Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và Đánh giá tỷ lệ nhiễm epstein barr virus, human herpes 6 Ở người việt nam có bệnh lý dạ dày Đồng nhiễm helicobacter pylori (tt)

pylori, với tỷ lệ nhiễm lên đến một nửa dân số thế giới, được xác định là nguyên nhân chính gây viêm dạ dày mạn, loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ dày, trong khi Epstein-Barr virus EBV

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

Hoàng Anh Hà

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN

VÀ ĐÁNH GIÁ TỶ LỆ NHIỄM EPSTEIN-BARR VIRUS, HUMAN HERPES-6 Ở NGƯỜI VIỆT NAM CÓ BỆNH LÝ DẠ

DÀY ĐỒNG NHIỄM HELICOBACTER PYLORI

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2024

Công trình được hoàn thành tại: Trung tâm Nghiên cứu Y học Việt Đức, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Huyền Trang PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân Phản biện:

PGS.TS Nguyễn Thuỳ Dương, Viện nghiên cứu hệ gene, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phản biện:

PGS.TS Đỗ Thị Phúc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc

sĩ họp tại P235 - T1, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồi 10 giờ 30 ngày 30 tháng

12 năm 2024

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU

Tỷ lệ mắc các bệnh lý dạ dày ở người trẻ ngày càng gia tăng, nếu không được điều trị kịp thời có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống và tiến triển thành ung thư dạ dày, loại ung thư phổ

biến đứng thứ năm theo GLOBOCAN 2022 Helicobacter pylori (H pylori), với tỷ lệ nhiễm lên đến một nửa dân số thế giới, được xác định

là nguyên nhân chính gây viêm dạ dày mạn, loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ dày, trong khi Epstein-Barr virus (EBV) và human herpesvirus-6 (HHV-6) thuộc họ Herpesvirus có thể gây nhiễm trùng tiềm ẩn liên quan đến ung thư biểu mô dạ dày và u lympho Tuy nhiên,

mối liên hệ đồng nhiễm giữa EBV, HHV-6 và H pylori trên bệnh lý

dạ dày và loét dạ dày tá tràng vẫn chưa được làm rõ.Từ thực tế này cho thấy việc nghiên cứu đặc điểm và mối liên hệ của EBV, HHV-6

và H pylori trên đối tượng bệnh nhân viêm, loét hoặc ung thư dạ dày

là cần thiết để hỗ trợ xây dựng các phác đồ điều trị các bệnh lý dạ dày

hiệu quả Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình đánh giá tỷ

lệ nhiễm Epstein-Barr virus, human herpesvirus-6 ở người Việt

Nam có bệnh lý dạ dày đồng nhiễm Helicobacter pylori” được thực

hiện với hai mục tiêu chính:

1 Xây dựng quy trình phát hiện Epstein-Barr virus và human herpesvirus-6 trên đối tượng người Việt Nam có bệnh lý dạ dày

nhiễm H pylori bằng phương pháp sinh học phân tử

2, Đánh giá tỷ lệ nhiễm Epstein-Barr virus và human herpesvirus-6 trên đối tượng bệnh nhân có bệnh lý dạ dày nhiễm

H pylori

Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm nghiên cứu Y học Việt Đức – Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 Thời gian nghiên cứu

từ tháng 4/2022 đến tháng 8/2024

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Dạ dày và các bệnh lý liên quan

1.1.1 Cấu tạo dạ dày

Dạ dày là một cơ quan vô cùng quan trọng đối với sức khoẻ của con người, là bộ phận đảm nhiệm việc phân giải và hấp thụ các chất dinh dưỡng thiết yếu trong hệ tiêu hoá Vai trò này vô cùng quan trọng đối với sự ổn định của quá trình trao đổi chất và sự phát triển của cơ thể Cấu tạo của dạ dày được chia thành tám phần

1.1.2 Các bệnh lý dạ dày

1.1.2.1 Viêm dạ dày

Viêm dạ dày là tình trạng viêm ở màng nhầy dạ dày, có liên quan

đến viêm bạch cầu trung tính và độc tính của vi khuẩn H pylori Tỷ lệ

viêm dạ dày khác nhau giữa các khu vực, cao hơn ở các nước đang phát triển (50,8%) so với các nước phát triển (34,7%) Ở Việt Nam,

chưa có nghiên cứu quy mô lớn, nhưng tỷ lệ nhiễm H pylori trong

cộng đồng dao động từ 56 - 75,2% theo xét nghiệm huyết thanh học

và 53 - 89,5% qua nội soi Trong các trường hợp viêm dạ dày mạn, tỷ

lệ nhiễm H pylori ở miền Bắc từ 53 - 72,8%, trong khi tại TP.HCM

là 64,7%

1.1.2.2 Loét dạ dày

Loét dạ dày tá tràng là tổn thương do axit gây phá vỡ lớp niêm mạc, liên quan đến nhiễm H pylori và sử dụng thuốc kháng viêm không steroid không kiểm soát Trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh trong dân số khoảng 5 - 10%, với tỷ lệ mắc mới hàng năm là 0,1 - 0,3% [64] Tại Việt Nam, 26% dân số mắc viêm loét dạ dày tá tràng, 70% có nguy cơ

mắc bệnh, với tỷ lệ ở nam giới cao gấp 4 lần nữ giới

1.1.2.3 Ung thư dạ dày

Theo thống kê của GLOBOCAN cho đến năm 2022, UTDD có tần suất chẩn đoán cao thứ năm trong các loại ung thư và nguyên nhân tử vong liên quan đến ung thư cao thứ ba, chiếm 6,8% tổng số ca tử vong

do ung thư Nguyên nhân chính của UTDD là đa yếu tố, mặc dù vậy

việc nhiễm vi khuẩn H pylori đến hiện nay vẫn được coi là nguyên nhân

thứ yếu [78] UTDD là một trong số ít các loại ung thư có liên quan đến tác nhân truyền nhiễm [21] Có sự chênh lệch về tỷ lệ mắc UTDD giữa các quốc gia với hơn 70% số ca UTDD là ở các nước đang phát triển Trong đó, các điểm nóng về tỷ lệ mắc UTDD tập trung ở ba khu vực bao gồm Đông Á, Đông Âu và Nam Mỹ [64] Theo GLOBOCAL năm

2022, tại Việt Nam số ca mắc mới UTDD là 16.277, chiếm 9% số ca ung thư mắc mới, đứng thứ năm sau ung thư vú và ung thư gan Đặc biệt, tuổi bệnh nhân UTDD đang dần trẻ hoá, đa phần dưới 40 tuổi chiếm tỷ lệ khoảng 20 – 25%

1.2 Các yếu tố nguy cơ gây ra bệnh lý dạ dày

1.2.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori (H pylori)

1.2.1.1 Đặc điểm sinh học của H pylori

H pylori là xoắn khuẩn Gram âm, hình chữ S, sản sinh lượng lớn

urease, giúp vi khuẩn trung hòa acid dạ dày bằng cách thủy phân ure thành amoniac và carbon dioxide Vi khuẩn này sống trong môi trường dạ dày của hơn một nửa dân số thế giới Theo nghiên cứu năm 2017, châu Phi, châu Mỹ Latin, Caribe và châu Á là những khu vực có tỷ lệ nhiễm H pylori cao nhất, lần lượt là 79,1%, 63,4% và 54,7% Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm H pylori ở người viêm dạ dày mạn tính là trên 55%, loét dạ dày tá tràng trên 70%, và ung thư dạ dày trên 60%, không khác biệt giữa Hà Nội

và TP.HCM Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xếp H pylori vào nhóm

tác nhân gây ung thư số một [86]

1.2.1.2 Cơ chế gây bệnh của Helicobacter pylori

Tổn thương niêm mạc dạ dày do H pylori gây viêm loét dạ dày

qua 3 cơ chế khác nhau: sự thay đổi sinh lí dạ dày, nhiễm độc trực tiếp

từ các sản phẩm của vi khuẩn, các phản ứng viêm với sự giải phóng nhiều sản phẩm phản ứng độc tố khác nhau Nếu nhiễm trùng không được điều trị thì sau 10 - 20 năm sẽ teo niêm mạc dạ dày, làm tăng pH

dạ dày lên 6-8 Các tuyến bị mất, viêm teo niêm mạc dạ dày và dị sản ruột, điều này có thể khởi đầu cho giai đoạn ác tính Những nghiên

cứu gần đây đã chứng minh rằng sự đồng nhiễm H pylori và EBV và

HHV-6 có thể làm tăng nguy cơ UTDD, đặc biệt là trong những trường hợp có viêm mãn tính hoặc tổn thương ở niêm mạc dạ dày [83] Cả hai virus này đều có khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô và tạo ra các thay đổi gen và biến đổi tế bào có khả năng dẫn đến ung thư, đặc biệt

là khi kết hợp với các tổn thương từ viêm nhiễm mạn tính do H pylori

1.2.2 Epstein-Barr virus

Hiện tại UTDD dương tính Epstein-Barr virus (EBV) được cho là

có liên quan đến tiên lượng bệnh tốt Tuy nhiên các cơ chế liên quan

đến sự tương tác hiệp đồng giữa EBV virus và H pylori và ảnh hưởng

của chúng đối với bệnh lý dạ dày hiện vẫn đang là câu hỏi còn bỏ ngỏ

và đang được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu Hiện nay, ở Việt Nam chưa có báo cáo nào đánh giá tỷ lệ nhiễm EBV và đồng nhiễm

EBV với H pylori trong các đối tượng bệnh nhân có bệnh lý dạ dày

1.2.3 Human herpesvirus-6 (HHV-6)

Theo nghiên cứu của National Institutes of Health (NIH) vào năm

2024, tỷ lệ nhiễm HHV-6 trong các bệnh lý đường tiêu hóa cho thấy

sự khác biệt rõ rệt tùy theo loại bệnh lý Cụ thể, tỷ lệ nhiễm HHV-6 trong viêm niêm mạc dạ dày là 10%, trong loét dạ dày tá tràng là 18%,

và trong ung thư dạ dày là 5,1% Nghiên cứu đã cho thấy HHV-6 gây

ra nhiều triệu chứng ở đường tiêu hóa như tiêu chảy, viêm nhiễm, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa

1.3 Các phương pháp xét nghiệm phát hiện H pylori, EBV và

HHV-6

1.3.1 Phương pháp mô bệnh học

Các phương pháp mô bệnh học đều đòi hỏi chuyên môn cao, kỹ thuật phức tạp, chi phí thực hiện cao, thời gian xử lý lâu và đặc biệt yêu cầu xâm lấn Do vậy, các phương pháp mô bệnh học chỉ phù hợp

để nghiên cứu sâu về ảnh hưởng của các tác nhân lên dạ dày chứ không phù hợp cho sàng lọc và chẩn đoán nhanh ban đầu, nhất là với các tác nhân EBV và HHV-6

1.3.2 Phương pháp nuôi cấy

Phân lập và nuôi cấy vi sinh vật là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán

và đánh giá đặc điểm sinh học như độ nhạy và kháng thuốc, nhưng đòi hỏi đầu tư lớn về cơ sở vật chất và kiểm soát an toàn Tuy nhiên, do thời gian nuôi cấy kéo dài và yêu cầu khắt khe, phương pháp này không phù hợp để chẩn đoán các căn nguyên virus mà chỉ cần thiết khi đánh giá kháng sinh đồ đối với vi khuẩn

1.3.3 Phương pháp miễn dịch

Phương pháp xét nghiệm miễn dịch đơn giản, chi phí thấp, phù hợp cho sàng lọc cộng đồng và nghiên cứu dịch tễ học, với ưu điểm độ nhạy cao và thời gian thực hiện nhanh Tuy nhiên, phương pháp này không phân biệt được nhiễm trùng hiện tại hay cũ, dễ dẫn đến dương tính giả và không xác định được nồng độ tác nhân gây bệnh

1.3.4 Phương pháp sinh hoá

CLO test là xét nghiệm nhanh phát hiện H pylori tại chỗ với độ nhạy

93-97% và độ đặc hiệu 95-100%, nhưng yêu cầu số lượng vi khuẩn đủ lớn để đạt kết quả chính xác Phương pháp này không phù hợp chẩn

đoán cuối đợt điều trị và có nguy cơ dương tính giả do các vi khuẩn

khác như Streptococcus hoặc Staphylococcus tiết urease

1.3.5 Phương pháp Realtime PCR

Realtime PCR là kỹ thuật xét nghiệm tiên tiến, cho phép phát hiện

và định lượng vật chất di truyền ngay trong quá trình phản ứng, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian trả kết quả nhanh, hỗ trợ chẩn đoán

và quyết định điều trị kịp thời Phương pháp này áp dụng trên nhiều loại mẫu bệnh phẩm, không chỉ chẩn đoán ban đầu mà còn theo dõi quá trình điều trị và phát hiện tái nhiễm ngay cả khi vi khuẩn hoặc virus ở mật độ rất thấp

1.3.6 Phương pháp Realtime PCR phát hiện EBV, HHV-6 trong những nghiên cứu trước

EBNA-1 là gen của EBV được biết đến với tính bảo tồn cao trong

trình tự gen, đặc biệt là vùng C-terminal, nơi chứa các domain quan trọng cho chức năng của protein [30] Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu

đã chỉ ra gen EBNA-1 là gen biểu hiện liên tục trong tất cả các giai

đoạn nhiễm EBV, kể cả là giai đoạn tiềm tàng hay giai đoạn hoạt

động Do đó, gen EBNA-1 được chọn làm gen đích để khảo sát thiết

kế mồi phục vụ cho việc thiết lập phương pháp Realtime PCR phát

hiện EBV Đối với HHV-6, gen U31 mã hoá cho protein tegument

lớn có vai trò quan trọng trong chu kỳ sống của virus, đặc biệt là trong quá trình xâm nhập và lắp ráp virus Bên cạnh đó, trình tự gen

U31 có đồng thời độ bảo tồn và độ đặc hiệu cao nhất so với virus duy nhất cùng chi là HHV-7 Do đó, gen U31 được chọn để khảo sát thiết

kế mồi phục vụ cho việc xây dựng phương pháp Realtime PCR phát hiện HHV-6

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu lựa chọn 248 bệnh nhân đến nội soi tại bệnh viện Trung ương Quân đội 108 có kết quả CLO test và tình nguyện tham gia nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu gồm ba nhóm: 89 bệnh nhân viêm dạ dày mạn, 85 bệnh nhân loét dạ dày, 74 bệnh nhân ung thư

dạ dày

2.2 Hoá chất và vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Hoá chất nghiên cứu

2.3.1.1 Sinh phẩm chẩn đoán H pylori

Phản ứng PCR chẩn đoán H pylori: Mastermix HotTaq (Qiagen), nước nuclease-free, mồi xuôi H pylori, mồi ngược H pylori, plasmid

có chèn gen đích phát hiện H pylori Điện di sản phẩm phản ứng PCR chẩn đoán H pylori: Agarose (NulGeneX), đệm TAE 1X, thuốc nhuộm gel Ethidium Bromide, Ladder 100bp

2.3.1.2 Môi trường vận chuyển mảnh sinh thiết dạ dày

Dung dịch A và dung dịch B Dung dịch A (200ml) chứa Bacto Casamino Acids, Bacto Peptone, Yeast Extract, và Sodium Chloride Dung dịch B (80ml) chứa L-cysteine, Dextrose, và Glycerol

2.2.1.3 Hoá chất tách DNA từ mảnh sinh thiết và huyết tương

Kit tách Genomic DNA Monarch (NEBlab), nước muối sinh lý NaCl 0.9%

2.2.1.4 Hoá chất chạy Realtime PCR xác định EBV và HHV-6

Mastermix cho Realtime PCR 2X (Qiagen), mồi EBV (IDT, Mỹ), đầu dò EBV (IDT, Mỹ), mồi HHV-6 (IDT, Mỹ), đầu dò HHV-6 (IDT, Mỹ), nước nuclease-free (Qiagen)

2.2.2 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

Ống eppendorf 1.5 ml, pipet các loại (Eppendorf, Đức), đầu côn các loại (Eppendorf, Đức), ống Realtime PCR (Eppendorf, Đức), tủ an toàn sinh học cấp 2, tủ lạnh -80℃, máy trộn mẫu (vortex) (Mỹ), máy

ly tâm lạnh, máy đo OD NanoDrop (Mỹ), máy PCR Eppendorf TMNexus Gradient Thermal Cycler (Đức), máy Realtime PCR BIORADS CFX96 (Bio-Rad, Mỹ), máy nghiền mẫu cầm tay

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Mỗi bệnh nhân sẽ được lấy 2 mảnh sinh thiết (MST) bằng sinh thiết nội soi (1 lấy từ hang vị, 1 lấy từ thân vị) Mảnh sinh thiết dạ dày được chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 1 ml môi trường vận chuyển Mẫu mảnh sinh thiết sau khi thu thập được thực hiện xét

nghiệm test urease để kiểm tra có sự xuất hiện của vi khuẩn H pylori

Sau đó mẫu mảnh sinh thiết được vận chuyển lên phòng thí nghiệm, được đánh mã bệnh nhân tương ứng và bảo quản ở tủ -80℃ cho các bước thí nghiệm tiếp theo

2.3.1 Tách DNA từ mẫu mảnh sinh thiết dạ dày

Chuyển mẫu MST từ môi trường vận chuyển vào ống eppendorf 1.5

ml có chứa 200 µl NaCl 0.9% Sử dụng máy nghiền cầm tay nghiền nhỏ mẫu bệnh phẩm Quy trình tách chiết DNA từ mẫu MST bằng kit tách Genomic DNA Monarch (NEBlab) được thực hiện theo như hướng dẫn của nhà sản xuất Nồng độ DNA cũng như độ tinh sạch của sản phẩm tách chiết được xác định bằng đo quang phổ ở bước sóng 260

và 280 nm Các mẫu có chỉ số OD 260/280 đạt từ 1,8 – 2 và nồng độ đạt từ 20 - 200 ng/µl được xác định đủ tiêu chuẩn để sử dụng trong các thí nghiệm PCR tiếp theo

2.3.2 Xác định H pylori trên mẫu DNA tách từ MST bằng phản ứng PCR

Các mẫu DNA thu được sau khi tách đạt yêu cầu về độ tinh sạch

và nồng độ DNA được đưa đi thực hiện phản ứng PCR để xác định H pylori Gen đích được sử dụng để phát hiện H pylori là gen 23S Thành phần phản ứng PCR xác định H pylori gồm:

Mẫu chứng âm là nước Nuclease-free, chứng dương là plasmid

được chèn đoạn trình tự đích trên gen 23S của H pylori

Bảng 2 Trình tự các đoạn mồi được sử dụng

Tên mồi Trình tự (chiều 5’ – 3’)

2.3.3 Xác định mẫu bệnh phẩm âm tính và dương tính với H pylori

Nhiễm H pylori được chẩn đoán xác định khi cả 2 xét nghiệm là

test urease nhanh (CLO test) và PCR trên mẫu mô sinh thiết cùng cho

kết quả dương tính Không nhiễm H pylori được chẩn đoán xác định

khi cả 2 xét nghiệm là CLO test và PCR trên mẫu mô sinh thiết cùng cho kết quả âm tính

2.3.4 Thiết kế phản ứng Realtime PCR phát hiện EBV và HHV-6

2.3.4.1 Thiết kế mồi và đầu dò phát hiện EBV và HHV-6

Để thiết kế các cặp mồi trong phản ứng PCR phát hiện EBV và HHV-6, tiến hành thu thập cơ sở dữ liệu trình tự gen đích phát hiện EBV và HHV-6 trên ngân hàng dữ liệu NCBI Tiếp theo tiến hành sắp đóng cột các trình tự thu thập được trên phần mềm BioEdit để chọn được vùng bảo tồn đặc trưng và tiến hành thiết kế mồi và đầu dò bằng phần mềm trực tuyến Primer 3 Sử dụng chương trình IDT OligoAnalyzer™ Tool để kiểm tra nhiệt độ lai, kích thước và các cấu trúc thứ cấp của mồi Độ đặc hiệu của trình tự mồi và đầu dò được kiểm tra bằng hệ thống dữ liệu gen trên phần mềm BLAST tại trang web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov

2.3.4.2 Tối ưu phản ứng Realtime PCR phát hiện EBV và HHV-6

Mẫu chứng âm là nước nuclease-free, khuôn DNA sử dụng để tối

ưu phản ứng PCR là plasmid đã được chèn gen đích phát hiện EBV và HHV-6