Trong biện pháp đấu tranh sinh học, trichoderma được sử dụng nhiều vì chúng vừa có khả năng tiết độc tố vừa có thể ký sinh trực tiếp trên các nấm gây bệnh nguy hiểm cho nhiều loại cây t
NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP
NỘI DUNG
- Thu thập nấm Trichoderma từ các địa phương
- Thử nghiệm tính đối kháng của các chủng nấm Trichoderma đã thu thập với một số nấm bệnh như Fusarium, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii
- Chọn một chủng nấm Trichoderma để nhân sinh khối trên môi trường mạt cưa phế thải sau khi nuôi nấm ăn
- Thử nghiệm chế phẩm Trichoderma để phòng trừ bệnh trên cây ăn quả.
VẬT TƯ, HÓA CHẤT
Sử dụng môi trường đơn giản, phổ biến dùng để nuôi nấm PGA, PDA
2.2.2 Môi trường lên men xốp
- Mạt cưa phế thải sau khi trồng nấm
Nấm Trichoderma được thu thập ở nhiều vùng khác nhau
2.4 Các nấm bệnh nghiên cứu tính đối kháng
Nấm Fusarium gây héo rũ cho cây cà chua, trong khi nấm Sclerotium gây lở cổ rễ trên các loại rau quả, và nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn Tất cả các loại nấm này đã được phân lập từ mẫu bệnh và hiện đang được lưu giữ tại phòng thí nghiệm Sinh học thuộc Trung Tâm nghiên cứu và phát triển nông dược của Công ty thuốc sát trùng Việt Nam.
PHƯƠNG PHÁP
3.1 Phân lập nấm Trichoderma ngoài tự nhiên
STT KYÙ HIEÄU NÔI LAÁY MAÃU
2 T.2 TP.Hồ Chí Minh - Hóc Môn (tháng 3 - 2005)
3 T.3 TP.Hồ Chí Minh - Gò Vấp (tháng 1 - 2005)
4 T.4 TP.Hồ Chí Minh - Thủ Đức (tháng 1 - 2005)
5 T.5 Giống có nguồn gốc Ấn Độ
Thu lấy mẫu đất hoặc tàn dư thực vật ngoài đồng ruộng
Cho 5 gram hạt thóc nẩy mầm đã nấu chín vào dĩa petri Đem hấp khử trùng ở 120 o C – 1 atm – 30 phút Để nguội Sau đó bổ sung 1 cc dung dịch
Cho mẫu thu thập (1 g) vào dĩa petri trên Hạt thóc sẽ là bẫy mồi cho nấm phát triển
Sau 3 - 7 ngày ủ trong hộp, phân loại chọn tìm Trichoderma Tách riêng bào tử Trichoderma vào ống nghiệm chứa môi trường PDA + 0,01 % streptomycin Tiếp tục, cấy chuyền vào ống nghiệm cho đến khi có được
3.2 Thử nghiệm tính đối kháng với nấm bệnh
Trong mối quan hệ tương tác giữa các vi sinh vật, một loài có thể kiểm soát và điều chỉnh số lượng quần thể của những loài khác thông qua cơ chế đối kháng hoặc cạnh tranh.
Rót môi trường PGA vào dĩa petri, để nguội 24 h
Kẻ đường kính dưới đáy đĩa petri và cấy nấm đối kháng Trichoderma cùng với nấm bệnh cách nhau 5 cm Nấm bệnh và Trichoderma cần được nuôi trên môi trường PGA từ 2 đến 5 ngày trước khi thực hiện thí nghiệm (Rhizoctonia và Sclerotium 2 ngày, Trichoderma và Fusarium 5 ngày) Sử dụng khoan có đường kính 5 mm đã được khử trùng bằng cồn để lấy mẫu nấm, sau đó dùng que cấy tròn chuyển thỏi nấm sang đĩa petri thử nghiệm, đảm bảo bề mặt khuẩn ty tiếp xúc với mặt thạch.
Bảo quản ở nhiệt độ phòng (28 o C), theo dõi nấm phát triển
3.2.3 Cơ sở đánh giá tính kháng của nấm Trichoderma sau 7 ngày nuôi cấy
Phần nấm Trichoderma phát triển bao phủ qua phần nấm gây hại
Phần nấm gây hại bị bào mòn dần ở mép khuẩn lạc và tạo các vùng phân giải (phân huỷ dần các sợi nấm gây bệnh)
Phần nấm Trichoderma phát triển và khống chế làm cho phần nấm gây hại không phát triển được
Chúng tôi phân loại tính kháng ở các mức:
- Kháng mạnh: nấm Trichoderma tấn công và phân huỷ hoàn toàn nấm gây hại, ký hiệu +++ (hình 3.2.3a)
- Kháng trung bình: nấm Trichoderma tấn công và phân hủy một phần nấm gây hại, ký hiệu ++ (hình 3.2.3b)
- Kháng yếu: nấm Trichoderma ngăn chặn sự phát triển của nấm gây hại, ký hiệu + (hình 3.2.3c)
- Không kháng: nấm gây hại gần như phát triển bình thường, xâm nhập vào vùng phát triển của nấm Trichoderma, ký hiệu - (hình 3.2.3d)
Hình 3.2.3 minh họa cách đánh giá tính kháng của Trichoderma trên đĩa petri với các loại nấm gây bệnh Kết quả cho thấy Trichoderma có khả năng kháng mạnh với các loại nấm gây bệnh (+++), kháng trung bình (++) và kháng yếu (+) Ngoài ra, cũng có trường hợp Trichoderma không kháng với một số loại nấm gây bệnh (-).
3.3 Thử nghiệm nhân sinh khối nấm Trichoderma trên mạt cưa thải 3.3.1 Các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm
3.3.1.1 Bảng 2.1: Ảnh hưởng của cám gạo đến sự phát triển của nấm
- Thu các bịch mạt cưa phế thải sau khi trồng nấm, đem nghiền vụn
- Cân cám và mạt cưa theo tỷ lệ cho vào một thẩu thủy tinh
- Cho nuớc vào thẩu chứa cám và mạt cưa trên, trộn đều Độ ẩm môi trường cần đạt 80% (trung bình 20 cc nước / 100 g môi trường)
- Sau khi môi trường được trộn đều sẽ được phân vào bình tam giác (100 cc / 1 bình) và đem hấp khử trùng ở 121 o C – 1 atm – 30 phút
- Cấy nấm Trichoderma vào bình tam giác trên Mỗi bình 3 khoanh nấm Trichoderma ( = 5 mm) Lắc nhẹ bằng tay, sau đó để yên theo dõi sự phát triển của nấm
3.3.1.2 Bảng 2.1: Nồng độ Ure ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm
NGHIỆM THỨC TỶ LỆ CÁM GẠO VÀ MẠT CƯA
2 1 phần cám : 1 phần mạt cưa
3 1 phần cám : 2 phần mạt cưa
4 1 phần cám : 3 phần mạt cưa
NGHIỆM THỨC MÔI TRƯỜNG NỒNG ĐỘ CỦA URE
Mạt cưa phế thải + cám
Thao tác thực hiện tương tự như phần 3.3.1.1, nhưng môi trường được chọn lọc theo tỷ lệ phù hợp từ kết quả thử nghiệm Nước được sử dụng trong môi trường là dung dịch Ure với nồng độ nhử treõn.
3.3.2 Công thức tính số lượng bào tử
Mẫu nghiên cứu là chất đặc
Chuẩn bị hai bình nón 250 cc vô trùng: bình 1 chứa 99 cc nước cất vô trùng và bình 2 không chứa gì Cân 1 g mẫu và cho vào cốc vô trùng, sau đó thêm một ít nước từ bình 1 và nghiền mẫu cho nát Dùng nước ở bình 1 để chuyển toàn bộ mẫu sang bình 2, lắc đều trong 5 phút và để lắng trong 30 giây Tiếp tục pha loãng mẫu với tỷ lệ từ 1/10 đến 1/1000.
- a : số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô con)
- b : số ô con trong 5 ô lớn (80 ô con)
- 10 3 : số chuyển mm 3 thành ml (1000 mm 3 = 1 ml)
THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM TRICHODERMA PHÒNG TRỪ BEÄNH THOÁI REÃ DO NAÁM PHYTOPHTHORA PALMIVORA TREÂN CAÂY SAÀU RIEÂNG
Giống cây: Sầu riêng cơm vàng hạt lép Ri 6 Địa điểm khảo nghiệm: Vườn ươm cây Trung tâm BVTV phía Nam
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức xử lý gồm 10 cây Những cây này được chuẩn bị để xuất khỏi vườn ươm và trồng ngoài đồng, với đường kính gốc ghép đạt 2,5 cm và đường kính cành mắt ghép là 1,2 cm.
4.2 Bảng 2.3: Công thức thử nghiệm
Nấm Phytophthora được nuôi trong phòng thí nghiệm trên môi trường PDA, với mỗi bầu cây giống chứa 4 mẫu thạch nấm (1 cm²) được đặt ở 4 hướng dưới đáy bầu Mỗi bầu cây giống được bổ sung 0,8 kg hỗn hợp phân và chế phẩm Trichoderma theo công thức đã định, sau đó được đổ đất để ươm cây như phương pháp truyền thống của nông dân Cần tưới nước cho cây mỗi ngày một lần để đảm bảo sự phát triển.
NGHIỆM THỨC LIỀU LƯỢNG CÁCH XỬ LÝ / CÂY
40 kg phân heo hoai mục 0,8 kg hỗn hợp phân chuồng và chế phẩm cho mỗi giá thể caây con gioáng Chuûng naám
Phytophthora ngay khi xử lý cheỏ phaồm
40 kg phaõn heo hoai muùc
40 kg phaõn heo hoai muùc
D 0,2 kg Trichoderma 20 g Trichoderma / baàu Đối chứng 1 Phân chuồng hoai 0,8 kg phân chuồng Đối chứng 2 Không phân chuồng
KẾT QUẢ
PHÂN LẬP NẤM
1.1 Mô tả nấm Trichoderma đã phân lập
Khuẩn lạc tròn mọc trên môi trường, ban đầu có màu trắng và chuyển dần sang màu xanh lá sậm sau khoảng 3 ngày Khuẩn ty phát triển nhanh chóng và dễ dàng nhận biết giai đoạn tạo bào tử qua những đốm li ti màu xanh xuất hiện.
Mẫu Trichoderma từ số 1 – 5 không tiết sắc tố vào môi trường
Mẫu Trichoderma số 6 thì tiết sắc tố vàng vào môi trường
Khuẩn ty là loại vi sinh vật không có tế bào chung với nhiều nhân (cộng bào) và có vách ngăn rõ ràng Đính bào tử của khuẩn ty không mọc thành bó hoặc trong quả thể, mà cành đính bào tử phân nhánh không đều, không có màu sắc và không mọc theo vòng Đính bào tử có hình dạng cầu, không màu, mọc ở đỉnh với vách trơn, không có gai.
Do không đủ thời gian và điều kiện, chúng tôi đã chọn ngẫu nhiên mẫu T.3 để nhân sinh khối và phân loại Mẫu T.3 được xác định là Trichoderma harzianum, theo tài liệu "Illustrated Genera of Imperfect Fungi" của H L Barnett, Ph.D và "Introduction to Food-borne Fungi" của Robert A Samson, Ellen S Hoekstra, Jens C.
• Division of sub-phylum: Eumycetes
THỬ NGHIỆM TÍNH ĐỐI KHÁNG
2.1 Thử nghiệm tính đối kháng với nấm Rhizoctonia solani
2.1.1 Bảng 3.1: Theo dõi sự phát triển của nấm Trichoderma và Rhizoctonia treõn ủúa petri
BÁN KÍNH NẤM PHÁT TRIỂN (mm)
Trong nghiên cứu theo dõi sự phát triển của nấm Rhizoctonia solani và Trichoderma trên dĩa pétri, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các chủng nấm thu được đều thể hiện tính đối kháng cao với Rhizoctonia solani sau 1 đến 7 ngày cấy Đặc biệt, chủng T6 cho thấy có ít bào tử hình thành hơn so với các chủng khác.
Sau 1 ngày cấy chuyền: Nấm Rhizoctonia solani và nấm Trichoderma phát triển bình thường, khuẩn lạc cả 2 nấm tròn đều, màu trắng
Sau 2 ngày cấy chuyền: Khuẩn lạc 2 nấm Rhizoctonia solani và
Trichoderma đã tiếp giáp nhau trên đường kính dĩa petri
Sau 3 ngày cấy chuyền: Nấm Rhizoctonia solani không còn phát triển khuẩn ty về phía có nấm Trichoderma nhưng vẫn có khả năng tạo hạch nấm ở hướng ngược lại Trong khi đó, nấm Trichoderma đã tạo được bào tử (khuẩn lạc có màu xanh) và khuẩn ty vẫn phát triển vào bên trong khuẩn lạc nấm
Sau 7 ngày cấy chuyền: Nấm Trichoderma hoàn toàn chiếm ưu thế trên dĩa petri và bào tử Trichoderma mọc trùm lên trên hạch nấm Rhizoctonia solani
2.2 Thử nghiệm tính đối kháng với nấm Sclerotium rolffsii
2.2.1 Bảng 3.2 : Theo dõi sự phát triển của nấm Trichoderma và Sclerotium treân dóa petri
Trong nghiên cứu về sự phát triển của nấm Sclerotium rolfsii và Trichoderma trên dĩa pétri từ 1 đến 7 ngày sau khi cấy, chúng tôi nhận thấy rằng các mẫu T1, T2, T3, T4 và T5 đều thể hiện tính đối kháng mạnh mẽ đối với nấm Sclerotium, trong khi mẫu T6 chỉ cho thấy tính đối kháng yếu.
Sau 1 ngày cấy chuyền: Nấm Slerotium rolffsii và nấm Trichoderma phát triển bình thường, khuẩn lạc cả 2 nấm tròn đều, màu trắng
Sau 2 ngày cấy chuyền: Khuẩn lạc 2 nấm Sclerotium rolffsii và
Trichoderma vẫn phát triển đều Trong đó khuẩn lạc nấm Trichoderma phát triển mạnh và lớn hơn nấm Sclerotium rolffsii
BÁN KÍNH NẤM PHÁT TRIỂN ( mm )
Sau 3 ngày cấy chuyền: Nấm Sclerotium rolffsii và Trichoderma đã tiếp gíap nhau, tại phần tiếp giáp khuẩn ty nấm Sclerotium có khuynh hướùng mọc dầy hơn Khảo sát hiển vi sợi khuẩn ty tại vị trí này, chúng tôi thấy khuẩn ty phân chia nhiều nhánh ngắn Những ngày kế tiếp, khuẩn ty tại nơi tiếp giáp khô dần và chết Tuy nhiên hạch nấm Sclerotium vẫn có khả năng hình thành vào ngày thứ 7 (về phía thành dĩa petri) Chỉ riêng có T6 là ngưng phát triển và có thể bị nấm Sclerotium lấn lướt sau 7 ngày
2.3 Thử nghiệm tính đối kháng với nấm Fusarum oxysporium
2.3.1 Bảng 3.3 : Theo dõi sự phát triển của nấm Trichoderma và Fusarium trên dóa petri
BÁN KÍNH NẤM PHÁT TRIỂN ( mm )
Nghiên cứu sự phát triển đồng thời của nấm Fusarium oxysporum và Trichoderma trên đĩa pétri cho thấy rằng, từ ngày thứ nhất đến ngày thứ bảy sau khi cấy, các mẫu T1, T2, T3, T4 và T5 thể hiện tính đối kháng cao đối với nấm Fusarium.
Từ 1 đến 3 ngày sau khi cấy: Nấm Fusarium và Trichoderma phát triển bình thường, khuẩn lạc Fusarium oxysporium có màu hồng, khuẩn lạc nấm
Trichoderma có màu trắng, sau đó ngã dần sang xanh
Bốn ngày sau khi cấy: Nấm Trichoderma phát triển đầy dĩa petri, bao tròn khuẩn lạc nấm Fusarium
Từ 5 đến 7 ngày sau khi cấy: Nấm Trichoderma mọc dần lên trên khuẩn lạc Fusarium, điển hình nhất là ở T6.
THỬ NGHIỆM NHÂN SINH KHỐI
3.1 Thử nghiệm bổ sung cám gạo trong môi trường mạt cưa nuôi naám Trichoderma
3.1.1 Bảng 3.4 : Ảnh hưởng của cám gạo đến mật độ bào tử trên môi trường nuoâi Trichoderma
MẬT ĐỘ BÀO TỬ (sau 7 ngày) Mật độ trung bình
Thử nghiệm bổ sung cám gạo vào môi trường mạt cưa nuôi nấm
Trichoderma, sau 7 ngày chúng tôi nhận thấy:
- Nếu môi trường chỉ có mạt cưa không bổ sung cám gạo thì lượng bào tử hình thành rất kém
Việc bổ sung cám gạo vào môi trường mạt cưa dẫn đến sự gia tăng đáng kể mật độ bào tử Đặc biệt, tỷ lệ mạt cưa và cám gạo là 3:1 mang lại mật độ bào tử cao nhất, đạt 13,5 x 10^8.
3.2 Ảnh hưởng của Ure đến sự hình thành bào tử
3.2.1 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của Ure đến sự hình thành bào tử
Thử nghiệm bổ sung Ure vào môi trường nuôi Trichoderma sau 7 ngày chúng tôi nhận thấy:
Môi trường kết hợp mạt cưa và cám với tỷ lệ 3:1, khi được bổ sung Ure, sẽ ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử Cụ thể, nếu nồng độ Ure trong nước trộn môi trường đạt 1 g/lít, mật độ bào tử sẽ cao hơn so với việc chỉ sử dụng nước thường.
MẬT ĐỘ BÀO TỬ (sau 7 ngày) Mật độ trung bình (bào tử/g)
Tuy nhiên nếu tăng lượng ure đến 2 g / lít hoặc 3 g / lít trong nước trộn thì mật độ bào tử có khuynh hướng giảm.
THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM TRICHODERMA TRỪ BỆNH THOÁI REÃ TREÂN CAÂY SAÀU RIEÂNG DO NAÁM
4.1 Bảng 6 : Tyû lệ cây chết hẳn sau khi xử lý 45 ngày, 60 ngày (%)
Trong cùng một cột các số có cùng chữ cái theo sau thì không khác biệt ở mức có ý nghĩa 5 % bởi phép thử Duncan Cv % = 13,4 – 9,0
Sau 45 ngày nhiễm nấm bệnh và xử lý Trichoderma: Ơû hầu hết các nghiệm thức đều có cây bị chết, tỷ lệ cây chết ở các nghiệm thức có xử lý
Trichoderma đều rất thấp so với nghiệm thức chỉ bón phân chuồng và nghiệm thức không bón phân
THỨC LIỀU LƯỢNG 45 ngày sau khi xử lý
60 ngày sau khi xử lý
40 kg phaõn heo hoai muùc 10, 00 c 10, 00 c
40 kg phaõn heo hoai muùc 10, 00 c 10, 00 c
40kg phaõn heo hoai muùc 10, 00 c 10, 00 c
D 0,2 kg Trichoderma 10, 00 c 10, 00 c Đối chứng 1 Phân chuồng hoai 20, 00 b 20, 00 b Đối chứng 2 không phân chuồng 46, 66 a 96, 66 a
Sau 60 ngày xử lý: Ơû nghiệm thức có xử lý Trichoderma và nghiệm thức có bón phân chuồng thì tỷ lệ cây chết không gia tăng Trong khi đóù nghiệm thức không có phân chuồng, không có Trichodrema thì thì lệ chết tăng cao 96,66 %.
HÌNH ẢNH THỬ NGHIỆM
GAÂY BEÄNH TREÂN CAÂY SAÀU RIEÂNG
HÌNH 5.2: CÁC NÒI NẤM TRICHODERMA THU THẬP ĐƯỢC
HÌNH 5.3: NAÁM RHIZOCTONIA SOLANI GAÂY BEÄNH KHOÂ VAÈN
HÌNH 5.4: NẤM SCLEROTIUM ROLFSII GÂY BỆNH LỞ CỔ RỄ
HÌNH 5.5: NAÁM FUSARIUM OXYSPORUM GAÂY BEÄNH HEÙO RUÕ,
HÌNH 5.6: THỬ NGHIỆM TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA TRICHODERMA VÀ NẤM BỆNH FUSARIUM SP (SAU 7 NGÀY)
HÌNH 5.7: THỬ NGHIỆM TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA TRICHODERMA VÀ NẤM BỆNH SCLEROTIUM (SAU 4 NGÀY)
HÌNH 5.8: THỬ NGHIỆM TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA TRICHODERMA VÀ NẤM BỆNH SCLEROTIUM (SAU 7 NGÀY)
HÌNH 5.9: THỬ NGHIỆM TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA TRICHODERMA VÀ NẤM BỆNH RHIZOCTONIA (SAU 4 NGÀY)
HÌNH 5.10: THỬ NGHIỆM TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA TRICHODERMA VÀ NẤM BỆNH RHIZOCTONIA (SAU 7 NGÀY)
HÌNH 5.11: THỬ NGHIỆM QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHỐI TRICHODERMA TỪ NGUỒN MẠT CƯA PHẾ THẢI
HÌNH 5.12: THỬ NGHIỆM QUÁ TRÌNH NHÂN SINH KHỐI TRICHODERMA TỪ NGUỒN MẠT CƯA PHẾ THẢI
