Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường: Khảo sát thành phần hóa học của cây phèn đen, phyllanthus reticulatus poir, thuộc họ thầu dầu euphorbiaceae

Xục tiêu: Khao sát thành phan hóa học của cấy Phén đen và thứ nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bao ung thư của một số hợp chất cô lập được.. Kết quả chính đạt được kho

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SU PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

BAO CÁO TONG KET

DE TAI KH&CN CAP TRUONG

Mã số: CS 2014.19.50

Chủ nhiệm đề tài: NGUYEN THỊ ANH TUYET

TP Hồ Chí Minh, Tháng 12/2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

BAO CAO TONG KET

ĐÈ TÀI KH&CN CAP TRƯỜNG

KHẢO SÁT THÀNH PHÀN HÓA HỌC CỦA CÂY PHÈN

ĐEN, PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR,

THUỘC HO THAU DAU EUPHORBIACEAE

Mã số:CS 2014.19.50

Xác nhận của cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài: NGUYEN THỊ ANH TUYET

/À—|Mux_—— ———

| YeDiva he ur

DANH SÁCH CÁC THÁNH VIÊN THAM GIÁ THỰC HIỆN ĐÈ TÀI

VA CÁC DON VỊ PHÓI HỢP CHÍNH

Các thành viên tham gia thực hiện đề tài:

I TS Nguyễn Thị Ảnh Tuyết - Chú nhiệm để tải;

2 GS.TS Nguyễn Kim Phi Phung (tư vấn khoa học)

Các đơn vị phối hợp chính:

; Trưởng ĐHKIHITN Tp HCM:

Viện Công nghệ hóa học Việt Nam

MỤC LỤC

Trang

Danh mục các chữ viết tắt ác c5 n1 say i

ĐHÄ tra sơ đỀ:cczc6cLàdgfGaããtcöy(tGiqGSGũiiiiäNtitvdGtsstscliiisiusgid i

Dành sae A BAN acca siess Voi cáG30 201761017 4v620x460414v10631454X4uL64U16ã4697411651 i

SEE) OL || ee ii

PAGAN, 0 onn0s.s<5ocessoaannns riaapaneanncaecinsnneceensesstiesagaeaieee ie ea ee |

Chương 1 TONG QUAN 2

1.1.Dac điểm thực vat cây Phén đen - c3 2

1.2 Các nghiên cứu về được tính - 5 - <5 <7<<<<<<2<222<4 2

1.3 Các nghiên cứu vẻ thành phan hoá học ¿5 5 52 4Chương 2 THỰC NGHIEM

2.1 Hoá chat, thiết bị, phương pháp - 8

án: NO VỐN: HỆ ¡xá gggãikt x01 01020000GG11405010140001598606 01463 8

3, ĐIiểu để tái NHI Oise a acctaevioiorieceeouroodnsaancoa 9

2.4 Sắc ki cột sillica gel cô lập một số hợp chat hữu cơ 10

2.5 Thir nghiệm hoạt tinh gây độc tế bào .- eens 12

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát cau trúc của hợp chat EA-P1 - «+ Is

3.2, Khảo sát cau trúc của hợp chất EA-P6 00cce00eeeeeneneees 16

3.3 Khảo sát cầu trúc của hợp chất EA-P2 - - < <« 183.4 Khảo sát cau trúc của hợp chất EA-P3 +52 20

3.5 Khảo sát cau trúc của hợp chất EA-P4 + 555 +<<<<<s2 22

3.6 Khảo sát cau trúc của hợp chat EA-P5 - - se 25

3.7 Khảo sát cau trúc của hợp chất E.A-P7 - -«s++s<<s+ 26

3.8 Khao sát cau trúc của hợp chất EA-P8 - 55 27

3.9 Kết quả thử nghiệm hoạt tinh gây độc tế bảo - - 29

KẾT LUẬN: Si:cGu 00 2222101000005262001639000000/5315062161Au 30TALLIEU THAM KWAO vise ocicccsicsssssccarterrnmucnnaccanins 31

PHU LUC

Mẫu 1 19CS

THONG TIN KET QUÁ NGHIÊN CỨU

DE TÀI KHOA HỌC VA CÔNG NGHỆ CAP TRƯỜNG

Tên dé tài: Khao sát thành phần hóa học của cây Phén đen, Phyllanthus reticularws

Poir, thuộc họ thâu dau Euphorbiaceae

Mã số: CS 2014.19.50

Chủ nhiệm đẻ tải: Nguyễn Thị Ảnh Tuyết Tel: 0918 391 061

E-mail: sptuyel(@yahoo.com

Cơ quan chủ trì dé tải : Khoa Hóa học, Trường Dai học Sư phạm Tp.HCM

Cơ quan và cả nhân phối hợp thực hiện :

GS.TS Nguyễn Kim Phí Phung, trường ĐH KHTN TP.HCM

Đại học KHIN TP.HCM

Viện Công nghệ hóa học Việt Nam

Thời gian thực hiện: 9-2014 đến 9-2015

1 Xục tiêu:

Khao sát thành phan hóa học của cấy Phén đen và thứ nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bao ung thư của một số hợp chất cô lập được.

2 Nội dung chính:

- Điều chế các loại cao và cô lập một số hợp chat hữu cơ.

- Nhận danh các hợp chất đã cô lập được bằng các phương pháp phản tích hóa lí hiện đại như phổ IR, NMR MS.

- Thứ nghiệm hoạt tỉnh sinh học trên hai hợp chất đã cô lập

3 Kết quả chính đạt được (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế-xã hội):

- _ Cô lập và xác định cấu trúc hóa học của tắm hop chất từ cao thd

- Thử nghiệm hoạt tinh gay độc tế bào trên ba dong tế bảo ung thư MCF-7

NCI-H460, và HeLa.

- Kết qua nghiên cứu công bố trên Tạp chí hóa học: Nguyen Thi Anh Tuyet,

Duong Thuc Huy, Nguyen Kim Phi Phung (2015), “Chemical constituents of Phyllanthus reticulatus Poir.”, Tạp chỉ hóa hoc, ŠS3(2e1}, 109-113.

Project Tithe: Studs on chemical constituents of Phy/lanthis retictlatus Poit.

Code number: CS.2014,19,50

Coordinator; Nguyễn Thị Anh Tuyết

Implementing Institution : chemistry department University of Pedagogy of HCM City

Cooperating Institution(s):

Prof Nguyễn Kim Phi Phụng University of Science

- Vietnam Academy Of Science And Technology

University of Science

Duration: from September 2014 to September 2015

I Objectives:

Study on chemical constituents of Phy/anthus reticulatus Poir, The cytotoxic activities

against HeLa, MCE-7 and NCI-H460 cancer cell lines on some isolated compounds were

evalinited.

2 Main contents

- lsolation compounds from PAytlanthus reticulatus

- Elucidating the structures of isolated compounds by 1D and 2D NMR spectroscopy as

well us high resolution ESI-MS analysis and comparison with those reported in the literature

Evaluating the cytotoxicity of two isolated compounds on three cell lines: MCF -7, NCI-H46U and HeLa,

3, Results obtained:

~ lsolating cight compounds from fractions of the crude ethanol extract.

- LJucidating the structures of isolated compounds by spectroscopic methods,

~ Evaluating the cytotoxicity of two isolated compounds on three cell lines: MCE-7

NCI-H46U and HeLa.

the research result was published on Vietnamese Journal of Chemistry:

Nguyen Thi Anh Tuyet, Duong Thue Huy Nguyen Kim Phi Phung (2015), “Chemical

constituents of PAyilanthus reticulatus Poir.”, Tạp chi hóa học Š3(3el ), 109-113.

DANH MỤC CHỮ VIET TAT

ddd Doublet of doublet of doublet

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO DiMethy! SulfOxide

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HR-ESI-MS High Resolution ElectroSpray Ionization Mass Spectroscopy

HSQC Heteronuclear Singlet Quantum Correlation

J Hang số ghép cặp

m multiplet mũi đa

M Khối lượng phan tử

NMR Nuclear Magnetic Resonance

Srrdỗ 2:1 Quy: tính điều chb canis 9

Sơ đồ 2.2 Quy trình cô lập các hợp chat từ cao etyl acetat - ‹‹- II

Sơ đồ 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tinh gây độc tế bao bằng phương pháp SRB 14

DANH MUC HINH ANH

Trang

Hinh 1.1 La va qua PHÊ /đẾssrasszszaaccczax=se=: 2 Hình 3.1 Một số tương quan HMBC của hợp chat EA-P! 16

Hinh 3.2 Tương quan HMBC của hợp chất EA-P6 00.ccccseeeeeees 18

Hinh 3.3 Tương quan HMBC của hợp chat EA-P2 c5 20

Hình 3.4 Tương quan HMBC của hợp chất

EA-P8 S5-DANH MỤC BANG BIEU

Bảng 1.1 Một số hợp chat đã được cô lập tử cây Phén đen, Phyllanthus

FE(CHIORG PON t6 76000400012(02G36500)/)46664v26K2)0/41X5%X6564<264t 3x4

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ely] acetat - <2

Bảng 3.1 Số liệu pho NMR của hợp chất EA-P1 (co Su:

Bảng 3.2 Số liệu phỏ NMR của hợp chat EA-P6 - c3

Bảng 3.3 Số liệu phỏ NMR của hợp chất EA-P2 - 5

Bang 3.4 Số liệu pho NMR của hợp chất EA-P3 - (222332

Bang 3.5 Số liệu phd NMR của hợp chất EA-P4 (c2

Bảng 3.6 Số liệu phd NMR của hợp chất EA-P5 (22222232

Bảng 3.7 Số liệu phỏ NMR của hợp chất EA-P7 c5 cv 2

Bảng 3.8 Số liệu pho NMR của hợp chất EA-P§ óc 2-5 32c

Bang 3.9 Kết qua thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bảo trên ba dong tế bảo ung

ee eee eee eee eee eee eras)

17 19 21

22 24

26

27

28

29

MỞ DAU

Nghiên cứu các hợp chất thiên nhién đã và dang đóng góp những thành tựu quý báu

cho ngành hoá học cũng như ngành sinh học va y được học Đông thời những chứng cứkhoa học từ lĩnh vực nghiên cứu hỏa học các hợp chất thiên nhiên và hoạt tính sinh học đã

góp phan củng cổ và phát triển các bài thuốc y học cổ truyền một cách thuyết phục nhất.

Việt Nam cỏ vị trí địa lý thuộc vùng nhiệt đới nóng ẩm, là điều kiện phát triển hệ thực

vật phong phú và đa dạng Đây cũng chính là lý do nên y học cô truyền của nước ta phát

triển mạnh Với vai trỏ nhà nghiên cứu vẻ hóa học các hợp chất thiên nhiên chúng tôi mongmuốn được đóng góp vao sự phát triển chung nay

Cây Phén den (Phyllanthus reticulatus Poir) là thực vật thuộc chỉ Phyllanthus được

dùng trong Y học cé truyền của Việt Nam và nhiều nuớc trên thế giới Các bộ phận của cây

đều được sử đụng làm thuốc: rễ Phèn đen được ding trị ly, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm

gan viêm thận và trẻ em cam tích Lá thường dùng chữa sốt, ly, ia chảy, phủ thung, ứ huyết

do don ngã huyết nhiệt sinh đính nhọt .

Cho đến nay, ở Việt Nam có rất ít công trình nghiên cứu vẻ thành phần hóa học của cây

Phẻn đen Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tính

hiệu quả an toàn của được liệu, đưa dược liệu vao sử dụng một cách khoa học hơn và có thẻ

đẩy mạnh khai thác sử dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh cho nhân dân,

chúng tôi tiên hành đẻ tai “Khảo sát thành phần hóa học của cây Phèn đen, Phyllanthusreticulatus Poir, thuộc họ thầu dau Euphorbiaceae”

Mục tiêu của đẻ tai là khảo sát thành phần hóa học của cây Phèn đen được thu hái ở tỉnh

Bình Dươngvà thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bảo trên một số dòng tế bào ung thư của một

số hợp chất cô lập được.

Để thực hiện mục tiêu trên, chúng tôi sử dụng các các phương pháp chiết, trích ly để

điều chế các loại cao Bên cạnh đó cỏn dùng các kỹ thuật sắc ký, kết tinh để cô lập các hợp

chất hữu cơ Cấu trúc các hợp chất được cô lập sẽ được xác định bằng các phương pháp

phân tích hỏa lý hiện đại như phé hỏng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phô khỏi lượng

Chương 1 TONG QUAN

|.1 DAC DIEM THỰC VAT CAY PHEN ĐEN [3]

Tên thong thường: Phén den

Tên gọi khác: nỗ, sap trang thao, tảo phan diệp, điệp ha châu mang, co ranh (tiếng Thai), may téng dam (tiếng Tay), chè nộc.

Thude ho Thau dau (Euphorbiaceae).

Tén khoa hoc: Phyllanthus reticulatus Poir.

1.1.1, Mô ta chung

Phén den là cây bụi mọc ty nhiên ở bờ bụi, ven đường, ven rừng, cây cao 2-4 m, cành

gay mảnh den nhạt, đôi khi hop tir 2 đến 3 cảnh trên củng một đốt dải 10-20 cm.

Lá có hình dạng thay đôi, hình trái xoan, hình bau dục hay hinh trứng ngược nhọn, hay

tù ở hai dau, phiến lá rat mỏng, dai 1,5 - 3 cm, rộng 6 - 12 mm, mặt trên có mau sam hơn

Phén đen thuộc loại cây ở vùng nhiệt đới châu A nên có phân bố rat rộng, có thẻ tìm thay

ở vùng Đông Nam A, Nam Trung Quốc, Tay và Nam Phi Ở nước ta, Phèn đen là loại mọc

hoang ở ven rừng hay bờ bụi khắp mọi miền hoặc được trồng làm thuốc.

Cây Phèn đen được trồng bằng hạt.

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

1.2.1 Dược tính theo y học cỗ truyền |2, 3]

Phèn đen vị đắng chát, tính mát, có tác dụng làm se, giảm đau, sát khuẩn, giải độc Chú

trị làm thuốc cầm máu, chữa đậu mùa, chữa viêm cầu thận, chữa ly, tiêu chảy Trong đó rẻ

kh»

Phén den có vị chát tính lạnh có tac dụng tiêu viêm Lá Phén den co tác dụng thanh nhiệt giải độc sat trùng, lợi tiểu

Cách dùng: Bộ phận ding làm thuốc chủ yếu là rễ và lá Vỏ thân cũng được dùng làm

thuốc Thuốc được thu hai vao mua thu, dem rửa sạch thái nhỏ phơi khô cat sử dụng dan; lá

được thu hái vào mùa he, phơi trong bóng ram (am can), vỏ thu hoạch quanh năm

Một số bài thuốc theo y học cỗ truyền:

Chữa kiết ly: dùng rễ cây Phén den, đây mơ lông, cỏ seo ga, cỏ tranh bang nhau, mỗi vị

20g gừng 2 lát 2g - sắc uông (Nam được thân hiệu).

Chữa máu tụ trong cơ thẻ: lá Phèn đen giã nhỏ, chế rượu vào và vắt lấy nước uống (Báchgia trân tang), hoặc ding 40g sắc rồi chế thêm một chén rượu - uống

Chữa nhọt độc mới phát: lá Phén den và lá Béo van gia nat rồi đắp (Bách gia trân tang).Chữa nhiệt tả va ly: cây Phèn den cả cảnh và lá đậu đen sao, mỗi thử 40g, 46 4 bát nước sắclay | bát chia ra uống làm 3 lần (Hoạt nhân toát yéu của Hoang Đôn Hòa)

Chữa đại tiện ra máu: cây Phèn đen cả cành vả lá, thái nhỏ 3 bát, sắc đặc uống (Bách gia

trân tàng).

Chữa chảy máu nướu răng: lá Phén đen phối hợp với lá Long não va lá Xuyên tiêu phơikhô, chế thành viên rồi ngậm

Trị rắn can: 14 Phén den tươi nhai nat nuốt hết nước rồi lấy ba đắp lên chỗ rắn cắn

Chữa đòn danh ir máu: lá phén den 40g, giã nát thêm 1 chén rượi ép vắt lay nước cho

udng.

Trị bệnh trĩ: Lay lá Phén den | nắm, lá trắc bách diệp | năm, lá huyết du 7 lá Sao vàng

hạ thỏ sau sắc lây nước uống | bát nước còn lại ding dé rửa vùng bị tri ngày | - 2 lần.

Trị chảy máu nướu răng: Lay lá Phén đen khô ngậm, có thé phối hợp cả lá long não và lá

xuyên tiêu.

Trị nhọt độc mới phát: Ding lá Phèn đen cùng với lá bèo van giã đắp vao nơi phat định

Trị chắn thương: Lấy lá Phèn đen giã nát đắp vào nơi sưng đau (theo Hải Thượng Lăn

Ong trong “Bách gia tran tang”).

Trị vét thương sưng dau: Dùng lá Phèn den khô tán bột rắc vào vét thương ngày | - 2 lan

sẽ chóng lành và nhanh lên da non.

Trị tiểu tiện khó khăn: Lay vỏ thân cây Phèn đen 20 - 40g sắc lấy nước uống ngày | thang

chia 2 - 3 lan trong ngày

Ngã va đập sưng dau: Lay 30g lá Phén đen giã nát đắp vào vùng bị tổn thương trong

vòng 30 phút Lam 3 ngay lien đến khi hết sưng đau.

1.2.2 Nghiên cứu về được tính

+ Hoạt tính chống tiểu đường:

Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thay dịch chiết eter dau hóa va cthanol từ lá của cây

P reticulatus có kha năng làm giảm đường huyết của chuột bị tiểu đường ở nông độ thử

nghiệm 1000 mg/kg [23].

+ Khả nang chống ky sinh tring sốt rét:

Nim 1997, E Omulokoki va cộng sự [10] đã sử dich chiết nước tử lá va cảnh của loai

Phyllanthus reticulatus Poir để khảo sát khả năng chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium

falciparum trên hai dòng chloroquine-sensitive (K67) và chloroquine-resistant (ENT36).

Kết qua thử nghiệm cho thấy dịch trích nước của lá có ICeg= 10pg/ml (ENT36) va dich

chiết nước của lá, than có [Ca lần lượt là 1.7 và 7.7 mpg/mg (K67).

+ Tác dung làm giảm cholesterol:

Dịch chiết nước của phan trên mặt đất từ cây P reticulatus có tac dụng làm giảm

cholesterol toản phân, VLDL-cholesterol, triglyceride (P<0.001), LDL-cholesterol (P<0.05)

va tang HDL-cholesterol khi thử nghiệm trên chột ở nông độ 250 mg/kg [25].

+ Hoạt tính kháng khuân:

Dịch chiết methanol, chloroform, hexane từ lá có khả năng kháng khuẩn Staphylococcus

aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi với đường kính

vòng vô khuẩn lần lượt là 9.07-30.18mm, 8.17-24.57 mm va.60-14.67 mm [21]

+ Tác dụng bảo vệ gan:

Dịch chiết ethanol của phần trên mặt đất được loại béo, sau đó thử nghiệm hoạt tính bảo

vệ gan trên chuột, kết quả cho thấy hai phân đoạn tir cao ethanol có tác dụng chống tổn

thương gan [6].

+ Tác dụng kháng oxid hóa:

Dịch chiết methanol và ethanol của toàn cây có tác dụng kháng oxid hóa 90% khi thử

nghiệm ở nông độ 400uig/ml so với chất chuẩn BHT (80%) [18]

+ Hoạt tinh kháng virus viêm gan siéu vi B

Hai phân đoạn được điều chế từ cao ethanol của cây thé hiện hoạt tính kháng virus viêmgan siêu vi B ở nông độ 20mg/ml [7]

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VE THÀNH PHAN HOÁ HỌC

Chi Phyllanthus, họ Thầu dau (Euphorbiaceae) có trên 700 loài gồm từ những cây thânthảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ Ở Việt Nam cỏ 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều

hơn ca là Phyllanthus amarus Schum et Thonn (cây Diệp hạ châu đăng), Phyllanthus urinaria L (cây Diệp hạ châu ngọt), và Phyllanthus reticulatus Poir (cây Phèn den) [9].

Các nghiên cứu vẻ thành phân hóa học của loài Phyllanthus reticulatus Poir được trình

bày trong bảng sau.

Bang 1.1 Một số hợp chat đã được cô lập từ cây Phèn den, Phyllanthus reticulatus Poir

aah sói Hợp chất Bộ phận cây Tài r:*

se oe Acid pyrogalic (1) 9)

Beusenots Acid galic (2 La a

Acid ellagic (3) : , Acid p-coumaric (4)

Sorghumol acetat (21)

Kokoonol (22) Reticulatuside A (23) (i)

Lignan Reticulatuside B (24)

Syringaresinol (25)

-sitosterol (26) Re vả thân {12]

B-sitosterol-3-O-B-D-glucopyranosid (27) (1) Sterol 3-Acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3-

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 HOÁ CHAT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP

2.1.1 Hóa chất

- Dung môi dùng trong ly trích, sắc kí cột, sắc kí điều ché va sắc kí lớp mong gồm: eter

dau hóa 60-90" C, cloroform, ety] acetat, aceton, metanol (Trung Quốc và Việt Nam).

- Thuốc thứ hiện hình các vết chat hữu cơ trên bảng móng: sử dụng H;SO, 20%

- Silica gel 60 loại dùng cho sắc ki cột, Merck.

- Sắc kí lớp móng 25DC-Alufolien 20x20cm Kieselgel F254, Merck.

- Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc ki cột và SKLM

2.1.2 Thiết bị

- Các dụng cụ dùng dé li trích (erlen becher, ống nghiệm pipet pasteur, ).

- Các thiết bị dùng dé giải ly, dụng cụ chứa mẫu.

- Các cột sắc kí.

- Máy cô quay chân không.

- Bếp cách thuỷ,

~ Đèn UV: bước sóng 254 nm vả 365 nm,

-Các thiết bị ghi pho: pho cộng hưởng từ hạt nhân: 1D- và 2D-NMR (500 MHz đối

với phd "H-NMR và 125 MHz đổi với phổ "C-NMR tại Phong NMR Viện Hóa Học,

Viện KH-CN Việt Nam, số 18 Hoang Quốc Việt, Cau Giấy, Hà Nội và Phong thí nghiệm

Phân tích trung tâm, Dai học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hồ

Chỉ Minh.

- Khếi phỏ phân giải cao HR-ESI-MS ghi trên máy HR-MS micrOTOF-Q II 10187 tại

Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn

Cừ, Q.5 Tp.Hồ Chí Minh

2.2 NGUYÊN LIEU

2.2.1 Thu hái nguyên liệu

Mau cây dùng trong nghiên cứu khoá luận [a lá, thân vả rễ cây Phén den (Phylianthus

reticulatus Poir.) được thu hái tại huyện Tân Liyên, Bình Dương, vào tháng 6/2013.

Mẫu cây đã được GS.TS Võ Văn Chí nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus

Reticulatus Poir." họ Thau dau (Euphorbiaceae).

2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch loại bỏ phản sâu bệnh phơi khô trong bóng râm rồi

xay thành bột mịn Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất

2.3 DIEU CHE CÁC LOẠI CAO

La, thân và ré cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) được phơi khô, chặt nhỏ

vả nghiên thành bột mịn, say khô đến khối lượng không đôi (m = 26.0 kg) Nguyên liệu

bột mịn được tận trích với etanol 96° bằng phương pháp ngâm dam, lọc va cô quay loại

dung môi đưới áp suất thấp thu được cao etanol thô (534.0 g).

Cao etanol thô được chiết lỏng - lỏng lần lượt với ete dầu hoa, etyl acetat và n-butanol

thu được cao ete đầu hoa (52.0 g) cao etyl acetat (118.0 g) va cao n-butanol (294.0g).

Quả trình thực hiện được tóm theo sơ dé 2.1,

Sơ dé 2.1 Quy trình điều chế cao

Bột lá, thân, vỏ và rể Phén

den (m= 26.0 kg)

~ Ngắm dim trong etanol

~ Cô quay thu hồi dung

Cao etanol

(534.0 @)

~ Chiết lỏng — lỏng với ete dầu hoa, ety!

acetat, n-butanol

~ Cô quay thu hồi dung méi

Cao ete dầu hóa Cao etyl acetat

2.4 SAC KI COT SILLICA GEL CÔ LAP MOT SO HỢP CHAT HỮU CƠ

Sau khi trích lỏng lỏng thu được 03 loại cao chiết với độ phan cực tăng dan Dựa trên kết

quả thực hiện sắc ký lớp móng, khối lượng thu được của các cao chiết cùng với các

nghiên cứu trước day, chúng tôi chọn lựa nghiên cứu thành phần hóa học của cao etyl

acetat trước, các cao con lại sẽ khảo sat sau.

Thực hiện sắc kí cột (SKC) silica gel trên cao etyl acetat (118.0 g) với hệ dung môiCH;Cl; -MeOH có độ phân cực tăng dan từ 0% đến 100% metanol Dịch giải ly qua cột

được hửng vào các lọ.Theo đối quá trình giải ly bing sắc kí lớp móng (SKLM) Những lọ

cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn Kết quả thu được 9

phân đoạn (EA1-EA9), được trình bảy trong bang 2.1.

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat

Trọng

(g)

1 |EFAI| — CHC | 050 | Vậtdh

EA2 CH¡;CI;:CH;OH 19:1 Chưa khảo sát

CH;CI;:CH:OH 19:1 2.53 Khao sat

| 254 | Nhiuvết |Chưakhảosất

| 5 | BAS | CH;Cl;CH;OH 19:1 07.0 Nhiéu vết

_ 6 | EA6 CH;CI;;CH;OH 9:1 27.3 Chưa khảo sat

7 CH;CI;:CH;OH 17:3 17,3 Chua khao sat

_ 8 | EA8 | CH;CI:CH:OH4:l 08.9 Vétdai | Chưa khảo sát

_ 9 | EA9 | CH;CI;CHIOH73 | 095 | Vếtdài | Chưakhảo sát

Từ phân đoạn EA3 (2.53 g), tiến hành sắc kí cột, giải ly với dung môi có độ phân

cực tăng dan, bắt dau từ eter dầu hỏa —etyl acetat ( 1:1), thu được 5 phân đoạn được kihiệu theo thứ tự từ EA3.1 đến EA3.5 Phân đoạn EA3.5 (0.36 g) được sắc ký cột lin nữavới hệ eter dau hỏa —etyl acetat ( 1:1) thu được EA-PI (5 mg) và EA-P6 (8 mg)

Từ phân đoạn EAS (07.00 g) tiễn hành sắc ki cột, giải ly với dung môi eter dau hỏa

- etyl acetat có độ phân cực ting dẫn, bắt đầu từ 80% EtOAc 100% EtOAc, thu được

10

P2 (22 mg), P3 (25 mg) P4 (15 mg) PS (6 mg) P7 (8 mg) va

EA-P8 (5.0 mẹ).

Sơ để 2.2 Quy trình cô lập các hợp chat từ cao etyl acetat

Cao etyl acetat (118.0 g)

2.5 THỨ NGHIỆM HOẠT TÍNH GAY ĐỘC TE BẢO

Hoạt tính gay độc tế bảo trên các dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ung thư phổi

NCI-H460 và ung thư cỏ tử cung HeLa được thử nghiệm trên các hợp chất tinh khiết cô

lập được với phương pháp Sulforhodamine B (SRB) [26].

2.5.1 Nguyên tắc

Thử nghiệm SRB lả một phương pháp so mau đơn giản va nhạy dé xác định độc

tính té bào của một chat SRB là một thuốc nhuộm, tích điện âm, sẽ liên kết tĩnh điện với

các phan tích điện đương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phan anh lượng

protein tong của tế bào

Trong thử nghiệm, tế bào được có định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên

kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt, có màu hồng Mật độ quang

đo được của dung dich tương ứng với protein tông hay số lượng tế bao Sự thay đôi lượng

tế bảo so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bao của chất nghiên cửu

2.5.2 Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB

Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc tế bảo bằng phương pháp SRB được trình bảy trong Sơ đỏ 2.3.

2.5.2.1 Thiết kế khảo sátMột mẫu chứng đương: tế bảo với camptothecin ở nông độ 0,01 pg/ml

Một mẫu chứng âm: tế bảo với dung môi hòa tan chất thử (DMSO 0,25%).

Các mẫu cần thử nghiệm hoạt tính gây độc.

Thiết kế thử nghiệm của một mẫu bao gồm hai giếng tế bào có môi trường nuôi cấy

chất thử ở nông độ khảo sát và hai giếng không có tế bào có môi trường nuôi cây chất thử

ở nồng độ khảo sát (hai giếng blank)

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lan, lay giá trị trung bình

2.5.2.2 Xứ lý kết quả

Sau khi có giá trị mật độ quang ở các bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu OD»)

và ODa¿¿), tính toán các giá trị như sau:

Tinh giả trị QD„s; (hoặc OD¿z;) = OD, — OD pix (1)

Tính giá trị OD = OD„w;- OD,„(2)

12

Tinh ti lệ (%) gây độc tế bào theo công thức

%[ = (I ~ 272+) 100%

Véi: OD, : giá tri OD của giéng có chứa tế bao

OD yuk : gid trị OD của giếng blank

OD„y : giá trị OD của mẫu thử tinh từ công thức (1) và (2) ODc : giá trịOD của mẫu chứng (control) tính từ công thức (1) vả (2)

2.5.3 Nơi thực hiện thử nghiệm

Phong thí nghiệm Sinh học Phân tử, Bộ môn Di truyền Khoa Sinh học, Trường Dai

học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chi Minh.

13

Sơ đỗ 2.3, Quy trình khảo sát hoạt tinh gây độc té bảo bằng phương pháp SRB [24]

=Giải đông nguồn tế bảo ung thư bảo quản trong nitrogen lỏng.

FNua tế bảo trong bình nuôi cấy đạt độ phủ khoảng 70-80%

=Phú tế bảo vảo các giếng trên đĩa 96 giếng với mật độ tế bao là 10* tế bảo/giếng

Ly ở 37 °C, 5% CO., 24 giờ

=——————_————

Bê sung môi trường chứa chất thử với nông độ gap đôi nông độ muốn thử

(không loại bỏ môi trưởng cũ đã có ở trong giếng)

~Ủ ở 37 °C, 5% CO,, 48 giờ

rs

Cé định tế bào trong giếng với trichloroacetic acid 50%:

~Đặt đĩa trên vào tủ lạnh (4 °C), 1-3 giờ

—Loai bỏ chất lỏng trong mỗi giếng

~Rửa nhẹ nhàng với nước (200 ml/giểng), 5 lần

—Dé khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, 12-24 giờ

Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

Tử cây Phén den Phyllanthus reticulatus Poir họ Thầu dau thu hái ở Binh Dương, chúng tôi đã điều chế ra cao ethanol thô (534.0 g) Thực hiện trích lỏng - lỏng trên cao

methanol thô lan lượt bằng các dung mỗi eter dầu hóa, ethyl acetat va n-butanol, sau đó cô quay thu héi dung môi, thu được các cao trích tương ứng Từ cao ethyl acetate, sử dung các phương pháp cô lập thường quy vả xác định cấu trúc bằng phương pháp phd NMR, MS đồng thời so sánh với tải liệu tham khảo, chúng tôi đã cô lập va đẻ nghị cau trúc hóa học của

08 hợp chất Phan biện luận cấu trúc của từng hợp chất được trình bày cụ thẻ như sau.

3.1 KHẢO SÁT CAU TRÚC CUA HỢP CHAT EA-PI

Hợp chat EA-PI (5 mg) thu được từ phân đoạn EA3 của sơ dé 2.2 có những đặc điểm

sau:

- Dạng gum không màu.

- Phé'H-NMR (CDCI, ) (Phụ lục 1a và Bảng 3.1),

- Phố °C-NMR kết hợp với DEPT (CDCI;) (Phụ lục 1b, le và Bảng 3.1)

- Phd COSY, HSQC, HMBC (CDC|)) (Phụ lục Id, le, If và Bang 3.1).

% BIEN LUẬN CÁU TRÚC

Phô 'H-NMR của EA-P1 xuất hiện mũi đơn tại ỗ¡; 6.58 (2H, s, H-2, H-6) của một vòng benzen mang 4 nhóm thé Tín hiệu mũi đơn tai 5, 5.49 (1H s) không cho tương quan

HSQC đến carbon náo, thé hiện đó là proton của ! nhỏm hydroxyl Tin hiệu mũi đơn tại by,

3,90 (6H, s) thé hiện có sự hiện diện của 2 nhóm metoxy.

Ngoàái ra, phổ 'H-NMR còn thẻ hiện các tín hiệu proton bão hỏa, đặc trưng của khung

diepoxytetrahydrofuran lignan tại 5, 4.73 (1H, đ, J = 3.5 Hz, H-7); 4.28 (LH, dd, J = 90/70

Hz, H-9a); 3.90 (1H, m, H-9b); 3.09 (1H, m, H-8).

Phổ C-NMR kết hợp với DEPT chi thé hiện 8 tin hiệu carbon, gểm các carbon thơm

ở vùng từ trường thấp, carbon metine mang oxygen tại ôc 86.2 (C-7), carbon metylene mang

oxygen tại ôc 71.7 (C-9), carbon metine bão hòa tại ôc $4.5 (C-8), 2 nhóm metoxy tai dc

56.5.

Phổ COSY cho thấy sự tương quan giữa proton ô,; 3.09 (H-8) với proton ô„ 4.73 (H-7)

và 4.28 (H-9).

Phổ HSQC thé hiện sự tương quan giữa proton có ổ„ 6.58 (H-2 và H-6) với carbon tại

ốc 102.9 (C-2 vả C-6); proton cộng hưởng tai 5; 4.73 (H-7) cho tương quan HSQC với

1S

carbon d¢ 86.2 7): proton tại 5,, 4.28 và 3.90 (2H H-9) tương quan với carbon ồc71.9

(C-9): proton có dy, 3.09 (H-Ñ) tương quan với carbon d¢ 54.5 (C-8).

Như vậy, EA-P1 được dự đoán là một lignan có cấu trúc đối xứng loại bicyclooctane

Tương quan HMBC từ tin hiệu 5, 4.73 (H-7 và H-7') den tín hiệu õc 102.9 (C-2.C-6 vaC-2', C-6') cho biết vòng thơm gin vào diepoxytetrahydrofuran tại vị trí 7 vả 7’

Các nhóm metoxy gắn vào vòng thơm được xác định bởi tương quan HMBC từ tín

hiệu ð,; 3.90 (6H s) đến tín hiệu 5, 147.3 (C-3 C-5).

Trong tự nhiên, hóa học lập thẻ của H-8 va H-8' của các epoxytetrahydrofuran lignan

luôn có cau hình cis [19] Hóa học lập thé tại C-7 và C-7' có thé xác định dựa vao hing số

ghép giữa H-7/H-8 và H-7'/H-8' Nếu J;„ < § § Hz thì H-7 và H-8 ở vị trí ans với nhau

[13].

Trong trường hợp của hợp chất EA-P1, hằng số ghép Jy» = 3.5 Hz nên H-7 va H-8 ở vị

tri trans với nhau Hóa học lập thé tại 2 vị trí C-7 và C-7' giống nhau do EA-P1 có cấu trúc

đôi xứng phô nghiệm chỉ thẻ hiện tín hiệu của một nửa phân tử

Việc phân tích các dir liệu phô nghiệm của EA-P1 va so sánh với số liệu phổ nghiệm

của syringaresinol [27] được trình bay trong bảng 3.1 cho thấy có sự tương đồng Vì vậy,

EA-PI được đẻ nghị là syringaresinol.

OCH,

AA, 1 en a

HạCO cy 7 oe H,co

-O Hy H-O Hạ

Hình 3.1 Một số tương quan HMBC Syringaresinol (EA-P1)

của hợp chat EA-PI

3.2 KHAO SÁT CÁU TRÚC HOP CHAT EA-P6

Hợp chất EA-P6 (8 mg) thu được tử phân đoạn EA3 của sơ đỏ 2 có những đặc điểm sau:

- Dạng bột màu trằng

- Phê 'H-NMR (CDCI;+MeOD) (Phụ lục 2a và Bang 3.2)

- Phd "C-NMR kết hợp với DEPT-NMR (CDCI; +MeOD) (Phụ lục 2b, 2c vả Bảng

3.2).

l6

- Pho HMBC, HSQC (CDCI; +MeOD) (Phụ lục 2d 2e và Bảng 3.2)

Bang 3.1 Số liệu phố NMR của EA-PI

Hợp chất EA-PI (CDCI) neal xn

-3-OCH, 190, s 56.5 C3 56.5

3'-OCH; 190, y $6.5 C+3! 56.5

$-OCH; 3.90, s 56.5 C-5 $6.5

S-OCH; 390, s 56.5 c-5' 56.5

# BIEN LUẬN CAU TRÚC

Pho 'H-NMR của hợp chất EA-P6 thẻ hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton gan trên

vòng thơm ở 6, 7.69 (1H, s) và 7.66 (1H, s) cùng với tín hiệu cộng hưởng của proton 3

vậy ngoại trừ ba carbon nhóm -OCH; hợp chất EA-P6 còn lại 14 carbon gôm 2 carbon

>C=O va 12 carbon vòng thom Hai carbon >C=O cộng hưởng ở vùng từ trường cao tại bc

159.1 và 159.0 cho thay hợp chất EA-P6 có chứa hai vòng lacton với >C=O liên hợp

Phỏ đỏ HSQC cho thay sự tương quan từ proton ở 5, 4.25 tới carbon tại d¢ 61.4, từ proton tại dy 4.21 tới carbon có d¢ 61.2, tử proton ở dy 4.05 tới carbon tại dc 56.3.

Sự tương quan HMBC tử proton ở 5, 7.66 (1H, s H-5) đến carbon tại d¢ 159.0 (>C=O,

C-7), và hai carbon mang oxygen khác của vòng thơm ở tại d¢ 152,2 (C-4) và 140.6 (C-3)

cho thay hai vị trí C-3, C-4 gan nhóm thé Tương tự, proton ở 54 7.69 (1H, s, H-5') chotương quan HMBC đến carbon tại &¢ 159.1 (>*C=O, €-7'), và hai carbon mang oxy khác củavòng thơm ở tại öc 153.8 (C-4`) và 141,6 (C-3") cho thay hai vị trí C-3", C-4` gắn nhóm thé

Từ những dit liệu trên cho phép dy đoán EA-P6 là dẫn xuất của acid ellagic.

Tương quan HMBC tử proton của nhóm -OCH; đến các carbon mang oxygen của nhânthơm (hinh 3.2), cho biết EA-P6 là acid ellagic có ba nhóm —OH đã bj methyl hóa

Từ những dữ liệu trên kết hợp so sánh với số liệu phổ của acid

3,3°,4’-tri-O-metylellagic [28] cho thấy có sự tương đồng nên EA-P6 được dé nghị là acid

3,3*,4*-tri-Ó-metylellagie.

Hình 3.2 Tương quan HMBC của EA-P6 Acid 3,4,3'-tri-Ó-metylellagic

(EA-P6)

3.3 KHAO SAT CAU TRUC CUA HOP CHAT EA-P2

Hợp chat EA-P2 (22 mg) thu được từ phân đoạn EAS của so đồ 2.2, có những đặc điểm sau:

- Hợp chất ở dang bột, màu trang

- Phổ HR-MS-ESI (phụ lục 3a) cho mũi ion giả phân tử có m/z = 425.1207 [M+Na]” phù

hợp với công thức phân tử C›¡H;yO¿ (tính toán cho [M+Na] = 425,1212)

- Pho 'H-NMR (MeOD) (Phụ lục 3b và Bảng 3.3)

- Phổ C-NMR kết hợp với DEPT - NMR ( MeOD) (Phụ lục 3c, 3d và Bảng 3.3)

- Phd COSY HSQC HMBC (Phy lục 3e, 3f, 3g)

Bang 3.2 Dữ liệu pho của hợp chất EA-P6

Acid 3,4,

3'-tri-Ó-Hợp chất EA-P6 ae :

4 metylellagic Vitel (CDCl)+MeOD) ds) (28)

OMe (37) 421,s 614 3 61.31

OMe (3) 425, 61.2 3 61.02

+ BIEN LUẬN CÁU TRÚC

Phỏ 'H NMR xuất hiện hai proton olefin cộng hưởng tại 5, 7.70 (1H, d, J = 16.0 Hz);

6.54 (1H, d J = 16.0 Hz) và 5 proton gan trên vòng benzen cộng hưởng ở 5y 7.59 (2H, m),

7.42 (3H, m) Hai proton olefin có hing sé ghép J =16.0 Hz nên nối đôi có cấu hình trans.

Phỏ đỗ cỏn thé hiện tin hiệu cộng hưởng của một vòng benzen mang hai nhóm thé ở vị

trí 1; 4 [ô„ 6.95 (2H, đ J= 8.0 Hz); 6.66 (2H, đ, # 8.0 Hz)], một proton anomer ở ỗ„ 4.75

(1H, d, J =7.0 Hz), các proton gắn trên carbon mang oxygen của phân tử đường cộng hưởng

trong ving 5, 3.45-4.56.

Pho °C kết hợp với DEPT - NMR cho thấy EA-P2 có 21 nguyên tử carbon Trong đó,

có 4 carbon loại >CH-O-, II carbon loại =CH-, một carbon loại >C=O, | carbon loại

-CH;-O Một carbon >C=O cộng hưởng ở ðc 168.3 ( C9"); hai carbon olefin vả các carbon của vòng benzen cộng hưởng ở d¢ 116.6-153.9 Tín hiệu cộng hưởng của phân tử đường hexose

bao gồm một carbon anomer ỗc 103.8, 4 carbon >CH-O- (ôc77.9, 75.4, 74.8, 71.9) và một

nhóm -CH;-O- tại ôc 64.9.

Hai proton olefin ở 5y 7.70 va 6.54 tương quan HSQC lần lượt đến 2 carbon tại ỗc

146.6 và 119.6 Hai cặp proton ghép cặp ortho ở ô; 6.95 (2H d, J=8.0 Hz) va 6.66 (2H, d,

J=8.0 Hz) tương quan HSQC lần lượt đến carbon ở 8¢ 119.6 và ðc 116.6 đó, phỏ

THƯ VIEN

rham

19 Trưững Dar Hoc

TP HỎ.^HI:MINH

HSỌC còn thẻ hiện sự tương quan từ proton anomer 6), 4.76 đến carbon ở d¢ 103.8, tir proton

của nhóm methylen mang oxygen ở ð¿¡4,Š7 va 4.54 đến với carbon tại &- 64.0 (C6`).

Từ các dữ liệu phổ nghiệm trên cho phép dự đoán EA-P2 có cấu trúc gồm 2 đơn vị

vong thom, | phan tứ đường 6 carbon, một nỗi đôi CH=CH vả một nhóm >C=O

Tương quan HMBC từ proton olefin ở ô„ 7.70 đến các carbon tại ö 135.5 (carbon tứ

cấp): 1297: 119.6 và 168.4 (>C=O C6") Proton olefin tại ổy 6.54 có tương quan HMBC

đến carbon ở 6 135.5 Như vậy, cấu trúc EA-P2 có một đơn vị cinnanoyl.

Hai proton gan trên carbon metylen mang oxygen (-CH;-O, C6") của phân tử đường

cộng hướng ở 84.55 và 4.37 cho tương quan HMBC đến carbon tại ổ 168.3 (*C=O, C9”), nên vị trí C6` của đường sẽ gắn vào cinnamony! qua liên kết ester, Mat khác, proton anomer

tại 6) 4.75 cho tương quan HMBC đến carbon tứ cấp của vòng thơm ở 8, 152.2; nên phân tứ

đường gan vao vòng thom con lại tai C1 (Šc 152.2)

Khoi phố phản giải cao HR-ESI-MS cho mũi ion giá phân từ tại m/z 425.1207

[M+Nal|” pha hợp với công thức phan tử Cy,H» Oy,

Việc phân tích các dit liệu phổ nghiệm của hợp chất EA-P2 va so sánh đối chiều với dữ

liệu phô nghiệm của 6ˆ- cinnamoylarbutin được tông hợp từ arbutin va vinyl cinnamate [16.

20] cho thấy có sự tương đồng nên EA-P2 được dé nghị là 6`-()-cinnamoylarbutin Mặc dù hợp chất 6’-O-cinnamoylarbutin được tổng hợp từ arbutin và viny! cinnamat nhưng đây là hợp chất mới trong tự nhiên.

Hình 3.3 lương quan HMBC của EA-P2 6'-O-Cinnamoy larbutin

3.4 KHAO SAT CAU TRUC CUA HOP CHAT EA-P3

Hợp chất EA-P3 (25 mg) thu được từ phân đoạn EAS của so dé 3 có những đặc điểm sau:

- Chất bột, mau trắng.

- Phô 'H-NMR (McOD) (Phụ lục 4a và Bang 3.4)

- Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT NMR (MeOD) (Phụ lục 4b 4 và Bang 3.4).

- Phê COSY, HSQC, HMBC (Phụ lục 4d, đe, 4).

20

Bang 3.3 Số liệu phố NMR của EA-P2

có Hợp chất EAP2 (MEOD) 6*@Cinnamoylarbutin

-Xã ði,(ppm) & (ppm) HMBC —& (ppm)

Ghi chủ * tin hiệu hj ching chap

+ BIEN LUẬN CÁU TRÚC

Phd NMR của hợp chất EA-P3 cho thấy những tín hiệu cộng hưởng gắn giống với phd

NMR của hợp chất EA-P2: bao gôm tín hiệu cộng hường cúa vòng benzen mang | nhóm

the [5 8.02 (2H d, J = 8.0 Hz; 7.61 (1H dd, J = 7.5 Hz); 7.48 (2H dd, J = 8.0/7.5 Hz):

vỏng benzen mang hai nhóm thé ở vị tri 1,4 [8y 6.93 (2H, d, J = 8.5 Hz; 6.59 (2H, ¿./ = 9.0

Hz}; proton anomer ở 5H 4.76 (1H, d, / = 7.5 Hz) và tin hiệu cộng hưởng của proton gắn

trên carbon mang oxygen của phân tử đường ở vùng 8, 3.42-4.71 Tuy nhiên, trong phô

'H-NMR của hợp chất EA-P3 không xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của pronton olefin như

trong trưởng hợp của hợp chất EA-P2.

Tương tự như hợp chất EA-P2, phổ °C kết hợp với DEPT NMR của hợp chit EA-P3 cho thấy có 21 carbon; gồm một carbon >C=O cộng hướng tại d¢ 167.8 các carbon của

vòng thơm cộng hưởng trong vùng 6 116,5-153.8, carbon anomer ở ðc 103.5 va 4 carbon mang oxygen >CH-O cua phan tử đường xuất hiện 6 ồc 72.0-77.9, một nhóm metylen mang oxygen ở ðc 65.4 Như vậy, EA-P3 cùng chứa một phân tử đường hexose.

Cac phd HSQC, HMBC va COSY giúp xác định thêm cấu trúc của hợp chất EA-P3.

Tương quan HMBC từ proton anomer 6, 4 6 đến carbon ð,- 152.1 cho phép xác định phân tứ đường sẽ gan vào vòng thơm thứ nhất ớ C-1 Hai proton của nhóm metylen mang

oxygen €-6` của phân tử đường cho tương quan HMBC đến carbon =C=O cua vòng thơm

con lại, nên C-6' cua phân tử đường gắn vào -COO- qua liên kết ester.

Như vậy, câu trúc của EA-P3 được dự đoán gồm có nhóm benzoyl gắn vào C-6` của

đường C-1° của đường gắn với 4-hydroxyphenyl qua liên két oside.

Proton H-3` và H-4` của phân tử đường có hang số ghép J lin lượt lá 8.5/8.5 va 8.5/9.5

Hz nên phan tử đường sé là đường B-b-glucose.

Từ sự phân tích dit liệu phỏ nghiệm của hợp chất EA-P3, kết hợp so sánh với dit liệu

pho nghiệm của hợp chất arbutin [14] cho thấy có nhiều điểm tương đông, nên chủng tôi dé nghj câu trúc của hợp chất EA-P3 là 6`-(2-benzoyl arbutin.

OH 6'-O-benzoyl arbutin (EA-P3)

Table 3.4 Số liệu NMR của hợp chất EA-P3

EA-P3 (CDCI,) 6 -C-benzoy! arbutin

3.5 KHAO SÁT CAU TRÚC CUA HỢP CHAT EA-P4

Hợp chat EA-P4 (15 mg) thu được tử phân đoạn EAS của sơ đỗ 3 có những đặc điểm sau:

- Chất 6 dang gum màu tring.

22

- Phd HR-MS-ESI (phụ lục Sa) cho mũi ion giả phân tử tại m/z 333.096 [M+Na]” phủ hợp

với công thức phân tử C;H¡gO¿Na với M + Na = 333.095.

- Phỏ 'H-NMR (MeOD) (Phụ 5b va Bang 3.5)

- Pho ''C NMR (MeOD) (Phụ Sc, 5đ va Bảng 3.5)

- Phỏ COSY, HSQC HMBC (phụ lục Se, Sf, Sg).

+ BIEN LUẬN CÁU TRÚC

Pho ‘H-NMR của hợp chat EA-P4 xuất hiện tin hiệu cộng hưởng của hai proton

olefin cộng hưởng tại 5y (ppm) 7.72 (2H, d, J=16.0 Hz), 6.54 (2H, đ, J=16.0 Hz) Hằng số

ghép J của 2 cặp proton olefin bằng 16.0 Hz nên nối đôi có cấu hình là trans.

Bên cạnh đó, phỏ 'H-NMR côn thé hiện 10 proton gan trên vòng thơm ở 8) 7.60 (4H,

m), 7.41 (6H m); 2 proton anomer tại ð„ 5.16 (1H, d, J=3.Š Hz), 4.56 (1H, d, J=8.0 Hz); các proton >CH-O- của phân tử đường cộng hưởng trong vùng 64 3.20-4.55.

Phé °C cho thấy EA-P4 có hai carbon >C=O cộng hưởng tại ôc 168.5 và 168.4: các

carbon của vòng thơm cộng hưởng ở vùng 5¢ 129.1-135.6 Tín hiệu cộng hưởng của hai

phan tử đường hexose bao gồm hai carbon anomer ở ổ„ 98.1 và 93.9, 8 carbon >CH-O (ỗc

77.8 - 70.7 ), hai nhóm metylene mang oxygen ở ôc 65,1 và 65.0.

Nhu vay, EA-P4 được dự đoán 1a hợp chất có cau trúc gồm hai đơn vị cinnamoyl va

hai phân tử đường hexose.

Hai proton olefin 5, 7.72 và 6.54 cho tương quan HSQC lần lượt với carbon ôc 146.4

và 118.6 Tương ty, hai proton anomer ở 5, 5.16 và 4.56 cho tương quan HSQC lần lượt

với carbon anomer tại ôc 93.9 và 98.3.

Carbon C-6 của phân tử đường gắn vào phan aglycon tại >C=O qua liên kết ester

được xác định bởi tương quan HMBC từ proton nhóm metylen tại 5y 4.55 và 3.35 với

carbon >C=O cộng hưởng ở ôc 168.5 và 168.4.

Phỏ COSY cho thấy proton anomer ở ỗ„ 4.56 (H-1) tương quan với proton tại 54

3.22 (dd, J=8.0, 8.5 Hz, H-2a), proton tai 5, 3.43 3a) tương quan với proton 5,, 3.22

(H-2a) va proton 5, 3.42 (H-4a) Qua đó, kết hợp với phd HSQC, HMBC xác định được các

tin hiệu công hưởng của các carbon C-la (d¢ 98.2), C-2a (6c 76.2), C-3a (õc 77.8), C-4a (ốc71.9/71.7), 75.3 và 65.0/65.1 Phân tử đường thứ nhất có hang số ghép của proton anomer

là 8.0 Hz va của proton H-4 lần lượt là 9.0/ 9.0 Hz nên phân tử đường này 1a đường

-D-glucose.

Tương tự, tử các tương quan COSY, HSQC, HMBC cho thấy phan tử đường thứ hai

tóm có 6 carbon >CH-O- công hướng ở ốc 93.9 (C-1b), 73.7 (C-2b), 74.7 (C-3b) 71.7/71.9

(C-4b).70.7 (C-Sb), 65.1/65.0 (C-6b) Phản tứ đường thử hai có hãng số ghép của proton

anomer lá J=3.5 Hz va hang số ghép của proton H-Sb lần lượt là 10.0/ 5.5/ 2.0 Hz cùng với

C-1b có d¢ 93.9 nên đây lá đường của a-D-glucose.

Phó HMBC không thé hiện tương quan nảo của 2 phân tử đường.

Pho HR-MS-ESI cho mũi ion gia phân tử có m/z= 333.096 (M+Na|” phủ hợp với

công thức phân tử C).H)yO-Na.

Tir sự phan tích các dit liệu phô nghiệm của hợp chất EA-P4, kết hợp so sánh dit liệu

pho của 6-0-cinnamoy!-a/B-D-glucopyranose [22] cho thấy có sự tương đồng Do đó công

thức của hợp chất EA-P4 được dé nghị là 6-(2-cinnamoyl-⁄-D-glueopyranose.

3.6 KHẢO SÁT CÁU TRÚC HỢP CHAT EA-P5

Hợp chất EA-P§ (6 mg) thu được từ phân đoạn E5 của sơ dé 2 có những đặc điểm sau:

- Dạng bột màu vang.

- Pho 'H-NMR (Aceton-d,) (Phụ lục 6a va Bang 3.6)

- Phổ "C-NMR kết hợp với DEPT-NMR (Aceton-d,) (Phụ lục 6b, 6c và Bang 3.6).

- Phé HSQC, HMBC (Aceton-d,) (Phụ lục 6d, 6e ).

+BIỆN LUẬN CÁU TRÚC

Phổ 'H-NMR xuat hiện tín hiệu cộng hưởng của 5 proton vòng thơm trong vùng dy

7.82-6.26 Trong đó có hai proton ghép cặp ortho ở 5, 7.68 (1H, d, J°8.5 Hz) và 6.99 (1H, đ,

J=§.0 Hz).

Pho °C kết hợp với DEPT NMR cho thấy hợp chất EA-P5 có 15 carbon cộng hưởng

trong vùng ôc 176.5-94.4, trong đó có một carbon >C=O cộng hưởng ở d¢ 176.5 và bảy

carbon mang oxy (ỗc 165.0, 162.3, 157.7, 148.3, 146.9, 145.8, 136.7) Do đó có thể dy đoán

EA-PS là hợp chất flavonol Như vậy, ngoài ba carbon mang oxygen của khung flavonol,hợp chat EA-PS còn có thêm bốn carbon khác mang oxygen

Sự tương quan HMBC từ proton ở 6, 7.82 (drs, H-2') đến carbon tại ðc 146.9 (C-2);

proton ở dy, 7.68 (d, J=8.5 Hz, H-6") cho tương quan HMBC đến carbon ở õc 146.9 (C-2)

Mat khác proton 5, 7.68 ghép cặp ortho với proton ở 5, 6.99 (1H, d, J=8.0 Hz) Từ đó có

thé dự đoán vòng B của flavonol mang 2 nhóm thé -OH tại C-3" và C-4’.

Mũi cộng hưởng của -OH kiêm nối ở 5, 12.15 giúp xác định vi trí C-5 mang nhóm —OH

Proton vòng thơm ở dy 6.26 (drs) cho tương quan HMBC tới carbon C-5 ở 5¢ 162.3 và

carbon mang oxy khác ở 5C 165.0 Proton vòng thơm ở 8y, 6.52 tương quan đến carbon C-6

(5¢ 99.1), C-10 (ðc 104.1) Do đó ngoài nhóm -OH ở vị trí C-Š còn có thêm nhóm -OH

khác gin ở C-7.

Từ những dit liệu trên, kết hợp so sánh với số liệu phd của quercetin [15] cho thấy có sự

tương đồng, nên hợp chất EA-P§ được dé nghị là quercetin

25

Bảng 3.6 Số liệu pho NMR của EA-P5

3.7 KHẢO SÁT CÁU TRÚC HOP CHAT EA-P7

Hợp chất EA-P7 (8.00 mg) thu được từ phân đoạn EAS của sơ dé 2 có những đặc điểm

sau:

- Dạng bột mau tring.

- Phổ 'H-NMR (Aceton-d,) (Phụ lục 7a và Bảng 3.7).

-Phỏ '"C va DEPT NMR (Aceton-d,) (Phụ lục 7b,7c và Bảng 3.7)

BIEN LUẬN CAU TRÚC

Phổ 'H NMR của hợp chất EA-P7 thẻ hiện tín hiệu cộng hưởng của ba proton vòng

thơm ở ð„ 7.53 (1H, d, 2.0 Hz), 7.47 (dd, 2.0, 8.0 Hz) và 6.90 (d, 8.0 Hz), như vậy có thé dự

doan hợp chất EA-P7 có vòng thơm mang ba nhóm thé 1,3,4

Phé °C kết hợp cới DEPT NMR cho thấy hợp chất EA-P7 có bảy carbon gồm mộtcarbon >C=O cộng hướng ở õc 167.0 va sáu carbon còn lại nằm trong vùng thơm 150.8 -

117.0 Trong sáu carbon vòng thơm có ba carbon tứ cấp ôc 150.8 ; 145.5 ; 123.0.

Từ những dữ liệu trên cho phép dự đoán hợp chất EA-P7 gồm một vòng thơm mang

một nhóm >C=O, hai nhóm thé còn lại có thé là -OH Kết hợp so sánh số liệu NMR củahợp chất EA-P7 với acid 3,4-dihydroxybenzoic acid [8] cho thay có sự tương đồng nên hợp

chất EA-P7 được đẻ nghị là acid 3.4-đihydroxybenzoic

26

iG

Acid 3, 4-dihydroxybenzoic (EA-P7)

Bảng 3.7 Số liệu phố NMR của hợp chất EA-P7

3.8 KHAO SÁT CÁU TRÚC HOP CHAT EA-P8

Hợp chat EA-P8 (5 mg) thu được tir phân đoạn EAS của so đồ 2 có những đặc điểm sau:

- Dạng gum, không màu.

- Phd ‘H-NMR (DMSO-d,, phụ lục 8a và Bảng 3.8)

Phỏ '*C-NMR kết hợp với DEPT NMR (DMSO-d¿) (Phụ lục 8b, 8c va Bảng 3.8)

- Phd HMBC, HSQC (DMSO) (Phụ lục 8d, 8e 80).

BIEN LUẬN CÁU TRÚC

Phỏ 'H-NMR của hợp chất EA-P8 thé hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton gắn

trên vòng thơm ở 6, 7.56 (1H, s) và 7.51 (1H, s) tín hiệu cộng hưởng của proton anomer ở

$y 5.48 (đ 1.0 Hz), nhóm metoxy ở dy 4,01, nhóm ~CH¡ ở dy 1,11 (d, 6,5 Hz) cùng với các

tín hiệu của proton >CH-O ở trong vùng 8), 3,3-4,0.

Phé °C kết hợp với DEPT-NMR cho thấy hợp chất EA-P8 cỏ hai carbon >C=O cộng

hưởng ở ôc 159,5; 159.1, các carbon của vòng thơm (5¢ 110,9-152,4), carbon anomer cộng

hưởng ở ôc 99,6, các carbon mang oxygen của đường (ôc 69,7-72,1) va nhóm -CH; (ỗc

18,0), Hai carbon >C=O cộng hưởng ở vùng tir trưởng cao tại d¢ 159,1 va 159,0 có thể dự

đoán cho thấy hợp chất EA-P8 có chứa hai vòng lacton với >C=O liên hợp.

Tương quan HSQC từ proton proton ở 5; 4,01 tới carbon tại d¢ 60,9.

27

Sự tương quan HMBC tir proton ở 6, 7,51 (1H, s, H-5) đến carbon tại dc 159.1 (>C=O,

C-7) va hai carbon mang oxygen khác của vòng thơm ở tại ôc 152.4 (C-4) và 139.9 (C-3)

cho thay hai vị trí C-3, C-4 gắn nhóm thé Proton cộng hưởng ở 5 7.56 (1H š, H-5*) cho tương quan HMBC đến carbon tại d¢ 159.1 (+C=O, C-7'), 147,8 (C-4'`).

Từ tất cả những dit liệu trên cho phép dự đoán hợp chất EA-P8 lá dẫn xuất của acid

ellagic có gắn thém phân tử đường.

Proton anomer (ổ 5,48, d, 1,0 Hz) cho tương quan HMBC tới carbon công hưởng ở & 147.8 (C-4`) nên phân tử đường gắn vào aglycon qua C-4' Proton của nhóm metoxy cộng hưởng ở 54 4.01 cho tương quan HMBC tới carbon cộng hưởng ở d¢ 139,9 (C-3) nên tại vị

Iri C-3 đã được mety! hóa.

Phần đường được xác định dựa vảo các sự kết hợp phô COSY, HSQC HMBC Theo

dé, phân đường gồm các 6 carbon (99,6; 70,1: 70,4; 72,1: 69,7 và 18,0), Tin hiệu cộng

hướng của proton anomer ở 6, 5,48 dưới dang mii đôi, J = 1,0 Hz và nhóm methyl C-6" (6),

1,10, d, 6,5 Hz, d¢ 18,0) cho phép dự đoán đây là đường a-t-rhamnosce.

Bang 3.8 Số liệu phd NMR của hợp chất EA-P8

Vị trí EA-P8 (DMSO) Hop chất so sánh

Gì chứ * Avid 3-O-methyt-4 -O-a-L-rhamnopyranosylellagic

** Tin liệu không thé hig

** * Tin hiệu bi che khuất

28

Kết hợp so sánh với số liệu phd NMR của hợp chat acid

3-O-methyl-4'-O-a-1-rhamnopyranosylellagic [5] cho thay có sự tương đẳng nén chúng tôi để nghị cầu trúc của

hợp chất EA-P8 là acid 3-O-methyl-4"-O-a-L-rhamnopyranosylellagic.

Hình 3.4 Tương quan HMBC của EAP8 Acid 3(methyl4`(2ư|

-rhamnopyranosylellagic (EA-P8)

3.9 KET QUÁ THU NGHIỆM HOẠT TÍNH GAY DOC TE BAO

Thu nghiệm hoạt tinh gây độc tế bảo trên ba dong tế bảo ung thư bao gồm tế bảo ung

thư va MCF-7, ung thư cô tử cung HeLa và ung thư phôi NCI-H460 Thực hiện thir nghiệm

trên hai hợp chất tính khiết EA-P2 và EA-P3 ở nông độ 100 pg/mL Kết quả thứ nghiệm

được trình bày trong bảng 3.9,

Bảng 3.9 Kết quá thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư

Hep chit ——— “Tỉ lệ phan trăm gây độc tế bào TB + DLC

HeLa NCI-11460 MCI?

KET LUAN

Tir cây Phèn den Phyllanthus reticulatus, sử dụng phương pháp trích ly ngâm dâm ở nhiệt độ phòng cùng các phương pháp sắc ký, chúng tôi đã cô lập được 8 hợp chất tinh

khiết Sử dung các phương pháp hóa lý hiện đại như HR-ESI-MS, ID và 2D-NMR và so

sánh với các tải liệu tham khảo chúng tôi đã xác định được cấu trúc hóa học của 8 hợp chất

đó bao gồm: syringaresinol (EA-P1), 6°-O-cinnamoylarbutin (EA-P2), 6`-benzoylarbutin

(EA-P3), 6-O-cinnamoyl-a/B-D-glucopyranose (EA-P4), quercetin (EA-PS),

3,3°,4°-tri-O-methylellagic acid (EA-P6), acid 3.4-dihydroxybenzoic (EA-P7) va acid

3-Ó-methyl-4'-Ó-a-L-rhamnopyranosylellagic (EA-P8).

Trong sé các hợp chất đã cô lập được thi hợp chất 6'-benzoylarbutin (EA-P3),

6-O-cinnamoyl-œ/B-D-glucopyranose (EA-P4) được biết lan dau tiên trong chi Phyllanthus Hợpchat 6`-Ø-cinnamoylarbutin (EA-P2) là hợp chat mới trong tự nhiên mặc dù hợp chat này đã

được tổng hợp từ arbutin và vinyl cinnamate

Kết quả nghiên cứu đã góp phan bổ sung thêm kiến thức về hóa - thực vật của chỉ

Phyllanthus

EA-P4

% Dé xuất hướng nghiên cứu tiếp theo:

Trong qua trình khảo sát cao ety! acetat, chúng tôi nhận thay còn cỏ sự hiện diện củanhóm hợp chất arylnaphtalen lignan Đây là những hợp chất có tiềm năng gây độc tế bào

ung thư Mong tìm được nguôn kinh phí đẻ tiếp tục khảo sat.

Kết quả nghiên cứu được công bố trên Tạp chí Hóa học: Nguyen Thi Anh Tuyet, Duong

Thuc Huy, Nguyen Kim Phi Phung (2015), “Chemical constituents of Phyllanthus reticulatus

Poir,", Tap chi hóa hoc, 53(2¢1), 109-113.

30

TÀI LIỆU THAM KHẢO

# TÀI LIỆU TIENG VIET

[1] Phan Văn Dan (2009), "Nghiên Cứu Thành Phan Hoá Học Có Trong Cây Phén den

(PhyllanthusReticulatus Poir Euphorbiaceae)”, Luân văn cao học Trường Đại học Su

phạm Thái Nguyên, 12-40.

[2] Lẻ Tran Đức (1997), “Cay thuốc Việt Nam”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 724-725

[3] Đỗ Tat Lợi (2000) “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam", NXB Y học, 550-551

* TÀI LIỆU TIENG ANH

[4] A.K Jamal, W.A Yaacob, Laily B Din (2008), “A Chemical Study on Phyllanthus

reticulatus ”, Journal of Physical Science, 19(2), 45-50

[5] Ana L M Nassera Camila B A Carlib, Clenilson M Rodriguesa Danielle C G.

Maiab Iracilda Z Carlosb, Marcos N Eberlinc, Cle’ lia A Hiruma-Limad và Wagner

Vilegasa (2008) “Identification of Ellagic Acid Derivatives in Methanolic Extracts

from Qualea Species”, Z Naturforsch., 63c, 794-800.

[6] Biplab K Das, Sukumar Bepary Bidyut K Datta, A K Azad Chowdhury, Mohammad

Shawkat Ali, Abu Shara Shamsur Rouf (2008), “Hepatoprotective Activity Of

Phyllanthus Reticulatus”, Pak J Pharm Sci 2l (4), 333-337.

[7Ị Biplab Kumar Das, Mohammad Shohel, Adit Muktadir Pavel, Rajib Bhattacharjec,

Banibrata Das, Tahmina Yasmin, Nasrin Akhter va JMA HannanAnti (2011), “Hepatitis

B Viral Activity of Phyllanthus reticulatus” Bangladesh Pharmaceutical Journal, 14 (1), 11-14.

[8] Boonchoo Sritularak, Nopporn Boonplod, Vimolmas Lipipun, Kitisak

Likhitwitayawuid (2013), “Chemical constituents of Canarium subulatum and their

anti-herpetic and DPPH free radical scavenging properties”, Rec Nat Prod., 7(2),

129-132, (Supporting information)

[9] Calixto J B., Santos A R (1998), “A review of the plants of the genus Phyllanthus:

Their Chemistry, Pharmacology, and Therapeutic Potential”, Pharmacology, Medicinal

Research Reviews, 18(4), 225-258.

[10] E Omulokoli, B Khan, S,C Chhabra (1997), “Antiplasmodial activity of four Kenyan

medicinal plants”, Journal of Ethnopharmacology, 56, 133-137.

{11] Jian-Xiong Ma, Ming-Sheng Lan, Shi-Jin Qu, Jun-Jie Tan, Hong-Feng Luo,

Chang-Heng Tan & Da-Yuan Zhu (2012), “Arylnaphthalene lignan glycosides and other

31