Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Phân lập, sàng lọc và xác định một số đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn đối kháng với Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Tuy nhiên,việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học tác động xấu đến môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe cộng đồng, phá vỡ sự bền vững của phát triển nông nghiệp như làm tăng tính khá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP, SÀNG LỌC VÀ XÁC ĐỊNH _ MOT SO DAC DIEM NUOI CAY CUA VI KHUAN DOI KHANG VOI Xanthomonas oryzae pv oryzae

NGANH : BAO VE THUC VATKHOA : 2016 — 2020

SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGUYEN NGỌC VINH

PHAN LẬP, SANG LỌC VÀ XÁC ĐỊNH MOT SO ĐẶC DIEM NUÔI CAY CUA VI KHUAN DOI KHÁNG

VOI Xanthomonas oryzae pv oryzae

Tac gia

NGUYEN NGOC VINH

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầuCấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật

HỘI DONG HƯỚNG DAN

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn quý thay cô giáo ở Khoa Nông học —Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh trong suốt 4 năm qua đã truyền đạtnhiều kiến thức bé ích, kỹ năng sống cũng như kỹ năng nghề nghiệp dé tôi hoàn thiệnbản thân trong quá trình rèn luyện tại trường Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắcđến TS Nguyễn Như Nhứt và TS Trương Phước Thiên Hoàng đã tận tình chỉ bảo,hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khoá luận tốt nghiệp Tôixin cảm ơn Chi nhánh công ty TNHH Gia Tường tinh Bình Duong đã hỗ trợ kinh phí

và trang thiết bị dé tôi thực hiện và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp Tiếp đến, tôi xingửi lời cảm ơn chân thành đến chị Trần Thu Hiền, chị Lê Thị Cam Nhi — là người trựctiếp và đồng hành chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu; cảm ơn anh Nguyễn

Mỹ - quản lý sinh viên luôn khắc khe trong công tác nhắc nhở, thúc giục tác phong, nềnếp trong quá trình làm việc tại công ty; cùng với đó là các anh chị và các bạn sinh viênkhác thực tập tại Công ty đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ hết mình và tạo điều kiệnthuận lợi nhất trong suốt thời gian tôi tiến hành khoá luận Cuối cùng, tôi xin cảm ơngia đình, bạn bè thân thiết và người bạn đặc biệt đã luôn bên cạnh tôi những lúc khókhăn nhất, luôn động viên, an ủi và là chỗ dựa tinh thần vững chắc dé tôi vượt qua 2năm dai dịch day trắc trở, những biến cố khách quan trong cuộc sống dé hoàn thànhnghiên cứu của mình Bước đầu ứng dụng kiến thức đã học vào thực tế nhưng lựa chọnchủ đề nghiên cứu mà kiến thức chuyên môn còn nhiều hạn ché, thiếu kinh nghiệm, thờigian nghiên cứu có hạn và còn nhiều bỡ ngỡ Do đó, khó tránh khỏi những thiếu sót Tôirất mong nhận được sự đóng góp quý báu của quý thầy cô và bạn bè dé nghiên cứu ngày

càng hoàn thiện hơn.

Thành phố Hồ Chi Minh, ngày 07 tháng 02 năm 2023

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Vinh

TÓM TẮT

NGUYÊN NGỌC VINH, lớp DHI6BV, Khoa Nông học, Trường Đại học NôngLâm thành phố Hồ Chí Minh, tháng 02 năm 2023 Đề tài: “Phân lập, sàng lọc và khảosát một số đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn đối kháng với Xanthomonas oryzae pV

oryzae’.

Giáo viên hướng dan: TS Trương Phước Thiên Hoàng

TS Nguyễn Như Nhứt

Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2021 đến tháng 09/2022 tại Chi nhánh Công

ty TNHH Gia Tường tinh Bình Dương nhằm thu nhận được chủng vi khuẩn có tính đốikháng cao với Xanthomonas oryzae pv oryzae từ dat vùng rễ của một số cây trồng vàxác định một số điều kiện nuôi cấy thích hợp dé tang sinh khối cho chung vi khuan chonlọc phục vụ công tac bao vệ thực vật Đề đáp ứng mục tiêu trên đề tài đã thực hiện các

nội dung sau:

Nội dung 1: Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuân đối kháng với Xanthomonasoryzae pV oryzae (Xoo) từ đất vùng rễ của cây ớt, bắp cải và cà chua Kết quả đã chothấy trong số 60 dòng vi khuân được phân lập từ 15 mẫu đất vùng rễ cây ớt, bắp cải và

cà chua có 16 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng với Xoo Trong 16 dòng vi khuẩnnày, dòng OT23 thé hiện kha năng đối kháng mạnh nhất bằng phương pháp giếng thạchVỚI VÒng đối kháng trung bình dat 19,85 mm và được định danh là loài Bacillus

mycoides.

Nội dung 2: Sau khi định danh thành công chung vi khuẩn chọn lọc tiến hànhkhảo sát một số điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm tăng sinh khối cho chủng vi khuẩn.Bằng phương pháp trãi đĩa và đếm mật độ tế bào đề xác định từng điều kiện phù hợp.Thí nghiệm cho thấy chủng Bacillus mycoides OT23 phát triển tốt nhất trong môitrường Luria Bertani (LB), có pH ban đầu là 7 với nguồn carbon là glucose và nguồnnitrogen là NH.Cl Tế bào vi khuẩn sau khi tăng sinh vẫn giữ được hoạt tính đối khángcao với Xoo (vòng đối kháng trung bình đạt 23,80 mm)

1H

MỤC LỤC

(ID K5 NHI an ga dang gay it dau ii elt ei leet ei iiTOM TAD suganeennrsgrianinttotrdaEnBEiEA05804610G44012815048415164862050LG.2713G-T.HQH0.313003058410121G/8Ó iiiDANH SÃÊN CÁC HNN sssssanaccrosssrcscnarennassoxacassncevanssveannsncensannereans ancossnoisunsnautonsin ixHANH SÁCH TỪ VIED TAR scmzcicoinncnenenanensaenmninnscanasnascoasamanananen x

FT Lan he nhiên deseo eaten ain sie aeons Antennae ane |

MUG KIỂU naeeaxasiniiidiadBioiigISEGG1E56GM/0G338W4HD.G03439YSSESSS'SGIISSTNGHGUSISRNXSGBITNSSSSEDBDSOIHENL438/800EEIESA88 3

Yêu cầu để tài -.cccc2 2 11t 1n re 3

PH S01 VA 118 NCCU saisecicsn rate aneseprnnesmstnsdunendieunvscactunltensttcatnnneasstvelsmpiotibueuaeraecemiuiwstecniealaeders 3

Chương 1 TONG QUAN TÀI LIBU csssssssssssssesossssessessnesscssecsncsnccsscsseensesscesesseeees 41.1 Sơ lược về vi khuẩn Xanthomonas oryzae Pv OFYZAE vsecsesccessesssessessesssecsesssessecseeesee 4

ID Vi tri phan load cece cccccsccseeesecesecseseeeseceeceeeeseseceeesesscesecseeeceseeeteeeeseeeseeeeeeenss 4

1.12 Đặc điểm rh thái yh ccs coc renancesancrmennesncscenennicrnandsesaungiaonenicearnesenes 4

1.1.3 Triệu chứng bệnh của vi khuân Xoo trên một số cây trồng -:-+¿ 61.1.3.1 Triệu chứng bệnh của vi khuân Xoo trên cây lúa 2-2 22 2+2 22+: 61.1.3.2 Triệu chứng bệnh của vi khuẩn Xoo trên họ THẬP EUiseesetboattoibotsesftohwatraes 71.1.3.3 Triệu chứng bệnh cua vi khuẩn Xoo trên cà chua - ¿5:52 2E+£v2EzEeEvzEs 81.1.4 Cơ chế gây bệnh của dòng vi khuân XzwfÏOinOWiđs - 52-5552 2+cs2cs2csz£: 91.2 So luge vé vi khuan vung rễ điều hòa tăng trưởng thực vật - 101.2.1 Định nghĩa vi khuẩn vùng rễ điều hoà sinh trưởng thực vật (PGPR), 101.2.2 Tương tác giữa các vi sinh vật vùng rễ thực vật - + s+cz+sccx+zzzcced 10

122.1 Quan HỆ Ky sitihvacacm rence eee enema een eerie ares 1]

L3 3; tai đế KẾ Hs a een 11

1.2.2.4 Quan hệ đối khang eccececccccssecssssssesssesscssessesssssssssssessssssssssssssesssssessteseseeaees 121.2.3 Khả năng đối kháng của vi khuẩn - 2-22 222222 2 1221211211712 Exe 121.2.3.1 Cơ chế đối kháng 2-22 2 ©E2EE9EE£EE12E1521121127171121111171111111 11111 cre 121.2.3.2 Ung dụng khả năng đối kháng - 2: 2¿©2+2E++2E£EEESEEE2EEE2EEeSEErrkesrev 131.3 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy tăng sinh khối vi khuẩn - 2 5z 522 +2 15eee et | cceeeseseeniriinsviientotikogrokgv0EEGEA703919603040190000103007400001 151.3.1.1 Nguồn carbon o cceccecsessssssesseessessecssessesssssessesssessessvessessessnessessesssessecssessessesaseeses 151.3.2 Điều kiện Vat LY oooceececcecccssesssessesssessessvessesseessessessssssessesssessssesesessessessessnessessessseens 16

IS 0ö» 32g 16

[5227 Nhi asseeseeseniooeshoistoendcoisnllEis2dg9suvgcoigtosstitiettoscguisdbstdotirtioailucrppdbgtiiaiborchglinsisis gai 16

1.4 Tình hình nghiên cứu về dòng vi khuẩn X4øhoiOofi4s 2 552©52 5525522 16

LA Tình Bình 08081 DUOC scscscssnswecamnenmanacmarecnnnm meena 16

1.4.2 Tinh hình trong TƯỚC - - 6 6 1111 1E 1E 1 1 1n nh nh nh nh Hàn Hà Hà Hành 17

Chương 2 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .- 192.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2: 2© £++x+SE£EEE+EE£EE2EEEEEE2EEEEEEEErrrkrree 19

2.4.1.2 Phương pháp pha loãng hàng loạt - ¿c2 22c 1211211211511 1511 11x 20

2.4.1.3 Phương pháp phân lập vi khuan từ đất ¿- 2 ¿+ z+EeEEz2EeExcrkrsrxrree 212.4.1.4 Phương pháp cấy ria làm thuần vi khuẩn trên đĩa petri 2-2-2 212.4.1.5 Phuong pháp bảo quản vi khuẩn trên thạch nghiêng 5 5255: 22

2.4.1.6 Phương pháp xác định khả năng đối kháng của các dòng khuẩn lạc vi khuẩn

VOLN 0 non nhinhtiodiiikiiGGG431638595554000553NEH8861400018089053.2510SRABESNN.ESS430588-401530G8B1EEEDEHOSSHS.U.A00810G0088 22

2.4.1.7 Phương pháp định theo khóa phân loại của Bergey - ‹ +++-+++s++s 24

2.4.2 Khao sát điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối chủng vi khuẩn tìm được 252.4.2.1 Ảnh hưởng của môi trường CAY eee ces essessesseesessesvesessvesessessessssscsssessesseaes 252.4.2.2 Ảnh hưởng của pH ban dau e ceccceccesessesssessesssessessesssessesssessesssessessesssessesseesseees 28PADS Ảnhh hưởng cane dr eat cxcincsncsincsannasenannacmmanciummevemunnninccane 282.4.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen VÔ CƠ - 2: 2+ 2++£+E++E++EE£+E++EEerEzzrxeres 292.4.3 Phương pháp xử lí số liệu ¿- 22 2¿©+¿22++2EEt2EE2E1221223122312711212 2212 xe 29Chương 3 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2s se ©ssessecss+sezseesserserse 303.1 Phân lập và sàng lọc (các) dòng vi khuẩn đối kháng ,Xoo -2- 2-5252 303.1.1 Phân lập và sàng lọc chủng vi khuân đối kháng XXoo 2: 525522 s52 303.1.2 Định danh dong vi khuân OT23 2-2 2¿+SE+EE2EE2EEE2E22E12752211221722222 7e 333.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối cho chủng vi khuẩn đối khang 343.2.1 Anh hưởng của môi trường nuôi cấy 22 + + +Ek£EE2EE£EEEEEEEEEerkrrrkeree 343.2.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sinh khối chủng

Bacillus mycoides O T'23 -.cc St 121111111 111111 11111111111 111 11 H1 HH HH Hiệp 35

3.2.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh khối chủng Bacillus mycoides OT23 373.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ đến sinh khối chủng Bacillus mycoides

3.2.5 Đánh giá khả năng đối kháng Xoo của chủng B mycoides OT23 sau khi nuôi cấytăng sinh khối ở các điều kiện tối ưu đã chọn - 2-2 +¿2++2++2zxz+zx+zzxzzx 43

EU TY ĐỀ NGHH-eeedeosaueoteeterrtouaotuoigbsostottdeoueneaossd 46

ee 46

T)G TOU cung se 161188661ã 188 Sog8gtlGS238d63 08Nãã8uu80aGã38:36ã0565igaš4S8538688 S:SE433438R8148138ÿSaEãSÿKEnSIRSẰ488808-aagÌ 46

PHỤ LỤC

vii

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng 2.1 Thông tin các mẫu đất 22 2¿©2++2EE22EEt2EE222122312221223122312212 22x 20Bảng 3.1 Đường kính vòng đối kháng các dong vi khuân - 2-2222 5z£: 30Bang 3.2 Két qua dimh 0N ‹.‹4 33Bang 3.3 Anh hưởng của môi trường nuôi cay đến kha năng tăng sinh của chủng vikhuẩn Bacillus mycoides OT23 5s 5s 5k2 1E122112112112112112111211011111 111 re 34Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH muôi cấy đến khả năng tăng sinh của chủng vi khuẩn

71/7/7158, 491/295 0E20000n0Ẻ857 Ầ d 36

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nu6n carbon nuôi cấy đến khả năng tăng sinh của chủng vikhuẩn Bacillus mycoides O23 sroạcccnssgiiiisbsiti1ã3Sđg0iA 01gAtu2XgtiSxES448E3,lSRQSG433 0438203 2A8: cutest 38Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen vô cơ đến kha năng tăng sinh của chủng vikhuân Bacillus mycoides OTT23 -25:©25:22+22222232221221122112211221122112111211 221 c2 2 40Bang 3.7 Đường kính vòng đối kháng (mm) Xoo của canh trường và dich lọc canhtrường chủng vi khuẩn B mycoides OT23 Error! Bookmark not defined

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn ,XØo - - c2 6S Sx£St‡E£EE+E£EeEEeErkerxzes 5

Hình 1.2 Rooms lúa B1 cHây d BỆNH DAC 1A nuanaeninnidintdditdidiiitbirbesE3g01010118388388804610 8 6

Hình 1.3 Hiện tượng bac lá trên mạ (trái) và trên lúa (phải) ‹ -+ ++5+52 7

Hình 1.4 Den gân bắp cải do X00 gây ra - 2-55 S2 St E2 1E E2112E171121111 1E xe 7Hình 1.5 Cây cà chua bị đốm đen do vi khuẩn X00 - ¿2-55 ©522cs+cvcczsvcxzei 8Hình 1.6 Triệu chứng bệnh đốm den vi khuẩn trên lá cà chua -¿-5¿ 8Hình 1.7 Triệu chứng bệnh đốm den vi khuẩn trên quả cà chua -. -2- 5: 9Hình 1.8 Triệu chứng đốm đen vi khuan trên thân cà chua -2- 525225522 9Hình 1.9 Vi khuẩn Xanthomonas campestris trên bề mặt lá - ¿-52ccc+cc+c2 9Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc OT23 trên môi trường cao thịt — peptone sau 48 giờ nuôi

3lHình 3.2 Vòng đối khang của OT23 với Xoo trên môi trường Wakimoto 31Hình 3.3 Kha năng đối khang Xoo của B mycoides OT23 sau khi nuôi cay ở điều kiện

1X

DANH SÁCH TU VIET TAT

LB: Luria Bertani

SPA: Sucrose Peptone Agar

X00: Xanthomonas oryzae pv oryzae

N dimiditaum: Neoscytalidium dimiditaum

B subtilis: Bacillus subtilis

B velezensis: Bacillus velezensis

R gallicum: Rizoctonia gallicum

GIỚI THIỆU

Đặt vẫn đề

Trong số các tác nhân gây bệnh cây trồng, vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

oryzae (Xoo) là một trong những nguyên nhân chính gây ra các bệnh làm thiệt hại nặng

về năng suất và chất lượng trên nhiều loại nông sản trong những năm gần đây như bệnhbạc lá lúa, bệnh đốm đen — xì mủ trên xoài, bệnh loét trên cây có múi VỊ khuẩn Xoođược phát hiện đầu tiên tại Nhật Bản vào khoảng năm 1884 — 1885 trên cây lúa bị hiệntượng bạc lá Khi ruộng bị nhiễm vi khuẩn Xoo, năng suất sẽ thất thu lên đến 74% Theo

số liệu thong kê cua Bộ Nông nghiệp va Phat triển nông thôn Việt Nam, diện tích lúanhiễm bệnh bạc lá năm 2013 là 135,4 nghìn ha, tăng gấp 6,5 lần so với năm 2010 Diệntích cây mắc bệnh tăng nhẹ từ năm 2010 đến năm 2011 và đột ngột tăng cao trong giaiđoạn từ năm 2011 đến năm 2012 Diện tích lúa bị nhiễm nặng dẫn đến mất trắng vàonăm 2013 là hơn 9,5 ngàn ha Tình trạng mat trắng van đang diễn ra và tăng cao trongcác năm trở lại đây tập trung nhiều tại các tỉnh phía Bắc và một số tỉnh vùng đồng bằngsông Cửu Long Năm 2019, diện tích nhiễm 9,291 ha (giảm 2,712 ha so với kỳ trước và

giảm 2,967 ha so với cùng kì năm trước), nặng 967 ha, phòng trừ 1,032 ha Phân bố ởcác tỉnh Thái Bình, Hải Dương, Nam Định, An Giang, Kiên Giang (báo cáo thong ké10/2019, Bộ Nông nghiệp va Phát triển Nông thôn Việt Nam) Trên xoài, nhiễm bệnhgiai đoạn cây con sẽ làm cây héo dần, mất nước và chết Nhiễm bệnh trong giai đoạnquả chín làm nứt nẻ vỏ trái, dịch mủ hòa trộn với vi khuẩn tràn ra xung quanh lây lan,bệnh ảnh hưởng đến chất lượng cũng như sản lượng quả Ngoài ra, vi khuẩn Xoo còngây bệnh héo rũ ở chuối, đốm lá trên cây rau Thập tự và nhiều loại cây khác

Cho đến nay, ở nước ta, thuốc bảo vệ thực vật hóa học đóng vai trò quan trọngtrong việc phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ hệ thống sản xuất nói chung và trong kiểm soátbệnh do Xanthomonas nói riêng Thuốc bảo vệ thực vật hóa học giup gia tang năng suat,sản lượng các loại cây trồng có giá trị cao, mang lại lợi nhuận kinh tế lớn Tuy nhiên,việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học tác động xấu đến môi trường, hệ sinh thái

và sức khỏe cộng đồng, phá vỡ sự bền vững của phát triển nông nghiệp như làm tăng

tính kháng thuốc, suy giảm hệ ký sinh - thiên địch, để lại dư lượng độc trên nông sản,

1

đất và nước, ảnh hưởng đến chất lượng môi trường, nhiễm độc ở người tiêu dùng nôngsản Các loại thuốc bảo vệ thực vật ngày càng đa dạng về chủng loại dẫn đến nguy cơsâu bệnh hại cũng ngày càng phát triển và tiến hóa.

Hiện nay, việc sử dụng các loại chế phẩm sinh học đã dần thay thế thuốc bảo vệthực vật hóa học độc hại, không gây ô nhiễm môi trường đã và đang là xu hướng củathé giới Điền hình là các mô hình nông nghiệp theo hướng VietGAP (Vietnamese Good

Agricultural Practices) hay GlobalGAP (Global Good Agricultural Practice) hướng tới

muc tiéu nén nông nghiệp hữu co sạch va an toàn Vì thế, việc sử dụng các chế phẩmsinh học có ý nghĩa rất quan trọng trong việc xây dựng một nền nông nghiệp xanh Trong

đó, phương hướng tiếp cận bằng vi sinh vật đối khang dé kiểm soát vi khuẩn Xoo cũngđang được quan tâm Trên thé giới, các nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật dé kiểm soátbệnh do X oryzae pv oryzae (Xoo) liên tục được báo cáo, chang hạn như nghiên cứucủa Kannan và cộng sự (2021) về sự đa dạng các vi sinh vật đối kháng với bệnh khô van

lá do vi khuẩn và nam trên cây lúa (Tạp chí Kiểm soát Dịch hại Sinh học Ai Cập) Kếtquả nghiên cứu xác định được ba chủng Bacillus lần lượt là Bacillus velezensis, Bacllussubtilis, Bacillus paralicheniformis và một chủng Trichoderma asperellum cho thayhiệu quả chống lại các mầm bệnh Rhizoctonia solani và Xoo trên lúa Hay nghiên cứucủa Deb, L và cộng sự (đăng trên diễn đàn sinh học — tạp chí quốc tế, 2021) đã xác địnhđược khả năng kháng khuẩn của Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin chống lạibệnh bạc lá lúa do Xoo gây ra thông qua các chủng được phân lập và kí hiệu lần lượt là

Bb3, Bb4, Bb48, Bb25 và Bb53.

Ở Việt Nam, mặc dù số lượng các báo cáo có ít hơn nhưng đã cho thấy sự quantâm của các nhà nghiên cứu vào xu hướng này trong thời gian gần đây Kết quả nghiêncứu của Phạm Thị Tố Oanh được đăng trên tạp chí khoa học và công nghệ Đại học TháiNguyên (04/2020) cho thấy các chủng vi sinh vật thuộc nhóm Streptomyces sp vaBacillus spp có khả năng đối kháng với Xoo gây bệnh bạc lá lúa Ngoài ra, ở Việt Nam

đã có một số sản pham trên thi trường được ứng dụng phòng trừ bệnh do vi khuẩnXanthomonas như Trichoderma, Bacillus, Exin 4.5 SC Phytoxin VS Tuy nhiên, sélượng và chủng loại san pham không nhiều Ngoài ra, các công bố về các nghiên cứu dé

tạo ra các sản phâm van còn rat hạn chê Từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn thực

hiện đê tài: “Phân lập, sang lọc và xác định một sô đặc điêm nuôi cây của vi khuân đôi

kháng voi Xanthomonas oryzae pv oryza€”.

Muc tiéu

Thu nhận được (các) chủng vi khuân có tinh đôi khang cao với vi khuân X oryzae

pv oryzae từ dat vùng rễ của một số cây trồng và xác định được một số điều kiện nuôicấy tăng sinh chủng vi khuẩn chọn lọc

Yêu cau đê tài

Tiến hành thu mẫu đất vùng rễ của cây ot tại tỉnh Tiền Giang, bắp cải và cà chuatại Đà Lạt (tỉnh Lâm Đồng)

Phân lập, sàng lọc dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với Xanthomonasoryzae pv oryzae (Xoo) bằng phương pháp giếng thạch và định danh dong vi khuẩnchọn lọc bằng phương pháp test sinh hoá

Xác định một số điều kiện nuôi cây thích hợp nhằm tăng sinh khối cho dòng vikhuẩn chọn lọc Đồng thời thu nhận canh trường nuôi cấy vẫn giữ được khả năng đối

kháng cao với Xoo.

Pham vi nghiên cứu

Đề tài được tiến hành thu mẫu tại các vườn trồng ớt nằm trong tỉnh Tiền Giang,

vườn trồng bắp cải, ca chua thuộc Da Lạt (tỉnh Lam Đồng) và được thực hiện tại Chi

nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương Chỉ phân lập vi khuẩn từ nhữngmau đất thu thập được, tiễn hành sàng lọc vi khuân đối kháng với Xanthomonas oryzae

pv oryzae (Xoo GTC 7.4.1) được cung cấp bởi công ty Gia Tường Đồng thời định danh

và xác đỉnh một số điều kiện nuôi cấy thích hợp đề thu nhận sinh khói tốt nhất cho dòng

vi khuân chon loc.

Chương 1

TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo Swings và cộng sự (1990), vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae vị trí

phân loại như sau:

Loai: X oryzae pv oryzae

1.1.2 Dac diém hinh thai va sinh ly

1.1.2.1 Dac diém hinh thai

Vi khuẩn X oryzae pv oryzae (Xoo) là một loại vi khuân Gram âm, tế bao hìnhque với đầu tròn, chiều dài từ 0,8 um dén 1 uum, chiéu rong từ 0,4 um dén 0,7 uum, baoquanh tế bao là một màng nhay Đây là loại vi khuẩn không sinh bao tử, khuẩn lạc hìnhtròn, lồi, bề mặt nhẫn, màu vàng trên môi trường Sucrose Peptone Agar (SPA) (Hình

1.1).

(Nguồn: en.wikipedia.org)

1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa

Phản ứng oxidase thường âm hoặc dương tính yếu, phản ứng catalase đương và

không hình thành nitrat Thường sản sinh đường cao phân tử ngoại bào Sự sinh sản bị

ức chế bởi triphenil-tetrazolium chloride (TTC) 0,02% trong nước Nhiệt độ thích hợpcho vi khuẩn sinh trưởng từ 26°C đến 30°C, nhiệt độ tối thiêu từ 0°%C đến 59C, tối đa40°C Nhiệt độ làm vi khuẩn chết là 53°C pH thích hợp từ 6,8 đến 7,2 Xoo sản sinhlượng lớn polysaccharide ngoại bào (EPS) Các chủng đột biến thiêu EPS không có khảnăng gây bệnh bạc lá lúa Chúng chỉ có thể tồn tại trong đất từ 1 đến 2 tháng hoặc tồntại trong hạt giống của các cây lúa bị nhiễm hay trong rơm rạ Các vi khuẩn gây bệnhbạc lá xâm nhập qua các vết thương do mưa bão gây ra trên lá và qua các khí không, sau

đó chúng gây bệnh trên các mô, nhân lên và lây lan dẫn đến nhiễm trùng toàn bộ cây

(Huang và cộng sự, 1997).

Sự sinh sản độc tố của vi khuân Xanthomonas oryzae pv oryzae: theo Ogawa vàcộng tác viên (1996), lần đầu tiên đã tách, chiết được Phenylacetic acid thô trên môitrường Wakimoto nuôi cấy vi khuẩn, sau đó sử dụng dịch chiết dé xử lí mạ Kết quả chothấy Phenylacetic acid có khả năng gây héo mạ non, ức chế sự phát triển của cây mạ saukhi xử lý được 3 ngày Puruthosaman và Prasad (1972) đã tách chiết được phenolic trongmôi trường nuôi cấy vi khuẩn Xoo, sau đó xử lý lá lúa non và cho kết quả lá bị héo rấtnhanh chỉ sau 12 giờ Trong khi đó, đối chứng xử lí bằng nước cất vô trùng sau 4 ngày

lá lúa mới bắt đầu vàng úa nhưng không có hiện tượng héo như khi xử lý dịch chiết vikhuan Xoo (Lê Lương Té, Tap chí Bảo vệ thực vật, số 5/2008).

1.1.3 Triệu chứng bệnh của vi khuẩn Xoo trên một số cây trồng

1.1.3.1 Triệu chứng bệnh của vi khuẩn Xoo trên cây lúa

Bệnh bạc lá phát sinh phá hoại suốt thời kì mạ đến khi lúa chín nhưng có triệuchứng dién hình là thời kì lúa cấy trên ruộng từ sau khi lúa đẻ nhánh đến trổ và chín sữa(Vũ Triệu Mẫn và cộng sự, 2007)

Hình 1.2 Ruộng lúa bị cháy do bệnh bạc lá

vi khuẩn còn có thể xâm nhập vào hệ thống mạch nhựa ở phan rễ bị đứt trong quá trìnhnhô mạ dé cấy Khi vi khuẩn xâm nhập qua rễ, cây lúa thường biểu hiện triệu chứng

Kresek, làm lá và toàn bộ cây bị héo rũ.

Trên lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ rệt hơn, tuy nhiên nó có thé biến đổi ítnhiều tùy theo giống và điều kiện ngoại cảnh Vết bệnh từ mép lá, mút lá lan dần vàotrong phiến lá hoặc kéo dài theo gân chính, nhưng cũng có vét bệnh từ ngay giữa phiến

lá lan rộng ra Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng màu vàng, mô bệnh xanh tái,

vàng lục, lá nâu bạc, khô xác (Trường dai học Nông nghiệp 1 — Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa, trang 135).

Hình 1.3 Hiện tượng bạc lá trên mạ (/rđ?) và trên lúa (phải)

(Nguồn: https://vaas.vn/)

1.1.3.2 Triệu chứng bệnh của vi khuẩn Xoo trên họ Thập tự

Xoo có thé gây bệnh trên nhiều loài cây khác nhau thuộc họ Thập tự như cây suhào, cải thìa, cải bắp Theo Kim Ngọc Quý (2015), triệu chứng trên họ rau Thập tự cócác biểu hiện như gân lá bị đen, thường bị từ rìa lá vào trong, mô lá có đốm vàng, lá vàng

dan, dé bị khô, cây non dé bị chết và phát triển không đều Đậu tương bị bệnh đốm gỉ trên

mặt lá như các mụn loét nên trông rất dé nhằm lẫn với bệnh gi sắt đậu tương do nam gây

ra Su hào bị nhiễm bệnh có hiện tượng bị rỗng trong phần ruột, lá rụng do tắt bó mạch

ảnh hưởng đền sự vận chuyên, cân băng nước trong cây làm cây héo và úa vang.

Hình 1.4 Đen gân bắp cải do Xoo gay ra

(Nguôn: camnangcaytrong.com)

1.1.3.3 Triệu chứng bệnh của vi khuẩn Xoo trên cà chua

Bệnh hại chủ yêu ở lá và quả, có khi vêt bệnh xuât hiện trên cả cuông lá và thân

cây Bệnh xuât hiện từ thời kì cây con cho đên cây có quả chín.

Hình 1.5 Cây cà chua bị đốm đen do vi khuân Xoo

mm Trên cuống lá và thân cành xuất hiện vết bệnh kéo dài, màu đen (Trường đại học

Nông nghiệp | — Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa, trang 145).

(Nguồn: phanbonsongma.vn) (Nguồn: phanbonsongma.vn)

1.1.4 Cơ chế gây bệnh của dòng vi khuẩn Xanthomonas

Phần lớn vi khuẩn Xanthomonas xâm nhập sâu vào hệ thong mach dẫn của cácloại cây trồng, dần dần xâm nhiễm toàn bộ các bộ phận của cây Đối với cây lúa, vikhuẩn xâm nhập thông qua các lỗ khí khổng, lỗ khí trên mút lá, mép lá đặc thù qua vếtthương sây sát trên lá Trên bề mặt lá mang màng nước, vi khuẩn thuận tiện xâm nhậpqua lỗ khí và qua vết thương tiến vào bên trong mô, vi khuẩn sinh sản và phát tán theo

trên bề mặt lá bệnh tiết ra các giot vi khuẩn là nguyên nhân quan trọng khiến bệnh pháttriển mạnh sau các đợt mua gió.

1.2 Sơ lược về vi khuẩn vùng rễ điều hòa tăng trưởng thực vật

1.2.1 Định nghĩa vi khuẩn vùng rễ điều hoà sinh trưởng thực vật (PGPR)

Vùng rễ thực vật được định nghĩa là vùng đất mỏng bao quanh rễ, có đặc điểmgiàu dinh dưỡng, là nơi sống của nhiều loài vi sinh vật quan trọng cho sinh trưởng vàphát triển của cây trồng (Philippot và cộng sự, 2013)

Theo Hoang Kim Chi và cộng sự (2019) đăng trên tạp chí Khoa học và Công

nghệ Việt Nam (05/2020), vi khuân vùng rễ điều hòa sinh trưởng thực vat (plant growthpromoting rhizobacteria - PGPR) là nhóm vi khuẩn cư trú ở vùng rễ và có tác động tíchcực trực tiếp hoặc gián tiếp tới sinh trưởng của thực vật

1.2.2 Tương tác giữa các vi sinh vật vùng rễ thực vật

Vi sinh vật vùng rễ có quan hệ mật thiết với cây trồng, chúng sử dụng những chattiết, các bộ phận chết đi của cây dé làm chất dinh dưỡng Đồng thời, trong quá trìnhsống, VSV cung cấp các chất dinh dưỡng cho cây trồng Tuy nhiên, vùng rễ thực vật córất nhiều vi sinh vật cùng chung sống Giữa chúng vừa có sự tương tác cùng nhau pháttriển vừa có sự hạn chế lẫn nhau tạo ra một môi trường sông linh hoạt và phức tạp Một

số vi sinh vật tiết ra các chất ức chế hoặc độc tố như kháng sinh sẽ gây độc cho các visinh vật liền kề Thêm vào đó, một số sinh vật ăn vi sinh vật như động vật nguyên sinh

ăn vi khuẩn hoặc vi sinh vật ký sinh (virus) gây nhiễm cả vi khuan và nam Khi một visinh vật không phải là ban địa được di nhập vào môi trường đất thường tôn tại trong thờigian ngắn, trừ khi đã được chọn lựa môi trường đặc thù Ảnh hưởng này rất quan trọngtrong sự ton tại của vi sinh vat gây bệnh hay vi sinh vật phân hủy sinh học khi được ứngdụng đề phân hủy sinh học hoặc kiểm soát sinh học (Biological control)

Sự phân bồ của vi sinh vật trong đất vô cùng phong phú cả về số lượng cũng nhưthành phan loài Trong quá trình sống chung như thé, chúng có một mối quan hệ tương

ho vô cùng chặt chẽ Dựa vào tinh chat của các loại quan hệ giữa các nhóm vi sinh vat,

người ta chia ra làm bốn loại quan hệ chính: ký sinh, cộng sinh, hỗ sinh và đối kháng

1.2.2.1 Quan hệ ký sinh

Quan hệ ky sinh là hiện tượng vi sinh vật này sống ký sinh trên vi sinh vật khác,hoàn toàn ăn bám và gây hại cho vật chủ Ví dụ như các loại virus sống ký sinh trong tếbao vi khuẩn hoặc một vài loài vi khuân sống ký sinh trên vi nam Các loại vi khuẩn cóđịnh nito cộng sinh thường hay bị một loại thực khuẩn thé ký sinh, trên môi trường dịchthê có hiện tượng môi trường đang đục trở nên trong Nguyên nhân là do thực khuẩn thêxâm nhập và làm tan tất cả các tế bào vi khuan — gọi là hiện tượng sinh tan (Hoang KimChi và cộng sự, 2019) Khi nuôi cay vi khuẩn trên môi trường đặc cũng có hiện tượngnhư vậy Các thực khuẩn thé này tồn tại ở trong dat trồng cây họ đậu làm ảnh hưởng rấtlớn đến quá trình hình thành nét san ở cây đậu

1.2.2.2 Quan hệ cộng sinh

Quan hệ cộng sinh là quan hệ hai bên cùng có lợi, bên này không thể thiếu bênkia trong quá trình sinh sống Ở vi sinh vật, người ta ít quan sát thấy quan hệ cộng sinh

Có một số giả thiết cho rằng: ty thể — cơ quan hô hấp của tế bào vi nắm chính là một vi

khuẩn cộng sinh với vi nam (Konstantin, 1910) Gia thiết đó dựa trên cấu tạo của ty thể

có cả bộ máy DNA riêng biệt, có thể tự sao chép như một cơ thể độc lập Giả thiết nàychưa được công nhận hoàn toàn Lại có giả thiết cho rằng, các plasmid có trong vi nam

và vi khuẩn chính là sự cộng sinh giữa virus và vi nắm hay vi khuân đó Ví dụ như cácplasmid mang gene kháng thuốc sẽ mang lại mối lợi cho vi khuẩn chủ là kháng đượcthuốc kháng sinh, vì thế mà hai bên cùng có lợi và gọi là quan hệ cộng sinh

1.2.2.3 Quan hệ hỗ sinh

Quan hệ hỗ sinh là quan hệ hai bên cùng có lợi nhưng không nhất thiết phải cónhau mới sống được như quan hệ cộng sinh Quan hệ này thường thấy trong sự sống của

vi sinh vật vùng rễ Ví dụ như mối quan hệ giữa nam mốc phân hủy tinh bột thành đường

và những nhóm vi khuẩn phân giải loại đường đó Mối quan hệ giữa nhóm vi khuẩn

11

phân giải phosphor và nhóm vi khuẩn phân giải protein cũng là quan hệ hỗ sinh, trong

đó nhóm thứ nhất cung cấp P cho nhóm thứ hai và nhóm thứ hai cung cấp N cho nhómthứ nhất

1.2.2.4 Quan hệ đối kháng

Quan hệ đối kháng lẫn nhau giữa hai nhóm vi sinh vật là loại này thường tiêu diệtloại kia hoặc hạn chế quá trình sống của nhau Ví dụ điển hình là xạ khuân sinh khángsinh và nhóm vi khuẩn mẫn cảm với chất kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra Khi nuôi cấyhai nhóm này trên môi trường thạch đĩa, ta có thể thấy rõ hiện tượng đối kháng: xungquanh nơi xạ khuẩn mọc có một vòng vô khuẩn, tại đó vi khuẩn không mọc được Người

ta căn cứ vào đường kính của vòng vô khuẩn đó mà đánh giá khả năng tạo ra kháng sinhcủa xạ khuẩn Tất cả các mối quan hệ trên đây của khu hệ vi sinh vật đất tạo nên những

hệ sinh thái vô cùng phong phú trong từng loại đất Chúng làm nên độ màu mỡ của đất,thay đối tính chất ly hóa của đất va từ đó anh hưởng đến cây trồng

1.2.3 Khả năng đối kháng của vi khuẩn

1.2.3.1 Cơ chế đối kháng

Vi khuẩn vùng rễ có khả năng kiểm soát nam bệnh gây hại trên cây trồng với itnhất hai cơ chế (Safdarpour và cộng sự, 2019) Cơ chế đối kháng nam bệnh nồi bật cóthê kế đến như cạnh tranh về không gian sống và chất dinh dưỡng, tạo ra các hợp chất

dễ bay hơi, màng sinh học Trong đó, cạnh tranh là cơ chế quan trọng nhất Cạnh tranhmôi trường sống và không gian sống giúp vi khuẩn sinh trưởng và phát triển quần thểlớn chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường, làm hạn chế sự gia tang nam bénh.Cạnh tranh chất dinh dưỡng cũng là một yếu tố không thể thiếu cho sự gia tăng mật độquan thé Các nghiên cứu trong điều kiện in vitro cho thay vi khuân có khả năng hap thuchất dinh dưỡng và sinh sản nhanh hơn nam bệnh gây ức chế sự nảy mam của bao tử

nâm bệnh.

Một sô chủng vi sinh vật có khả năng tạo ra chat siderophore — là chat ái lực cao

với sat, dẫn đến sự cạnh tranh sắt giữa vi sinh vật và siderophore có ái lực thấp tạo ra từ

nam bệnh làm ức chế sự phát triển nắm bệnh Nghiên cứu của Spadaro (2016) về mộtloại nắm gây bệnh ở người cho thấy tình trạng thiếu oxy và cân bằng nội môi của sắt cóliên quan đến một số gene chịu trách nhiệm thể hiện độc lực của nắm Theo Sarwar vàcộng sự (2020), trong số 120 dong vi khuẩn được phân lập từ đất trồng Arachir hypogaea

L có 20 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp siderophore, trong đó, chủng Bacillussubtilis, B halotoleran và B safensi có khả năng tong hợp siderophore cao nhất lần lược

là 69%, 73% và 68%.

Sản xuất kháng sinh cũng được xem là một trong những cơ chế quan trọng trongviệc tạo ra các loại thuốc có tác dụng phòng và trừ các loại bệnh liên quan đến virus.Góp phần đáng kể trong lĩnh y tế, cải thiện sức khỏe, nâng cao đời sống tỉnh thần củacon người Kháng sinh là một nhóm các chất hữu cơ khác nhau có trọng lượng phân tửthấp, được tạo ra bởi vi khuẩn có khả năng làm giảm hoặc ngăn chặn sự phát triển của

vi sinh vật gây bệnh Các loại kháng sinh do Pseudomonase fluorescens và P.

aeruginosa cũng được nghiên cứu khá nhiều Các loại kháng sinh được tông hợp bởicác chủng nay bao gồm 2,4 Diacetyl Phloroglucinol (DAPG), Phenazine-1-carboxylic

acid (PCA), Phenazine-1-carboxamide (PCN), Pyoluteorin (Plt), Pyrrolnitrin (Prn), OomycinA, Viscosinamide, Butyrolaxtones, Kanosamine, Zwittermycin-A Theo

Goswami va cộng sự (2016), các loại kháng sinh này có khả năng chống lại các loại

virus, kháng khuân và côn trùng

Sản xuất các hợp chất hữu cơ dé bay hơi (VOC) có tác dụng thúc day hoặc ứcchế sự tăng trưởng các vi sinh vật khác, thực vật, đối kháng nắm Tuy có tiềm năngnhưng VOC ít được chú ý và chưa được khai thác hết trong kiểm soát sinh

học (Carmona-Hernandez và cộng sự, 2019).

1.2.3.2 Ứng dụng khả năng đối kháng

Hiện nay, ứng dụng khả năng đối kháng của vi khuân để kiểm soát bệnh hại ngàycảng phổ biến Nghiên cứu của Trần Thị Thu Thủy và cộng sự được đăng trên tạp chíkhoa học Đại học Cần Thơ (2014) cho thấy trong số 45 mẫu phân lập thuộc chi Bacillus

có 6 mẫu phân lập có khả năng đối kháng tốt với nam Fusarium monilifome được ký

hiệu là AGB 1, AGB 3, AGB 4, AGB 15, AGB 17 và AGB 27 Nhóm nghiên cứu do

3

PGS.TS Lê Như Cương làm chủ nhiệm công bố kết quả nghiên cứu về “Da dạng và tácđộng đối kháng của vi khuan đối kháng trên cây lạc với nam Sclerotium rolfsii gây bệnhthôi gốc mốc trang” Kết quả nghiên cứu cho thay chủng vi khuân Pseudomonas sp H9/15 sản sinh 2,4-diacetylphloroglucinol có khả năng hạn chế bệnh thối gốc mốc trắng

và nâng cao năng suất lạc qua hai vụ thí nghiệm năm 2015-2016; chủng vi khuẩnBacillus sp QB 5/3 han ché bénh hai va nang cao nang suất lạc năm 2015

Năm 2017, nghiên cứu của PGS.TS Đồng Huy Giới và PGS.TS Nguyễn ThanhHải (Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 2017) “Đánh giá về khả năng ức chế vi khuânXoo gây bệnh bạc lá lúa của nano bạc và dịch chiết lá trầu không” Kết quả nghiên cứucho thay, nồng độ nano bạc thấp nhất có khả năng ức chế in vitro chủng vi khuẩnXanthomonas oryzae pv oryzae là 6,25ppm Khi sử dụng phối hợp cao dịch chiết lá trầukhông với nano bạc ở nồng độ 3,125ppm làm tăng khả năng ức chế vi khuẩn in vitro củacao dịch chiết Nong độ nhỏ nhất của cao dich chiết lá trầu không sử dụng dung môiethanol 96% khi bồ sung vào lỗ thạch van quan sát thay vòng vô khuẩn đối với cả chủng

vi khuân Xanthomonas oryzae pv oryzae là 1,5625 mg/ml Khi sử dụng cao dịch chiếtkết hợp với nano bạc (3,125ppm), nồng độ cao dịch chiết nhỏ nhất vẫn có tác dụng ứcchế vi khuẩn in vitro là 2-8x100mg/ml Sử dụng riêng lẻ hay phối hợp dung dịch nanobạc và cao địch chiết đều làm giảm khả năng gây bệnh bạc lá trong điều kiện thí nghiệm

in vivo Chiều dài vết bệnh có giảm đi rõ rệt dao động từ 7,55cm đến 13,67cm, tức làgiảm đi chỉ còn 35,85% đến 64,91% so với đối chứng

Theo nghiên cứu của Russo và cộng sự (2017), khi tiến hành sàng lọc 88 chủngLactobacillus plantarum, kết quả cho thay 75% các chủng L plantarum có tác dung ứcchế mạnh mẽ đối với Fusarium culmorum, Penicillium expansum và P chrysogenum.Tương tự, Lašanin và cộng sự (2017) đã tiễn hành khảo sát khả năng ức chế nam

Yarrowia lipolytica va Penicillium brevicompactum của 16 chủng L plantarum Ngoài

ra, theo báo cáo của Haidar và cộng sự (2016), khi tiến hành phân lập và sàng loc cácchủng vi khuẩn có kha năng đối kháng với nắm bệnh Phaeomoniella chlamydospora,với kết quả cho thấy 2 dòng vi khuẩn có khả năng ức chế nam bệnh tốt nhất trong 46dòng vi khuẩn là B pumilus (S32) và Paenibacillus sp (S19) Các chủng này thê hiện

sự ức chế tốt trong khoảng từ 31,4% đến 38,7%

Thể giới vi sinh vật rất phong phú và đa dạng Tuy nhiên việc nghiên cứu và ứngdụng khả năng đối kháng của chúng vẫn còn nhiều hạn chế mặc dù đã có một vài thànhtựu nồi bậc ở các lĩnh vực như y học, nông nghiệp Những thành tựu đáng kề đến nhưphát hiện ra hoạt chất penicillin từ nam penicilltum diéu tri va ngăn ngừa nhiễm trùng,

vi khuân Bacillus thuringiensis dùng dé kiểm soát âu trùng của nhiều loài Lepidoptera

và Coleopfera, tác dụng ức chế vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa của dịch chiết cây mòhoa trắng và đơn đỏ (PGS.TS Nguyễn Thanh Hải, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp ViệtNam), phòng ngừa sự tập hợp tế bào - gen thiG cần thiết đối với độc tính của vi khuẩnXoo (được đăng tải trên chi cục bảo vệ thự vật, 08/2015) cho thấy tiềm năng đầy triểnvọng khi nghiên cứu ứng dụng khả năng đối kháng của vi sinh vật

1.3 Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy tăng sinh khối vi khuẩn

1.3.1 Điều kiện dinh dưỡng

Vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng có nhu cầu đinh dưỡng rất khác nhautùy theo chủng dé tăng trưởng Trong môi trường nuôi cay, hai thành phần chính và quantrọng nhất là nguồn carbon và nitrogen Nếu carbon và nitrogen có hàm lượng thấp thìsinh trưởng và hoạt động của vi sinh vat đất cũng rất chậm Một số vi sinh vật đất chuyềnsang trạng thái ngủ khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt Tuy nhiên, các sinh vật cố định damthường có số lượng lớn và hoạt động mạnh nhờ rễ cây tiết ra chất dinh dưỡng Ngoài racòn có các thành phần như các loại khoáng đa lượng, vi lượng và các yếu tô tăng trưởng

khác.

1.3.1.1 Nguồn carbon

Carbon là thành phần chính trong các phân tử protein, nucleic acid và các hợpchất hữu cơ khác, là cơ sở tạo nên cơ thể vi sinh vật nên vấn đề chuyên hóa nguồn thức

ăn carbon thành các thành phần hữu cơ của tế bào chiếm vị trí hàng đầu trong dinh

dưỡng vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng, 1975)

Các nguồn carbon thường dùng trong phòng thí nghiệm dé nuôi cấy vi khuẩn như

glucose, fructose, sucrose Ngoài ra, một sô loài vi khuân còn có khả năng sử dụng

15

các polysaccharide dé tăng trưởng như cellulose, chitin, pectin Mỗi chủng vi khuẩn

có nhu câu nguôn và nông độ nguôn carbon khác nhau.

Tương tự như carbon, nitrogen là thành phần quan trọng trong thành phần tế bào,đặc biệt là các phân tir nucleic acid và protein Các nguồn N có nguồn gốc từ vô cơ hoặchữu cơ nhằm cung cấp N dé tạo thành các nhóm amin (-NH2) và nhóm imin (=NH) trongphân tử amino acid, các nucleotide và một số hợp chất khác có mặt trong nguyên sinhchất của tế bào Thành phần và nồng độ nguồn nitrogen thích hợp đề nuôi cấy thay đôitùy theo chủng vi khuẩn

độ tối ưu giữa 20°C và 45°C, nhóm ưa lạnh có nhiệt độ tối ưu đưới 20°C và nhóm ưanóng có nhiệt độ tối ưu trên 45°C Ở nhiệt độ quá thấp vi khuẩn không phát triển đượcnhưng có thé còn sông Còn ở nhiệt độ cao hoặc rất cao thì vi khuẩn bị tiêu diệt

1.4 Tình hình nghiên cứu về dòng vi khuan Xanthomonas

1.4.1 Tình hình ngoài nước

Trên thế giới, vi khuẩn Xanthomonas nói chung và Xoo nói riêng đã được đâymạnh nghiên cứu những năm đầu thế kỉ 20 từ lần đầu tiên xuất hiện trên lúa ở tỉnhFukuoka (Nhật Bản) Ban đầu bệnh do vi khuẩn Xoo chỉ xuất hiện và phổ biến trên câylúa Tuy nhiên, sau này, người ta lại phát hiện vi khuân Xoo gây bệnh trên các loại cây

khác như xoải, cây rau họ Thập tự, ớt với những triệu chứng như ghẻ trên quả, vàng

lá, chết cây con gây thiệt hại nặng nề về mặt chất lượng và sản lượng, nhất là các câytrồng quan trọng mang lại hiệu quả kinh tế cao Cụ thể, năm 2001, vi khuẩnXanthomonas campestris pv musacearum gây ra bệnh héo rũ trên cây chuối 6 Uganda,đông Cộng hòa Dân chủ Congo, tây Kenya, tây bắc và tây Tanzania, toàn bộ Rwanda

va Burundi với thiệt hại về sản lượng lên đến 80-100% (Singh và cộng sự, 201 1)

Một số công trình nghiên cứu ứng dụng PGPR đề kiểm soát bệnh thực vật do vikhuẩn Xoo gây ra đã được tiễn hành nhằm xây dựng nền nông nghiệp an toàn, sạch vàxanh thay thé cho thuốc bảo vệ thực vật hóa học Nghiên cứu của Mojgan và cộng sự(2012) phát hiện Lactobacillus sp phòng trừ được dòng vi khuẩn X campestris đượckhảo sát trên nhiều mẫu cây trồng khác nhau và được khẳng định lại một lần nữa vào

năm 2014 bởi Shresth và cộng sự Một bai báo trên NCBI — Trung tâm thông tin công

nghệ sinh học quốc gia (2019) công bố kết quả của nhóm nghiên cứu đến từ Hàn Quốc

về bệnh trên cây có múi do Xanthomonas citri subsp citri (Xcc) nhiễm bệnh Kết quanghiên cứu cho thay chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis đã kiểm soát hiệu quả bệnh

hại trên cây có múi kháng streptomycin do Xcc gây ra Các nghiên cứu nói trên là một

minh chứng khả thi cho việc sử dụng vi khuẩn thực vật kiểm soát vi sinh vật gây hại

thực vật.

1.4.2 Tình hình trong nước

Ở nước ta, một nước có tryền thống về nông nghiệp lúa nước thì việc chịu tácđộng chung của vi khuan Xanthomonas là điều không thê tránh khỏi Bạc lá lúa gây rabởi vi khuẩn Xoo đã và đang là một mối nguy hại lớn đối với sản lượng và chất lượngngành lương thực Cụ thể, hơn 9,5 ngàn ha lúa bị mất trắng vào năm 2013 làm sản lượnglúa xuất khẩu giảm xuống 1/3 Hiện nay, nhiều biến thé mới của chủng vi khuanXanthomonas gây hại trên nhiều loại thực vật khác như bơ, củ hành tây, su hào khiếnngười dân hoang mang Việc sử dụng bừa bãi thuốc bảo vệ thực, sai quy định và khôngđúng đối tượng khiến cho môi trường sinh thái nông nghiệp ngày càng ô nhiễm, đất đaisuy thoái và bạc màu Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật không đúng cách còn gây ra nhiều

rủi ro về an toàn thực phâm, nhiễm độc nông sản, nguy hại cho người tiêu dùng Qua

17

đó, bên cạnh việc cần thiết kiêm soát bệnh do vi khuẩn Xanthomonas gây ra thì bảo vệmôi trường sinh thái, xây dựng một nền nông nghiệp xanh, an toàn, bền vững đã và đang

là xu hướng không chỉ ở Việt Nam mà là toàn thế giới Dé thực hiện điều đó thì việc sửdụng các chế phẩm sinh học có nguồn sốc từ vi khuẩn thực vật thay thế thuốc bảo vệthực vật phòng trừ bệnh thực vật nói chung và bệnh do vi khuẩn Xanthomonas gây ra là

điêu cap bách và cân thiết.

Trong những năm gần đây, việc sử dụng vi khuẩn nói chung và vi sinh vật đặcbiệt là vi sinh vật vùng rễ nói riêng là một trong những hướng tiếp cận mới đang đượcphát triển dé kiểm soát các vi sinh vật khác gây ra trên thé giới Cụ thể, Phan Thị PhươngHoa (2010) Viện VI sinh vật và Công nghệ sinh học — Đại học Quốc gia Hà Nội đã sànglọc các chất có hoạt tính sinh hoc từ xạ khuẩn dùng cho đấu tranh sinh học và diệt vikhuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam; Dao Văn Thông và cộng sự (2011) đã pháthiện chủng Bacillus B16 có khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn, tăng khả năngsinh trưởng, phát triển đối với khoai tây; Nguyễn Văn Vinh (2013) đã định danh được

vi khuẩn phòng trừ bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xoo là chủng Bacillus cho thay việcnghiên cứu vi khuẩn vùng rễ kiểm soát vi sinh vật gây bệnh là một xu hướng day tiềm

năng.

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2021 đến tháng 09/2022

Địa điểm nghiên cứu: Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương

2.2 Vật liệu

Chung vi khuan Xoo GTC 7.4.1 được Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tinhBinh Duong cung cap

Mau đất vùng rễ của cây ớt, bắp cai va cà chua

Các dụng cụ và hóa chất thông thường của phòng thí nghiệm Vi sinh — Sinh hóa

Các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm Vi sinh — Sinh hóa

2.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập và sàng lọc được chủng vi khuẩn đối kháng từ các mẫu đất được thuthập ở những cây trồng có khả năng nhiễm bệnh do vi khuan Xoo gây ra

Khảo sát điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối tối ưu cho chủng vi khuẩn đối kháng

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn đối kháng

Các mẫu dat sau khi thu thập sẽ được tiễn hành phân lập tại phòng thí nghiệm détìm các chủng vi khuẩn khác nhau xuất hiện trong mẫu đất Môi trường được sử dụng

dé tiến hành phân lập là môi trường cao thịt — peptone Tiến hành tuần tự ở 3 nhóm mẫuđất thu được tương ứng với 3 cây trồng khác nhau

19

2.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu đất

15 mẫu đất được thu trên 3 loại cây trồng đó là ớt, bắp cải và cà chua Mỗi câytrồng lay 5 mẫu dat và mỗi mẫu đất 500 gram được thu cách nhau tối thiểu 1 km Cácmẫu đất sau khi thu được kí hiệu lần lượt là OT, BA và CA với các thông tin như

Bang 1.

Bang 2.1 Thông tin các mẫu đất

Mẫu Cây Trồng Thời gianthumẫu Giai đoạn sinh trưởng Ba Ca TH

OT Ot Thang 8/2021 Ra hoa Tinh Tién Giang

BA Bap cai Tháng 12/2021 Thu hoạch Đà Lạt

CA Cachua Thang 03/2022 Ra hoa va tao trai Da Lat

2.4.1.2 Phuong phap pha loang hang loat

Agar 24g

Nước 1000 ml

Cách pha: cho các thành phan ở trên vào 500 ml nước rồi khuấy đều và định mức lên

1000 ml Dun trên bếp đến khi agar tan hết Phân môi trường vào các chai rồi mang dihấp khử trùng

2.4.1.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ đất

Thao tác

Bước 1: Chuẩn bị các dia petri có chứa môi trường cao thịt — peptone

Bước 2: Hút 0,1 ml dung dịch huyền phù từ đất có độ pha loãng 103 — 10° lêntrên bề mặt môi trường thạch cao thịt — peptone (*) trong đĩa petri

Bước 3: Nhung que trang vào cồn, ho qua ngọn lửa dé khử trùng Dé que trangnguội trong không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn cồn

Bước 4: Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que trang lên bề mặt thạch của đĩa và dànđều dung dịch huyền phù khắp bề mặt môi trường trong đĩa

Bước 5: Lat ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ đến 72 gid

Bước 6: Chon những khuẩn lạc vi khuẩn rời rạc có hình thái khác nhau (màu sắc

và hình dạng) đề làm thuần Mỗi dòng khuẩn lạc được mã hóa bằng một ký hiệu riêng

biệt.

2.4.1.4 Phương pháp cấy ria làm thuần vi khuẩn trên đĩa petri

Thao tác

Bước 1: Chuẩn bị các đĩa chứa môi trường thạch cao thịt — peptone (*)

Bước 2: Dùng que cấy vòng tiến hành các thao tác khử trùng

21

Bước 3: Sau đó lay một ít sinh khối từ khuẩn lạc được chọn dé cay ria cac duongzigzac trên dia petri chứa môi trường cao thịt — peptone Sau mỗi đường ria liên tục, đốtkhử trùng que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.

Bước 4: Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ đến 72 giờ

Bước 5: Kiểm tra tính đồng nhất của các khuẩn lạc trên đĩa Nếu khuẩn lạc chưathuần thì kiểm tra chọn khuan lạc có đặc điểm giống như đặc điểm ban dau đã chọn trêndia phân lập dé lặp lại thao tác làm thuần Nếu khuẩn lạc đã thuần thì thực hiện cấychuyền dé bảo quản trên thạch nghiêng

2.4.1.5 Phương pháp bảo quản vi khuẩn trên thạch nghiêng

Thao tác

Bước 1: Dùng que cay vòng đã qua khử trùng lay một ít sinh khối từ khuẩn lạc

vi khuẩn trên đĩa làm thuần đề cấy chuyền vào các ống thạch nghiêng chứa môi trườngcao thịt — pepptone (*) theo kiểu zigzac

Bước 2: Ghi ký hiệu mã khuẩn lạc và ngày cấy lên ống nghiệm và mang đi ủ ởnhiệt độ phòng trong 48 giờ đến 72 giờ

Bước 3: Lấy ống giống bảo quan ở ngăn mát tủ lạnh có nhiệt độ từ 4°C đến 89C.Định kỳ cấy chuyền lại giống sau một tháng bảo quản

2.4.1.6 Phương pháp xác định khả năng đối kháng của các dòng khuẩn lạc vi khuẩn

với Xoo

Các dòng khuân lạc sau khi phân lập và làm thuần sẽ được đánh giá khả năng đốikháng với Xoo bằng phương pháp đục lỗ thạch

Bước 1: Chuan bị các canh trường Xoo và canh trường các dòng khuan lạc vi

khuân nghiên cứu.

Bước 2: Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường thạch Wakimoto

Bước 3: Hút 0,1 ml canh trường tăng sinh cấp 1 Xoo trải đều lên bề mặt đĩa đến

khi khô hoàn toàn.

Bước 4: Sử dụng ống trụ bằng kim loại có đường kính 12 mm dé đục 3 giếng trên

mỗi đĩa thạch

Bước 5: Lấy 0,1 ml canh trường dòng khuẩn lạc vi khuẩn nghiên cứu sau khiđược nuôi cấy tăng sinh trong môi trường cao thịt - peptone (*) dé nhỏ vào mỗi giếngthạch của đĩa Mỗi chủng vi khuẩn được cấy riêng lẻ trên mỗi đĩa và được lặp lại trên 3

đĩa cho moi chủng vi khuan khảo sát.

Bước 6: Ủ đĩa ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ Quan sát và đo đường kính vùng ứcchế sự tăng trưởng của Xoo được tạo thành xung quanh các giếng thạch

Bước 7: Tính kết quả, so sánh đường kính vòng ức chế của các dòng khuẩn lạc

Hiệu số I càng lớn thì hoạt tính ức chế của dòng khuẩn lạc vi khuẩn kháng Xoo

càng cao Các dòng khuân lạc vi khuân có hoạt tính ức chê Xoo cao được chọn lọc đê

định danh.

Canh trường Wakimoto

Khoai tây 300 g

23

Cách pha: cắt nhỏ 300 gam khoai tây, cho vào nồi đun sôi với 1000 ml nước trong

30 phút tính từ lúc sôi Sau đó, đem lọc lấy phan nước chiết Cho NaHPOa.12H›O,Ca(NO3)2.4H20, peptone, saccharose vào ít nước và khuấy đều Hòa tan dung dich vừakhuấy với dịch chiết khoai tây và định mức lên 1000 ml Dem chỉnh pH dat giá trị 7bằng dung dịch NaOH 10% va HCl 10% Phân dịch chiết vào các chai và mang hap khửtrùng Sau đó bồ sung chủng vi khuan Xoo GTC 7.4.1 vào dịch chiết mang di nuôi caylắc ở nhiệt độ 30°C trong 72 giờ

Canh trường cao thịt — peptone

2.4.1.7 Phương pháp định theo khóa phân loại của Bergey

Định danh theo khóa phân loại của Bergey là kỹ thuật sử dụng những chỉ tiêu vềhình ảnh va sinh hóa dé xác định và định danh các dòng vi khuẩn theo phương pháp có

trong số tay hướng dẫn xác định vi khuẩn học của Bergey (Holt và cộng sự 1994) Mẫuđược gởi đến trường Đại học Khoa học tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâmcông nghệ và công nghệ sinh học dé thực hiện định danh.

2.4.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối chủng vi khuẩn tìm được

Sau khi sàng lọc và định danh được chủng vi khuẩn ta tiễn hành khảo sát một số

điệu kiện nuôi cây tăng sinh khôi tôi ưu.

Các điêu kiện được chon dé khảo sát là môi trường nuôi cây, pH, nguôn carbon,

nguồn nitrogen vô cơ

2.4.2.1 Anh hưởng của môi trường cấy

Môi trường nuôi cấy được chon dé tiễn hành khảo sát bao gồm: môi trường

Sucrose Peptone Agar (SPA), môi trường King’S B, môi trường Wakimoto, môi trường

Luria Bertani (LB) và môi trường nước chiết giá đậu đường pepton

Chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy vào môi trường cao thịt - peptone đề nuôicay lắc tăng sinh cấp 1 trong 48 giờ nhằm tạo nguồn giống thống nhất khi khảo sát lựachọn môi trường Sau đó, 1 ml canh trường này được cay vào 200 ml môi trường khảosát (5 môi trường nêu trên) dé nuôi cấy tăng sinh cấp 2 bằng cách lắc trong 48 giờ ở 200vòng/phút và 30°C được lặp lại 3 lần Áp dụng phương pháp trải đĩa nhằm kiểm tra mật

độ tế bao trong canh trường cấp 2 để xác định môi trường nuôi cấy tối ưu trong số các

môi trường trên Cách thực hiện:

Phương pháp xác định mật độ tế bào

Bước 1: Chuẩn bị 9 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí

vô trùng Hut 1 ml dung dịch vi khuan tăng sinh cấp 2 cho vào ống nghiệm đầu tiên, lắcđều ta được dung dịch vi khuẩn có nồng độ 107,

Bước 2: Hút 1 ml dung dich ở ống nghiệm đầu tiên sang ống nghiệm thứ 2 tađược dung dịch có nồng độ 10” Thực hiện tương tự với các ống nghiệm còn lại ta đượcnồng độ từ 103 đến 10°

25

Bước 3: Hút 0,1 ml dung dịch pha loãng ở nồng độ 3 độ pha loãng liền kề (thườngdùng 10°, 105 va 107) cay trang đều lên đĩa petri (mỗi nồng độ 3 dia petri) chứa môitrường thường là cao thịt — peptone Trải đều mẫu trên đĩa.

Bước 4: U đĩa trong 48 giờ đến 72 giờ

Bước 5: Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa sau 48 giờ đến 72 giờ Ghi chép

số liệu, chọn những đĩa có chứa 25 — 250 khuẩn lạc, xử lý và kết luận môi trường tối ưu

Mật độ tế bào vi khuẩn tính theo công thức:

[ N(CFU/ml) =——È—— | (Công thức 2.2)

V.(n1+0,1.n2).d

Trong đó:

CFU (Colony Forming Unit): đơn vị hình thành khuan lạc,

N: tông số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu (CFU/ml),

C: là tong số khuan lạc đếm được trên các dia được chon có 25 - 250 khuẩn lạc,

ni, No: tong sé lượng đĩa được chon ở độ pha loãng thứ nhất và thứ 2,

V: thé tích dich mẫu cấy (0,1 ml),

d: độ pha loãng thứ nhất

Các môi trường đã được chọn dé khảo sát:

() — Môi tường SPA

Peptone 58

Saccharose 20g

KoHPO4 0,5 g

MgSO 7H20 0,25g

Nước 1000 ml

pH 7,0+0,2

Cách pha: can peptone, saccharose, K2HPOs, MgSOu.7H20 cho vào 500 ml nước

và khuấy đều rồi định mức 1000 ml Phân môi trường vào các chai rồi dem hap khử

Cách pha: can peptone, glycerol, K2HPOs, MgSOa.7H›O cho vào 500 ml nước

và khuấy đều rồi định mức 1000 ml Phân môi trường vào các chai rồi dem hap khử

Cách pha: trộn các nguyên liệu cho tan đêu, sau đó phân môi tường vào các chai

Cách pha: đun 200 g giá với 1000 ml nước trong 30 phút tinh từ lúc sôi, sau đó

đem lọc lay phần nước chiết Cho glucose và peptone vào định mức bằng nước đến 1000

ml Phân vào các chai rồi đem hấp khử trùng

2.4.2.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu

Từ kết quả chọn được môi trường nuôi cấy tối ưu ở thí nghiệm trên, tiếp tục khảo

sát sự tác động của nông độ pH ban đâu đên sự tăng sinh của chủng vi khuân được chon.

Tiến hành pha môi trường được chọn như mục 2.4.2.1 điều chỉnh nồng độ pHbang dung dịch NaOH 1 N và HCI 1 N về các giá trị pH lần lượt là 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 và8,0 Thí nghiệm được lập lại 3 lần tương ứng với mỗi nồng độ pH Xác định nồng độ

pH phù hợp sau khi nuôi cấy 48 giờ bằng cách đếm mật độ tế bào có trong các canhtrường bằng phương pháp đêm trải như ở trên

2.4.2.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Từ kết quả chọn được pH nuôi cấy tối ưu ở thí nghiệm trên, tiếp tục khảo sát sự

tác động của nguôn carbon đên sự tăng sinh của chủng vi khuân được chọn.

Chuân bị môi trường nuôi cây được chọn với các thành phân tương tự ở mục

2.4.2.1 với nồng độ được chọn ở mục 2.4.2.2 nhưng thêm 2% các loại đường glucose,