Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa hình gen Neuropeptide y và đánh giá ảnh hưởng đa hình đến một số chỉ tiêu sinh sản ở gà Hắc Phong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC NGHIÊN CỨU DA HÌNH GEN NEUROPEPTIDE Y VA ĐÁNH GIA ANH HUONG DA HÌNH DEN MỘT SO CHI TIEU SINH S

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

NGHIÊN CỨU DA HÌNH GEN NEUROPEPTIDE Y

VA ĐÁNH GIA ANH HUONG DA HÌNH DEN MỘT SO

CHI TIEU SINH SAN O GA HAC PHONG

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thựchiện =: NGUYÊN DUY AN

Mã số sinh viên : 18126001

Niên khóa : 2018 - 2022

TP Thu Đức, 3/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU DA HÌNH GEN NEUROPEPTIDE Y

VÀ ĐÁNH GIA ANH HUONG ĐA HÌNH DEN MỘT SO

CHỈ TIÊU SINH SAN Ở GA HAC PHONG

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS NGUYÊN NGỌC TÁN NGUYÊN DUY AN

TP Thú Đức, 3/2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến Cha Mẹ của em Con cảm ơn cha mẹ đã nuôidạy con khôn lớn và trưởng thành Cảm ơn Cha Mẹ đã luôn cố gắng tạo mọi điều kiện tốtnhất dé con được học tập và phát triển Cảm ơn cả gia đình đã tin tưởng, ủng hộ con trêncon đường mà con đã lựa chọn và là chỗ dựa cho con mỗi khi con gặp khó khăn, vấp ngã

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và vô cùng biết ơn Thầy hướng dẫn khoa học củamình là Thầy Nguyễn Ngọc Tan Thay là người đã truyền cảm hứng cho em trong nghiêncứu khoa học và là một tấm gương to lớn cho em noi theo Cảm ơn Thay đã truyền đạt cho

em những kiến thức quý báu về khoa học cũng như là những kinh nghiệm sống quý giá màThay đã tích lũy được Cam on Thay đã giúp em định hướng mục tiêu phan đấu, luôn tạomọi cơ hội, điều kiện tốt nhất để em có thể phát triển bản thân Em cảm ơn Thầy đã tận tìnhgiúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp Em vô cùng kính trọng

và biết ơn

Em xin chân thành cảm ơn đến tất cả các thành viên của Phòng thí nghiệm Phôi

Động Vật nói chung và đặc biệt là các Anh Chị trong lab nói riêng Cảm ơn các Anh, các

Chị đã luôn giúp đỡ em trong suốt thời gian qua, tận tình dạy cho em các kỹ năng, thao tác,

chia sẻ những kinh nghiệm quý báu của người đi trước cho em Cảm ơn các bạn, các em đã

đồng hành và động viên mình trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến các Quý Thầy Cô của Khoa Khoa học Sinh học — trườngđại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã truyền đạt những kiến thức chuyên môn quý giá

cho em trong 4 năm học vừa qua.

Cuối cùng em xin cảm ơn đến Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Chăn nuôi Giacầm VIGOVA đã hỗ trợ cung cấp nguồn mẫu và hóa chất giúp em hoàn thành đề tài

Trong quá trình thực hiện đề tài, không thể tránh được việc xảy ra sai sót, em rất sanlòng và mong nhận được nhận xét và góp ý từ Quý Thầy Cô Em xin chân thành cảm ơn

Trân trọng.

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tác giả xin xác nhận và cam đoan toàn bộ kết quả được trình bày trong Khóa luận

là do tác giả thực hiện Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực

và khách quan.

Họ và tên: NGUYÊN DUY AN Lớp: DH18SHB Mã số sinh viên: 18126001

Số điện thoại: 0981668016 Email: 18126001@st.hcemuaf.edu.vn

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 02 năm 2023

Người thực hiện

Nguyễn Duy An

ii

TÓM TẮT

Nghiên cứu nhằm đánh giá đa hình gen Neuropeptide Y bằng kỹ thuật PCR-RFLP

và ảnh hưởng của đa hình gen đến môt số chỉ tiêu sinh sản gà Hắc Phong Tổng số 398 maumáu gà Hắc Phong được thu nhận, tách chiết DNA và khuếch đại đoạn gen mục tiêu cókích thước 252bp, sau đó sản pham PCR được phân cắt bang enzyme Dral Kết qua chothay enzyme phân cắt đa hình ở locus NPY/Dral với 02 kiểu allen A và B được nhận diện,tần số kiểu gen BB, AB và AA lần lượt là 0,555; 0,392 và 0,053 Kết quả phân tích cácthông số đa hình cho thấy thông tin đa hình (PIC) là 0,304 và tan số di hợp mong đợi (H,)

là 0,374 Sản lượng trứng tính đến tuần tuổi 38 của gà đối với kiểu gen AA là 48,5 quả,kiểu gen AB là 50,0 qua và kiểu gen BB là 55,9 quả Nhóm ga mang kiểu gen BB có năngsuất trứng ở cao hơn có ý nghĩa (P<0,05) so với nhóm gà mang kiểu gen AA và AB Cần

mở rộng nghiên cứu đa hình gen tại locus NPY/Dral qua nhiều thế hệ dé tạo cơ sở dữ liệutin cậy cho hỗ trợ chọn lọc giống gà Hắc Phong theo hướng tăng năng suất trứng

Từ khóa: gà Hac Phong, neuropeptide Y, da hình gen, sinh sản, PCR-RFLP

1H

The aims this study were to evaluate the Neuropeptide Y gene polymorphism and the influence of gene polymorphisms on some reproductive parameters in Hac Phong chickens A total of 398 individual blood samples of Hac Phong chickens were collected,

DNA were extracted to amplify the target gene segment with size 252bp Then the PCR product was digested with the Dral enzyme The result showed that the enzyme cleavage

polymorphic at locus NPY/Dral with 02 alleles A and B was identified Three genotypes were observed and frequency of AA, AB and BB genotype was 0.053; 0.392 and 0.555, respectively The the polymorphism information content (PIC) was 0.304 and the expected

heterozygosity (H.) was 0.374 Egg yield up to 38 weeks of age of chickens for genotype

AA was 48.5 eggs, AB was 50.0 eggs and BB was 55.9 eggs The group of chickens with genotype BB had significantly higher egg production (P<0.05) than the group of chickens with genotypes AA and AB It is necessary to evaluate of gene polymorphism at the NPY/Dral locus through several generations in order to get more the accurary data to support the selection Hac Phong chicken with improvement of egg yields.

Keyword: Hac Phong chicken, Neuropeptide Y, gene polymorphism, reproduction, PCR-RFLP.

iv

MỤC LỤC

; ; Trang

XÁC NHẬN VA CAM ĐOAN 222-22222222122121121211212121211212112121111211211221 222 c2 IITÓM 8 0S De II

ABSTRACT 2-2222 2222212221221122121122112212211211211211121121121111121121121121121221111 11 ca IV

;;i5.2xi 01005 .ÔÔỒỎ Vv

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TẮTT -2- 2 2+E2+E2E+EE+EE+EE2E22E22E2232222222222222Xe2 VIIDANH SÁCH CÁC FINA vcssissisinnannsnmmenannnaanianiaunane au muniereaninanenennns VIIIDANH SÁCH CAC BẢNG 2-52 22222222221221221221211211211211211221212121121122 2 0 IxCHƯƠNG 1 MO ĐẦU 2: 522S22222E2522122122121121121221211211211111121121121111121121 21 e0 |1.1 ĐẶT VAN ĐỀ 2-5-2221 121121121121112112112111111110112111111211211211 212112121 ru |1.2 MỤC TIỂU -. - 2 2+S2E+EESEE2E12E21E71211211211111111211211111111111111111111 11 E1Ea re 5

OC, EO trtrnaetorontntrgriitisipittsirtaiguipnvdlitrgtngthiyriooti trtGfigtietibEadbxensg 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU - 2-2: 2+S2SE+E£EE+E£EE+E£EE2EE2E2EEZE2EEZE2EEzEzzzzxee 32.1 GIGI THIỆU VỀ GIỐNG GA HAC PHONG 2-2: 2+S+S22E2E22E2222E2212222 2e 3

2.2 GEN NEUROPEPTIDE Y 2-2-©22+SE2EE22E22EE22E127E222122122212211271221122112212212 221 c2e 4

2.3 KỸ THUAT PCR + 222 +E9E2E9E1219212122121112111211111111111111111111211 2121111 1x xe 5

2.3.1 ĐỊNH NGHĨA VÀ LICH SỬ -. -+-2- 2 522222 22221322221 22223 221111112 1 2X 52.3.2 NGUYEN TAC HOAT DONG CUA PHAN UNG PCR oo.ocescscsecseessesseeteseeteeeeeeees 52.4 CHỈ THỊ PHAN TU ono eccccecccccccccccsessesesessessesesscsceescecssacssasssasssaesnssesssessseseaeeeeaees 6

DAT TT GA 6

AD eke el TỦ HE ee 72.4.3 PHƯƠNG PHAP PCR-RFLP 2-52 ©52222221221221271121121121121122121 21221121 xe 72.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA HÌNH GEN NEUROPEPTIDE Y -2- 2= 82.5.1 NGHIÊN CUU TRONG NƯỚC 2-22 +22+E2+EE£EE£EEEEE21222122127122121.22 21 Xe 82.5.2 NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC -2- 2+ 222222EE22E+2EE22E1221222122122212222222 xe 9CHUONG 3, VAT LIEU VÀ PHƯƠNH PUAP sicncircrcreomnencrcasmnenmumnnwnetecces 103.1 DIA DIEM VA THỜI GIAN THỰC HIỆN 2 222 +2+2£+E22E2E+zE+zzzzzzzzzse2 10

3.2 VAT LIEU NGHIÊN CỨU - 2 2+S2+E+EEEE£EE+E£EE2EEEEEEEEE2EE212112121221212111212e 103.2.1 LY TRÍCH DNA TONG SO TỪ MẪU MÁU 22-©2¿2222222222222zz2x2zze2 11

3.2.2 PRIMER 00 cceccessessesssessessessessessesssesuessessessessssesssesiessessessessessusssesiessessessesateaesessesses 12

3.3 PHƯƠNG PHAP THUC HIỆN 22 ©2222222E22EE22E127122122122212211221222122222 Xe 123.3.1 KHUECH ĐẠI DOAN GEN MỤC TIÊU BANG PHAN UNG PCR 133.3.2 NHAN DIEN VA PHAN TÍCH ĐA HÌNH GEN BANG ENZYME CAT GIỚI

HAN 0 cccccceccccccccceceseueseeeeeeseeeeeesssuuaneeeeseseseesesusasseeeeesseeeeesesssaaneeeesess 14

3.3.3 PHAN TÍCH ANH HUGNG CUA ĐA HÌNH GEN DEN NANG SUÁT TRUNG

OL OF C7; Ca 15

ge en 15CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2 22222252+2E22E2E22E22E2E2Exzzxzzzzea 174.1 KHUECH DAI DOAN GEN NEUROPEPTIDE Y BANG KỸ THUẬT PCR 174.1.1 DANH GIA CHAT LUGNG DNA TONG SO LY TRÍCH TU MAU MÁU 174.1.2 KHUECH DAI DOAN GEN MỤC TIÊU BANG PHAN UNG PCR 174.2 NHAN DIỆN VA PHAN TÍCH DA HÌNH GEN BANG ENZYME CAT GIỚI

HAN oo cccccccccccccccceceeeeeeseeeeeceeeeeeeesussueeeeseseeeeeessusseeeessseseseeeessaeeeeeesess 19

4.3 PHAN TÍCH ANH HUONG CUA DA HÌNH GEN DEN MOT SO CHI TIEU SINHSẢN CỦA 6 7; ne 22CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ ĐỀ NGHHỊ, 222 S2+SE2EE2E12E252521122121171 21111 re 24O_o 245.2 ĐỀ NGHỊ, + 2-52 SS2S2E2E12552121112111211112111121111112111111111111121121111212 0121112 re 24

TP STTLTETE TT ete erties 25

lạ 70g ee 27

VI

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

ANOVA : Analysis of variance

Bp : Base pair

DNA : Deoxyribonucleic acid

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

PCR : Polymerase Chain Reaction

PIC : Polymorphic information content

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SNP : Single nucleotide polymorphism

SSR : Simple sequence repeats

Ta : Annealing temperature

TAE : Tris — Acetate -EDTA

UV : Ultraviolet

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Gà Hắc Phong 222 222222£2E£SE22E22E12E12212212212211211211211211211212112121 Xe 4Hình 2.2 Sơ đỗ các giai đoạn của phần ứng ĐỚP S221 Ee022121E 26160 6

Hình 2.3 Quy trình kỹ thuật PCR R.ELTP - G231 32***x* SE *EE+EEErkrrkrrkrrkrkrkkrkrerke §

Hình 3.1 Thu nhận mẫu máu từ tĩnh mạch cánh của gà 2-2 252252 52zSz5+zs4 10

Hình 3.2 Vị trí của cặp primer được kiểm tra bằng phần mềm BLAST 12Hình 4.1 Hình ảnh đại diện kết qua điện đi DNA tổng số -2 22222522222522z< 17Hình 4.2 Hình ảnh đại diện kết guả điện đi sán phim ĐỢP -e.oeiiiiiiiekiee 18Hình 4.3 Kết quả giải trình tự sản phâm PCR - 22 22222222E++2EE2EE2EEzzrxrsrxree 18Hình 4.4 Hình anh đại diện kết quả điện di sản phẩm sau phản ứng phân cắt 19Hình 4.5 Hình ảnh kết quả giải trình tự các mẫu đại diện cho 03 kiểu gen - 20

Vili

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Bảng 3.1 Thông số cặp primer sử dụng cho dé tài -c c2 22-2 22222 12Bang 3.2 Thành phan phản ứng PCR - SE 1 11251 11151151 1111 11 81 11H ướu 13

Bang 3.3 Chu trình nhiệt phan ứng PCTR - - c2 1222211112221 11222 11111555111 153 %5 13

Bảng 3.4 Kích thước dự kiến của sản phẩm sau phân cắt và quy ước kiểu gen của gen

sts tsi Si i i hs 5 tii Es tt tA tt et 14

Bảng 3.5 Thanh phan phan ứng phân cat sản pham khéch dai bang enzyme Dral 15Bang 4.1 Kết qua phân tích da hình gen neuropeptide Y tailocus NPY/Dral 21Bảng 4.2 Anh hưởng của da hình gen NPY đến một số chỉ tiêu sinh sản của gà 32

ix

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nước ta là một nước đang phát triển với nông nghiệp là ngành kinh tế chủ chốt Bêncạnh với ngành trồng trọt thì chăn nuôi cũng là một trong những lĩnh vực kinh tế quan trọngkhông chỉ mang lại nguồn kinh tế cho đất nước mà còn là kế sinh nhai của người nông dân.Hiện nay, chăn nuôi gia cầm đang rất được chú trọng vì gia cầm có vòng đời sinh trưởng

ngắn, dễ nuôi, có thể nuôi với số lượng đàn lớn, mang lại lợi nhuận kinh tế cao nhờ cung

cấp nhiều loại sản phẩm như thịt, trứng, long, gidp người nuôi nhanh thu hồi lại vốn Theo

số liệu thống kê năm 2021, số lượng đàn gà ở Việt Nam dat trên 420,2 triệu con (Cục Chănnuôi, 2021) Đặc biệt, các giống gà lông màu đang nam giữ thị phần cao, hiện đang đượcđây mạnh nghiên cứu trong chọn lọc giống

Gà Hắc Phong được biết đến là giống gà thuốc có giá trị dinh dưỡng cao, với đặcđiểm lông đen, chân đen, thịt đen và ít mỡ, chất lượng thịt thơm ngon Nắm bắt được giátrị dinh đưỡng cũng như kinh tế từ giống gà này, các trang trại chăn nuôi đang tiến hành

đây mạnh việc chọn lọc giống Ngày nay, nhờ vào sự phát triển nhanh chóng của công nghệ

sinh học di truyền phân tử mà việc chọn lọc giống đã trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn

Đã có các nghiên cứu trong nước và ngoài nước đã chứng minh rằng các tính trạng sinhtrưởng và sinh sản một phần là bị ảnh hưởng bởi đa hình gen Do đó, việc nghiên cứu về

đa hình gen đang rất được quan tâm trong chọn lọc giống vật nuôi Trong đó, gen

neuropeptide Y (NPY) được xem là một trong những gen ứng viên quan trọng hỗ trợ cho

việc chọn lọc.

Neuropeptide Y (NPY) là một loại peptide thần kinh được biết đến là có chức năngtham gia vào các quá trình sinh lý và cân bằng nội môi khác nhau ở cả hệ thống thần kinhtrung ương và ngoại vi Ở ga, gen NPY được chứng minh là có tác động đến tuôi đẻ của quatrứng đầu tiên (Dunn và ctv, 2004; Tran Thị Bình Nguyên va ctv, 2018) Đa hình gen NPYtại nhiều vị trí khác nhau cũng cùng ảnh hưởng đến các tính trạng sinh sản ở gà (Xu va ctv,2011a) Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình genneuropeptide Y và ảnh hưởng của đa hình gen đến các tính trạng năng suất trứng ở gà, tuy

nhiên việc nghiên cứu và ứng dụng vào chăn nuôi ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế Do đó,nghiên cứu này nhằm phân tích đa hình gen NPY và đánh giá ảnh hưởng của đa hình genNPY đến một số chỉ tiêu sinh sản đối với giống gà Hắc Phong góp phan tạo xây dung cơ sở

dữ liệu phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo và hỗ trợ chọn lọc giống sau này

1.2 Mục tiêu

Phân tích đa hình gen neuropeptide Y bang kỹ thuật PCR-RFLP và đánh giá anhhưởng của đa hình gen đến một số chỉ tiêu sinh sản ở gà Hắc Phong

1.3 Nội dung

Nội dung 1: Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

Nội dung 2: Nhận diện và phân tích đa hình gen bằng enzyme cắt giới hạn

Nội dung 3: Phân tích ảnh hưởng của đa hình gen đến một số chỉ tiêu sinh sản của

gà.

Chương 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về giống gà Hắc Phong

Ở Việt Nam, cùng với chăn nuôi gia súc thì chăn nuôi gia cầm là một ngành mangnguồn kinh tế cao cho người nông dân Chăn nuôi gia cam giúp góp phan giải quyết về nhucầu thực phẩm cho con người vì gia cầm cung cấp không chỉ thịt mà còn có cả trứng Theo

số liệu của Tổng cục Thống kê, vào tháng 6/2022 tông đàn gia cầm trên cả nước ước tínhtăng 1,2 % với năm 2021, cung cấp ra cho thị trường khoảng 980 ngàn tan thịt xuất chuồng

và khoảng 8,8 ty quả trứng (Cục chăn nuôi, 2022) Nhiều năm gần đây, ngành chăn nuôi gà

đã và đang phát triển nhanh chóng nhờ các tiến bộ về khoa học kỹ thuật, dịch bệnh đã đượckiểm soát, người dân cũng chú tâm hơn vào chọn lọc giống vật nuôi Hiện nay, các giống

gà đang được nuôi ở nước ta rất da dang có thé ké đến như: ga Noi, gà Tàu Vang, gà Tre,

ga Ri, gà Đông Tảo, Ngoài ra còn có các loại gà nhập ngoại như gà Tam Hoang, gà Luong

Phuong, Day là các giống gà có khả năng phát triển nhanh chóng, trọng lượng cơ thénặng, đem lại hiệu quả kinh tẾ cao Tuy vậy, nhu cầu của con người chưa bao giờ là đủ.Hiện nay, người tiêu dùng lại chú tâm về việc bồi bổ sức khỏe nhiều hơn, vì thế các giống

gà thuốc đang rất được ưa chuộng trên thị trường điển hình như gà Ác, gà Thái Hòa, gà HắcPhong Trong đó gà Hắc Phong là giống gà còn khá mới lạ với nhiều người mặc dù có nhiều

ưu điểm hơn các giống gà thuốc thịt đen còn lại như có khả năng chóng chóng chịu bệnhtốt, dé thích nghi với các vùng khí hậu khác nhau (Nguyễn Thi Phương Giang va ctv, 2022)

Gà Hắc Phong là một giống gà có nguồn gốc từ Trung Quốc và đang được nuôinhiều tại Quảng Ninh, thịt gà có giá trị dinh dưỡng cao Giống gà này được biết đến với đặcđiểm lông đen, chân đen, thịt đen và ít mỡ, chất lượng thịt thơm ngon Ngoài ra, gà HắcPhong còn được biết đến là một giống gà thuốc có tác dụng chữa bệnh và bồi bổ sức khỏe(Phạm Công Thiếu và ctv, 2018)

Hiện tại, thì giống gà này đang được xem là giống gà mang lại nhiều triển vọng Đã

có các nghiên cứu về đặc điểm sinh trưởng cũng như sinh sản ở gà Hắc Phong để phục vụviệc ứng dụng mở rộng chăn nuôi thương phẩm giống gà này Theo kết quả mô hình nghiêncứu Phạm Công Thiếu và ctv (2018), một số chỉ tiêu cơ bản về sinh sản sinh trưởng như

khối lượng co thé ga ở 8 tuần tuổi đạt trung bình 666,47 g/con, khối lượng trung bình của

gà mái 19 tuần tuổi là 1.212,09 g/con, năng suất trứng trên mỗi cá thể gà mái 72 tuần tuổi

là 148,69 quả và lượng tiêu tốn thức ăn là 2,51 kg khi gà đẻ 10 quả trứng Kết quả xây dựng

mô hình cho thấy, trọng lượng gà đạt 1415,7 g/con khi đã 16 tuần tuổi

Mặc đù với nhiều đặc điểm ưu việt như vậy, nhưng đo là một giống gà bản địa chưaquá pho biến nên gà Hắc Phong chỉ được nuôi tại nông hộ hoặc các trang trại nhỏ lẻ làchủyếu Cũng vì là một giống gà bản địa nên thường chỉ được nuôi tại địa phương, không đượcquan tâm nhiều về quá trình chọn lọc giống, về lâu về dài sẽ dẫn đến nguy cơ thoái hóagiống Vì vậy, việc nghiên chọn lọc giống là việc làm hết sức cần thiết góp phần duy trìgiống tốt, nâng cao năng suất, chất lượng thịt và trứng cũng như giúp pho biến giống ganày hơn, giúp đa dạng hơn về nguồn gen, song góp phần nâng cao đời sống kinh tế cho

người nông dân.

Gen Neuropeptide Y

Neuropeptide Y (NPY) là một loại peptide than kinh tham gia vao cac qua trinh sinh

ly và cân bằng nội môi khác nhau ở ca hệ thống thần kinh trung ương và ngoại vi NPYđược xác định là peptide có nhiều nhất trong hệ thống thần kinh trung ương bao gồm não

và tủy sống của động vật có vú

Ở gà, gen neuropeptide Y tồn tại ở chromosome số 2, kích thước khoảng 7kb gồm 3

intron và 4 exon mã hóa cho 97 axit amin (NCBI).

4

Ngoài ra, neuropeptide Y (NPY) còn được biết là có ảnh hưởng đến chức năng củatuyến sinh dục ở gia cầm (Hilal và ctv, 1996) Ở gà, Neuropeptide Y kiêm soát hoạt độngcủa buồng trứng thông qua việc điều hòa sự tiết của hormone Gonadotropin (Contijoch vàctv, 1993) Gen NPY còn điều khiển quá trình hấp thụ thức ăn, điều hòa hoạt động sinh sản

và tuôi thành thục về giới tính (Kuenzel và ctv, 1995) NPY cũng được cho là có ảnh hưởngđến tuổi đẻ quả trứng đầu tiên (Dunn va ctv, 2004; Xu và ctv, 2011)

Neuropeptide Y được xem như là một gen đại diện cho mối liên kết điều hòa thần

kinh giữa dinh dưỡng và sinh sản ở mức độ CNS (Gladysz và Polkowska, 2006) Nhu vậy,

neuropeptide Y có tac động đến các quá trình sinh trưởng, đặc biệt là sinh sản ở gia cầm nóichung và gà nói riêng Do đó, các nghiên cứu về méi tương quan giữa đa hình genneuropeptide Y và các tính trạng năng suất trứng cần được nghiên cứu nhiều hơn nữa dé cóthé ứng dụng rộng rãi trong chọn lọc giống vật nuôi cho sau nay

2.3 Kỹ thuật PCR

2.3.1 Định nghĩa và lịch sử

Polymerase Chain Reaction viết tắt là PCR là một kỹ thuật trong Công nghệ Sinhhọc dùng dé nhân bản vô số bản sao từ một đoạn DNA mục tiêu dựa trên sự biến tinh vahôi tính của đoạn gen thông qua các chu trình nhiệt

Kỹ thuật PCR được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1983.

2.3.2 Nguyên tắc hoạt động của phản ứng PCR

Một chu trình nhiệt của một phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn: (Hình 2.2)

Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ của phản ứng được tăng lên 95°C, các liên kết hydro

nối các nucleotide giữa 2 mạch DNA bị phá vỡ, DNA mau ban dau từ mạch đôi bị biến tính

tách thành mạch đơn.

Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống 55 — 65°C tùy vao độ dai

và phan tram GC của cặp primer sử dung cho phan ứng Ở giai đoạn nay, primer bat cặp bésung đặc hiệu vào hai đầu của DNA khuôn mau

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ phản ứng được đưa lên 72°C, enzyme Taq polymerase

xúc tác các dNTP gắn vào DNA khuôn mau theo nguyên tắc bồ sung dé kéo dài mạch khuôn

từ đầu 3” của primer Các liên kết hydro hình thành, DNA mạch đôi mới được tạo ra

Chu kỳ 3 giai đoạn lặp lại 30 - 40 lần

2.4 Chỉ thị phân tử

2.4.1 Định nghĩa

Chỉ thị phân tử hay chỉ thị DNA được hiểu là những thay đổi trong phân tử DNA,các chỉ thị này ảnh hưởng đến một số tính trạng nhất định Chỉ thị DNA được hình thành

từ các đột biến DNA khác nhau như đột biến điểm đột biến thêm hoặc bớt một hay đoạnnucleotide hoặc lặp lại các đoạn DNA liền kề Hiện nay, chỉ thị phân tử đang được sử dụngrộng rãi trong các nghiên cứu về gen, lập bản đồ di truyền, xây dựng phát sinh chủng loài

Ngày nay, các chỉ thị phân tử mới được ra đời đáp ứng với nhiều mục đích khácnhau trong công tác chọn tạo giống như: RFLP (đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn), SSR(các chuỗi lặp lai đơn giản), SNP (đa hình nucleotide đơn) Ngoài ra, việc cải tiến kết hợpcác chỉ thi phân tử dựa trên nên là sản phẩm của phản ứng PCR ngày càng được ứng dụng

rộng rãi do sự hiệu quả của nó mang lại.

2.4.2 Chỉ thị phan tử RFLP

Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là đa hình về độ dài cácđoạn cắt giới hạn Nguyên tắc của chỉ thị này là dựa trên trình tự nhận biết và cắt đặc hiệucủa enzyme cắt giới hạn trên đoạn gen mục tiêu DNA mẫu sau khi cắt bằng enzyme cắtgiới hạn sẽ được lai với đoạn dò DNA đã đánh dấu, sau đó thấm truyền lên màng lai bằngphương pháp Southern Kết quả tạo ra các đoạn DNA có kích thước khác nhau do sự khácbiệt về vị trí cắt, tạo ra nhiều kiểu gen, từ đó tạo nên đa hình cho kiểu gen của quần thểđược nghiên cứu (Nguyễn Đức Thành, 2014)

RFLP là một chỉ thị đáng tin cậy trong phân tích mối liên kết giữa kiểu gen và tínhtrạng kiểu hình Kỹ thuật RFLP đã được ứng dụng trong lập bản đồ genome (Lander vàBotstain, 1989), xác định giống (Karp và ctv, 1998), nghiên cứu đa dạng di truyền (Dubreuil

và ctv, 1996).

2.4.3 Phương pháp PCR-RFLP

Phương pháp PCR-RFLP là phương pháp nghiên cứu đa hình một đoạn gen mục tiêu

khi được cắt bởi enzyme cắt giới han dựa trên sản pham của phản ứng PCR Quy trình thựchiện PCR-RFLP gồm các bước: (1) Ly trích và tinh sạch DNA tổng số; (2) Thực hiện phanứng PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu; (3) Phân cắt sản phẩm khuếch đại bằng enzymecắt giới hạn; (4) Điện di kiểm tra sản phẩm DNA sau phân cắt (5) Thu thập dit liệu kiểu

gen và đưa ra kết luận.

=~ = es s_—tExtraction labelled primer

Digestion with restriction enzyme

— <= “mmr oT,»

Dalsbase || røehoshomss ®*-rim) 4Irrrirranalysis 7 5

Hinh 2.3 Quy trinh ky thuat PCR-RFLP

Kỹ thuật PCR-RFLP với nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với kỹ thuật RFLP truyềnthống như: đơn giản, sử dụng lượng mẫu nhỏ, giảm chi phí, do đó phương pháp nay đangđược ứng dụng rộng rãi trong chọn tạo giống vật nuôi do sự tiện lợi cũng như hiệu quả mà

kỹ thuật này mang lại.

2.5 Các nghiên cứu về đa hình gen neuropeptide Y

2.5.1 Nghiên cứu trong nước

Trần Thị Bình Nguyên và ctv (2018) cũng đã có nghiên cứu về ảnh hưởng đa hìnhmat một đoạn 4 nucleotide (indel) của gen neuropeptide Y đến các tính trạng sản xuất trứng

ở gà Liên Minh — Việt Nam Kết quả cho thấy vị trí đa hình tại locus NPY/Dral tương ứngvới kiêu gen II (0,76); ID (0,20) va DD (0,04) Trong đó, các cá thé gà mang kiểu gen dihợp tử ID có tuổi đẻ sớm hơn so với các cá thể gà mang kiêu gen đồng hợp tử II và DD

Nguyễn Trọng Ngữ và ctv (2015) cũng chỉ ra có mối liên hệ giữa gene NPY với tínhtrạng sản lượng trứng trên gà Nòi ở vùng đồng bằng Sông Cửu Long Gà mái được nuôitheo phương thức cá thể và theo dõi số trứng đẻ ra trong 20 tuần Nghiên cứu đã nhận diệnđược 2 kiểu allen và 3 kiểu gen tại locus NPY/Dral

2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu của Dumn và ctv (2004) trên giống gà Scotland đã cho thấy điểm độtbiến trên gen NPY tại vị trí cắt của enzyme Dral mang ảnh hưởng đáng ké lên tuổi đẻ quảtrứng đầu tiên Kiểu gen di hợp tử (+/-) có tuổi đẻ quả trứng đầu tiên sớm nhất là 189,4ngày so với hai kiêu gen đồng hợp tử là (+/+) 198,0 ngày và (-/-) 193,8 ngày

Kết quả nghiên cứu đa hình gen NPY của Xu va ctv (2011a) tại hai vị trí 131391359D(indel 4 nucleotide) và C31394761T (SNP) đã chỉ ra mối quan hệ giữa đa hình của gen NPY

và tuôi đẻ quả trứng đầu tiên ở gà bản địa tại Quảng Đông — Trung Quốc

Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy gen neuropeptide Y ảnh hưởng đến các tínhtrạng năng suất của các giống gà trên thé giới Theo kết quả công bố của Fatemi va ctv(2012) cũng cho thấy có mối tương quan giữa gene WPY và các tính trạng sinh sản cũngnhư khả năng sinh trưởng của nhiều giống gà Nghiên cứu của El Halawami và ctv (2000)

đã chứng minh rằng tiêm hormone neuropeptide Y cho gà 25 và 54 tuần tuôi dẫn đến tăngsản lượng trứng Như vậy, gen neuropeptide Y có thê được xem như chi thị phân tử dé hỗtrợ chọn lọc nâng cao một số tính trạng sinh sản trên gà

Hiện tại, các nghiên cứu về đa hình gen øeuzopepfide Y liên quan đến các tínhtrạngsản xuất trên các giống gà chưa được tiễn hành rộng rai trong nước, đặc biệt trên đối tượng

gà Hắc Phong Vì vậy, nghiên cứu này tập trung phân tích đa hình gen neuropeptide Y vàảnh hưởng đa hình gen đến một số tính trạng sản xuất trứng ở giống gà Hắc Phong nhằm

tạo cơ sở dữ liệu đáp ứng cho nhu câu chọn tạo các giông gà nuôi sau này.

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

3.2.

Dia diém thuc hién: Dé tai duoc thuc hién tai Phòng thí nghiệm Công nghệ Phôi

Động vật - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường; Khoa Khoa học Sinh học

- Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Địa chỉ: Khu phố 6, Phường Linh Trung, TP Thủ Đức, TP Hồ Chí Minh Thời gianthực hiện: Từ thang 7/2022 đến thang 11/2022

Vật liệu nghiên cứu

Gà Hắc Phong được nuôi tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển chăn nuôi gia cầmVIGOVA (Phân viện chăn nuôi Nam Bộ - Viện chăn nuôi) trong cùng một điều kiện chăm

sóc và nuôi nhốt (khẩu phần ăn, nước uống, chuồng trai, ) Tổng số 398 mẫu máu ga được

thu nhận từ 398 cá thé khác nhau bằng phương pháp lay máu từ tĩnh mạch cánh Mau máuđược chuyên vào ống nghiệm chống đông máu chứa EDTA, bảo quản trong thùng chứa đágel dé vận chuyên về phòng thí nghiệm và được bảo quản trong tủ âm sâu ở -30°C cho đến

khi sử dụng.

Py | | tae ee arte geervaee re pares

xaw

10

3.2.1 Ly trích DNA tổng số từ mẫu máu

Thiết bi được sử dụng: máy ly tâm (Eppendorf, Đức), máy Votex và bổn ủ nhiệt détách chiết DNA, may đo OD NanoBioDrop (BioDrop — Anh) dé định lượng DNA đã lytrích, máy điện di và máy chụp gel GelDoc It2 dé đánh giá chất lượng DNA sau ly trích

Tổng số 398 mẫu máu gà sau khi được lay ở trang trại mang về phòng thí nghiệm vàđược tách chiết DNA tổng số bằng bộ kit TopPURE ® blood DNA exctraction (ABT - ViệtNam) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, gồm các bước:

Bước 1: Hút 200 uL BL Buffer cho vào eppendorf 1,5 mL.

Bước 2: Lan lượt cho 20 pL máu toàn phan và 180 pL PBS Buffer vào eppendorf1,5 mL chứa sẵn BL Buffer Tiếp tục thêm vào 20 uL Proteinase K, trộn đều hỗn hợp bằngmáy vortex sau đó ủ mẫu trong bồn ủ ở 72°C trong 10 phút

Bước 3: Thêm 200 pL Ethanol (96 — 100%), trộn đều và chuyên hỗn hợp sang cộtsilica đặt sẵn trong eppendorf 2 mL Tiến hành ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong | phút.Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

Bước 4: Đặt lại cột vào eppendorf 2 mL cũ Thêm 500 uL WBI vào cột, tiễn hành

ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

Bước 5: Đặt lại cột vào eppendorf 2 mL cũ Thêm 500 uL WB2 vào cột, tiến hành

ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dưới

Bước 6: Dat lại cột vào eppendorf 2 mL cũ, ly tâm ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút

11

DNA tổng số tiếp tục được đánh giá chất lượng bằng phương pháp điện di trên gelagarose 1% với thang chuẩn 100 bp ở hiệu điện thế 100 V trong 15 phút Quan sát vàchụpảnh kết quả điện di bằng máy chụp gel GelDoc It2.

3.2.2 Primer

Cặp primer được sử dụng trong đề tài cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mụctiêu có kích thước 252 bp (khi không có đột biến)/248 bp (khi xảy ra đột biến mất 4nucleotide) (Xu va ctv, 2011a) Thông số của cặp primer được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Thông số cặp primer sử dụng cho đề tài

Kíchthước GC Tm Primer Trình tự (5’-3’) (Nu) (%) (°C) Vi tri

IRR TOE oA NO oT) ve INO ROT ` ES) Re er) ro SOON CS A 5 " +

Hình 3.2 Vị trí của cặp primer được kiểm tra bằng phần mềm BLAST

Từ kết quả Hình 3.1 cho thấy, vi trí của đoạn gen mục tiêu được khuếch đại từ Nu

số 415-666 phù hợp với kết quả nghiên cứu của Dunn và ctv (2004)

3.3.1 Khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

Thiết bị sử dụng: máy luân nhiệt Thermal Cycler Bioer (Bioer - Trung quốc), máy

điện di, máy chụp gel GelDoc I2.

Hóa chat sử dụng cho phản ứng PCR: bộ kit MyTaqTM Mix 2X (Bioline — Anh),H:O nuclease-free (Bioline — Anh) Hóa chất điện di: Agarose (Bioline — Anh), GelRed 6X

(TBR), ladder 100 bp (Thermo Scientific — My), dung dịch đệm TAE 50X (Viét Nam).

Phan ứng PCR có tổng thé tích là 12,5 wl, gồm các thành phan được trình bay ở Bang

3.2.

Bảng 3.2 Thành phan phan ứng PCR

Thanh phan Thé tich (ul)

MyTaqTM Mix 2X 6,25

Primer xuôi 0,4 (10 pmol/H])

Primer ngược 0,4 (10 pmol/l)

DNA 1 (10 ng/u)

H20 nuclease-free 445

Tổng thể tích 12,5Phan ứng khéch dai doan gen mục tiêu được thực hiện ở nhiệt độ bắt cặp là 56°C,gồm các giai đoạn được trình bày ở Bảng 3.3

Bang 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiêt độ Thời gian Số chu kì

Tiền biến tính 95°C 3 phut |

Biến tính IC 30 giây

Bat cap 56°C 30 giây 35

Kéo dai 72°C 30 giây

Hậu kéo dài THC 7 phút 1

13

Các sản phẩm khuếch đại được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose1,5 % với hiệu điện thế 100 V trong 30 phút bao gồm 11 giếng chứa sản phẩm khuếch đại;

1 giếng đối chứng âm (sản phâm khuếch đại của thành phan phan ứng mà DNA mẫu đượcthay thế bằng HzO nuclease-free) và 1 giếng thang chuẩn (ladder) 100 bp (ThermalScientific — Mỹ) Các mẫu được bơm giếng với tông thé tích là 4 ul gồm 1 wl GelRed(phaloãng về nồng độ 0,6X) và 3 ul sản phâm khuếch đại Giếng chứa thang chuẩn (ladder) gồm

2 pl ladder và 2 ul GelRed (0,6X) Quan sát và chụp hình ảnh kết quả điện di bằng may

GelDoc l2.

Bên cạnh đó, sản phẩm PCR bắt kỳ được gửi đi giải trình tự dé kiểm tra độ đặc hiệu

cua primer.

3.3.2 Nhận diện và phân tích đa hình gen bang enzyme cắt giới han

Thiết bị được sử dụng: bồn ủ nhiệt, máy điện di và máy chụp gel GelDoc It2 (UVP,

USA).

Hóa chat sử dụng cho phản ứng phân cắt: Enzyme Dral (BioLab — Anh) Hóa chất

điện di: Agarose (Bioline — Anh), GelRed 6X (TBR), ladder 100 bp (Thermo Scientific —

My), dung dich dém TAE 50X (Viét Nam).

Enzyme Dral (Biolab — Anh) được sử dụng dé thực hiện phan ứng phân cắt sản

phẩm khuếch đại theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kích thước dự kiến của sản phẩm sauphân cắt và quy ước kiểu gen được trình bày ở Bảng 3.4

Bảng 3.4 Kích thước dự kiến của sản phẩm phân cắt và quy ước kiểu gen của gen NPY

Enzyme Nhiệtđộủ(°C) Kích thước sản phẩm (bp) Kiểu gen

Bảng 3.5.

14

Bang 3.5 Thanh phan phản ứng phân cat sản phâm khéch đại bằng enzyme Dral

Thanh phan Thể tích (ul)

100 bp (Thermal Scientific — Mỹ) với hiệu điện thé 100 V trong 40 phút Các mẫu đượcbơm vào giếng với tông thể tích là 4 ul gồm 1 pl GelRed (pha loãng về nồng độ 0,6X) va

3 yl sản phẩm sau phân cat Giếng chứa thang chuẩn (ladder) gồm 2 pl ladder và 2 ulGelRed (0,6X) Quan sát và chụp hình ảnh kết quả điện di dé tiễn hành xác định kiểu genbằng máy GelDoc I2

Các mẫu sản phẩm phân cat đại điện cho các kiểu gen được gửi đi giải trình tự déxác định điểm đột biến cũng như vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn trên đoạn gen mục tiêu.3.3.3 Phân tích ảnh hưởng của đa hình gen đến năng suất trứng của gà

Thu thập số liệu về khối lượng cơ thé gà 19 tuần tuổi (trước khi vào đẻ) và năng suấttrứng của gà Hắc Phong được thu nhận ở tuần tuổi 38 tuôi và đánh giá ảnh hưởng kiểu genđến chỉ tiêu năng suất trứng Gà Hắc Phong được nuôi trong cùng một điều kiện chăm sóc

và nuôi nhốt (khẩu phần ăn, nước uống, chuồng trại, ) tại Trung tâm Nghiên cứu và Pháttriển chăn nuôi gia cam VIGOVA (Phân viện chăn nuôi Nam Bộ - Viện chăn nuôi)