Bài báo cáo môn thực hành công nghệ tế bào Động vật bài 2 phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào Đơn từ tuyến sinh dục gà vnt

Tủ nuôi cấy tế bào động vật Tủ nuôi cấy tế bào động vật hay tủ ấm CO2 incubator là thiết bị phòng thí nghiệm thiết yếu cho việc nuôi cấy tế bào với chức năng tạo ra môi trường ổn định

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Trường Đại Học Mở TP.HCM

BÀI BÁO CÁO

Môn:

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Giảng viên hướng dẫn: Lao Đức Thuận

NHÓM 1: TRẦN THUỶ TIÊN - 2253010096

TRẦN THỊ LINH ĐAN - 2253010013 ĐINH THỊ NGỌC HÂN - 2253010019 MAI THỊ MỸ TIÊN - 2253010094

Mục lục

BÀI 1 CHUẨN BN DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ

BÀO ĐỘNG VẬT 1.1 Một số thiết bị sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật

1.1.1 Tủ an toàn sinh học

Tủ an toàn sinh học ( laminar-flow hood or biosafety cabinet) là dạng tủ kín khí, dòng khí đối lưu bên trong, có tác dụng bảo vệ người làm thí nghiệm, đồng thời ngăn ngừa các tác nhân nhiễm trên mẫu thí nghiệm Tủ an toàn sinh học được chia thành 3 cấp độ:

BÀI 1 CHUẨN BỊ DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 2

1.1 Một số thiết bị sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật .2

1.1.2 Tủ nuôi cấy tế bào động vật .3

1.1.3 Kính hiển vi đảo ngược .4

1.1.4 Máy ly tâm .4

1.1.5 Bình nitơ lỏng, tủ lạnh, tủ âm và bể ổn nhiệt .4

1.1.6 Nồi hấp tiệt trùng .5

1.2 Một số dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật .5

1.2.1 Bình nuôi cấy tế bào .5

1.2.2 Đĩa nuôi cấy tế bào .5

1.2.3 Pipetman và típ .5

1.3.3 Buồng đếm hồng cầu .6

1.3.4 Môi trường và hoá chất nuôi cấy .6

1.3 Kỹ thuật vô trùng .7

1.3.1 Khu vực làm việc vô trùng 7

1.3.2 Tiệt trùng dụng cụ nuôi cấy và môi trường nuôi cấy 7

1.4 Hoá chất và vật liệu thí nghiệm .7

1.5 Quy trình thí nghiệm .7

BÀI 2 : PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐƠN TỪ TUYẾN SINH DỤC GÀ/ VỊT .7

Hoá chất và vật liệu thí nghiệm .7

Quy trình thí nghiệm 8

+ Tủ an toàn sinh học cấp 1: Đây là cấp độ thấp nhất và phù hợp cho các công việc đơn giản và an toàn với các mẫu sinh học không gây nguy hiểm cho

người

+ Tủ an toàn sinh học cấp 2: Cấp độ này được sử dụng cho các mẫu có khả năng gây bệnh cho người, nhưng không có khả năng lây qua đường hô hấp và có biện pháp phòng chống hiệu quả

+ Tủ an toàn sinh học cấp 3: Đây là tủ cấp độ cao nhất, nó được sử dụng cho các mẫu sinh học gây bệnh nghiêm trọng và có thể lây lan qua đường hô hấp

1.1.2 Tủ nuôi cấy tế bào động vật

Tủ nuôi cấy tế bào động vật hay tủ

ấm CO2 ( incubator) là thiết bị phòng thí nghiệm thiết yếu cho việc nuôi cấy tế bào với chức năng tạo ra môi trường ổn định và sạch, duy trì

sự ổn định của nhiệt độ, độ ẩm pH và mức độ khí CO2

1.1.3 Kính hiển vi đảo ngược

Kính hiển vi đảo ngược ( Inverted microscope) là loại kính hiển vi được thiết kế

ngược đối với kính hiển vi thông thường Trong kính hiển vi đảo ngược, vật kính hướng xuống dưới và bàn mẫu vật

1.1.4 Máy ly tâm

Máy ly tâm ( Centrifuge) sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý và phân tách hai pha rắn-lỏng hoặc lỏng-lỏng thành các thành phần riêng biệt

1.1.5 Bình nitơ lỏng, tủ lạnh, tủ âm và bể ổn nhiệt

- Bình nitơ lỏng ( Liquid nitrogen storage) là thiết bị được sử dụng để lưu trữ và vận chuyển nitơ lỏng có nhiệt độ cực thấp ( -196 độ C ), được sử dụng để bảo quản đông lạnh mẫu tế bào nuôi cấy

- Tủ lạnh ( Refrigerator) được sử dụng để lưu trữ mẫu và dung dịch tại nhiệt độ thấp, thường là từ 2 độ C đến 8 độ C

- Tủ âm ( Freezer) hay tủ đông, được sử dụng để lưu trữ và bảo quản mẫu tế bào

và các chất lượng sinh học khác ở nhiệt độ rất thấp, thường dưới -20 độ C hoặc thậm chí là -80 độ C, nhiệt độ này giúp ngăn chặn quá trình phân hủy và bảo quản mẫu tế bào trong thời gian dài

− Bể điều nhiệt ( hay còn gọi là bể ấm, Water bath) là thiết bị quan trọng và thông dụng trong phòng thí nghiệm với mục đích duy trì và kiểm soát nhiệt độ của dung dịch nước trong bể

1.1.6 Nồi hấp tiệt trùng

− Nồi hấp tiệt trùng ( Autoclave) là thiết bị dùng để tiệt trùng các tác nhân gây nhiễm , chẳng hạn: vi khuẩn,nấm,virus, , những vật như dụng cụ phẫu thuật, thiết bị, dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm

1.2 Một số dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật

1.2.1 Bình nuôi cấy tế bào

− Bình nuôi cấy tế bào (Cell culture flask) được sử dụng nuôi cấy các loại tế bào khác nhau tại phòng thí nghiệmbình nuôi cấy tế bào T25 diện tích mặt bám của bình nuôi cấy, tương ứng là 25 cm2 Bình nuôi cấy tế bào được sản xuất từ polystyrene hoặc thủy tinh Bề mặt được xử lý để tăng sự bám dính của tế bào

1.2.2 Đĩa nuôi cấy tế bào

− Đĩa nuôi cấy tế bào được tạo từ nhựa polyethylene được sử dụng nuôi cấy các loại tế bào khác nhau tại phòng thí nghiệm Thông thường, đĩa nuôi cấy tế bào động vật có nhiều kích thước khác nhau, gồm 6 giếng, 24 giếng, 48 giếng và

96 giếng Đường kính khoảng 35mm đến 100mm

1.2.3 Pipetman và típ

− Pipetman hay Micropipette là dụng cụ chuyển để hút và nhà chất lỏng có thể tích nhỏ với độ chính xác cao và chuẩn Mỗi pipetman đều được gắn với một

loại típ tương ứng với nó Típ phải được thay thể sau mỗi lần sử dụng để đảm bảo tính sạch sẽ và tránh nhiễm khuẩn giữa các mẫu hoặc các chất lỏng khác nhau Ngoài ra, pipetman còn được chia thành pippet đơn kênh hoặc pippet đa kênh

1.3.3 Buồng đếm hồng cầu

Các loại phòng đếm máu thường gặp được gọi chung là huyết cầu kết (Hemocytometer) Loại phòng đếm thường được dùng là bưồng đếm Neubauer, Việc thực hiện đếm tế bào trên phòng đếm các ô nhỏ Cấu trúc của buồng đếm Neubauer, buồng đếm được cấu tạo từ một kính dày trong suốt, có khắc 4 rãnh sâu là chỗ để thoát dung dịch, ngăn không cho dung dịch tràn lên bờ Chính giữa hai khu vực chứa hai lưới đếm riêng biệt Gờ giữa của lưới đếm thấp hơn bờ bên 0,1 mm (độ chính xác tới 0,001 mm) Do đó, khi đậy lamelle lên, khối dung dịch máu được xác định có chiều cao là 0,1 mm Vì vậy, khi cho dung dịch máu vào cần phải lau buồng đếm và lamelle thật sạch để đảm bảo cho chiều cao này

1.3.4 Môi trường và hoá chất nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy tế bào động vật là môi trường nhân tạo chứa các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển, tăng sinh của tế bào động vật trong điều kiện in vitro Các thành phần của môi trường thông thường chứa: amino acid, các vitamin, muối vô cơ, glucose, chất đệm (HEPES, bicarbonate, )

- Môi trường DMEM/F-12: đây là một loại môi trường kết hợp của DMEM và HAM's F-12, cung cấp sự pha trộn tốt giữa các thành phần và tạo điều kiện nuôi cấy phù hợp cho một số loại tế bào động vật

- Môi trường thích hợp cho hầu hết các tế bào động vật hữu nhũ là DMEM F12, 10% FBS, 1% Pen-Step ở nhiệt độ 37°C và 5% CO2

Cách pha môi trường 100 ml môi trường DMEM F12 (ống gốc: 1X) bổ sung 10% FBS (ống gốc: 1X), 1% Pen-Strep (ống gốc: 5000 U/ml):

- Thể tích DMEM F12: 89 ml

- Bổ sung FBS, Pen-Strep với thể tích lần lượt là: 10 ml; 1 ml

- Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffered Saline): một dung dịch muối phosphate có giá trị pH vào khoảng 7,4 được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật, như: rửa mẫu, pha loãng mẫu tế bào,

1.3 Kỹ thuật vô trùng

1.3.1 Khu vực làm việc vô trùng

Khu vực thực hiện phải luôn luôn được đảm bảo vô trùng để tránh ngoại nhiễm

1.3.2 Tiệt trùng dụng cụ nuôi cấy và môi trường nuôi cấy

- Đối với dụng vụ nuôi cấy thương mại hoá nhue đĩa nuôi cấy, bình nuôi cấy thì quá trình kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt để đảm bảo tính vô trùng

- Đối với các dụng cụ khác thì hấp tiệt trùng ở 121 độ, 1atm, 30 phút Ngoài ra trước khi sử dụng thì phải lau lại bằng cồn 70 độ

1.4 Hoá chất và vật liệu thí nghiệm

Dung dịch PBS

1.5 Quy trình thí nghiệm

Pha 100ml PBS

− Cần các hoá chất sau đựng vào becher : Nacl 0,8g ; Na2HPO4 0,144g ;

KH2PO4 0,024g ; KCl 0,02g

− Sau đó đong 100ml nước cất vào ống đong

− Cho 1 ít nước cất vào becher đã có chứa sẵn hoá chất sau đó khuấy cho tan hết

− Sau khi đã tan hết thì cho vào bình và thêm phần nước cất còn lại vào

BÀI 2 : PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐƠN TỪ TUYẾN SINH

DỤC GÀ/ VNT Hoá chất và vật liệu thí nghiệm

Dung dịch PBS

Trypsin 0,25%

Môi trường DMEM F12

FBS

Trypan Blue 0,4%

Cồn 70 độ

Kẹp, kéo, dao, đĩa petri, pipetman

Màng lọc tế bào ( cell strainer) 70µm

Eppendorf 2ml

3 Becher 50ml

Buồng đếm Naubeuer, lame, lamelle

Bình nuôi cấy tế bào T25

Trứng vịt đã thụ tinh từ 15 - 21 ngày tuổi

Quy trình thí nghiệm

❖ Thí nghiệm 1

- Khử trùng khu vực thí nghiệm Khử trùng tay và đeo bao tay Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 700, để diệt khuẩn, đảm bảo vô trùng, tránh ngoại nhiễm từ các hạt trong không khí và đảm bảo an toàn cho thí nghiệm

- Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 700, để trứng lên becher 50ml, dùng kẹp vô trùng làm rạn đứt sau đó mở phần nắp trên của trứng, đổ dung dịch PBS vào đĩa petri

- Dùng kẹp kẹp nhẹ phần đầu của phôi và kéo ra khỏi vỏ trứng rồi đặt vào đĩa petri đã có chứa sẵn dung dịch PBS * Lưu ý nếu phôi còn dính noãn hoàng thì nhớ loại bỏ ra.Dung dịch PBS giúp giữ pH ổn định, cũng đồng thời dùng để rửa mẫu

- Rửa sạch máu và vết dơ bằng dung dịch PBS 2 đến 3 lần

- Sau khi phôi được rửa sạch dùng dao cắt bỏ phần đầu, để loại bỏ mô không cần thiết và tránh việc nhiễm trùng

- Dùng dao mổ tiến hành mở lồng ngực ra, loại bỏ toàn bộ nội quan để làm lộ ra tuyến sinh dục.Để dễ dàng tiếp cận và thu nhận 2 tuyến sinh dục và giảm nguy cơ nhiễm chéo từ các mô khác

- Dùng kẹp và kéo tách toàn bộ tuyến sinh dục ra sau đó chuyển vào becher 50ml có chứa sẵn dung dịch PBS

- Sau đó rửa mẫu lại với dung dịch PBS từ 2 đến 3 lần Để đảm bảo mẫu được sạch và không bị nhiễm khuẩn

❖ Thí nghiệm 2:

- Chuẩn bị eppendorf 2,0ml, tuyến sinh dục sau khi được rửa sạch chuyển vào

eppendorf đã được chuẩn bị, dùng kéo cắt nhuyễn tuyến sinh dục Cắt nhuyễn là phương pháp cơ học để phân tách nhỏ mẫu mô

- Sau đó, bổ sung 100µl Trypsin 0,25%, đem ủ ở 37ºC trong vòng 5 phút Tiếp tục, bổ sung 400µl môi trường DMEM F12 10% FBS 1% Pen-step vào Trypsin 0,25% dùng

để phân tách tế bào đơn ra khỏi mô

- Dùng màng lọc tế bào để lọc toàn bộ dịch huyền phù, ta thu được dịch lọc phía dưới chảy qua màng (dịch lọc chảy vào becher 50ml đặt dưới màng lọc tế bào) Màng tế bào giúp loại bỏ những cụm tế bào, những mảnh mô lớn ra khỏi hỗn hợp để có được huyền dịch tế bào ở trạng thái đơn

- Hút toàn bộ dịch lọc thu được, cho vào 1 eppendorf mới, tiến hành đem ly tâm

Spindown trong 30 giây Máy ly tâm Spindown giúp tách tế bào ra khỏi các thành phần khác (môi trường nuôi cấy, trypsin, dung dịch PBS)

- Sau đó, loại bỏ phần dịch nổi, thu nhận phần cặn và hoà tan phần cặn trong 1ml môi trường DMEM F12 10% FBS 1% Pen-step DMEM F12 cung cấp chất dinh dưỡng, điều chỉnh pH 10% FBS cung cấp dinh dưỡng và yếu tố tăng trưởng của tế bào 1% Pen-step được sử dụng làm chất kháng sinh

- Cho 3ml môi trường DMEM F12 10% FBS 1% Pen-step cho vào bình nuôi cấy

* Giải thích nhóm thao tác sai ở bước này: Việc nuôi cấy tế bào động vật cần đảm bảo

kỹ thuật vô trùng, không để nhiễm khuẩn, nhưng trong quá trình hút môi trường

chuyển vào bình nuôi cấy, nhóm để đầu típ chạm vào bình nuôi cấy mà không thay đầu típ, và tiếp tục dùng đầu típ bẩn đó để hút môi trường

- Để lại 10µl dịch dùng cho TN4, phần còn lại cho vào bình nuôi cấy Nuôi cấy ở nhiệt

độ 370C, 5% CO2 Để duy trì các điều kiện sinh lý tương tự như trong cơ thể vật lấy mẫu

❖ Thí nghiệm 3: Xác định mật độ tế bào đơn sau khi tách bằng buồng đếm hồng cầu Neubeuer

- Rửa sạch và phơi khô buồng đếm hồng cầu Neubauer và lamelle

- Đặt lamelle lên trên buồng đếm và quan sát dưới kính hiển vi điều chỉnh cho thấy rõ để xác định phòng đếm

- Pha loãng dịch huyền phù ở thí nghiệm 2 100 lần, chuyển lên buồng đếm và xác định mật độ tế bào/ml

- Quan sát với kính hiển vi:

- Số tế bào đếm được là: 2 tế bào

- Công thức xác định mật độ tế bào: C=D x a x 10^4 ( tế bào/ml)

- C= 100 x 2 x 10⁴ = 2x106 tế bào/ml

❖ Thí nghiệm 4 : Xác định tỷ lệ phần trăm tế bào sông chết

-Buồng đếm hồng cầu Neubauer và lamelle rửa sạch, phơi khô Đặt lamelle lên trên buồng đếm và quan sát dưới kính hiển vi xác định phòng đếm

-Lấy 10µl dịch thí nghiệm trên bổ sung thêm 10µl Trypan Blue 0,4% Sau khi nhuộm với Trypan Blue tế bào sống sẽ không bắt màu với thuộc nhuộm, còn tế bào chết thì bắt màu với thuốc nhuộm tế bào có màu xanh Do tế bào sống còn màng tế bào

nguyên vẹn nên sẽ không bắt màu khi nhuộm còn ngược lại tế bào chết thì bắt màu Hình ảnh soi với kính hiển vi

Số lượng tế bào sống chết là:

- Số tế bào sống: 1 tế bào

- Số tế bào chết: 3 tế bào chết

- Tỷ lệ phần trăm sống chết của tế bào là 25% tế bào sống và 75% tế bào chết Kết luận: Sau khi đã thu nhận và phân lập tế bào đơn từ tuyến sinh dục đã tách từ phôi thì có dịch huyền phù nhóm đem đi nhuộm với Trypan Blue và khi được quan sát trên kính hiển vi ta thấy được rằng nhóm đã thu nhận được tế bào nhưng lượng không được quá nhiều, khá ít tế bào Và phần lớn tế bào chết là nhiều Nguyên nhân do quá trình pha loãng tế bào của nhóm không đều dẫn tới khi lấy để xác định tỷ lệ sống chết của tế bào thì lấy ngay vùng có mật độ tế bào thấp vì vậy kết quả đếm tế bào không có nhiều tế bào

❖ So sánh kết quả nuôi cấy tế bào đơn từ tuyến sinh dục gà/vịt của phòng thí nghiệm và của nhóm thực hiện

Hình 1 Kết quả nuôi cấy tế bào sau 3 ngày do phòng thí nghiệm cung cấp

Nhận xét: Thấy rõ hình thái tế bào trong nuôi cấy, có tế bào dạng nguyên bào lympho

có hình cầu, tế bào nguyên bào sợi Các tế bào bám dính phát triển gắn liền với bề mặt của bình nuôi cấy tế bào Quá trình phân chia tế bào vẫn tiếp tục diễn ra, các tế bào có

xu hướng phát triển lan rộng cho đến khi đạt diện tích mặt bám của bình nuôi cấy Theo quan sát, tế bào phát triển thưa thớt, phân bố không đều, chỉ bám dính một phần diện tích nhỏ mặt bám của bình nuôi cấy Môi trường nuôi cấy không bị nhiễm tạp chất, đáp ứng đủ yêu cầu cho tế bào phát triển bình thường Việc tế bào chưa phát triển bám dính phủ hết diện tích bề mặt của bình nuôi cấy có thể vì đây là nuôi cấy sơ cấp, các tế bào sơ cấp cần nhiều thời gian để phát triển hơn các dòng tế bào khác và tiềm năng phát triển hạn chế ngay cả trong điều kiện tăng trưởng tối ưu và cuối cùng

bị lão hóa và chết

Hình 2 Kết quả nuôi cấy tế bào sau 7 ngày của nhóm

Nhận xét: Không thấy dấu hiệu phát triển của tế bào trong môi trường nuôi cấy Một

số nguyên nhân dẫn đến kết quả như sau: Thao tác thí nghiệm sai sót, không đảm bảo

vô trùng trong các thao tác làm cho mẫu bị nhiễm khuẩn vào môi trường nuôi cấy Dẫn đến việc tế bào chết và mẫu xuất hiện nhiều tạp chất Trong quá trình lấy tuyến sinh dục gà/vịt, nhóm gây nát mẫu, hao hụt mẫu và mẫu có thể còn bị lẫn với các mô khác

Biện pháp khắc phục: Cần rèn luyện thao tác, tính cẩn thận, nắm vững các bước thực hiện để tránh sai sót trong quá trình thực hiện thí nghiệm Lúc nào cũng phải đảm bảo khu vực thí nghiệm, vật liệu, dụng cụ và tay được vô trùng để tránh gây ngoại nhiễm, đảm bảo an toàn thí nghiệm

• Tài liệu tham khảo: Nhóm có xin hình ảnh của lớp Bt02 tổ 4 nhóm thực hành thứ 2 để hoàn thiện bài báo cáo và biện luận kết quả