Dé tài khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu HươngTOM TAT KET QUÁ NGHIÊN CỨU ĐÈ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG Tên dé tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớ
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SU PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SU PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH
Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài
(Ký họ tên, đóng dau) Gf, hota)
Lé Thi Thu Huong
Tp Hồ Chi Minh, thang 12 năm 2016
Trang 3DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN
THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐÈ TÀI
Giảng viên: Ths Lê Thị Thu Hương - Chủ nhiệm đề tải
Các sinh viên khoa Hóa ĐHSP TP.HCM gồm có:
1 Ngô Văn Khuê
2 Nguyễn Thị Mỹ Hạnh
3 Nguyễn Như Ngọc
4 Vũ Hải My
Trang 4CÁC KÝ HIEU VA CHỮ VIET TAT TRONG BÀI BAO CÁO
Bond correlation
Heteronuclear Single Quantum
Correlation Part per million
Singlet Doublet Double of Doublet
Multiplet Coupling constant Thin Layer Chromatography
Tương quan H-C qua 2, 3 liên kết
Tương quan H-C qua 1 liên kết
Một phần triệu
Mũi đơn Mũi đôi
Mũi đôi đôi
Mũi đa
Hằng số ghép spin Sắc ký bảng mỏng
Trang 5Dé tài khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
TOM TAT KET QUÁ NGHIÊN CỨU
ĐÈ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG
Tên dé tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây cỏ sữa lá lớn Euphorbia
hirta L.”
Mã số: CS.2015.19.18
Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Thu Hương Tel: 0963817468
E-mail: huonghctn@ yahoo.com
Cơ quan chủ tri đề tài : Truéng Dai học Sư phạm Tp.HCM
Cơ quan và cá nhần phối hợp thực hiện : Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Ngô Văn Khuê, Nguyễn Thị Mỹ Hanh, Nguyễn Như Ngoc, Vũ Hai My.
Thời gian thực hiện: Tháng 04 năm 2015 đến tháng 04 năm 2016
1 Mục tiêu:
Cô lập 5-7 hợp chất từ cây cỏ sữa lá lớn
Công bồ 01 bài báo.
Đào tạo 02 sinh viên.
2 Nội dung chính:
Đã cô lập và xác định cấu trúc của 6 hợp chất từ cây cỏ sữa lá lớn.
3 Kết quả chính đạt được (khoa học, ứng dụng, đảo tạo, kinh tế-xã hội):
Công bồ 01 bài báo trên Tap chí Khoa học tự nhiên, Trường Đại học sư phạm Ha Nội.tập 61, số 9, trang 48-52, năm 2016
04 sinh viên làm khóa luận tốt nghiệp.
Trang |
Trang 6Đề tài khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
SUMMARY
Project Title: “Studies on chemical constituents of Euphorbia hirta L.”.
Code number: CS.2015.18.19
Coordinator: Le Thi Thu Huong Tel: 0963817468
E-mail: huonghctn@ yahoo.com
Implementing Institution : University of Pedagogy Ho Chi Minh City
Cooperating Institution(s):
e Vict Nam Academy of Science and Technology.
® Ngo Van Khue, Nguyen Thi My Hanh, Vu Hai My, Nguyen Nhu Ngoc.
Duration: from April, 2015 to April, 2016.
e Six compounds were isolated from Euphorbia hirta L Their structures were
elucidated using one and two dimensional NMR spectroscopic techniques.
3 Results obtained:
e¢ Published one article on the Journal of Science, Natural Sciences, Hanoi
National University of Education, volume 61, number 9, page 48-52, 2016.
e Trained four students working on undergraduate thesis
Trang 2
Trang 7Dé tài khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
PHAN I MO DAU
1 Tính cấp thiết của đề tai
Từ xưa đến nay việc sử dụng các cây có làm thuốc đóng vai trò hết sức quantrọng trong đời sống con người Ngày nay với nén kinh tế phát triển mạnh mẽ mục tiêu
chăm sóc sức khỏe con người ngày càng được nâng cao, chính vì thể, được tính và hóa tính của nhiều loại thảo mộc đang được nghiên cứu và không ngừng phát trién.
Trong đó, cây co sữa lá lớn hiện điện khắp nơi và được sử dụng trong Y học cô
truyền dé chữa các bệnh thông thường như: giải nhiệt hạ sốt, an than, kháng viêm, chữa
ly, hen suyén, viêm phế quản Ngoài ra, có sữa lá lớn còn chứa chất chống oxy hóa,
kháng khuan, kháng nam, lợi tiêu và chong ung thư
Cho đến nay việc nghiên cứu về thành phan hóa học của cây cỏ sữa lá lớn ở
các nước trên thế giới rất phd biến, đặc biệt ớ các nước như Trung Quốc, Nhật Bán, An
Độ Malaysia nhưng ở Việt Nam có rất ít công trình nghiên cứu về loài cây này.
Với những lí đo trên, chúng tôi đã chọn đẻ tài “Nghiên cứu thành phần hóahọc của cây có sữa lá lớn - Euphorbia hirta L.” nhằm mục dich tách chiết và xác địnhcau trúc của một số chất có trong cây cỏ sữa lá lớn được thu hái ở tinh Đông Nai
2 Mục tiêu của đề tài
- Thu nhận các mẫu cặn chiết từ cây cỏ sữa lá lớn ở tinh Dong Nai
- Tách chiết và xác định cấu trúc của một số hợp chất thiên nhiên có trong cây cỏ sữa lá
lớn.
3 Cách tiếp cận đề tài
- Tổng quan tài liệu về cây cỏ sữa lá lớn
- Thu hái mẫu cây ở tinh Đông Nai
- Tiến hành ngâm chiết bằng dung môi cther dau hỏa, cthyl acetate, butanol để thu được các cặn chiết khác nhau.
4 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp ngâm chiết bang dung môi ether dau hỏa, ethyl acetate, butanol dé thu
được các cặn chiết khác nhau
- Phân lập tách chiết các hợp chất bằng các phương pháp sắc kí cột và sắc kí bảng mỏng.
Trang 3
Trang 8Dé tài khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
- Sử dụng phương pháp vật lí hiện đại như phô hồng ngoại, phô cộng hướng từ hạt nhân
để xác định cấu trúc của các chất cô lập được.
5 Phạm vi nghiên cứu
- Cô lập các chất có trong cặn chiết ethyl acetate của cây cỏ sữa lá lớn
6 Nội dung nghiên cứu
- Sử dụng phương pháp sắc kí cột, sắc kí bảng mỏng dé cô lập 5-7 hợp chất có trong cây
cỏ sữa lá lớn.
- Xác định cau trúc hóa học của các chất tách được bang các phương pháp vật lí hiện dai như phô MS, 'H-NMR., '*C-NMR, HSQC, HMBC.
Trang 4
Trang 9Dé tải khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
PHAN II NOI DUNG VA KET QUÁ NGHIÊN CỨU CUA DE TÀI
CHUONG 1 TONG QUAN
1.1 M6 tả thực vật
Cây co sữa lá lớn hay còn gọi là cỏ stra lông,
thiên căn thảo, cây mủ, cây vú sữa đất, có tên khoa học
là Euphobia hirta L thuộc họ thầu dau
Euphorbiaceae.!!°>
Cây có thân bò hoặc hơi đứng, cao khoảng 15-40
em, cây có nhiều rễ phụ hơi đỏ hoặc tím, toàn cây có
P 5 : "
lông vàng và nhựa mủ trang”
cm, rộng 1-1,5 cm, mép có răng cưa nhỏ Gốc cuống lá có 2 lá kèm nhỏ, hình lông cứng °Ì
Nhiều cụm hoa màu trắng đỏ nhạt, hình chén nhỏ ở các nách lá
Quả lúc đầu đỏ sau đó xanh rồi chuyển dan sang nâu rất nhỏ, đường kính khoảng 1,5 mm, khi già nứt thành 3 mảnh vỏ, có 3 hạt rất nhỏ! "*
1.2 Phan bố và sinh thái
Cây cỏ sữa lá lớn mọc hoang khắp nơi ở Việt Nam, ở những chỗ đất có sói đá,
bãi có, đường di, ở miền Bắc cũng như ở miền Nam Cây còn mọc ở Trung Quốc, Malaysia, An Độ Australia, châu Phí ”* *Š! châu Mỹ.
1.3 Tac dụng dược lí
Nhiều nghiên cứu chi ra rằng Euphorbia hirta L chứa nhiều chất trị rỗi loạn tiêu
hóa, tiêu chảy”, loét da dày, ợ nóng, nôn mira’), bệnh ly"! bệnh cao huyết Ap"),
chống ngứa thông sữa, rối loạn kinh nguyệt, vô sinh và các bệnh hoa liễu”, cây cũng được sử dụng trong điều trị các rối loạn phế quản và đường hô hấp bao gồm cả bệnh
= [6] {*, 13] L4]
hen suyễn “Ì, viêm phế quản, sốt mùa he"! và viêm kết mac!
Mu của cây thường được sử dụng trị các mụn cóc và dé ngăn chặn lây nhiễm
mam bệnh“,
Trang Š
Trang 10Dé tải khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
————— Gr id:
Cỏ sữa lá lớn có các hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuân!°”, kháng nắm, lợi
[21] 2,25]
tiểu”, giải lo âu”, chống viêm và chồng ung thul!? 7),
Ngoài ra người ta còn nghiên cứu tac dụng của cỏ sữa lá lớn trong việc điêu trị
bệnh tiêu đường !”!
1.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa
Năm 2011, Abu Arra Basma, Zuraini Zakaria và các cộng sự!” đã nghiên cứu
về khả năng chống oxi hóa từ các bộ phận khác nhau của cây có sữa lá lớn đề tìm kiếmnguồn mới của chất chong oxy hóa an toàn và ít tốn kém Từ các mẫu 14, cành, hoa và
rễ người ta đã tim ra các hợp chất phenolic va flavonoid có khả năng chống oxy hóa
mạnh.
1.3.2 Hoạt tính điều trị bệnh tiểu đường
Năm 2014, Quy Trinh, Ly Le"! đã có nghiên cứu vẻ hoạt tính sinh học của một
số chất trong cây cỏ sữa lá lớn có tác dụng trị bệnh tiều đường bằng phương pháp gắn
kết các chất tìm được trong cây cỏ sữa lá lớn với một số protein liên quan tới bệnh tiêuđường loại 2 Các chất này bao gồm quercetrin, rutin, myricitrin, cyanidin 3.5-Ó-
diglucoside, pelargonium 3,5-diglucose thuộc họ flovonoid và øœ-amyrine, đ-amyrine,
taraxerol thuộc họ terpene Kết quả nghiên cứu cho thấy sự liên kết của các chất trongcây có sữa lá lớn với các protein có khả năng điều trị hiệu quả bệnh tiéu đường
1.3.3 Hoạt tính kháng khuân
Năm 1995, K Vijaaya, S Ananthan và các cộng sự!” đã nghiên cứu tác dụngkháng khuẩn của các hợp chất chiết xuất từ Camellia sinensis L và chiết xuấtmethanol của cỏ sữa lá lớn chống lại bệnh ly - một loại bệnh do Shigella spp gây nên
Các tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết methanol của cỏ sữa lá lớn đã được chứng minh trong phòng thí nghiệm bang cách sử dụng loài vi khuẩn Shigella Thực nghiệm
cho thay chiết xuất không gây độc tế bào và có hoạt tính kháng khuẩn
Năm 2013, A Annamalai, V.L.P Christina cùng các cộng su’! đã nghiên cứu
về hoạt tính kháng khuẩn của cây cỏ sữa lá lớn bằng việc tông hợp các hạt nano vàngkhông độc hại (Au NPs) băng cách sử dụng các chất chiết từ lá của cây cỏ sữa lá lớn.Các Au NPs này có khả năng chống lại các chủng vi khuan như Escherchia coli,
Pseudomonas aeroginosa và Klebsiella pneumonia.
Trang 6
Trang 11Dé tải khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
1.3.4 Hoạt tinh chong viêm
Năm 1991, khi khảo sát chiết xuất n-hexane của các bộ phận của cây cỏ sữa lálớn và thành phan chính của nó (triterpene, /-amyrin 24-methylenecycloartenol, Ø-
sitosterol), M.C Lanhaers và các cộng sự!” đã đánh giá hiệu quả kháng viêm ở chuột Chiết xuất dung dịch nước đông khô có khả năng giảm đau, hạ sốt và chỗng viêm Bên
cạnh đó, hoạt động trằm cảm trung ương, thẻ hiện bởi tác dụng an thần mạnh mẽ kết
hợp với hiệu ứng giải lo âu cũng được tiễn hành nghiên cứu
1.3.5 Hoạt tính chẳng ung thư
Năm 1995, K Vijaya, S Ananthan và các cộng sy"! còn nghiên cứu khả năng gây độc của các chất trong các dịch trích khác nhau Các chất chiết xuất nay đóng vai
trò như một tác nhân kháng khuẩn hiệu quả và không gây độc tế bào Riêng chiết xuất
của cỏ sữa lá lớn lại có hoạt tính gây độc tế bào chọn lọc đối với một số dòng tế bào
ung thư Điều đó cho thay cây cỏ sữa lá lớn rất hữu ích trong điều trị ung thư, khôi u
ác tính và ung thư tế bào vảy
1.3.6 Hoạt tính chỗng nọc độc của rắn
Năm 2016, Kadiyala Gopi!TM! cho biết quercetin-3-O-rhamnoside từ Euphorbia hirta
có khả năng chống lại nọc độc của rắn.
1.4 Thanh phần hóa học của cây có sữa lá lớn
1.4.1 Flavonoid
Năm 1972, Blanc P và các cộng sự đã cô lập được euphorbianin (1), quercitol
(2), leucocyanidol (3), quercitrin (4)
Năm 1991, Chen L bằng các phương pháp hóa lí và quang phô, đã phan lập các
hợp chất từ lá của cây cỏ sữa lá lớn là quercitrin (4), myricitrin (5).
Nam 2012, Wu Yi, Qu Wei, Geng Di, Liang Jing-Yu, Luo Yang-Li đã cô lập các
hợp chat là isorhamnetin (6), pinocembrin (7), kaempferol (8), luteolin (9), quercetin
(10).°*!
Nam 2013, Yuya Nomoto, Sachiko Sugimoto, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki
Otsuka đã cô lập được hợp chat afzelin (11), isovitexin (12) P8
Trang 7
Trang 12(1) (2)
Trang 8
Trang 13Năm 1978, Elnagar L và các cộng sự đã cô lập được acid shikimic (16) từ cao
ethanol của cây cỏ sữa lá lớn.*!
Năm 1991, Chen L bằng các phương pháp hóa lí và quang phô đã phân lậphợp chat từ lá của cây cỏ sữa lá lớn là acid gallic (14), acid 3,4-di-O-galloylquinic
(17) 2.4.6-tri-O-galloyl-D-glucose (18) 1.2.3,4,6-penta-Ó-galloyl-/-D-glucose
q19)!"
Năm 2012, Wu Yi, Qu Wei, Geng Di, Liang ling-Yu, Luo Yang-Li đã cô lập 3
hợp chất là scopoletin (20), scoparone (21), isoscopoletin (22).Ê°1
Năm 2013, Yuya Nomoto, Sachiko Sugimoto, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki
Otsuka đã cô lập được methyl 3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenylpropanoate
@-/-D-glucopyranoside (23), syringin (24).
Trang 9
Trang 15Dé tải khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
Năm 1966, Gupta D R va Gard S K đã cô lập từ thân co sữa lá lớn được
taraxerol (25), friedelin (26) đ-sitosterol (27)."”)
Năm 1972, Ahmed M Attallad, Harold J Nicholas đã cô lập từ lá và thân cỏ
sữa lá lớn taraxerol (25), taraxerone (28), campesterol (29), stigmasterol (30) (7 Cùng năm 1972, Blane P và các cộng sự đã cô lập camphol (31).
Năm 1980, từ thân có sữa lá lớn, Baslas R K., Agarwai R đã cô lập
cycloartenol (32) euphorbol (33).""!
Năm 1984, Sofowora và các cộng sự đã cô lập được các hợp chất
24-methylenecycloarternol (34), đ-amyrin (35), đ-amyrin acetate (36), ingenoltriacetate
(37), tinyaloxin (38).
Năm 1999, Mariano Martinez Vazquez đã cô lập hợp chất 12-0-tetradecanoyl
phorbol acetate (TPA) (39).!"”!
Năm 2011, Shijun Yan và các cộng sự đã tim ra 3 hop chất
2f,16a,19-trihydroxy-ez-kaurane (40), 2/,16ø-dihydroxy-enr-kaurane (41),
16a,19-dihydroxy-ent-kaurane (42).!°'
Trang II
Trang 16Dé tải khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
Năm 2013, Consolacion Y Ragasa, Kimberly B Comelio đã cô lập
25-hydroperoxycycloart-23-en-3/ol (43), 24hydroperoxycycloart-25-en-3Øol (44), cycloartenol (45), lupeol (46), @-amyrin (47), cycloartenol fatty acid ester (48), lupeol
fatty acid ester (49), a-amyrin fatty acid ester (50), B-amyrin fatty acid ester (S1)?
Nam 2013, Yuya Nomoto, Sachiko Sugimoto, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki
Otsuka đã cô lập được hirtionoside A (52), hirtionoside B (53), hirtionoside C (54),
blumenol C glucoside (55), citroside A (56), corchoionoside C (57).!TM")
Trang 19(42) (43)
(44) (45)
(46) (47)
Trang 15
Trang 20Dé tải khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
(50) (51)
R: gắc axit béo mạch dài
HO OH HO OH
Trang 16
Trang 21Dé tải khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
Nam 2009, Uppuluri V Mallavadhani va Kilambi Narasimhan da tim ra 2 déng
phân anomer: — n-butyl-1-O-/-L-rhamnopyranoside (62), —
ø-butyl-l-O-z-L-rhamnopyranoside (63)°”!
Năm 2013, Yuya Nomoto, Sachiko Sugimoto, Katsuyoshi Matsunami, Hideaki Otsuka đã cô lập được 3-hydroxyoctanoic acid glucoside (64), methyl 3-
hydroxyoctanoat acid glucoside (65), (Z)-3-hexenyl /@D-glucopyranoside (66),
rutinoside (67), linocinnamarin (68), benzyl /đ-D-glucopyranoside (69) ““
Trang 17
Trang 22Dé tải khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
Trang 23Dé tai khoa học va công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.1 NGUYÊN LIEU, HOA CHAT, THIẾT BỊ
2.1.1 Nguyên liệu
Mẫu cây Euphorbia hirta L được thu hái ở Đồng Nai vào tháng 7 năm 2013,
được định danh bởi TS Phạm Văn Ngọt - Bộ môn Thực vật học - Trường Đại học Sư
phạm Tp Hỗ Chí Minh Mau cây được phơi khô trong bóng ram, dé nơi khô thoáng,
say ở 50-55°C Sau đó xay thành bột, ngâm trong ethanol dé điều chế các cao
2.1.2 Hóa chất
+ Dung môi: ethyl acetate, petroleum ether, hexane, chloroform, methanol,
acetone, acetic acid, nước.
+ Silica gel: Silica gel 230 — 400 Mesh, Himedia - An Độ dùng cho sắc ký cột
+ Sắc ký ban mong loại 25DC — Alufolien 20 x 20, Kiesel gel 60 Fo54, Merck
+ Thuốc thứ hiện hình sắc ký bảng mỏng: H;SO, 20%.
+ Máy soi UV.
+ Can điện tử Sartorius Mass 620g,
+ Phô cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từhạt nhân Bruker AC.500, tan số cộng hưởng SOOMHz
+ Pho cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR kết hợp ky thuật DEPT được thực hiện
trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC.500, tan số cộng hưởng 125MHz
+ Phô khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS được ghi trên máy LC-MSD-Trap-SL.
Trang 19
Trang 24Dé tải khoa học vả công nghệ cấp Trường Lê Thị Thu Hương
— Tất cả phô được ghi tại phòng phân tích cau trúc, Viện Hóa Học - Viện Khoa Học
và Công Nghệ Việt Nam, 18 - Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội vàphòng Phân Tích Trung Tâm trường đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố HồChí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, quận 5, thành phô Hỗ Chí Minh
2.2 CÔ LẬP CÁC HOP CHAT HỮU CƠ TRONG CAY CO SỮA LA LỚN
12 kg mẫu cây khô (phan trên mặt dat) được ngâm với ethanol 96”, dịch chiếtđược gom lại rồi cô thu hồi dung môi bằng máy cô quay đưới áp suất thấp thu được
635 gam cao thô Cao ethanol thô được chiết lỏng — lỏng lần lượt với ether dau hoa,ethyl acetate thu được cao ether đầu hoa (60,4 gam), cao ethyl acetate (335,3 gam)
Quá trình thực hiện được tóm tat theo sơ đồ 2.1.
Sắc ký cột silica gel phần cao ethyl acetate (335,3 gam) với hệ dung môi
ED:EA có độ phân cực tăng dần Dịch từ cột sắc ký được hứng vào các bình tam giác
250 ml Sau đó, cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hũ bi Dùng sắc ký bảng mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom
lại thành một phân đoạn Kết quả thu được 5 phân đoạn ki kiệu là EA1-5, các phan
đoạn được trình bày trong bảng 2.1.
2.2.1 Sắc ký cột phân doan EA.I
Phan cao thu được từ phân đoạn EA.1 tiếp tục sắc ký cột silica gel với hệ dung
môi ED:EA tỷ lệ 5:5 Kết quả thu được 3 phân đoạn, các phân đoạn được trình bày
trong bảng 2.2.
Tiếp tục sắc kí cột với phân đoạn EA.1.1 với hệ dung môi C:M (9:1) thu được 4
mg hợp chat EHS
2.2.2 Sắc ký cột phân đoạn EA.2
Phân cao thu được từ phân đoạn EA.2 (54.5 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel với hệ
dung môi ED:EA tỷ lệ 3:7 Kết quả thu được 3 phân đoạn, các phân đoạn được trình
bày trong báng 2.3.
Tiếp tục sắc kí cột với phân đoạn EA.2.1 với hệ dung môi C:M (8:1) thu được 8
mẹ hợp chất EH2 và 4 mg hợp chat EH3
Trang 20
