trong bệnh dạ dày Nhưng một bước ngoặt lớn đã xuất hiện khi hai nhà khoa học là Barry Marshall và Robin Warren phân lập thành

công được xoắn khuẩn H pylori từ đối tượng bệnh nhân bị viêm dạ dày mạn tính

[57] Marshall và Warren đã phải đối mặt với những thách thức to lớn khi cố gắng

nuôi cấy H pylori trong điều kiện phòng thí nghiệm Sau khi thu thập mẫu từ bệnh

nhân viêm loét dạ dày, họ đã cố gắng tạo điều kiện tối ưu để vi khuẩn có thể phát triển, điều chưa từng được thực hiện trước đó Trong một nỗ lực đầy quyết tâm, Marshall và Warren đã thay đổi các điều kiện nuôi cấy, kéo dài thời gian ủ đến hơn

5 ngày, và cuối cùng họ đã thành công khi phát hiện vi khuẩn H pylori phát triển

trong môi trường giàu khí CO₂ và nhiệt độ cơ thể Để củng cố giả thuyết của mình,

Marshall đã dũng cảm tự nguyện uống vi khuẩn H pylori nhằm chứng minh rằng vi

khuẩn này có thể gây ra bệnh viêm dạ dày Sau đó, ông nhanh chóng phát triển các triệu chứng của viêm dạ dày cấp, và quá trình soi dạ dày cho thấy sự hiện diện rõ rệt của vi khuẩn Hành động táo bạo này không chỉ tạo được tiếng vang lớn mà còn giúp

thuyết phục cộng đồng y học rằng H pylori thực sự là một trong những yếu tố nguy

cơ chính gây ra các bệnh lý dạ dày [60]

1.2.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori (H pylori)

1.2.1.1 Đặc điểm sinh học của H pylori

H pylori là một xoắn khuẩn Gram âm, hình cong hoặc hình chữ S, đường kính

từ 0,3 - 1µm, dài 1,5 - 5 µm với 4 - 6 lông mảnh ở mỗi đầu Chính nhờ các lông này cùng

với hình thể của mình mà H pylori có thể chuyển động trong môi trường nhớt [1][11][22] H pylori thường cư trú ở trong lớp nhày tập trung chủ yếu ở hang vị sau đó

là thân vị và có thể thấy H pylori ở những vùng có dị sản dạ dày ở tá tràng Tuy nhiên không thấy H pylori trên bề mặt niêm mạc ruột và vùng dị sản ruột ở dạ dày H pylori

gắn chọn lọc vào một vị trí đặc hiệu của chất nhày và một vị trí glycerolipidic của màng

Nó sản sinh ra một lượng lớn urease, lớn hơn nhiều so với bất kỳ một loại vi khuẩn nào

khác, vì thế ở dạ dày sự hiện diện của urease gần như đồng nghĩa với sự có mặt của H pylori Urease sinh ra từ H pylori xúc tác phản ứng thuỷ phân ure thành amoniac (NH3)

và carbondioxide (CO2) Amoniac là một chất bazơ yếu có khả năng nhận proton trong môi trường acid dạ dày tạo thành amoni (NH4+) Phản ứng này giúp làm giảm độ acid của dịch vị Amoniac taọ ra đưa môi trường xung quanh về trạng thái pH trung tính và

duy trì mức pH này, giúp bảo vệ H pylori khỏi tác động của acid mạnh và môi trường

khắc nghiệt trong dạ dày Bên cạnh đó, carbondioxide sinh ra trong quá trình phân huỷ urea cũng góp phần vào việc điều chỉnh pH thông qua hệ đệm bicasronate, duy trì pH

của môi trường dạ dày xung quanh H pylori luôn ở mức trung tính [11]

H pylori có thể vừa chịu được môi trường acid vừa chịu được môi trường

kiềm (pH trong khoảng 5-8.5), đồng thời tăng trưởng ở nhiệt độ 30-40oC và sống ở phần sâu của lớp nhày bao phủ niêm mạc dạ dày, giữa lớp nhày với bề mặt của lớp tế bào biểu mô và ở các vùng nối giữa các tế bào này Chính vì những điều kiện này mà

việc điều trị dứt điểm H pylori là rất khó khăn Đặc điểm sinh học nổi bật của H pylori là sự đa dạng của các kiểu gen và khả năng biến đổi di truyền Hầu hết mỗi người nhiễm bệnh không chỉ nhiễm chủng H pylori của bản thân, mà các chủng còn

trải qua quá trình biến đổi gen in vivo dẫn đến tốc độ đột biến tăng cao và gây ra sự tái hợp thường xuyên để thích nghi với vật chủ [11]

H pylori sống trong môi trường dạ dày của hơn một nửa dân số thế giới [14] Các nghiên cứu khác nhau đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm H pylori phụ thuộc vào nhiều

yếu tố như tuổi tác, môi trường sống, khu vực địa lý và tình trạng kinh tế xã hội [58]

Theo nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm H pylori trên toàn cầu vào năm 2017, châu Phi, châu

Mỹ la tinh và Caribe và châu Á là các khu vực có tỉ lệ nhiễm H pylori cao nhất, tương

ứng là 79,1%, 63,4% và 54,7% Tại châu Á, Ấn Độ (50,7%) và Trung Quốc (40,0%)

là hai quốc gia có tỷ lệ nhiễm H pylori cao đứng đầu [32] Tại Việt Nam, ở các đối tượng viêm dạ dày mãn tính, tỷ lệ nhiễm H pylori chiếm trên 55% ở đối tượng người Kinh Các nghiên cứu đánh giá trên bệnh nhân loét dạ dày tá tràng, tỷ lệ nhiễm H pylori ở các đối tượng này là trên 70% Ở bệnh nhân ung thư dạ dày, tỷ lệ nhiễm H pylori là trên 60% và không có sự khác biệt ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh

H pylori được lây truyền qua nhiều con đường khác nhau như miệng - miệng,

phân - miệng, dạ dày - miệng và dạ dày - dạ dày, trong đó lây truyền qua đường miệng -

miệng là phương thức lây truyền chủ yếu làm nhiễm vi khuẩn H pylori Điều đó có thể

lý giải cho lý do tại sao các thành viên trong cùng một gia đình thường dễ dàng cùng bị

nhiễm H pylori nếu có một người mắc phải [4][8][43][58][59] Người ta ước tính rằng 50% dân số thế giới nhiễm H pylori mạn tính, và khoảng 15% trong số những người nhiễm sẽ phát triển thành loét dạ dày [81] Tuy nhiên ngay cả khi nhiễm H pylori không

có triệu chứng thì bệnh cũng có thể tiến triển thành loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ dày

[9] Nhiều nghiên cứu về sau cũng đã chỉ ra, nhiễm H pylori mạn tính có thể dẫn đến

một loạt các biến chứng rối loạn hệ tiêu hóa như viêm dạ dày mạn tính, u lymphoma MALT (1 loại u lymphoma non-Hodgkin có đặc tính sao chép và tăng sinh chậm các tế

bào B, một loại tế bào miễn dịch trong lớp lót dạ dày, ung thư dạ dày) H pylori được

coi là nguyên nhân chính của viêm dạ dày mạn tính và bệnh loét dạ dày tá tràng [87]

Mối liên quan giữa nhiễm H pylori và sự phát triển của ung thư dạ dày đã được nghiên cứu rõ ràng Hơn 60% các trường hợp dung thư dạ dày có H pylori [9] Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã phân loại H pylori vào nhóm gây ung thư số một [86]

1.2.1.2 Cơ chế gây bệnh của Helicobacter pylori

Hình 4 Sơ đồ quá trình xâm nhập và sinh bệnh của H pylori [40]

Không gian bên trong dạ dày có pH từ 1-5, đây là điều kiện chỉ cho phép H pylori tồn tại trong 30 phút [49][77] Lớp niêm mạc dạ dày lại được tái tạo tế bào mới liên tục, quá trình hình thành khuẩn lạc của H pylori phải được diễn ra liên tục và H pylori phải định hướng được đến các khu vực có điều kiện môi trường thích hợp hơn

Điều này được hỗ trợ thực hiện bởi cơ chế hướng hóa học (chemotaxis) Kết hợp với

tiên mao (flagella) và cấu trúc dạng xoắn, H pylori dễ dàng di chuyển tránh các điều

kiện ức chế trong dạ dày và di chuyển hướng tới các khu vực có điều kiện tối ưu để sinh sôi, qua lớp niêm dịch vào ổ sinh thái thích hợp ở lớp dưới niêm mạc dạ dày để tồn tại trong môi trường acid của dịch vị [85]

Bên cạnh cơ chế hướng hoá học, H pylori còn có các cơ chế khác hỗ trợ cho quá trình sinh sôi trong dạ dày Lớp vỏ của H pylori có các protein bên ngoài và các cấu trúc

lipopolysaccaride gây viêm bám vào tế bào vật chủ Hệ thống tiết type IV biểu hiện phân

tử cấu trúc dạng gai hỗ trợ cho sự xâm nhập qua màng tế bào của các phân tử effector có nhiều chức năng như hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, giải phóng các yếu tố trung gian hóa học trong viêm (các Interleukin, các gốc oxy

tự do), giải phóng ra yếu tố hoạt hóa tiểu cầu - một chất trung gian quan trọng trong viêm, làm cho biểu mô phù nề hoại tử, long tróc, bị acid ăn mòn dẫn đến trợt rồi loét, ức chế sinh trưởng tế bào, ức chế sự chết theo chu trình của tế bào (hình 1.4) [37]

Cơ thể bị nhiễm H pylori sẽ sản xuất ra kháng thể chống lại H pylori Các

kháng thể này lại gây phản ứng chéo với các thành phần tương tự trên các tế bào biểu

mô dạ dày của cơ thể, gây tổn thương niêm mạc dạ dày [28][64] Sau khi vận động

vào trong lớp nhày dạ dày, H pylori bám dính vào biểu mô tiết ra nhiều men urease,

phân hủy urea thành ammoniac trong dạ dày, gây kiềm hóa môi trường xung quanh,

giúp H pylori tránh được sự tấn công của acid trong dịch vị Amoniac cùng các độc

chất tế bào (cytotoxin) phân hủy các thành phần của chất nhầy dạ dày Mặt khác, sau

khi bám vào màng tế bào, thông qua các thụ thể, H pylori sẽ tiết ra các nội độc tố

(endocytotoxin), gây tổn thương trực tiếp các tế bào biểu mô dạ dày, gây thoái hóa, hoại tử, long tróc tế bào, tạo điều kiện để acid, pepsin thấm vào và tiêu hủy, gây trợt

rồi loét dạ dày [28][72] Do bị H pylori gây tổn thương, niêm mạc dạ dày sẽ làm

giảm tiết somatostatin, chất này được sản xuất từ tế bào D có mặt ở nhiều nơi trong niêm mạc ống tiêu hóa trong đó có dạ dày Lượng somatostatin giảm sẽ gây tăng gastrin máu từ tế bào G sản xuất ra, mà chủ yếu tăng gastrin-17 (từ hang vị), còn gastrin-34 (từ tá tràng) tăng không đáng kể Hậu quả trên làm tăng tế bào thành ở thân

vị, tăng tiết acid HCl và kèm theo là tăng hoạt hóa pepsinogen thành pepsin Đây là

2 yếu tố tấn công chính trong cơ chế bệnh sinh của loét dạ dày tá tràng

Hình 5 Cấu trúc của vi khuẩn H pylori [28]

Như vậy tổn thương niêm mạc dạ dày do H pylori gây viêm loét dạ dày qua 3

cơ chế khác nhau: sự thay đổi sinh lí dạ dày, nhiễm độc trực tiếp từ các sản phẩm của

vi khuẩn, các phản ứng viêm với sự giải phóng nhiều sản phẩm phản ứng độc tố khác nhau Nếu nhiễm trùng không được điều trị thì sau 10 - 20 năm sẽ teo niêm mạc dạ dày, làm tăng pH dạ dày lên 6-8 Các tuyến bị mất, viêm teo niêm mạc dạ dày và dị sản ruột, điều này có thể khởi đầu cho giai đoạn ác tính [16][24][81]

Tại các quốc gia như Hàn Quốc, Nhật Bản và Mông Cổ, dù tỷ lệ nhiễm H pylori - yếu tố nguy cơ chính của viêm loét dạ dày tá tràng và UTDD - đã giảm nhờ

vào các chương trình kiểm soát và điều trị tuy nhiên tỷ lệ mắc UTDD vẫn duy trì ở mức cao Điều này đặt ra câu hỏi rằng liệu còn các yếu tố nguy cơ nào khác góp phần làm tăng khả năng phát triển UTDD ở các quốc gia này Một giả thuyết nổi bật là vai trò của các yếu tố đồng nhiễm như Epstein-Barr virus (EBV) và human herpesvirus-

6 (HHV-6) trong việc thúc đẩy quá trình tiến triển thành ung thư ở những bệnh nhân

có tiền sử viêm loét dạ dày tá tràng Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng

sự đồng nhiễm EBV và HHV-6 có thể làm tăng nguy cơ UTDD, đặc biệt là trong những trường hợp có viêm mãn tính hoặc tổn thương ở niêm mạc dạ dày [83] Cả hai

virus này đều có khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô và tạo ra các thay đổi gen và biến đổi tế bào có khả năng dẫn đến ung thư, đặc biệt là khi kết hợp với các tổn thương

từ viêm nhiễm mạn tính do H pylori gây ra [77]

1.2.2 Epstein-Barr virus

Epstein-Barr virus (EBV hay HHV-4), thuộc họ Herpesviridae, là một loại Herpes virus ở người lần đầu tiên được phát hiện năm 1963 từ một tế bào ung thư hạch Burkitt EBV có đường kính khoảng 122 nm đến 180 nm Vật chất di truyền của EBV là chuỗi xoắn kép DNA với khoảng 172.000 cặp base chứa khoảng 85 gen được bao quanh bởi một protein vỏ (nucleocapsid protein) Phân tử nucleocapsid bao gồm protein chính VCA-p18 và protein gắn kết Bọc bên ngoài nucleocapsid là lớp màng lipid kép chứa các glycoprotein bề mặt quan trọng giúp EBV xâm nhập vào tế bào vật chủ

Hình 6 Cấu trúc của Epstein-Barr virus [61]

Epstein-Barr virus là loại virus gây ung thư đầu tiên được giới y khoa mô tả [49] Người ta phát hiện ra rằng EBV có liên quan đến nhiều loại khối u có nguồn gốc từ tế bào B như u lympho Burkitt, bệnh tăng sinh bạch huyết sau cấy ghép và bệnh Hodgkin, các tình trạng liên quan đến virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) và u lympho của hệ thần kinh trung ương EBV cũng được phát hiện từ các khối u biểu mô, bao gồm ung thư biểu mô vòm họng và ung thư biểu mô dạ dày [42] Năm 1990, Bruke và cộng

sự phát hiện Epstein-Barr virus trong UTDD biểu mô tế bào vảy dạng lympho [16] Đây

là báo cáo mô bệnh học đầu tiên về UTDD liên quan EBV

Nishikawa và cộng sự đã phát hiện ra rằng UTDD do EBV được xuất phát từ

viêm dạ dày mạn tính nhiễm H pylori [36] Đối với các chủng H pylori cagA+, được biết đến là có liên quan đến độc lực cao hơn, tương tác đồng nhiễm giữa EBV và H pylori càng được gia tăng, từ đó làm tăng nguy cơ mắc UTDD [33] UTDD liên quan

đến EBV chiếm khoảng 10% số ca UTDD trên toàn thế giới [61] Tuy nhiên, UTDD liên quan đến EBV hiện vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu [66][84]

Nghiên cứu của Shukla và cộng sự đã tìm được mối liên hệ có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) khi có mặt EBV trong mô dạ dày của bệnh nhân loét dạ dày tá tràng (70%) khi so sánh với mô dạ dày của bệnh nhân không mắc các bệnh lý dạ dày [75] Nghiên

cứu của Shukla và cộng sự cho thấy đồng nhiễm EBV và H pylori trong thời gian dài

sẽ dẫn tới các tổn thương tế bào, gây ra các đột biến về gen, thúc đẩy sự gia tăng của các tác nhân ung thư trong cơ thể (hình 1.8) [19] Một nghiên cứu khác cũng cho thấy

có mối liên quan giữa EBV và H pylori trong cơ chế bệnh sinh của loét dạ dày tá tràng

[72] Nghiên cứu của Jin Hee Noh và cộng sự cho thấy tình trạng nhiễm hay không

nhiễm EBV ở bệnh nhân UTDD, bất kể là bệnh nhân âm tính hay dương tính với H pylori, đều ảnh hưởng tới bệnh học lâm sàng của các loại UTDD [44]

Hiện nay, cơ chế truyền nhiễm của EBV vẫn còn được các nhà khoa học nghiên cứu [82] Sau khi thực bào, vật chất di truyền của EBV được vận chuyển tới nhân tế bào Tại đó, hệ genome DNA dạng sợi thẳng của EBV được ghép thành dạng vòng nhỏ nhằm bảo vệ DNA khỏi hư hại cấu trúc và đảm bảo hệ gen của EBV được biểu hiện liên tục [51] Khi bước vào thời gian ủ bệnh, EBV thúc đẩy methyl hóa trong hệ genome của tế bào chủ, làm mất cân bằng các chu trình tế bào dẫn tới bất thường trong biểu hiện gen, từ đó tạo ra một môi trường thuận lợi cho các khối u phát triển [39][82] Năm

2014, nghiên cứu di truyền học biểu sinh của Liang trên đối tượng bệnh nhân ung thư

dạ dày dương tính EBV phát hiện 216 gene bị giảm biểu hiện do sự tăng methyl hóa xúc tác bởi EBV Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra, trong các khối u dương tính với

EBV, sự methyl hóa được gia tăng đáng kể ở các gene ACSS1, FAM3B, IHH, TRABD

và năm đường truyền tín hiệu ở tế bào bị ảnh hưởng đáng kể [50]

Hình 7 Bộ gen của Epstein–Barr virus: a) Hình ảnh hiển vi điện tử cho thấy cấu trúc virion của EBV; b) Sơ đồ vị trí các gen tiềm ẩn của EBV trên chuỗi DNA sợi

kép [52]

Hệ genome của EBV mã hóa cho các protein gây ung thư (oncoproteins) tác động đến các chu trình tế bào quan trọng [19] EBV có ba loại pha tiềm tàng [27] Đối với UTDD liên quan EBV, tác động của EBV diễn ra thông qua con đường của pha tiềm tàng loại I (latency type Infection) và sự tái kích hoạt và biểu hiện các gene tiềm tàng (latent gene) [30] Trong đó, các phân tử protein EBERs, EBNA-1, LMP2A

và miR-BARTS được biểu hiện với mức độ cao và chiếm một vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của virus [50][56] EBNA-1 hỗ trợ EBV gắn vật liệu di truyền vào chromosome của tế bào chủ [73] Phân tử protein EBNA-1 có thể làm suy giảm số lượng thể hạt nhân protein tiền tủy bào (protein PML) Đây là tác nhân có vai trò quan trọng trong chết tế bào theo chu trình và ức chế khối u Đồng thời, EBNA-1 còn làm suy yếu phản ứng của tế bào đối với những hư hại trong cấu trúc DNA [73] LMP2A

là phân tử protein quan trọng nhất trong thời gian ủ bệnh của Epstein-Barr virus [82] Phân tử này có thể tác động đến con đường của yếu tố nhân Kappa B (NF-kB), một yếu tố phiên mã kiểm soát quá trình biểu hiện gen mã hóa của yếu tố phát triển và

các phân tử như cytokine, chemokine và các các phân tử bán dính tế bào cũng như các protein pha cấp [34][92] Từ đó, LMP2A kiểm soát sự biểu hiện của cycline E,

số lượng tế bào ở pha S, từ đó thúc đẩy phân bào [53][67]

Hiện tại UTDD dương tính EBV được cho là có liên quan đến tiên lượng bệnh tốt [93] Tuy nhiên các cơ chế liên quan đến sự tương tác hiệp đồng giữa Epstein-

Barr virus và H pylori và ảnh hưởng của chúng đối với bệnh lý dạ dày hiện vẫn đang

là câu hỏi còn bỏ ngỏ và đang được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu Hiện nay, ở

Việt Nam chưa có báo cáo nào đánh giá tỷ lệ nhiễm EBV và đồng nhiễm EBV với H pylori trong các đối tượng bệnh nhân có bệnh lý dạ dày Do vậy, việc đánh giá tỷ lệ

nhiễm này nắm giữ một vai trò có ý nghĩa trong việc hỗ trợ xây dựng các phác đồ điều trị bệnh dạ dày hiệu quả ở Việt Nam

Hình 8 Tương tác gây bệnh giữa EBV và H pylori [24]

1.2.3 Human herpesvirus-6 (HHV-6)

Human herpesvirus-6 (HHV-6) là loại virus phổ biến thường bị nhiễm từ thời thơ ấu HHV-6 có 2 subtype là HHV-6A và HHV-6B, được Uỷ ban Quốc tế về Phân loại virus phân loại là 2 loại virus khác biệt vào năm 2012 [8] Trong đó, HHV-6B là loại phổ biến hơn với hơn 90% dân số bị nhiễm trong vòng 3 năm đầu đời [26] Kháng nguyên human herpesvius-6 đã từng được tìm thấy trong niêm mạc dạ dày tá tràng của các bệnh nhân ghép gan chưa từng nhiễm HHV-6, đồng thời tất cả tất cả các chủng HHV-6 được phát hiện đều là biến thể HHV-6B Nhóm nghiên cứu tại Đại học Pittsburgh đã sử dụng Bản đồ bộ gen ung thư (Cancer Genome Atlas) đã phát hiện ra

sự có mặt của HHV-6 trong 3,9 % trường hợp các bệnh nhân ung thư dạ dày trong khi không tìm thấy ở các mẫu dạ dày khoẻ mạnh [93] Bằng phương pháp tin sinh, Cao cùng cộng sự đã tìm thấy HHV-6 với tỷ lệ tương đối cao ở các bệnh nhân ung thư tiêu hoá, trong đó 3,5% trong ung thư biểu mô dạ dày [24] Trong một số trường hợp, HHV-6 được phát hiện bằng ảnh giải trình tự DNA và RNA [26] Human herpesvirus-6 (HHV-6) thuộc phân họ 𝛽-Herpesvirus thường gây ra bệnh sốt phát ban ở trẻ em

Như nhiều herpesvirus khác, HHV-6 tồn tại ở trong vật chủ ở dạng tiềm tàng và

có thể tái kích hoạt lại khi bị ức chế miễn dịch Nghiên cứu của L Halme và cộng sự chỉ ra tác động gián tiếp chính của HHV-6 là do khả năng tác động hiệp đồng làm trầm trọng thêm các bệnh truyền nhiễm khác gây viêm niêm mạc dạ dày [37] Nghiên cứu của Elva Eliassen và cộng sự cũng cho thấy rằng, trong một số trường hợp, HHV-6 có

thể cùng tác động với EBV và H pylori thúc đẩy sự phát triển của ung thư dạ dày [26]

HHV-6 thuộc họ Herpesviridae và có cấu trúc khá phức tạp, bao gồm ba thành

phần chính: lõi DNA, vỏ capsid, và lớp bao lipid bên ngoài Lõi trung tâm của

HHV-6 chứa một phân tử DNA sợi kép, có kích thước khoảng 1HHV-62 kilobase, mã hóa hơn

100 gen DNA này được bảo vệ bởi vỏ capsid hình khối icosahedral, bao gồm khoảng

162 capsomere Lớp capsid này được bao bọc bởi một vỏ protein phức tạp, được gọi

là tegument, chứa các protein chức năng giúp virus xâm nhập và tái tạo trong tế bào vật chủ Bên ngoài lớp tegument là lớp bao lipid, chứa các glycoprotein đóng vai trò

trong việc bám dính và xâm nhập vào tế bào chủ Các glycoprotein này như gB, gH,

và gL tạo điều kiện để virus tương tác với các thụ thể tế bào, cho phép quá trình hợp nhất màng và xâm nhập vào bên trong tế bào Cấu trúc ba lớp này giúp HHV-6 có khả năng ẩn nấp trong hệ miễn dịch của người và tái hoạt động trong điều kiện suy giảm miễn dịch

Hình 9 Cấu trúc vỏ của Human herpesvirus-6 [92]

HHV-6A và HHV-6B có điểm nổi bật so với các Human herpervirus khác là khả năng tích hợp vào đầu telomer của chromosome như là một dạng của pha tiềm tàng Khoảng 1% dân số thế giới mang chromosome di truyền có tích hợp HHV-6 với toàn bộ hệ gen của HHV-6 được tích hợp vào vùng cận đầu tận cùng của chromosome ở các tế bào có nhân [82] Các vùng gen được tích hợp của HHV-6 có thể được kích hoạt trở lại bởi thuốc [51] và bệnh nhân bị ức chế miễn dịch có thể xuất hiện viêm nhiễm có triệu chứng từ các chủng HHV-6 được tích hợp [27] Sự tích hợp này có thể thay đổi độ bền của telomere, dẫn đến các bất thường về gen và tăng nguy

cơ ung thư [34][90] Theo nghiên cứu của National Institutes of Health (NIH) vào năm 2024, tỷ lệ nhiễm HHV-6 trong các bệnh lý đường tiêu hóa cho thấy sự khác biệt

rõ rệt tùy theo loại bệnh lý Cụ thể, tỷ lệ nhiễm HHV-6 trong viêm niêm mạc dạ dày

là 10%, trong loét dạ dày tá tràng là 18%, và trong ung thư dạ dày là 5,1% Nghiên cứu đã cho thấy HHV-6 gây ra nhiều triệu chứng ở đường tiêu hóa như tiêu chảy,

viêm nhiễm, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa [70] Mối liên hệ giữa HHV-6 và các biện chứng liên quan đến các bệnh túi mật cũng đã được nhiều nghiên cứu chỉ ra [70]

Nghiên cứu của nhóm tại Đại học Pittsburgh đã sử dụng Bản đồ Bộ gen Ung thư (Cancer Genome Atlas) và phát hiện ra sự có mặt của HHV-6 trong 5.1% trường hợp ung thư dạ dày, trong khi không tìm thấy ở các mẫu dạ dày khỏe mạnh [30] Cao

và cộng sự cũng đã sử dụng phương pháp tin sinh để tìm thấy HHV-6 với tỷ lệ tương đối cao ở các bệnh nhân ung thư tiêu hóa, bao gồm 3,5% trong ung thư biểu mô dạ dày [49] Trong một số trường hợp, HHV-6 được phát hiện bằng ảnh giải trình tự DNA và RNA [52]

Các yếu tố đồng nhiễm như EBV và HHV-6 không chỉ hoạt động độc lập mà

còn có thể phối hợp với H pylori, tạo ra một môi trường phức tạp và nguy hiểm trong

dạ dày Khi các yếu tố này cùng tồn tại, nguy cơ phát triển UTDD sẽ tăng lên do tác động cộng hưởng từ các cơ chế gây viêm, đột biến gen và suy yếu miễn dịch Trong trường hợp của các quốc gia châu Á như Hàn Quốc và Nhật Bản, nơi mà tỷ lệ nhiễm

H pylori đã giảm nhờ vào các biện pháp phòng ngừa, tỷ lệ UTDD vẫn cao có thể là

do tác động tổng hợp của các yếu tố đồng nhiễm này Điều này cho thấy rằng, bên

cạnh H pylori, các yếu tố đồng nhiễm cần được chú ý và kiểm soát, đặc biệt là trong

các chương trình phòng ngừa ung thư Các nghiên cứu cho thấy rằng việc phát hiện sớm và kiểm soát EBV và HHV có thể là một hướng đi tiềm năng để giảm thiểu nguy

cơ UTDD, đồng thời giúp cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân [90]

Tại Việt Nam, hiện vẫn chưa có nghiên cứu nào đánh giả tỷ lệ nhiễm cũng như có mặt của HHV-6 trên các đối tượng bệnh nhân có bệnh lý dạ dày tá tràng Việc phát hiện sớm nhiễm EBV và HHV-6, nghiên cứu sinh bệnh học của EBV, HHV-6 ở bệnh nhân có bệnh lý dạ dày sẽ cho phép đánh giá chính xác tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr Virus và human herpesvirus-6 trên đối tượng bệnh nhân có bệnh lý dạ

dày nhiễm và không nhiễm H pylori, từ đó giúp mang đến cái nhìn đa chiều hơn về

vai trò của EBV và HHV-6 với tiên lượng bệnh ở bệnh nhân viêm loét dạ dày nhiễm

và không nhiễm H pylori

1.3 Các phương pháp xét nghiệm phát hiện H pylori, EBV và HHV-6

H.pylori là một loại vi khuẩn có liên quan mật thiết đến nhiều bệnh lý dạ dày,

bao gồm viêm loét dạ dày, tá tràng và UTDD EBV và HHV-6 cũng là các yếu tố nguy cơ thúc đẩy sự tiến triển của bệnh Việc phát hiện các tác nhân này kịp thời có

ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán và điều trị bệnh lý dạ dày, giúp kịp thời ngăn ngừa các biến chứng nghiêm trọng Hiện nay, có nhiều phương pháp xét nghiệm

phát hiện H pylori, EBV và HHV-6, mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm

khác nhau

1.3.1 Phương pháp mô bệnh học

Phương pháp này là một phương pháp quan trọng khi thực hiện xét nghiệm trên mẫu bệnh phẩm mô Kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch giúp phát hiện kháng nguyên EBV-LMP1 và kỹ thuật lai tại chỗ phát hiện RNA mã hoá hởi EBV được xem là tiêu chuẩn vàng để phát hiện EBV Kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng được áp dụng để nhận diện protein capsid của virus hoặc

kỹ thuật lai tại chỗ phát hiện DNA của HHV-6 trong mô là hai phương pháp thường

được sử dụng để phát hiện HHV-6 [46] Đối với H pylori, nhuộm hoá mô miễn dịch

và nhuộm bạc Warthin-Starry có khả năng phát hiện vi khuẩn ngay cả ở mật độ

thấp, nhuộm giemsa thường được sử dụng để quan sát rõ hình thái của H pylori Trong khi đó nhuộm H.E chỉ giúp quan sát được vị trí của vi khuẩn H pylori trên

bề mặt hoặc trong lớp nhầy dạ dày, tuy nhiên độ nhạy của phương pháp này thấp hơn so với các phương pháp trên [35] Các kỹ thuật này đều đòi hỏi chuyên môn cao, kỹ thuật phức tạp, chi phí thực hiện cao, thời gian xử lý lâu và đặc biệt yêu cầu xâm lấn Do vậy, các phương pháp mô bệnh học chỉ phù hợp để nghiên cứu sâu về ảnh hưởng của các tác nhân lên dạ dày chứ không phù hợp cho sàng lọc và chẩn đoán nhanh ban đầu, nhất là với các tác nhân EBV và HHV-6

1.3.2 Phương pháp nuôi cấy

Phân lập, nuôi cây luôn được đánh giá là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán các căn nguyên vi sinh từ đó đánh giá được các đặc điểm sinh học như độ nhạy và tình trạng kháng thuốc của các vi sinh vât thông qua kháng sinh đồ Kết quả kháng sinh

đồ rất hữu ích hỗ trợ cho các bác sĩ lựa chọn phương án điều trị phù hợp và hiệu quả cho bệnh nhân Tuy nhiên, phương pháp này đạt ra một số thách thức:

+ Việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy phù hợp cho từng vi sinh vật cần sự đầu tư lớn về cơ sở vật chất, nhân lực, thiết bị, sinh phẩm hóa chất cũng như hệ thống kiểm soát an toàn Phân lập virus từ mẫu bệnh phẩm cần những yêu cầu nghiêm ngặt

về an toàn sinh học do đó không nằm trong các khuyến cáo chẩn đoán thường quy tìm căn nguyên virus

+ Hiệu quả nuôi cấy phụ thuộc lớn và khả năng thích ứng của các vi sinh vật

trong môi trường in vitro

+ Thời gian nuôi cấy thường kéo dài hơn các phương pháp chẩn đoán khác

nên Thời gian từ thời điểm phân lập H pylori từ mảnh sinh thiết đến khi thu được

chủng để định danh có thể kéo dài 3-5 ngày

Với những đặc điểm kể trên mặc dù nuôi cấy vẫn được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán căn nguyên vi sinh tuy nhiên không khả thi trong thực hành đối với các chẩn đoán các căn nguyên virus, và chỉ thực sự cần thiết khi phải tiến hành đánh giá kháng sinh đồ đối với vi khuẩn

1.3.3 Phương pháp miễn dịch

Một phương pháp xét nghiệm khác hay được sử dụng là xét nghiệm huyết thanh, trong đó kiểm tra sự hiện diện của các kháng thể IgG, IgM sản sinh ra để đáp

ứng với sự nhiễm của các tác nhân H pylori, EBV và HHV-6 trong máu của bệnh

nhân Đây là phương pháp đơn giản và chi phí thấp, đặc biệt thích hợp cho các chương trình sàng lọc trong cộng đồng hoặc nghiên cứu dịch tễ học Các xét nghiệm miễn dịch có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, thời gian thực hiện nhanh, có thể cho kết quả trong vài phút đến vài giờ Tuy nhiên, nhược điểm lớn của phương pháp này là không phân biệt được nhiễm trùng hiện tại với nhiễm trùng cũ, vì kháng thể cho các tác nhân trên vẫn tồn tại trong máu sau khi chúng đã bị tiêu diệt, dẫn đến nguy cơ dương tính giả cao hơn [1] Bên cạnh đó, các kết quả hiệu giá kháng thể lại không giúp xác định được nồng độ vi khuẩn, vius mà chỉ xác định được bệnh nhân nhiễm hay không nhiễm các yếu tố gây bệnh

1.3.4 Phương pháp sinh hoá

Đối với một số vi khuẩn do các đặc tính sinh học đặc trưng của chúng có thể phát triển các xét nghiệm nhanh cho phép phát hiện tại chỗ như CLO test đối với vi

khuẩn H pylori Xét nghiệm nhanh urease dựa vào cơ chế phân hủy urea trong dạ dày của enzyme urease tiết nhiều bởi vi khuẩn H pylori Cơ chế của phản ứng như sau:

(NH2)2CO + H2O à CO2 +2NH3

Dung dịch urease test chứa 2% urea và phenol red trong dung dịch đóng vai trò

là chất chỉ thị độ pH Sự thay đổi pH trong môi trường do NH3 sinh ra trong quá trình phân hủy urea làm thay đổi màu dung dịch từ vàng (pH 6.8) lên màu hồng sáng (pH

8.2) Phương pháp xét nghiệm H pylori này cho độ nhạy (93 - 97%), độ đặc hiệu (95

- 100%) Hạn chế của phương pháp này là độ nhạy thấp, cần phải có ít nhất 105 vi khuẩn trong mảnh sinh thiết mới đủ để làm đổi màu dung dịch Không thể dùng xét nghiệm này để chẩn đoán ở cuối đợt điều trị vì có thể vi khuẩn vẫn còn nhưng không nhiều không đủ để đổi màu dung dịch Bên cạnh đó, có một số vi khuẩn tiết urease có

ở miệng như Streptococcus, Staphylococcus có thể cho kết quả dương tính giả

1.3.5 Phương pháp Realtime PCR

Một kỹ thuật xét nghiệm đang được ưa chuộng hiện nay là kỹ thuật Realtime PCR Kỹ thuật Realtime PCR là kỹ thuật có thể sử dụng được nhiều loại bệnh phẩm khác nhau, phát hiện được nhiều mục tiêu, đáp ứng được các yêu cầu như cho kết quả nhanh chóng, chính xác Kỹ thuật này sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu để nhân bản và phát hiện vật chất di truyền của tác nhân trong mẫu bệnh phẩm kể cả ở nồng độ thấp

Trong phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction), mạch khuôn của vật chất di truyền được khuyếch đại lên số lượng lớn bản sao nhờ enzyme polymerase Thành phần chính của phản ứng Realtime PCR bao gồm vật chất di truyền của mẫu, mồi (primer), đầu dò TaqMan, và mastermix Mastermix là hỗn hợp

đã chuẩn bị sẵn gồm enzyme tổng hợp DNA polymerase (như Taq polymerase), deoxynucleotide triphosphate (dNTPs), dung dịch đệm (thường là Tris-KCl với pH khoảng 8-9), và ion Mg²⁺, cung cấp môi trường phù hợp cho hoạt động tối ưu của phản ứng PCR Vật chất di truyền của mẫu là phân tử mục tiêu cần được khuếch đại

Bộ đôi mồi xuôi và mồi ngược, các đoạn oligonucleotide ngắn khoảng 18-30 nucleotide, sẽ bám vào hai đầu của đích và tạo điều kiện cho enzyme Taq polymerase khởi động quá trình tổng hợp Để đảm bảo độ chính xác, các mồi phải đáp ứng những tiêu chí cụ thể về trình tự, hàm lượng GC (thường trong khoảng 35-65%), và nhiệt độ nóng chảy Tm thích hợp (thường từ 50-65°C) Đầu dò TaqMan là một đoạn oligonucleotide có gắn chất phát huỳnh quang và chất hấp thụ ở hai đầu

Việc thiết kế mồi của nghiên cứu được dựa trên những nguyên tắc sau: mồi có chiều dài từ 15-30 nucleotide với hàm lượng GC trong khoảng 30-80% Về trình tự nucleotide, nucleotide G và C phải được phân bố đều khắp trình tự thiết kế Nucleotide G và C nằm ở hai đầu của mồi nhưng tránh trường hợp đầu 3’ của mồi có nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C có thể gây bắt cặp không đặc hiệu [25] Đồng thời, nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi được thiết kế nằm trong khoảng 50-65°C và chênh lệch nhiệt đô nóng chảy (∆Tm) không quá 5°C.Thiết kế trình tự đầu dò cũng tuân thủ những nguyên tắc này Bên cạnh đó, nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mẫu dò phải lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi từ 5-10°C nhằm đảm bảo cho việc bắt cặp hoàn toàn với sợi DNA khuôn trong bước bắt cặp và kéo dài của chu kỳ PCR Đồng thời không có G ở đầu 5’ của mẫu dò vì G có thể hấp thu ánh sáng huỳnh quang ngay cả khi mẫu DNA bị phân giải bởi Taq polymerase [4][7]

Chu trình nhiệt của Realtime PCR bao gồm ba giai đoạn: biến tính ở nhiệt độ cao (94 - 98°C) để phá vỡ liên kết hydro giữa các sợi DNA và tạo ra các sợi đơn; sau

đó là giai đoạn bắt cặp ở khoảng nhiệt độ 50-65°C, trong đó mồi và đầu dò sẽ gắn vào các sợi DNA khuôn; cuối cùng là giai đoạn kéo dài ở nhiệt độ tối ưu từ 60°C đến 72°C, nơi DNA polymerase tổng hợp nên mạch DNA mới Đồng thời, tín hiệu huỳnh quang tăng tỉ lệ thuận với sự gia tăng số bản sao chép DNA mới Tín hiệu này có thể được sinh ra bằng cách sử dụng thuốc nhuộm như SYBR Green (gắn vào DNA sợi đôi) hoặc đầu dò đặc hiệu như TaqMan (phát huỳnh quang khi bị enzyme polymerase phân cắt, giải phóng chất huỳnh quang), từ đó máy có thể ghi nhận tín hiệu phát ra và

đo lường sự gia tăng của DNA theo thời gian thực

Với phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện tại điểm kết thúc, bằng cách điện di trên gel agarose Ngược lại, Realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm vật chất di truyền được khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra Việc tiến hành phản ứng và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch đại

Đây là kỹ thuật chẩn đoán và xác định yếu tố gây bệnh tiên tiến và đang được phát triển để sử dụng rộng rãi ở Việt Nam cũng như trên thế giới Kỹ thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao so với các phương pháp khác Nhờ sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu, phương pháp này hạn chế tối đa các kết quả dương tính giả Realtime PCR

là một trong những phương pháp xét nghiệm có thời gian trả kết quả nhanh nhất hiện nay Quá trình này chỉ mất khoảng 1-2 giờ để hoàn thành, giúp cung cấp kết quả ngay trong ngày, hỗ trợ bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời Điều này đặc biệt quan trọng trong các trường hợp cần chẩn đoán nhanh để điều trị hoặc khi bệnh nhân không thể lưu lại lâu trong bệnh viện So với phương pháp nuôi cấy, vốn đòi hỏi thời gian vài ngày trở lên, Realtime PCR là một lựa chọn tối ưu cho những trường hợp cần xét nghiệm nhanh chóng và cho kết quả chính xác

Realtime PCR có thể áp dụng trên nhiều loại mẫu bệnh phẩm khác nhau, từ mẫu mô sinh thiết dạ dày đến mẫu phân hoặc dịch vị Điều này rất tiện lợi, đặc biệt khi bệnh nhân không thể thực hiện nội soi hoặc không thể cung cấp mẫu sinh thiết Khả năng linh hoạt trong loại mẫu bệnh phẩm của Realtime PCR làm cho nó trở thành một lựa chọn lý tưởng cho nhiều nhóm bệnh nhân khác nhau, bao gồm trẻ em và người cao tuổi

Ngoài khả năng chẩn đoán ban đầu, Realtime PCR còn rất hữu ích trong việc theo dõi quá trình điều trị và phát hiện tái nhiễm sau điều trị Do kỹ thuật này có độ nhạy cao,

nó có thể xác định được sự tồn tại của vi khuẩn, virus ngay cả ở mật độ rất thấp sau khi bệnh nhân đã hoàn thành liệu trình điều trị Điều này giúp bác sĩ đánh giá hiệu quả điều trị và phát hiện sớm các trường hợp tái nhiễm hoặc kháng thuốc, từ đó điều chỉnh phác

đồ điều trị kịp thời Khả năng theo dõi và kiểm soát tái nhiễm của Realtime PCR là một lợi thế lớn trong việc quản lý điều trị một cách hiệu quả và lâu dài

1.3.6 Phương pháp Realtime PCR phát hiện EBV, HHV-6 trong những nghiên cứu trước

Phương pháp Realtime PCR phát hiện EBV và phát hiện HHV-6 đã được nghiên cứu ở nhiều nghiên cứu trước với các vùng gen đích được lựa chọn khác nhau Để phát hiện EBV bằng Realtime PCR, một số vùng gen đích thường được

chọn là EBNA-1, BamHI-W, LMP-1, BHRF1 và BZLF1 EBNA-1 là gen của EBV

được biết đến với tính bảo tồn cao trong trình tự gen, đặc biệt là vùng C-terminal, nơi chứa các domain quan trọng cho chức năng của protein [30] Nghiên cứu của Zahra trên tạp chí Springer Nature đã phân tích trình tự vùng C-terminal của gen

EBNA-1 ở bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu lympho mạn tính và so sánh với nhóm đối

chứng khoẻ mạnh Kết quả cho thấy mặc dù có một số đột biến nhưng những domain quan trọng ở vùng C-terminal vẫn được bảo toàn, thể hiện tầm quan trọng của những

vùng này trong chức năng của EBNA-1 [99] Các điểm nóng đột biến của EBNA-1

đã được xác định rõ ràng trong các mẫu phân lập lâm sàng của EBV [80] Bên cạnh

đó, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra gen EBNA-1 là gen biểu hiện liên tục trong tất cả các

giai đoạn nhiễm EBV, kể cả là giai đoạn tiềm tàng hay giai đoạn hoạt động

[42][91][95] Do đó, gen EBNA-1 được chọn làm gen đích để khảo sát thiết kế mồi

phục vụ cho việc thiết lập phương pháp Realtime PCR phát hiện EBV [94] Đối với

HHV-6, gen U31 mã hoá cho protein tegument lớn có vai trò quan trọng trong chu

kỳ sống của virus, đặc biệt là trong quá trình xâm nhập và lắp ráp virus [28][68] Trong quá trình xâm nhập, protein U31 liên kết với capsid của virus, hỗ trợ vận chuyển capsid đến nhân tế bào chủ sau khi virus xâm nhập Điều này đảm bảo DNA của virus được đưa vào nhân để bắt đầu quá trình sao chép [68] Trong quá trình lắp ráp, protein U31 tham gia vào việc lắp ráp các thành phần của virus và đảm bảo sự

hình thành và hoàn thiện các hạt virus mới [28] Bên cạnh đó, trình tự gen U31 có

đồng thời độ bảo tồn và độ đặc hiệu cao nhất so với virus duy nhất cùng chi là

HHV-7 [28] Do đó, gen U31 được chọn để khảo sát thiết kế mồi phục vụ cho việc xây

dựng phương pháp Realtime PCR phát hiện HHV-6