Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập, định danh và tuyển chọn các dòng vi khuẩn Rhizobia có khả năng kích thích nảy mầm, tăng trưởng ở quy mô phòng thí nghiệm

TÓM TẮTĐề tài được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn Rhizobia có khả năng kích thích nảy mầm, tăng trưởng trên cây họ đậu.. Do đó, đề tài “Phân lập, định danh và tu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO _TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ TUYẾN CHỌN CAC DONG

VI KHUẨN Rhizobia CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH

NAY MAM, TANG TRƯỞNG Ở QUY MO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ TUYẾN CHỌN CÁC DÒNG

VI KHUAN Rhizobia CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH

NAY MAM, TANG TRƯỞNG Ở QUY MO

PHONG THÍ NGHIEM

Hướng dẫn khoa hoc 1g ( Sinh viên thực hiện

TS Nguyễn Quang Vĩnh

ThS Đào Uyên TrânĐa ]j/( — —

Bùi Hoàng Nguyễn

TP Thú Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Dé hoàn thành dé tài luận văn một cách hoàn thiện nhât, em đã nhận được rat nhiêu sự

chỉ dạy và giúp đỡ tận tình của các Thay/C6, Anh/Chi và Bạn bè.

Đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại họcNông Lâm TP Hồ Chí Minh, các Thầy/Cô thuộc Khoa Khoa học Sinh học, Viện nghiên

cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện cho em được học tập và truyền

đạt những kiến thức hữu ích dé làm nền tảng trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin cảm ơn đến các Anh/Chị tại phòng Nghiên cứu, Chi nhánh Trung tâm Nghiêncứu - Phát triển, Công ty cô phần Phân bón Dầu Khí Cà Mau

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Quang Vinh đã tận tình

hướng dẫn, giảng dạy và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành khóa luận này Emxin cảm ơn ThS Đào Uyên Trân Da đã nhiệt tình hỗ trợ và chỉ bảo em trong suốt quá

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Bùi Hoàng Nguyễn, MSSV: 19126116, Lớp: DH19SHA (Số di động:

0373809977, Email: 19126116@st-hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh học

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: đây là khóa luận do bảnthân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu va thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trungthực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng về những cam

Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 thang 07 năm 2023

Người viet cam đoan

BÙI HOANG NGUYEN

il

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn Rhizobia

có khả năng kích thích nảy mầm, tăng trưởng trên cây họ đậu Vi khuẩn từ mẫu nốt san

ở rễ cây họ đậu tại Đồng Tháp, Cần Thơ và Đồng Nai được chọn lọc trên môi trường

YMCA Thông qua định danh, 15/39 dòng vi khuẩn Gram âm với hình thái khuẩn lạckhác nhau được xác định thuộc nhóm Rhizobia so với dữ liệu gen NCBI Đặc tính sinh

lý - sinh hóa của 15 dòng Rhizobia được khảo sát với các đánh giá bao gồm: khả năngchịu mặn, chiu nhiệt, điều kiện pH, khả năng tạo axit/kiém và sử dụng đường glucose.Bên cạnh đó, khả năng tông hợp các hoạt chat sinh học như IAA và siderophores của 15dòng Rhizobia cũng được đánh giá Hai dòng vi khuẩn có khả năng tông hợp IAA vàsiderophores cao nhất lần lượt là dong M-18 (Rhizobium vallis - IAA 118,21 pg/ml và

dong M-56 (Rhizobium miluonense - 93,07 % SU) Ngoai ra, cac dong Rhizobia khong

có sự khác biệt về kích thích nay mam ở đậu xanh nhưng có sự khác biệt ở đậu nành,đặc biệt là dòng Ensifer adhaerens (M-3, M-4 và M-5) Thêm vào đó, hau hết tat cả cácdòng Rhizobia đều có khác biệt ý nghĩa so với đối chứng về sự kích thích tăng trưởngchiều dai thân và rễ ở cây đậu xanh sau 7 ngày Một số dòng có kích thích sinh trưởngkhác biệt ở cả thân và rễ thuộc loài Ensifer sp., Ochrobactrum sp và Pseudomonas sp.

cho thấy khả năng kích tích chiều dai than trong khi Rhizobium sp kích thích phát triển

rễ ở cây đậu xanh.

Từ khóa: Rhizobia, cây họ đậu, hoạt chat sinh học, IAA, siderophores, nay mam, tăng

trưởng.

This study aimed to isolate and select Rhizobia strains that have the ability to increase the germination and growth of legume plants The bacteria from root nodule samples of leguminous plants in Dong Thap, Can Tho and Dong Nai provinces were selected on YMCA medium There were 15/39 Gram-negative bacteria strains with different colony morphology were identified as the Rhizobia group in comparison with the NCBI gene database The physiological and biochemical characteristics of

15 Rhizobia strains were investigated including salt tolerance, heat tolerance, various

pH conditions, acid/alkali production, and glucose utilization The ability to produce biologically active compounds such as IAA and siderophores of 15 Rhizobia strains was also explored Two isolated strains with the highest ability to produce JAA and siderophores were M-18 (Rhizobium vallis - IAA 118.21 pg/ml) and M-56 (Rhizobium miluonense - 93.07% SU), respectively The Rhizobia strains indicated no significance

in germination increase of mung bean seeds but there were noteworthy differences in soybean seeds, especially Ensifer adhaerens strains (M-3, M-4, and M-5) Most of the Rhizobia strains had significant differences compared with the control treatments in the increase of stem and root length growth in mung beans after 7 days of treatment Some strains showed a sharp increase in growth of stem and root lengths such

as Ensifer sp and Ochrobactrum sp strains Pseudomonas sp strains revealed the ability to increase stem length while Rhizobium sp grew the root length in mung beans.

Keywords: Rhizobia, legume plants, biologically active compounds, IAA, siderophores, germination, growth.

IV

JR TK — TS -ẶẰằĂẶằẶẪ—Ặ—ằẶẴẴÑ—TằẴTẶTẮằẴằẶẴẶẴẨẴẨẴẴằẴằẶằẶẴẶẪẰẴÑR——— 1

1.2 Me tiêu ñiØh1Êh CUT se Sktinis 12016651 6451050 18 30 160006 aacnenaren cers SE 1238 ann 21155 Cố: 29g50-3880g010 2

L3 NOI Ui HUG HIẾN: ssoaseouesiebsiibdsbssssgissesetilgslgtdg3Q98|SSSERSERGGS.SHSSISENGES-SIDHEHGESE3iG8 2

Clee TOG QUA TẤT TIẾTU «-eseeeseeenngEEgHH-nhghnig402 00070 820003600000 iat 32.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn ÑÖizobia -2222-52252222222S22E22Ec2E2zxcrxrzrree 32.1.1 Phân loại nhóm vi khuẩn cố định đạm 2-2 22 2SE+SE2E££E£EE2E£E2E22EZEzExze, 32.1.2 Phân loại vi khuẩn ÄjizØbia 5252-52 522222E2E22E2212152322121121221211212112121 2 xe 42.1.3 Đặc điểm sinh ly, sinh hóa và hình thành nốt san của vi khuẩn Rhizobia 52.1.4 Hình thai khuẩn lac của vi khuẩn RIIZODIG cece ec ec eesecseeseesessesseesessesseeseeseees 62.1.5 Phan bố của vi khuẩn RUiZODIA oe ececcccccececesessesesesesesseseesevevssssevevevsesesevevevevetesecees 62.1.6 Sinh sản va cộng sinh của vi khuẩn Öizobia -5-©22©22-52255222sc25z2csc 6

2.1.7 Vai trò của vi khuẩn Rhizobia trong nông nghiỆp ©22 5252 2S2S2x2zz2z2 7

2.2 Hoạt chất điều hòa sinh trưởng ở Öizobia 2-©52 522 5222222222222xczxczxczscrei 8

2.2.1 Chất điều hòa sinh trưởng TAA oo cece cscs esseessessessuesseeseesseesesssessessteeueeseeseeeees 8

2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Rhizobia trên thế giới và tại Việt Nam 10

Chương 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 2: ¿©2222222E2EE2E+2Exzzx+zrxeex 13 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2-2 2¿+22+2E+2E+2EE2EE+2EE2EE+2EEeExrrrrerrres 13 3.2 Vat 8i i62 00 0 13

3:3 Phương phap nghiền GỮUsssescessbsassivieisieiissasdisgiA01566360361411565950511034803910648890238 14 3.3.1 Thu mẫu nốt san rễ và phân lập - 2-22 222+2E++EE+£++2EE+ZE+zE+zzxzzxzzzxeex 14 3.3.2 Đánh giá về hình thái, sinh hóa và định danh sinh học phẩm te eesezsesee- 15 3.3.3 Đánh giá đặc điểm sinh ly và sinh hóa của các dòng vi khuẩn Rhizobia 17

3.3.4 Khảo sát khả năng tổng hợp các hợp chat thứ cap của các dòng Rhizobia 20

3.3.5 Đánh giá khả năng khích thích của các dòng Rhizobia lên sự nảy mam va tăng trưởng của hạt đậu ở điều kiện phòng thí nghiệm 2- 2-22©22222222222Ez2222zzzz+2 22 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 2¿ 222222222222E+2EE221222122122312212211221221212 222 23 Chương 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2-¿©222222E+2E22E22E22E222222222222225e2 24 4.1 Thu mẫu nốt san rễ và phân lập vi khuân - 2-2 2222z+Ez++zE+£xrzz+rxrrrs 24 TT, A NEE A cuesssssnsroesssotuatuesnotrgtggtiiogigfkbfngiieo80180300910086g00GM162301u8g300:2g80) 24 4.1.2 Hình thai các dong vi khuẩn Rhizobia được phan lập 2 22525225522 25 4.1.3 Phân loại gram các dong vi khuẩn đã chọn loc từ môi trường YMCA 27

4.1.4 Định danh các dòng vi khuẩn phân lập bang sinh học phân tử 29

4.2 Đánh giá đặc điểm sinh lý và sinh hóa của các dòng vi khuan Rhizobia 34

4.2.1 Đánh giá khả năng phát triển trong điều kiện pH thay đổi - 34

4.2.2 Đánh giá khả năng phát triển trong điều kiện nhiệt độ thay đổi 3Š 4.2.3 Đánh giá khả năng phát triển trong điệu kiện mặn 22 2 2552222252 36 4.2.4 Kha năng tiết axit/kiềm bằng chi thi màu Bromothymol Blue 38

4.2.5 Ghi nhận sử dụng nguồn đường glucose của vi khuân RÖizobia 39 4.3 Kha năng tổng hop IAA từ vi khuẩn RÖ¡zobia 22-252272222222c22zccsszssre 40 4.4 Kha năng tổng hợp Siderophores của vi khuẩn ##izobia :-52-52-55- 42

VI

4.5 Hiệu quả kích thích nảy mầm lên hạt đậu của các dòng R#¿zobia - 444.6 Hiệu quả của các dòng Rhizobia lên khả năng kích thích sinh trưởng đậu ở điều kiện

phones thĨ HD HIỂTHsösxs:siztz21560022312G01EEBEBSE2PSHEEIHMEESSESSEEUELISBSSERSSBLG/GGĐ2GHSi39590H5710/529/4G703uE006:002duosgd 46

Chương 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, - 2 2+222E2E22E22E22E222222222222222222.2Xe2 51

CC CC ớớớớớƠACcAcAAAA 51

he | anon 52TÀI LIEU THAM KHẢO - 22 2+SS+2E2EE2EE22EE2E112E122121122122112112711211211 21.21 e6 53

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

YMA : Yeast extract mannitol agar

YMB : Yeast extract mannitol broth

YMB-BTB : Yeast extract mannitol broth - Bromothymol Blue

YMCA : Yeast extract mannitol congo red agar

vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 3.1 Cách pha dung dịch chuẩn làm việc IAA 252552 552552252525z25+2 21

Bảng 4.1 Thông tin về mẫu nốt san rễ được thu thập cho thi nghiệm 25

Bảng 4.2 Kết quả nhuộm Gram (G) vi khuẩn phân lấp W0: scccs2ssezsssscsaisaooae 27

Bang 4.3 Các dong vi sinh vật được phân lập có kết quả tương đồng với các dòngRhizobia từ nguồn thư viện trực tuyến NCBI - 2-22 ©2222222E22222E22222Ezzrzrvec 30Bang 4.4 Kha năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường có pH thay doi 34Bang 4.5 Khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường có nhiệt độ thay đôi 36Bảng 4.6 Kha năng phát triển của vi khuẩn trên môi trường có muối thay đổi 37

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Một số mẫu nốt san ở rễ cây đậu phộng (A, B), đậu xanh (C) và mẫu được bảo quản trong ống chứa mẫu (D) - 2-2 ©2222E2SE22EE2EE22EE2EE22EE2EE22E22E222E2Ee22rcrev 24

Hình 4.2 Một số hình ảnh khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập 26

Hình 4.3 Hình vi khuẩn gram âm của một số dòng vi khuẩn ở vật kính 40X 28

Hình 4.4 Hình anh DNA của 39 dòng vi sinh được phân lập được khuếch đại, tinh sạch và kiểm tra trên gel agarose 1 % ở điều kiện 80 Vol, 70 min, 3 wl mẫu - 29

Hình 4.5 Cây phat sinh loài (Phylogenetic Tree) của 15 dong vi khuẩn có độ tương đồng thuộc nhóm /Öizobia 52- 5252 522SE2EE2E2EEEEEEerrrerrrrr 33

Hình 4.6 Đánh giá khả năng tiết axit/kiém của các dòng vi khuẩn Rhizobia 38

Hình 4.7 Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường GPA 39

Hình 4.8 Dung dịch IAA chuẩn và mẫu đánh giá khả năng tổng hợp IAA 40

Hình 4.9 Biéu đồ thé hiện hàm lượng IAA tổng hợp từ các chủng Rhizobia 41

Hình 4.10 Định tinh hàm lượng siderophores tông hợp từ các chúng Rhizobia 42

Hình 4.11 Sự nảy mam của đậu xanh và đậu nành - 2 22s 52+S22S2£22Sz£Ezzzzzz 44 Hình 4.12 Hạt đậu xanh sau khi nay mầm được chuyên vào ống nghiệm 47

Hình 4.13 Chiều dài thân và rễ của cây đậu xanh ghi nhận sau 7 ngày 47

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây họ đậu có giá trị cao về mặt đinh dưỡng, kinh tế và đóng vai trò quan trọngtrong nền sản xuất nông nghiệp Các cây họ đậu phé biến như đậu phộng, đậu đen, đậuxanh, và đậu đỏ được trồng trên điện rộng và có mức tiêu thụ cao vì chúng dé canh tác,

dễ chế biến, giàu giá trị dinh dưỡng, đặc biệt đối với sản xuất thực phẩm dành cho người

ăn chay Trong canh tác, người nông dân thường lạm dụng việc sử dụng phân hóa học,

đặc biệt là phân đạm và các chất kích thích sinh trưởng nhằm rút ngắn thời gian trồngtrọt, thu được năng suất và lợi nhuận cao Điều này dẫn đến sự tồn dư chất độc gây hạitrong đất cũng như trong sản phẩm, gây ảnh hưởng tiêu cực cho môi trường và conngười Do đó, nhu cầu về thực phẩm sạch, an toàn nhưng có năng suất, chất lượng cao,thời gian thu hoạch ngắn là van đề thiết yếu trong canh tác cây họ đậu Việc phát triểnnông nghiệp bền vững đi cùng hạn chế tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏengười tiêu dùng là một trong những chiến lược quan trọng canh tác cây họ đậu cũng như

ngành nông nghiệp nói chung Canh tác theo định hướng sinh học thông qua việc giảm

tải phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học, chú trọng sử dụng các sản phẩmphân - thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ vi sinh vật có lợi cho cây trồng là tâmđiểm đáng chú ý trong nông nghiệp bền vững Nguồn vi sinh vật có lợi trong cây trồng

đã được nghiên cứu từ rất lâu và mang lại hiệu quả tốt trong việc tăng năng suất và chấtlượng nông sản Tuy nhiên, để phát triển và có nhiều ứng dụng trong sản xuất nôngnghiệp bền vững, việc nghiên cứu sâu hơn về tác động của vi sinh lên khả năng tăng

cường chất dinh dưỡng, sinh trưởng ở cây trồng, đặc biệt là nhóm cây họ đậu, cũng như

sự tương tác giữa hệ vi sinh vật đất và cây trồng là những nghiên cứu mang tính thiếtthực nhất, tạo nền tảng cho xây dựng và phát triển nền nông nghiệp bền vững

Tăng cường chất dinh dưỡng nhờ vi khuẩn cộng sinh có định đạm trên cây họđậu đã được biết đến trong nhiều nghiên cứu trước đây Những nghiên cứu chứng minh

sự cộng sinh này đã được bat đầu vào thé kỷ 19 và nó đã cho thay rằng vi khuẩn hiệndiện trong các nốt san trên rễ cây họ đậu có chức năng trong việc có định N: trong khíquyền (Deshwal và ctv, 2011; Malisorn và Prasarn, 2014) Vi khuẩn Rhizobia thuộc

mối quan hệ cộng sinh với cây họ đậu Sự cộng sinh của vi khuẩn Rhizobia và cây họđậu là sự tương sinh hỗ trợ, được nghiên cứu rộng rãi vì cây họ đậu là cây lương thựcquan trọng Ước tính được rằng vi khuẩn Rhizobia sông cộng sinh với gần 100 cây họđậu trong ngành nông nghiệp và chiếm hơn một nửa trên hệ sinh thái vi khuẩn có địnhđạm trong đất (Zahran, 1991; Sobti va ctv, 2015) Ung dung vi khuan Rhizobia dé tang

độ phi nhiêu cho đất, năng suất cây trồng nông nghiệp là một giải pháp dé dàng va tốnchi phí thấp (Shahzad và ctv, 2012; Sobti va ctv, 2015) Vi khuẩn Rhizobia xâm nhậpvào rễ cây một cách hiệu quả và giúp tăng sự phát triển của cây thông qua việc sản xuất

các hormone tang trưởng thực vật (Deshwal và ctv, 2011; Malisorn và Prasarn, 2014).

Cùng với những tóm lượt bên trên, việc ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất phânbón, các chế phẩm, hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật đang được quan tâm, nghiêncứu và phát triển mạnh trên thế giới cũng như trong nước Việc khai thác được nguồn vi

sinh vật bản địa có lợi cho cây trồng, phù hợp với từng vùng canh tác và từng nhóm cây

trồng là những nghiên cứu cơ bản tạo tiền dé cho phát triển nông nghiệp bền vững Do

đó, đề tài “Phân lập, định danh và tuyển chọn các dòng vi khuẩn Rhizobia có khả năngkích thích nảy mam, tăng trưởng ở quy mô phòng thí nghiệm” được thực hiện, nhằmhướng đến việc tuyên chọn các chủng Rhizobia có khả năng khích thích sinh trưởng -phát triển cây trồng và phục vụ cho sản xuất phân bón trong tương lai

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và định danh ở mức độ loài vi khuẩn Rhizobia trên cây họ đậu tại khuvực tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và Cần Thơ

Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn Rhizobia có khả năng khích thích nay mam,tăng trưởng ở cây họ đậu và chịu được điều kiện tự nhiên bắt lợi nhằm hướng tới sảnxuất chế phẩm sinh học

1.3 Nội dung thực hiện

Đề tài được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu, Chi nhánh Trung tâm Nghiên cứu —Phát triển, Công ty Cô phần Phân bón Dầu khí Ca Mau với những nội dung như sau:

Nội dung 1: Thu thập mẫu rễ đậu và phân lập

Nội dung 2: Định danh các dòng phân lập bằng sinh học phân tử

Nội dung 3: Khảo sát đặc tinh sinh lý và sinh hóa của các chủng Rhizobia.

Nội dung 4: Đánh giá khả năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng lên cây họ đậu

Chương 2 TONG QUAN TAI LIEU

2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn Rhizobia

2.1.1 Phần loại nhóm vỉ khuẩn cố định đạm

Theo Saharan và Nehra (2011), vi sinh vật tham gia vào tiến trình có định đạm Rhizobia bao gồm 3 nhóm chính như sau: Nhóm vi khuẩn cố định đạm sống cộng sinhbắt buộc với rễ cây họ đậu gồm các chi Rhizobium, Bradyrhizobium, Burkholderia,Sinorhizobium va Mesorhizobium (Saharan và Nehra, 2011) Nhóm cô định đạm sốngcộng sinh với rễ không thuộc cây họ đậu gồm Frankia và vi khuẩn lam Nhóm vi khuẩn

-cô định đạm sống tự đo có thé liên kết hoặc nội sinh vào bên trong các bộ phận của cây

như: Azospirillum, Azotobacter, Acetobacter diazotrophicus, Azoarcus, , Klebsiella và Clostridium

2.1.1.1 Vi khuẩn cố định đạm cộng sinh thuộc cây họ đậu

Nhóm vi sinh vật cộng sinh đóng vai trò quan trọng nhất cho quá trình cố địnhđạm trong đất Hiện nay, hệ vi sinh vật cộng sinh và có khả năng cé định đạm được tìmthấy ở vùng rễ của hơn 600 loài cây trồng, đặc biệt là cây họ đậu (Leguminosales)(Saharan và Nehra, 2011) Chi Rhizobium là nhóm vi khuẩn chính, có khả năng sinhtrưởng nhanh và có hoạt động có định đạm mạnh nhất (Saharan và Nehra, 2011) Ngoài

ra, một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chi Bradyrhizobium thuộc nhóm vi khuẩn sinhtrưởng chậm, có khả năng cô định đạm và tạo nốt san ở rễ ở cây đậu nành và đậu phộng

(Saharan và Nehra, 2011; Karthik và ctv, 2017).

2.1.1.2 Vi khuẩn có định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu

Hai nhóm vi khuẩn cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu đượcnghiên cứu rộng rãi gồm Frankia và vi khuẩn lam Trong đó, Frankia là đại diện của vikhuẩn xạ khuẩn có định đạm và có một số đặc cô định đạm không chỉ trong điều kiệnsống tự do mà còn cộng sinh với trên 200 loài thực vật không thuộc họ đậu (Kucho vàctv, 2017) Theo Nguyễn Lân Dũng (1984), rất nhiều loài vi khuẩn lam sống trong ruộng,nước đã được chứng minh là có khả năng cố định đạm Chúng đã góp phan không nhỏvào cân bằng nguồn đạm cho nông nghiệp ở nhiều nước, nhất là các nước nhiệt đới(Nguyễn Lân Dũng, 1985).

2.1.1.3 Vi khuẩn cố định đạm sống tự do

Vi khuẩn cô định đạm tự do có vai trò quan trọng trong quá trình tạo ra nguồnđạm cho cây trồng sử dụng Nhóm vi khuẩn có định đạm sống tự do nảy có thé tạo ralượng chất hữu cơ đáng kê Một hạn chế chính mà vi khuẩn nhóm này gặp phải đó là sựthiếu hụt nguồn carbon và nguồn năng lượng cho quá trình cố định dam, vì tiến trình cóđịnh đạm cần nhiều năng lượng Tuy nhiên, hạn chế này có thể được khắc phục Một số

vi khuân nhóm này có thé di chuyển gan rễ cây dé liên kết hoặc nội sinh bên trong rễ

cây (Lê Thị Xã, 2021).

2.1.2 Phân loại vi khuẩn Rhizobia

Các loại vi khuẩn có định đạm cộng sinh trên cây họ đậu thuộc các chi khác nhau

của bộ Rhizobiales được gọi chung là Rhizobia (Soto va ctv, 2006) Việc phân loại vi

khuẩn Rhizobia đã trải qua một sự thay đôi đáng ké trong những năm gan đây do việc

bồ sung một số chi và loài mới cho nhóm vi khuẩn quan trọng này Ngày càng có nhiều

dòng vi khuan Rhizobia được phân lập và xác định đặc điểm mỗi ngày Thông qua đó,nhiều loài vi khuân mới đã được xác định và phân nhóm cụ thể hơn (Berrada và Fikri-Benbrahim, 2014) Hiện nay, vi khuẩn Rhizobia được công bố hợp lệ bao gồm 98 loàitrong 13 chi Hầu hết các loài vi khuẩn này thuộc họ Rhizobiacae trong alpha-

proteobacteria và thuộc các chi Rhizobium, Mesorhizobium, Ensifer hoặc

Bradyrhizobium Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng còn có nhiều loài thuộc

Rhizobia khác ngoài những loài này (Weir, 2016).

Cac chi thuộc Rhizobia bao gồm: Chi Rhizobium được mô tả bởi Frank vào năm

1889 hiện có 49 loài, chi Mesorhizobium được mô tả bởi Jarvis và cộng sự vào năm

1997 hiện tại có 21 loài, chi Ensifer (trước đây là Sinorhizobium) được mô tả bởi Chen

và cộng sự vào năm 1988 hiện có 17 loài, chi Bradyrhizobium được Jordan mô tả năm

1982 hiện bao gồm 9 loài, chi Burkholderia hiện có 7 thành viên chi này đã được đặt

tên, chi Phyllobacterium hiện có 3 loài, chỉ Microvirga gồm 3 loài, chi Azorhizobium

gồm có 2 loài, chi Ochrobactrum hiện có 2 loài, chi Methylobacterium, Cupriavidus,Devosia, Shinella đều có một loài duy nhất (Weir, 2016) Bên cạnh đó, nhiều chủngPseudomonas fluorescens thường tìm thay trong đất và vùng rễ cũng được phân loại là

vi khuẩn Rhizobia giúp tăng trưởng ở thực vật (Cook va ctv, 1995)

Ngoài ra, một số cách phân loại khác cũng được sử dụng cho việc xác định vikhuẩn Rhizobia dựa vào tốc độ phát triển của khuẩn lạc trên môi trường thạch nuôi cấybao gồm nhóm vi khuẩn phát triển nhanh và phát triển chậm Một số dòng vi khuẩn đãđược nghiên cứu như: Rhizobium meliloti — nhóm vi khuan phát triển nhanh sống cộngsinh với cây linh lăng có chu kỳ sinh trưởng 2 — 4 giờ và hình thành khuẩn lạc có đườngkính 2 — 4 mm sau 3 — 5 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch Nhóm vi khuan phát triểnchậm điền hình như Bradyrhizobium japonicum, sông cộng sinh với cây đậu tương hoặcBradyrhizobium sp (lupines) trong cỏ lupin Loại vi khuẩn này có chu kỳ sinh trưởng

từ 6 — 8 giờ, khuẩn lạc hình thành trên môi trường thạch với đường kính khuẩn lạc nhỏkhông quá 1 mm sau 5 — 7 ngày nuôi cấy (Lưu Ngọc Hưng, 2018)

2.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thành nốt san của vi khuẩn Rhizobia

Rhizobia là vi khuẩn hình que, gram âm, hiéu khi, không sinh bao tu, là loại vi

khuẩn cộng sinh cố định dam thuộc ho Rhizobiaceae Nhiệt độ lý tưởng cho sự phát

triển của Rhizobia ở điều kiện tự nhiên là 25 — 30°C, mặc dù một số loài có thé chịuđược nhiệt độ lên tới 42°C ở các khu vực khô hạn, thích hợp sống ở điều kiện đất trungtính và hơi chua (Ormeño-Orrillo và ctv, 2016) Trong điều kiện nuôi cấy tại phòng thínghiệm, vi khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 — 30°C với độ pH 6,5 — 7,0 Vi khuẩnRhizobia sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau, một vài axit hữu cơ, thậm chí cảpolisacarit làm nguồn cung cấp năng lượng Chúng có thể phát triển trong môi trườngnghèo đạm Nguồn đạm thường được sử dụng là pepton, axit amin (Camerini và ctv,

2008).

Vi khuẩn Rhizobia cũng được tìm thấy trong đất, nơi canh tác những cây ho dau.Chúng tồn tại trong dat và có thé xâm nhập vào các lông hút của rễ cây họ đậu dé hìnhthành nốt san nên còn được gọi là vi khuẩn nét san ở rễ Các nốt san này có khả năng cốđịnh Nitơ tự do trong khí quyền và chuyên hóa thành dạng Nitơ hữu ích cho cây trồng

sử dụng Đề cô định Nitơ Rhizobia cần một cây ký chủ đề thực hiện quá trình cộng sinh

mà không thé cố định Nitơ một cách độc lập (Zahran, 1999) Mối quan hệ giữa cây hođậu và vi khuẩn nót san là mối quan hệ cộng sinh Cả hai loài hỗ trợ cho nhau trong quátrình sinh trưởng và phát triển Trong đó, vi khuẩn nốt san giữ vai trò có định đạm từtrong không khí cho cây và ngược lại cây trồng cung cấp dinh dưỡng cần thiết và nơi để

vi khuẩn nốt san tồn tại và sinh trưởng Căn cứ vào đặc điểm của nốt san về màu sắc,hình dáng, kích thước, vi trí nốt san dé đánh giá hiệu qua và giai đoạn phát triển của nốt

san cũng như phản ánh tình trạng liên kết giữa vi khuẩn nốt san và hiệu quả quá trình cốđịnh đạm Nốt san chuyên đổi màu từ đỏ sang nâu là lúc quá trình có định kém hiệu quả(Trần Cam Vân, 2002; Ngô Thế Dân va ctv, 2014) Căn cứ vào hiệu quả cố định đạm,nốt san cây họ đậu được chia làm hai nhóm bao gồm nốt san hữu hiệu và nốt san vô hiệu(Ngô Thế Dân và ctv, 2014).

2.1.4 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Rhizobia

Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Rhizobia được ghi nhận khi nuôi cấy trên môi

trường Yeast extract mannitol Congo red agar (YMCA) (Wekesa và ctv, 2022) Khuẩn

lạc vi khuẩn Rhizobia sinh trưởng nhanh thường tao ra các khuẩn lạc mau trắng, hìnhtròn, bán trong suốt và có chất nhay Bên cạnh đó, các khuẩn lạc sinh trưởng chậmthường tao ra các khuân lạc có màu trắng, hình tròn, đục và có đường kính không quá 1

mm sau thời gian ủ lâu Trong bóng tối, Rhizobia nỗi bật đưới dạng các khuẩn lạc nhỏ

mau trắng, trong mờ, lap lánh, nhô cao, có cả mép, trái ngược với các khuẩn lạc nhuộm

màu đỏ của Agrobacterium khi phát triển trong bóng tối

2.1.5 Phân bố của vi khuẩn Rhizobia

Vi khuẩn Rhizobia thường tồn tại trong đất va trong vùng rễ, bề mặt rễ hoặc kếthop với rễ ở các nốt san cây họ đậu Mỗi loài Rhizobia sẽ có phạm vi cộng sinh trên

thực vật cụ thể, các loài thực vật khác nhau đều có các chủng vi khuẩn cộng sinh đặc

trưng (Stacey, 2007) Vi khuẩn Rhizobia có thê tồn tại trong các điều kiện môi trườngkhắc nghiệt và cạnh tranh với hệ vi sinh vật trong đất trước khi thiết lập sự cộng sinhvới cây Chúng có thể sống trong môi trường nghèo đạm và thiếu các chất dinh dưỡng(Poole và ctv, 2018) Các tính chất hóa lý của đất đóng vai trò quan trọng trong sự phân

bố và đa dạng của Rhizobia bao gồm nhiệt độ, độ pH, độ mặn, hạn hán va dư lượngthuốc trừ sâu (Jaiswal va ctv, 2016)

2.1.6 Sinh sản và cộng sinh của vi khuẩn Rhizobia

Vi khuẩn Rhizobia là sinh vật sinh sản theo hình thức phân hạch, chúng phản ứng

với rễ cây bằng cách tăng mật độ quan thé và bám vào bề mặt rễ Khi ở trong một tương

tác tương thích (nghĩa là cộng sinh thích hợp với một vật chủ thích hop), Rhizobia bị

thu hút bởi chất tiết ra từ rễ, xâm nhập vào lông hút rễ qua việc nhận ra các tín hiệuflavonoid (chất chuyền hóa thứ cấp của thực vật) do cây bài tiết (Stacey, 2007) Ngoài

ra, một số loài có thé xâm nhập vào các vết thương hở trên rễ thông qua các 16 thủngbiểu bì rễ (Soto và ctv, 2006) Chúng xâm nhập vào rễ thông qua cấu trúc hình ống gọi

6

là sợi xâm nhiễm, sợi nay phát triển hướng về phía biểu bì rễ Khi sợi xâm nhiễm chạmđến lớp nguyên sinh, vi khuẩn được giải phóng vào tế bao chất của thực vật Tại đây, vikhuẩn biệt hóa thành dạng nội cộng sinh và tạo ra nốt san ở rễ (Soto và ctv, 2006) Cácnốt sần sẽ thực hiện vai trò sản xuất đạm cho sự sinh trưởng và phát triển của cây họđậu Sau khi cây họ đậu chết, nốt sần sẽ vỡ ra và giải phóng Rhizobia trở lại đất, nơi

chúng có thé sống riêng lẻ hoặc tái nhiễm với một vật chủ cây họ đậu mới (Saritha vàTollamadugu, 2019).

2.1.7 Vai trò của vi khuẩn Rhizobia trong nông nghiệp

Vi khuẩn Rhizobia đóng vai trò quan trọng, ứng dung rộng rãi trong sản xuấtnông nghiệp như: gia tăng độ phì nhiêu cho đất, cải thiện năng suất cây trồng Ứng dụng

vi khuân Rhizobia là những giải pháp tiềm năng giúp tiết kiệm chi phí trong sản xuấtnông nghiệp (Shahzad và ctv, 2012; Sobti và ctv, 2015) Một số nghiên cứu cho thấy

Rhizobia có nhiều tác động có lợi đối với cây cảnh, cây lâm nghiệp, rau và cây nông

nghiệp thông sự phát triển nhanh của cây, việc tăng cường khả năng nảy mầm của câycon, tăng cường sức khỏe, sức sống, chiều cao cây, trọng lượng chồi, hàm lượng chấtdinh dưỡng của các mô chồi, nở hoa sớm (Saharan và Nehra, 2011) Việc bón chế phẩmRhizobia trên cay đậu phộng có thể làm tăng các nốt san ở rễ, có chức năng cố định damcho cây giúp tăng sự phát triển của lá, thân, rễ, hoa và quả (Kebede, 2021) Bên cạnh

đó, mối quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn và cây trồng giúp giảm các yêu cầu sử dụng

phân đạm trong quá trình tăng trưởng của các loại cây họ đậu và tăng độ phì nhiêu của

đất qua quá trình có định Nitơ trong không khí Bồ sung vi khuẩn Rhizobia có thể cungcấp hiệu quả đạt tới 50 - 70% tổng lượng đạm cần thiết để tăng sản lượng cây trồng(Frey-Klett va ctv, 2011) Điều nay góp phan đáng kể trong việc giảm tải sử dụng phânhóa học trong nông nghiệp, đặc biệt đối với các loại phân bón đắt tiền Ngoài ra, việc bổsung vi khuan Rhizobia góp phan hạn chế 6 nhiễm nước ngầm do nitrat, giúp bảo vệ hệ

sinh thái (Berrada và Fikri-Benbrahim, 2014).

Bên cạnh khả năng sản xuất các hormone tăng trưởng thực vật, hòa tan P, cố địnhđạm giúp tăng hiệu qua sinh trưởng cho cây trồng, vi khuẩn Rhizobia còn giữ vai tròquan trọng trong các hoạt động kiểm soát sinh học (Deshwal và ctv, 2011; Malisorn và

Prasarn, 2014) Một số chủng vi khuẩn Rhizobia được ghi nhận là có khả năng hap thu

và giảm thiêu các kim loại độc hại, do đó, giúp gián tiếp thúc day sự tăng trưởng và pháttriển của cây trồng trong môi trường đất nông nghiệp bị ô nhiễm (Karthik và ctv, 2017;

Koskey va ctv, 2018) Các chế phẩm Rhizobia cung cấp khả năng kiểm soát sinh họccác bệnh thực vật bằng cách tăng cường khả năng chống lại mầm bệnh hoặc ức chế

bệnh Các cơ chế liên quan đến kiểm soát sinh học các bệnh thực vật bao gồm cạnh tranh

các vị trí nhiễm bệnh và chất dinh đưỡng, kích hoạt tính kháng và sản xuất các chất như

hormone tăng trưởng, kháng sinh, enzyme và siderophores (Kebede, 2021).

2.2 Hoạt chất điều hòa sinh trưởng ở Rhizobia

2.2.1 Chat điều hòa sinh trưởng IAA

Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật là những chất hóa học được sản xuất bởithực vật Chất điều hòa sinh trưởng có chức năng điều chỉnh sự tăng trưởng, phát triển,quá trình sinh sản, tuổi thọ và thậm chí cả cái chết của thực vật Những phân tử nhỏ này

có nguồn gốc từ quá trình trao đổi chat thứ cấp và đóng vai trò đặc biệt quan trọng tronghoạt động bình thường của thực vật (Chu và ctv, 2017) Mỗi phản ứng thường là kết quả

của hai hoặc nhiều hormone hoạt động cùng nhau Hormone thực vật có 2 tác động chính

là kích thích hoặc ức chế sự phát triển của thực vật Có 5 nhóm hormone thực vật chính:

auxins, gibberellins, ethylene, cytokinins va abscisic acid (Saharan và Nehra, 2011).

Indole-3-Acetic Acid (IAA) là chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhómauxin Hiệu quả đặc trưng của auxin là tác động lên sự giãn của thành tế bảo Auxin gây

ra sự giảm độ pH trong thành tế bào nên hoạt hóa các enzyme phân giải các polysacharidliên kết giữa các sợi cellulose làm cho chúng lỏng lẻo và tạo điều kiện cho thành tế bàogiãn ra đưới tác dụng của áp suất thâm thấu của không bảo trung tâm (Cao Ngọc Điệp,

2007) IAA giữ vai trò trung tâm trong sự tăng trưởng ở thực vat và được coi 1a loại

auxin tự nhiên quan trọng nhất trong các chất điều hòa sinh trưởng Ở thực vật, IAAđược sản xuất từ tiền chất tryptophan ở lá non, thân và hạt thông qua các phản ứngdecarboxyl hóa (Lebuhn va Hartmann, 1993) [AA thường được dùng như một chất điềuhòa quá trình sinh học, giúp kích thích kéo dài tế bao bằng cách thay đổi các điều kiệnnhất định như tính thấm lọc, tăng tính thấm nước, giảm áp lực thành tế bào và tăng sựtổng hợp thành tế bào IAA còn ngăn chặn và trì hoãn hiện tượng sinh lý của lá, thúcđầy sự ra hoa, tạo quả (Zhao, 2010) IAA kích thích sự sinh trưởng của tế bào, làm cho

tế bào đài ra Ngoài ra, [AA cũng kích thích sự téng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành

tế bào đặc biệt là các cellulose, pectin và hemicellulose Bên cạnh đó, IAA còn ảnh

hưởng đến sự phân chia của tế bào, tuy nhiên không chỉ IAA có sự ảnh hưởng lên sự

giãn dai và sự phân chia tế bao mà còn lài mối quan hệ tác động tương hỗ với các

phytohormone khác như gibberellin và cytokinin (Cao Ngọc Điệp, 2007).

IAA tác động lên quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Ngoài nguồnIAA nội sinh do thực vật tự tổng hợp, một lượng không nhỏ IAA bên ngoài được tổnghợp bởi nhiều khoảng 80% vi sinh vật vùng rễ, đặc biệt là vi khuẩn Rhizobia (Loper và

Schroth, 1986; Zahran, 1991) Chúng có khả năng tổng hop IAA như chất chuyển hóa

thứ cấp giúp tham gia vào quá trình hấp thu dinh dưỡng cho cây (Datta và Basu, 2000).Một số nghiên cứu cho thay vi khuẩn Rhizobia tác động tích cực đến đặc tinh sinh trưởng

va năng suất rau muống và rau mông toi, gia tăng có ý nghĩa thống kê chiều cao cây,khối lượng thân lá và rễ tươi, khối lượng chất khô của cây bắp trồng trong chậu (ĐặngThị Ngọc Thanh và ctv., 2016) Dòng vi khuẩn Pseudomonas putida giúp gia tăng chiềudài rễ, chiều cao của chôi, tăng khả năng hấp thu lân ở cây cai dau (Lifshitz, 1987) Bên

cạnh đó, trong điều kiện tự nhiên, rễ cây bai tiết các hợp chất hữu cơ, bao gồm L-Trp có

thé được vi khuẩn Rhizobia sử dụng dé sinh tổng hợp IAA, giúp các loài thực vật khôngbản địa chống lai các điều kiện căng thang sinh học và phi sinh học (Lebrazi va ctv,2020) Tuy nhiên, ảnh hưởng của IAA lên mỗi giống cây trồng phụ thuộc vào nồng độcủa nó, ở nồng độ thấp có thé kích thích sinh trưởng nhưng lại có thé gây ức chế ở nồng

độ cao (Faisal, 2013) Sản xuất IAA bởi vi khuẩn Rhizobia có thé khác nhau đáng kếgiữa các loài khác nhau hoặc các chủng của cùng một loài Hơn nữa, một số yêu tố môitrường có thé anh hưởng đến quá trình sinh tổng hop của phytohormone nay (Zerrouk

va ctv, 2019).

2.2.2 Hoạt chất thứ cấp Siderophores

Sắt cần thiết cho mọi sinh vật sống (Harca và ctv, 2014) Trong môi trường thiếusắt, vi khuẩn cung cấp sắt cần thiết thông qua các phối tử liên kết sắt gọi là siderophores(Datta và Basu, 2000; El Attar và ctv, 2019) Trong tự nhiên, siderophores có thé cónhiều cấu trúc hóa học khác nhau Theo Hider và Kong (2010), hơn 500 siderophores

đã được phát hiện và cấu trúc hóa học của 270 siderophores đã được làm sáng tỏ (Hider

và Kong, 2010).

Một số vi sinh vật sống trong vùng rễ cây trồng có khả năng chuyên hóa dạng sắtthành dang dé hấp thụ cho cây trồng và tăng cường hàm lượng sắt trong môi trường.Siderophores có ái lực cao với Fe** và có thé khử nó thành Fe?" dé cây trồng có thé hapthu và sử dung (Glick, 2005) Ngoài việc thúc đây tăng trưởng ở cây trồng siderphores

còn giúp kiểm soát mầm bệnh thực vật và làm giảm tác động độc hại của kim loại nặngtrong đất (Shanmugaiah và ctv, 2015).

Các vi khuẩn thuộc nhóm Rhizobia có mối quan hệ cộng sinh với cây chủ Mốiquan hệ nảy phụ thuộc vào sắt, vì sắt cần thiết cho sự hình thành nốt san và là thànhphan của các đại phân tử quan trọng như leghaemoglobin va nitrogenase (Guerinot,

1991; Datta và Basu, 2000) Một số chủng có khả năng tiết hợp chất siderophores thuộc

chỉ Azorhizovium, Bradyrhizobium và Rhizobium và được ứng dụng nhiều trong sản xuất

nông nghiệp (Guerinot, 1991)

2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Rhizobia trên thé giới và tại Việt Nam

Nhiều nghiên cứu về vi khuẩn Rhizobia đã được thực hiện trên thế giới cũng nhưtại Việt Nam Da phan, các nghiên cứu này tập trung vào quá trình phân lập, chọn lọcnhững dòng vi khuẩn Rhizobia từ các cây họ đậu trồng tại các vùng bản địa, nhằm thu

thập được nguồn thư viện Rhizobia cho những nghiên cứu về tác động tích cực của vi

khuẩn đến sinh trưởng — phát triển của cây trồng Ngoài ra, việc xác định và phân tíchcác hoạt chat thứ cấp từ các dòng vi khuẩn Rhizobia cũng là một trong những nghiên

cứu đáng chú ý và có tính ứng dụng cao cho sản xuất nông nghiệp Một số tổng quan về

nghiên cứu vi khuẩn Rhizobia trên thế giới và Việt Nam được tổng hợp như sau:

Vào năm 1969, Libbert va ctv đã bao cáo rằng thu được 58 chủng vi khuẩn có

được phân lập từ cây đậu Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng đã xác định hoạt tính IAA từ

các dòng vi khuẩn đã được phân lập Nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng việc sản xuất IAA

do vi khuẩn được cho là quan trọng đối với cây trồng Hoạt động tổng hop IAA phụthuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý của vi khuẩn và điều kiện môi trường (Libbert và

Risch, 1969).

Năm 1985, Somasegaran và Hoben đã thực hiện nghiên cứu về các kỹ thuật nuôicấy Rhizobium từ cây họ đậu Nghiên cứu này đã cung cấp những nền tảng kiến thức

quan trọng cho nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm bao gồm việc thu mẫu nốt san của

rễ, cách lựa chọn nốt san, môi trường nuôi cấy chuyên biệt cho vi khuẩn Rhizobia, cáchđánh giá hình thái và chọn lọc khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường, các đánh giá theodõi các đặc tính sinh hóa — sinh ly, cách khảo nghiệm sự sống của dong phân lập và ảnhhưởng của các dòng vi khuẩn vi khuẩn lên sinh trưởng và phát triển của cây trồng

(Somasegaran và Hoben, 1985).

10

Hungria và ctv (2010) đã thực hiện các nghiên cứu xử lý hạt giống của cây lúa

mì va bắp với các chủng vi khuan có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA Kết quả

ghi nhận sự gia tăng năng suất lúa mì và bắp thêm tương ứng là 27% va 31% so với

năng suất ở nghiệm thức chỉ bón phân hóa học

Một nghiên cứu về khả năng ứng dụng vi khuẩn Rhizobia — chủng Azospirillum

sp trên cây lúa đã được thực hiện ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng (Isawa và ctv,

2010) Kết quả cho thay chủng Azospirillum sp có ảnh hưởng tích cực đến cây lúa, giúptăng khả năng năng cô định đạm, tổng hợp IAA làm tăng số nhánh và tăng năng suất hat

so với nghiệm thức không chủng trong điều kiện ngoài đồng

Tran Bao Trâm va ctv (2017) đã phân lập được 31 chủng vi khuẩn có đỉnh đạm

từ đất trồng Sâm Việt Nam tại Quảng Nam Kết quả bước đầu của nghiên cứu trên câydưa chuột được ghi nhận với sự tạo thành của LAA thô trong dịch lên men chủng tuyên

chọn có ảnh hưởng tích cực đến tỷ lệ nảy mam của hạt giống (tăng từ 80% ở thí nghiệm

đối chứng lên 93,3% ở thí nghiệm xử lí vi sinh), cũng như các chỉ tiêu về sinh trưởng(chiều dai thân/rễ, khối lượng tươi thân lá, số rễ) của dua chuột

Một số nghiên cứu khác về sản xuất IAA từ vi khuẩn mang lại nhiều kết quả hữuích trong nghiên cứu Rhizobia như: Sang lọc và tôi ưu hóa sản xuất axit indole-3-aceticbởi Rhizobium sp sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Lebrazi và ctv, 2020) Ởnghiên cứu nay nhân mạnh rang vi khuẩn vùng rễ sản xuất IAA có thé được khai thác

dé cải thiện sự phát triển của cây trồng Hơn nữa, việc sản xuất chúng có thé được kiểmsoát dé dang Theo Igiehon va ctv (2019) Rhizobia có thé thúc day sự tăng trưởng vàphát triển của cây đậu tương ở điều kiện khô hạn (Igiehon va ctv, 2019)

Lê Thị Xã (2020) đã khảo sát sự ảnh hưởng của các dong Rhizobia lên rau muống.Kết qua cho thấy tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống cao hơn khi so sánh giữa nghiệmthức chủng vi khuẩn (mật số 105 cfu/mL ngâm với hạt rau muống) và đối chứng, với tỷ

lệ tăng chênh lệch từ 16,3% đến 19,5% Ngoài ra, kết quả thí nghiệm còn cho thấy khi

chủng vi khuẩn còn giúp hạt rau muống nảy mam sớm hơn và gia tăng số rễ mầm so vớinghiệm thức đối chứng không chủng vi khuẩn Kết quả đánh giá khả năng kích thíchsinh trưởng cây rau muống của các dong vi khuẩn trên môi trường agar 1% ở điều kiệnphòng thí nghiệm cho thấy chiều cao của cây rau muống trong nghiệm thức chủng vikhuẩn cao hơn và có ý nghĩa khác biệt về mặt thống kê so với đối chúng sau 10 ngày

quan sát.

Một nghiên cứu về đặc điểm của Rhizobia được phân lập từ cây học đậu và tácdụng của chủng vi khuẩn này lên cây đã chỉ ra rằng Rhizobia có tác động thúc day tăngtrưởng ở cây Các đặc tính sản xuất IAA, NHs, siderophore, HCN và hoạt tính ACCdeaminase cũng được khảo sát trong nhiên cứu này Ở điều kiện nhà kính, cây đậu đượccấy thêm các chủng vi khuẩn khác nhau cho thấy sự cải thiện về chiều cao cây, số nhánh,

tổng số diép lục, số nốt san, trọng lượng nốt san, trọng lượng chồi, trọng lượng rễ, thé

tích rễ và diện tích bề mặt rễ ở 30 và 45 ngày hơn so với gieo trên các cây đối chứngkhông được cấy vi khuẩn (Mir va ctv, 2021)

Trương Thị Yến Nhi (2022), đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn từ 20 mẫu rễlan Trong đó một chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA cao với hàm lượng đạt 107,14ug/mL sau 5 ngày nuôi cấy Một chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp GAs caonhất trong các chủng vi khuẩn nội sinh đã phân lập là 0.3428 mgGAs/mL Kết quả nay

còn cho thay rang sử dụng đồng thời hai chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA va Gas

cao nhất có tác dụng tăng tỷ lệ sống, thúc day phát triển chiều cao và cải thiện tình trang

lá của cây phong lan con.

Ngoài ra, tại Việt Nam trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu về đề tài

về vi sinh vật sản xuất IAA như: Phân lập tuyển chon vi sinh vật nội sinh tổng hợpindole — 3 — acetic acid (IAA) trong hệ rễ cây ca phê (Coffea) tại Đắk Lắk (NguyễnKhoa Trưởng và ctv, 2021) Phan lập các dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợpIAA và cô định đạm trên cây chuối (Nguyễn Thị Huynh Như, 2013); Sự sản xuất IAA

và siderophores của các chủng vi khuẩn liên hiệp thực vật và ảnh hưởng lên sự tăngtrưởng của cây bắp (Zea mays L.) trồng trong chậu (Đặng Thị Ngọc Thanh và ctv, 2016)

12

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 02/02/2023 đến 01/07/2023 tại phòng Nghiên cứu, Chinhánh Trung tâm Nghiên cứu - Phát triển, Công ty cổ phần Phân bón Dầu khí Cà Mau

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu thí nghiệm được thu thập từ nguồn rễ cây đậu đũa, đậu phộng, đậu đen, đậutrắng và đậu xanh tại các vườn và đồng ruộng ở 3 tỉnh gồm Đồng Tháp, Đồng Nai vaCan Tho

Nguồn giống đậu sử dung trong thi nghiệm đánh giá tác dung của vi sinh vật lênsinh trưởng của cây trồng là giống đậu tương DT2008 va đậu xanh DX2008, thu hoạchtại Đồng Nai ngày 25/05/2023

Dụng cụ và thiết bị

Các trang thiết bị bao gồm: Nồi hấp khử trùng, cân điện tử, máy lắc gia nhiệt,

máy ly tâm, tủ ủ, tủ sấy, tủ cấy, máy PCR, máy điện di, máy chụp ảnh gel, lò vi sóng,máy luân nhiệt, bộ điện di vả các trang thiết bị khác

Dụng cụ gồm: dia petri, ống nghiệm, bình erlen, que cấy, đèn cồn, các loại

pipette, micropipette và một số dụng cụ thí nghiệm khác

Hóa chất

Các loại hóa chất:

- Các hóa chất cho phân lập: Manitol (Cas#69-65-8, Duksan), KaHPO¿

(Cas#7758-11-4, Scharlau), MgSO4.7H20 (Cas#10034-99-8, Scharlau), NaCl (Cas#7757-82-6, Merck), CaCO3 (Cas# 471-34-1, Himedia), Yeast extract (Cas# 8013-01-2, Himedia), congo red (Cas# 573-58-0, Merck), D- Glucose (Cas# 50-99-7, Himedia).

- Các hóa chất cho định danh sinh hóa: (Cas#7758-11-4, Scharlau), MgSO4.7H2O

(Cas#10034-99-8, Scharlau).

- Các hóa chất cho định danh phân tử: Phenol (Cas#108-95-2, Merck), Chloroform

(Cas#67-66-3, Merck) , Isoamyl alcohol (Cas#123-5 1-3, Merck).

Thành phan môi trường:

- Môi trường YMCA: 10 g/L manitol, 0,5 g/l KaHPOa, 0,2 g/L MgSO4.7H20, 0,1 g/L NaCl, 4 g/L CaCOs, 0,4 g/L yeast extract, 0,25 % congo red, 20 g/L agar.

- Môi trường YMB-BTB: 10 g/L mannitol, 0,5 g/L KaHPO¿, 0,2 g/L MgSOa, 0,1 g/L NaCl, 0,5 g/L yeast extract, 0,025 g/L Bromothymol Blue.

- Môi trường GPA: 10 g/L Glucose, 20 g/L pepton, 5 g/L NaCl, 20 g/L agarose.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thu mẫu nốt san rễ và phân lập

3.3.1.1 Thu mẫu nốt san rễ

Mau nốt san từ rễ cây đậu sẽ được thu thập ngẫu nhiên từ khu vực vườn va đồngruộng tại tinh Đồng Nai, Đồng Tháp va Cần Thơ Dé thu được mẫu nốt san, dùng dụng

cụ đào chuyên dụng dé đào khoảng 20 cm theo chiều sâu và 15 cm theo chiều ngang.Tiến hành đào xới đất cần thận, đưa rễ đậu ra khỏi mặt đất và làm sạch Rễ đậu sau đóđược đặt vào trong giấy nhôm vô trùng và gói lại đưa vào trong lọ hoặc túi kín có chứahat silica gel hút ẩm và được đậy bằng nút bông gòn với chiều dai 1 cm hoặc bằng nắp,vặn kín để tránh làm khô mẫu (Koskey và ctv, 2018; Beshah và Assefa, 2019) Mẫuđược vận chuyền trực tiếp về phòng thí nghiệm ngay trong ngày và bảo quản ở nhiệt độ

4°C cho các quy trình phân lập Rhizobia (Somasegaran và Hoben, 1994).

3.3.1.2 Phân lập vi khuẩn Rhizobia từ nốt san của rễ

Đầu tiên, các mẫu rễ chứa nốt sần được rửa kỹ bằng nước máy, sau đó cân thậntách nốt san khỏi rễ bằng cách sử dụng kẹp đã khử trùng (Karthik va ctv, 2017) Nếucác nót san bị khô cần được ngâm trong nước cat vô trùng qua đêm dé các nốt san thấmhút nước (Beshah va Assefa, 2019) Tiếp theo, các nốt san nguyên vẹn và không bị hưhại được ngâm trong ethanol 95% trong 10 giây và khử trùng bề mặt trong hydrogenperoxide 3% trong 3 phút và rửa liên tục 6 lần trong nước cat vô trùng dé rửa sạch vàloại bỏ hoàn toan các hóa chất khử trùng (Malisorn và Prasarn, 2014; Khalid và ctv,2020) Sau đó, các nốt san đã khử trùng bề mặt được chuyền sang đĩa petri vô trùng sànglọc và lần lượt được nghiền trong eppendort có chứa NaCl 0.85% tạo thành dịch huyềnphù Dung dịch huyền phù trên được pha loãng theo bậc 10 và nồng độ từ 10? đến 10°

được bơm vào đĩa petri môi trường thạch Yeast extract mannitol congo red agar

(YMCA) bang kỹ thuật cay trang (Trần Ánh Nguyệt, 2017) Các dia petri mẫu được ủ

trong 3 — 7 ngày ở 28°C (Malisorn và Prasarn, 2014; Beshah và Assefa, 2019) Các

khuẩn lạc hình vòm đơn lẻ được chọn và tiếp tục cấy ria sử dụng môi trường YMA và

ủ ở 28°C Độ thuần của các khuẩn lạc được đánh giá qua độ tinh khiết và tính đồng nhấtcủa các khuân lạc qua nhiều lần nuôi cấy lặp lại Các chủng vi khuẩn sau đó sẽ được bao

14

quản trong glycerol 20 % ở -80°C cho thí nghiệm tiếp theo (Beshah và Assefa, 2019;

Khalid và ctv, 2020).

3.3.2 Đánh giá về hình thái, sinh hóa và định danh sinh học phân tử

3.3.2.1 Đánh giá hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Rhizobia

Đặc điểm hình thái khuẩn lac vi khuân Rhizobia được đánh giá dựa trên sự biểu

hiện của các khuẩn lạc riêng lẻ về màu sắc, kích thước, độ nhay, độ trong suốt, đường

viền và hình dạng sau 3 — 7 ngày phát triển trên môi trường YMCA ở điều kiện 28°C.Nếu khuẩn lạc vi khuẩn Rhizobia sinh trưởng nhanh thường tạo ra các khuẩn lạc màu

trăng, hình tròn, bán trong suốt và có chất nhay Ngược lại, các khuẩn lạc sinh trưởng

chậm thường tạo ra các khuẩn lạc có màu trắng, hình tròn, đục và có đường kính không

quá 1 mm (Gauri và ctv, 2011).

3.3.2.2 Nhuộm Gram

Hình thai Gram của các dong vi khuân phân lập được thực hiện bang kỹ thuậtnhuộm gram va quan sat gram dưới kính hiển vi (Beck và ctv, 1993; Koskey và ctv,2018) Các khuẩn lạc thuần từ 3 — 4 ngày tuổi được nuôi cay trên môi trường YMAđược cố định lên các lam kính hién vi sạch, sau đó, được làm khô trong không khí, cốđịnh nhiệt và tiến hành nhuộm gram Các dòng vi khuẩn được nhuộm Gram với bộ

nhuộm của Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa.

Phương pháp thực hiện như sau: Tiêu bản mẫu được chuẩn bị bằng cách nhỏ mộtgiọt nước cất vô trùng lên giữa lam; Dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn rồilấy một ít vi khuẩn trãi mỏng lên kính: Đề khô tự nhiên hoặc ho nhanh mặt đưới của lamkính trên ngọn lửa đèn cồn đề có định vi khuẩn trên lam Sau đó, nhuộm bằng 1 —2 giọtCrystal Violet trong 1 phút, rửa nước 5 giây Tiếp tục nhỏ 1 — 2 giọt dung dich Lugol dé

1 phút, rửa nước 5 giây Rửa lại bang cồn thật nhanh trong 30 giây dé tây màu cho đếnkhi giọt cồn không còn mau tím, rửa kỹ với nước Nhuộm tiếp bang 1 — 2 giọt Safranine

dé 1 phút, rửa lại bằng nước và dé khô Tiêu bản sau đó được quan sát bằng dưới kínhhiển vi quang học ở độ phóng đại 40X (Beck và ctv, 1993)

3.3.2.3 Định danh phân tử của các dòng vi khuẩn được phân lập

a Ly trích DNA của các dòng vi khuẩn

Mau vi khuân Rhizobia được chuẩn bị bằng cách nuôi tăng sinh trong môi trườngYMB từ 3 đến 5 ngày ở 28°C DNA tổng số của các dòng vi khuẩn phân lập được lytrích bang kit GeneAll - Hàn Quốc Các ly trích được thực hiện theo quy trình chuẩn của

nhà sản xuất GeneAII® ExgeneTM Cell SV mini Kit Quy trình tóm tắt gồm các bước nhưsau: 1,5 ml dung dịch vi khuẩn được loại bỏ dịch môi trường nuôi cay thong qua ly tam

10.000 rpm trong 1 phút Tiếp theo, phan tế bào kết tủa được sử dung cho qua trình ly

trích Tế bào kết tủa tiếp tục được ky trích bằng cách sử dụng cột lọc và các hóa chấtphân giải, kết tủa và rửa DNA từ nhà sản xuất Mẫu DNA tổng số được hòa tan trongbuffer AE và lưu mã ở -20°C cho các thí nghiệm tiếp theo

b Khuếch đại DNA, tỉnh sạch và định danh các dòng vi khuẩn được phân lập

Vùng V3 của đoạn gene 16S rDNA của các dòng vi khuân đã phân lập với độ dài

~1.400 bp được khuéch dai bang kỹ thuật PCR, su dụng đoạn mỗi 27F

(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) va 1389R (5’°-ACGGGCGGTGTGTACAAG-3’)

(Hongoh va ctv, 2003; Vinh, 2016) Phan ứng PCR được thực hiện với các thành phantheo hướng dẫn của nhà san xuất OneTaq® 2X Master Mix với Standard Buffer (NEB -Mỹ) gồm: mẫu DNA (< 1,000 ng), 1 ul (10 pM) mỗi môi, 25 pl của 1X Master mix vànước khử ion vô trùng dé tạo ra thê tích cuối cùng của phản ứng là 50 ul, trộn nhẹ nhànghỗn hợp dung dịch trước khi chạy mẫu Master mix và nước khử ion vô trùng để tạo ra

thể tích cuối cùng của phản ứng là 25 ul, trộn nhẹ nhàng hỗn hợp dung dich trước khi

chạy mẫu Phản ứng PCR với 30 chu kỳ được thực hiện với các bước như sau: Tiền biếntính ban đầu ở 95°C, 5 phút; tiếp theo là 30 chu kỳ 95°C, 1 phút; 60°C, 1 phút; 72°C, 2phút; cuối cùng là giai đoạn kéo dài với 72°C, 10 phút; mẫu được giữ ở 4°C cho đến khitắt máy Sản phẩm PCR được kiểm tra và đánh giá bằng phương pháp điện di với gelagarose 1% trong dung dịch đệm TAE 0.5X Thuốc nhuộm GelRed® Nucleic Acid GelStain (Biotium - Mỹ) được sử dụng để nhuộm DNA trong gel agarose Thang chuẩnDNA 1Kb (NEB - Mỹ) được sử dụng dé ước tính kích thước của sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch sử dụng bộ tinh sạch DNA ExpinTM Combo GP(GeneAll - Hàn Quốc) theo quy trình cung cấp của nhà sản xuất Quy trình thực hiệntheo các bước như sau: Band DNA từ gel agarose 1% của vi khuẩn mục tiêu được cắt ra

từ kết quả chạy điện di và cân định lượng với từng tube riêng lẻ Sau đó, dung dịch GBđược cho vào các tube dé hòa tan gel với tỉ lệ (GB: Gel DNA là 3:1), ủ ở 50°C trong 10phút hoặc đến khi gel tan hoàn toàn trong dung dich GB Tiếp theo, dung dich hòa tan

có màu vàng cam được sử dụng cho quá trình tinh sạch bằng cách sử dụng cột lọc, hóachất rửa cột theo quy trình chuẩn từ nhà sản xuất Cuối cùng, DNA trên cột được hòa

tan trong 50ul dung dịch EB hoặc nước khử ion va dat ở nhiệt độ thường trong 2 phút.

16

Mẫu được ly tâm ở 13.000 rpm trong 1 phút đề thu được DNA trong dung dịch EB Mẫu

DNA tinh sạch được trữ ở -20°C cho giải trình tự từ công ty First BASE, Malaysia.

c Phân tích trình tự DNA

Các dữ liệu về trình tự DNA được phân tích sử dụng các công cụ và phần mềmphân tích tin sinh học Trình tự đoạn gene 16S rDNA của các dong vi khuẩn Rhizobiađược định danh sử dụng nền tảng đữ liệu sinh học trực tuyến NCBI (National Center for

Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Công cụ BLAST (The

Basic Local Alignment Search Tool) trén hé thong NCBI được sử dụng dé xác định mức

độ tương đồng của các trình đoạn gene 16S rDNA Ngoài ra, MEGA X được dùng dé

so sánh sự tương đồng của các trình tự DNA khác nhau giúp xây dung được cây pha hệnhằm xác định được mối quan hệ tiến hóa giữa các dòng vi khuẩn Rhizobia đã được

phân lập.

3.3.3 Đánh giá đặc điểm sinh lý và sinh hóa của các dòng vi khuẩn Rhizobia

3.3.3.1 Đánh giá kha năng phát triển trong các điều kiện pH thay doi

Các dòng vi khuan Rhizobia được nuôi cấy trên môi trường pH khác nhau nhằmmục đích đánh giá khả năng và tuyển chon được dòng vi khuẩn có khả năng thích nghi

tốt với sự thay đổi pH Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, bao gồm các bước

như sau:

Bước 1: Vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa 16 giếng, mỗi giếng chứa 4 ml môi

trường YMB đã được khử trùng với dãy pH khác nhau từ 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 8,5

và 9,0 Độ pH của môi trường được điều chỉnh đến mức mong muốn bằng dung dịch

NaOH IN và HCI IN.

Bước 2: Mẫu vi khuẩn chủng được cấy vào môi trường với thé tích 100 ul dungdịch vi khuẩn gốc cho từng pH khác nhau Mẫu đượ ủ ở nhiệt độ 28°C trong 2 — 7 ngày

Bước 3: Sau 2 — 7 ngày nuôi cấy, các dòng vi khuẩn được tăng sinh trên môi trường

có pH khác nhau được đánh giá sự phát triển bằng cách cấy trang trên môi trường YMA

Tiến hành hút dung dịch tăng sinh và pha loãng môi trường để đạt nồng độ 105 Tiếptheo, 100 pl từ ống pha loãng được trang vào đĩa môi trường YMA Đĩa môi trường sau

đó được ủ ở điều kiện 28°C trong 2 — 7 ngày Kết quả ghi nhận dựa trên khả năng pháttriển của khuẩn lạc trên môi trường với cấp độ phát triển được đánh giá trên thang từcấp độ 0 đến 5 Với cấp 0 biểu thị cho sự không phát triển và cấp 5 biểu thị cho mứcphát triển cao nhất (Gauri va ctv, 2011; Beshah và Assefa, 2019)

3.3.3.2 Đánh giá khả năng phát triển trong các điều kiện nhiệt độ thay đỗi

Thí nghiệm đánh giá khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn Rhizobia trong

các điều kiện nhiệt độ thay đôi được thực hiện nhằm đánh giá và tuyển chọn được dòng

vi khuẩn có khả năng thích nghỉ tốt với sự thay đôi nhiệt độ Thí nghiệm được thực hiệnvới 3 lần lặp lại, bao gồm các bước như sau:

Bước 1: Các dòng vi khuẩn dùng cho thử nghiệm được tăng sinh trong 20 mldung dịch môi trường YMB, lắc với tốc độ 180 rpm, ở nhiệt độ 28°C trong 2 — 7 ngày

Bước 2: Sau 2 — 7 ngày nuôi cay, các dòng vi khuan tăng sinh được pha loãng déđạt nồng độ 10° Tiếp theo, 100 ul từ ống pha loãng được trang vào đĩa môi trườngYMA và tiễn hành ủ ở các mức nhiệt độ khác nhau

Bước 3: Đĩa mẫu đã cấy trang sau đó được ủ ở các mức nhiệt độ khác nhau từ5°C, 15°C, 40°C, 48°C và đĩa đối chứng ở 28°C trong 2 — 7 ngày Kết quả ghi nhận dựatrên khả năng phát trién của khuẩn lạc trên môi trường với cấp độ phát triển được đánhgiá trên thang từ cấp độ 0 đến 5 Với cấp 0 biểu thị cho sự không phát triển và cấp 5biểu thị cho mức phát triển cao nhất (Gauri và ctv, 2011; Beshah và Assefa, 2019).3.3.3.3 Đánh giá khả năng phát triển trong môi trường mặn

Thí nghiệm đánh giá khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn Rhizobia trongcác điều kiện mặn khác nhau được thực hiện nhằm đánh giá và tuyển chọn được dòng

vi khuẩn có khả năng chịu mặn tốt Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, baogồm các bước như sau:

Bước 1: Các dòng vi khuan dùng cho thử nghiệm được tăng sinh trong 20 mldung dich môi trường YMB, lắc với tốc độ 180 rpm, ở nhiệt độ 28°C trong 2 — 7 ngày

Bước 2: Sau 2 — 7 ngày nuôi cấy, dịch tăng sinh gốc của vi khuân được pha loãng

dé đạt nồng độ 10° Tiếp theo, 100 ul từ ống pha loãng được trang vào dia môi trườngYMA với nồng độ muối khác nhau ở 2%, 4%, 6%, 8%, 10% NaCl

Bước 3: Dia mau đã cấy trang ở các nồng độ muối khác nhau được ủ ở ở 28°Ctrong 2 — 7 ngày, mẫu đối chứng được nuôi cấy trên môi trường với nồng độ muối 0%NaCl Kết quả ghi nhận dựa trên khả năng phát triển của khuẩn lạc trên môi trường vớicấp độ phát triển được đánh giá trên thang từ cấp độ 0 đến 5 Với cấp 0 biểu thị cho sựkhông phát triển và cấp 5 biểu thị cho mức phát triển cao nhất (Gauri va ctv, 2011;

Beshah và Assefa, 2019).

18

3.3.3.4 Đánh giá khả năng tiết axit/kiềm bằng chỉ thị màu Bromothymol Blue

Thí nghiệm khảo sát khả năng tiết axit/kiém của các dòng vi khuẩn Rhizobiađược thực hiện sử dụng thuốc thử Bromothymol Blue nhằm phân loại các dòng khả năngtiết axit hoặc kiềm và đồng thời phân biệt giữa dòng vi khuân Rhizobium sp với vi khuẩnBradyrhizobium sp Thí nghiệm được phân biệt dựa trên sự thay đổi mau sắc của môitrường Các dòng vi khuẩn sinh trưởng nhanh (thông thường là sau 2 ngày nuôi cấy) cókhả năng tạo axit làm môi trường chuyên từ xanh lá sang vàng, thường là các chủng

Rhizobium sp Ngược lại, các chủng sinh trưởng chậm (thông thường là sau 7 ngày nuôi

cấy) và có khả năng tạo kiềm làm môi trường chuyên từ xanh lá sang xanh lam, thường

là các chủng Bradyrhizobium sp (Hamza và Alebejo, 2017; Pervin và ctv, 2017; Koskey

va ctv, 2018) Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của (Hamza và Alebejo,

2017; Pervin và ctv, 2017; Koskey va ctv, 2018) với 3 lần lập lai như sau:

Bước 1: Thí nghiệm được nuôi cấy trên đĩa 16 giếng, mỗi giếng chứa 4 ml môitrường YMB có bồ sung 0.025 g/l Bromothymol Blue đã được khử trùng Độ pH củamôi trường được điều chỉnh đến pH 7,0 dé có màu xanh lá bằng dung dich NaOH 1N

và HCI IN.

Bước 2: 10 pl dich tăng sinh gốc của vi khuẩn được cho vào từng giếng va ủ ởnhiệt độ 28°C ở điều kiện tối trong 2 — 7 ngày Kết quả được ghi nhận dựa vào sự thayđổi màu sắc môi trường sau, màu xanh lá sang màu vàng hoặc xanh lam

3.3.3.5 Khả năng sử dụng nguồn đường glucose của vi khuẩn Rhizobia

Thí nghiệm được thực hiện bằng cách đánh giá khả năng phát triển của các dòng

vi khuẩn Rhizobia trên môi trường Glucose Peptone Agar (GPA) Kha năng sử dụngđường glucose trong môi trường GPA được dùng dé phân biệt Rhizobium sp voi vikhuẩn Agrobacterium sp và loại bỏ các dòng tạp nhiễm Ở các vi khuẩn thuộc chiRhizobium chúng không sinh trưởng hoặc sinh trưởng rất yếu trên môi trường GPA.Ngược lại, các loài vi khuẩn như Agrobacterium sp có thé phát triển tốt trên môi trường

nay (Garrity và ctv, 2005) Thí nghiệm ược thực hiện theo phương pháp cua (Garrity và

ctv, 2005) với 3 lần lặp lại như sau:

Bước 1: Các dong vi khuẩn dùng cho thử nghiệm được tăng sinh trong 20 mldung dich môi trường YMB, lắc với tốc độ 180 rpm, ở nhiệt độ 28°C trong 2 — 7 ngày

Bước 2: Sau 2 — 7 ngày nuôi cấy, dịch tăng sinh gốc của vi khuẩn được pha loãng

dé đạt nồng độ 10° Tiếp theo, 100 pl từ Ống pha loãng được trang vào dia môi trường

GPA và môi trường YMA (đối chứng) Mẫu được ủ ở kiện 28°C trong 2 - 7 ngày Kếtquả ghi nhận dựa trên khả năng phát triển của khuan lạc trên môi trường với cấp độ phattriển được đánh giá trên thang từ cấp độ 0 đến 5 Với cap 0 biểu thị cho sự không phattriển và cấp 5 biểu thị cho mức phát triển cao nhất.

3.3.4 Khảo sát khả năng tong hợp các hợp chat thứ cấp của các dòng Rhizobia

3.3.4.1 Đánh giá khả năng tổng hợp IAA

Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn Rhizobia được thực hiện nhằmsàng lọc được các dòng vi khuẩn có khả năng tổng IAA cao cho những ứng dụng trongsản xuất nông nghiệp IAA được vi khuẩn tổng hợp và tồn tại trong dịch môi trường saunuôi cấy Thí nghiệm được thực hiện theo tiêu chuẩn Việt Nam 10784 (2015) về đánhgiá định tính và định lượng IAA bằng thuốc thử Salkowski sẽ làm môi trường chuyền

sang mau đỏ, hàm lượng IAA cảng cao mau dung dịch càng đậm Thí nghiệm được thực

hiện với 3 lần lặp lại bao gồm các bước như sau:

Bước 1: Các dòng vi khuan dùng cho thử nghiệm được tăng sinh trong 20 mldung dịch môi trường YMB có bồ sung 0,1% L — Tryptophan, lắc với tốc độ 150 rpm,

ở điều kiện tối, nhiệt độ 28°C trong 7 ngày

Bước 2: Sau 7 ngày nuôi cấy, 2 ml mẫu dung dịch nuôi cay được ly tâm ở tốc độ10.000 rpm, trong 10 phút nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn Sau đó, 1 ml phan dung dichsau khi loại bỏ tế bào được cho vào ống nghiệm Tiếp đến, bồ sung 4 ml thuốc thửSalkowski dé đạt thé tích là 5 ml Mẫu được trộn đều và ủ ở điều kiện tối trong vòng 25phút Mẫu được đánh giá ghi nhận sự thay đổi màu sắc và xác định hàm lượng IAA bằngmáy đo quang phố ở bước sóng 530 nm

Bước 3: Ngoài ra, dung dich IAA chuẩn cũng được chuẩn bị song song trong quátrình thực hiện đo mẫu IAA từ các dòng vinh sinh vật mục tiêu theo Bảng 3.1 Từngnồng độ dung dịch chuẩn IAA được tiến hành tương tự như bên trên với 1 ml mẫu dichchuẩn ở từng nồng độ trộn đều với 4 ml của thuốc thử Salkowski, ủ ở điều kiện tối trongvòng 25 phút Xây dựng biểu đồ đường chuan IAA có dạng y =ax + b (R? > 0.95) và ápdụng dé tính hàm lượng IAA trong mau

20

Bang 3.1 Cách pha dung dịch chuẩn làm việc IAA

Ông IAA Stock (ul) Nước (ml) Tổng thé tich (ml) Nông độ (ug/ml)

Bước 4: Ham lượng IAA trong mẫu nuôi cay vi sinh vật được tính dựa vào hàm số

từ đồ thị đường chuẩn IAA (y =ax + b) và giá trị OD được tính theo công thức:

M=[(OD - ODo)—bị]/a Trong đó:

M: Hàm lượng IAA do vi sinh vật tong hợp, tính bằng microgram/mililiit (ug/ml);OD: Chỉ số OD của mẫu thử nghiệm ở bước sóng 530 nm;

ODo: Chỉ số OD của mẫu đối chứng (môi trường nuôi cấy) ở bước sóng 530 nm;3.3.4.2 Khảo sát khả năng tổng hợp Siderophores của vi khuẩn Rhizobia

Kha năng tông hợp siderophores của các dòng vi khuẩn Rhizobia được phân lậpđược xác định bằng phương pháp Chrome Azurol S (CAS) (Pastor va ctv, 2014) Thinghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại bao gồm các bước như sau:

Bước 1: Các dòng vi khuẩn dùng cho thử nghiệm được tăng sinh trong 20 mldung dịch môi trường YMB, lắc với tốc độ 150 rpm, ở điều kiện tối, nhiệt độ 28°C trong

7 ngày.

Bước 2: Sau 7 ngày nuôi cấy, 6 ml mẫu dung dịch nuôi cay được ly tâm ở tốc độ12.000 rpm, trong 20 phút ở nhiệt độ 4°C nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn Phần dung dịchsau khi loại bỏ tế bào được điều chỉnh đến pH 2.0 bằng HCI đậm đặc (6 N) dé giảm độ

hòa tan của Siderophore trong nước (Pandey và ctv, 2017).

Bước 3: Mẫu được tiếp tục quá trình phân tích bằng cách lấy pha trộn mẫu vớithuốc thử CAS ở tỉ lệ 1:1 (v/v) (1 ml dung dịch mẫu (pH 2.0) : 1 ml dung dịch thuốc thửCAS — Mẫu/CAS) Bên cạnh đó, mẫu đối chứng âm cũng được thực hiện tương tự bằngcách sử dung 1 ml dung dịch thuốc thử CAS với 1 ml môi trường nuôi cay hoặc nước

cất (đối với thử nghiệm độ tinh kiết của siderophores) Hỗn hợp Mẫu/CAS được trộnđều bằng máy vortex.

Bước 4: Tiếp theo, 10 pil dung dich CAS shuttle solution được thêm vào hỗn hợpMau/CAS, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 30 phút Mẫu có hoạt tính liênkết sắt được định tính bằng cách dựa trên sự biến đôi màu thuốc thử CAS từ màu xanh

lam sang cam sau 30 phút ủ mẫu Ngoài ra, hàm lượng siderophores tương đối (% SU)

được xác định bang cách do sự thay đổi màu sắc bằng độ hap thụ của dung dịch ở bước

630 nm và được tính theo công thức [(Ar — As) / Ar] x 100 As là độ hap thụ của dung

dịch có hoạt độ siderophores và Ar là dung dịch đối chứng (hoặc mẫu blank).

3.3.5 Đánh giá khả năng khích thích của các dòng Rhizobia lên sự nảy mầm vàtăng trưởng của hạt đậu ở điều kiện phòng thí nghiệm

3.3.5.1 Chuẩn bị nguồn vi khuẩn Rhizobia

Thí nghiệm được thực hiện nhằm tao được dòng vi khuẩn Rhizobia gốc cho các

đánh giá khả năng nảy mầm và tăng trưởng của hạt đậu ở các thí nghiệm kế tiếp Nguồn

vi khuẩn sốc được chuẩn bị theo (Hoben và Somasegaran, 1982) gồm các bước như sau:

Bước 1: Các dòng vi khuẩn thuần được nuôi tăng sinh trong bình duran 250 mlchứa 200 ml môi trường YMB lắc ủ điều kiện 150 rpm ở 28°C trong 3 ngày

Bước 2: Sinh khối các dòng vi khuẩn được thu hồi bằng cách sử dụng 30 ml dungdịch vi khuẩn sau nuôi cấy và ly tâm ở 6.000 rpm trong 5 phút Tiếp theo, phần sinhkhối kết tủa được thu lại, phần dung dich ở pha trên được loại bỏ Phần sinh khối nàyđược làm sạch bằng cách rửa liên tục 3 lần với 30 ml nước khử khoáng tiệt trùng bằngcách ly tâm ở cùng điều kiện bên trên Cuối cùng, sinh khối của các dòng vi khuẩn đượchòa tan hoàn toan vào 30 ml nước khử tiệc trùng và giữ cho các thí nghiệm tiếp theo.3.3.5.2 Đánh giá khả năng kích thích của các dong Rhizobia lên sự nảy mầm đậu ởđiều kiện phòng thí nghiệm

Hai loại đậu bao gồm đậu xanh và đậu nành được sử dụng trong thí nghiệm khảosát khả năng kích thích của các dòng Rhizobia Thí nghiệm được thực hiện theo phương

pháp của Lê Thị Xã và ctv (2020) với mục tiêu đánh giá va sang lọc được dòng vi khuẩn

có khả tác động tốt đến cây trồng Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức lặp lại với các bước

được trình bày như sau:

Bước 1: Các hạt đậu xanh và đậu nành được lựa chọn dựa trên độ đồng đều vềhình dạng, kích thước và màu sắc nhằm loại bỏ những hạt có chất lượng kém Ba mươi

22

hạt đậu được ngâm 4 giờ với 30 ml dung dich huyền phù vi khuẩn gốc đã được chuẩn

bị trước đó.

Bước 2: Sau 4 giờ ngâm hat, hạt đậu được đặt vào dia petri chứa sẵn giấy lọc 4m

đã khử trùng ở 121°C trong 20 phút Mẫu hạt trong đĩa petri được đặt ở nhiệt độ phòngtrong điều kiện tối Ngoài ra, nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự với các

hạt đậu được ngâm với nước cắt tiệt trùng thay cho dịch huyền phù vi khuẩn Quan sát

và ghi nhận tỉ lệ hạt nay mầm sau 36 giờ ủ tối

3.3.5.3 Đánh giá khả năng kích thích của các dòng vi khuẩn Rhizobia lên tăng

trưởng đậu ở điều kiện phòng thí nghiệm

Thí nghiệm đánh giá kha năng kích thích của các dòng vi khuẩn Rhizobia lên sự

tăng trưởng cây họ đậu được thực hiện với 3 lần lặp lại theo phương pháp của Lê Thị

Xã và ctv (2020) Hạt đậu xanh được chọn làm mẫu đánh giá cho thí nghiệm này, với

các bước thực hiện như sau:

Bước 1: Các hạt đậu xanh có chất lượng tốt được lựa chọn dé tiến hành thínghiệm Hạt được nảy mầm với quy trình tương tự như thí nghiệm đánh giá nảy mầm

đã trình bày Các hạt nảy mầm được ghi nhận và lựa chọn cho bước kế tiếp

Bước 2: 10 hạt đậu xanh có độ nảy mam tốt và có sự tương đồng trong độ dảiman (khoảng 1 cm) được đặt vào ống nghiệm tiệt trùng chứa 10 ml agar 1% Các ốngnghiệm được đậy nắp không kín hoàn toàn và dat ở vi trí thoáng mát trong điều kiệnphòng thí nghiệm trong 7 ngày Các chỉ tiêu về chiều cao thân (được đo từ gốc đến chóp

lá cao nhat), chiều dài rễ (được đo từ gốc đến chop rễ dài nhất) được quan sát và ghi

nhận.

3.4 Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và phần mén xử ly thống kêMinitab phiên bản 16.2.4 bằng phân tích Anova One-Way phương pháp Tukey’s

Chương 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thu mẫu nốt san rễ và phân lập vi khuẩn

4.1.1 Thu mẫu nốt san rễ

Mẫu nốt san ở rễ được thu thập ở 3 địa điểm thuộc tỉnh Đồng Nai, Cần Thơ vaĐồng Tháp Một số giống đậu được trồng phô biến tại Việt Nam đã được thu thập gồm:Đậu phộng, đậu đen, đậu xanh, đậu đỏ, đậu trắng và đậu đũa Mẫu nốt san ở rễ của các

loại đậu được thu ngẫu nhiên gồm 3 mẫu tại | địa điểm Mẫu được xử lý bước đầu bằng

cách loại bỏ đất ở vùng rễ, rửa sạch qua nước, làm khô bằng khăn giấy và trữ vào ốngchứa mẫu có bông khử trùng và các hạt silica gel (Hình 4 1).

Hình 4.1 Một số mẫu nốt san ở rễ cây đậu phộng (A, B), đậu xanh (C) và mẫu đượcbảo quản trong ống chứa mẫu (D).

Quy trình thu mẫu, xử lý và bảo quản làm theo phương pháp của (Koskey và ctv,

2018; Beshah và Assefa, 2019) Thông tin về mẫu nốt san rễ thu được trình bày ở

Bảng 4.1.

24

Bảng 4.1 Thông tin về các mẫu rễ đậu được thu thập cho thí nghiệm

Loại đậu Ngày thu Số lượng Nguôn mẫu

Huyện Trang Bom, tinh Đông Nai (10°56'36.1"N 107°04'40.6"E)

Mẫu nột sân của cây đậu phộng 20 ngày

Hữmghông Hồ/LU2052 a tudi, dat chuyên canh trồng đậu.

Điều phone 16/11/2022 3 Mẫu nốt sân của cây đậu phộng 30 ngày

tuôi, đất trồng xen canh với cây bắp Đậu phong 16/11/2022 3 Mau not sân của cây đậu phộng 40 ngày

tuôi, đất trồng xen canh với cây rau

Viện lúa ĐBSCL, Ô Môn, Cần Thơ (10°07'23.4"N 105°35'11.1"E)

Mau not sân của cây dau do 40 ngày

guide SƯ ngGg : tuôi, đất trồng chuyên canh cây họ đậu.

Mẫu nốt san của cây đen 45 ngày tuổi,

ĐẦM BH KH ưng = dat trong chuyên canh cây họ dau.

Đậu trắng 26/12/2022 3 Mẫu nốt san của cây trắng 45 ngày tudi,

đất trồng chuyên canh cây họ đậu.

Gao Giéng, huyện Cao Lãnh, tỉnh Đông Tháp (10°38'38.2"N 105°38'16.9"E)

Mau nốt san của cây đậu đũa 50 ngày

Đậu đũa 29/01/2023 3 tuôi, đất phèn trồng chuyên canh cây đậu

đùa.

Đậu đen 29/01/2023 3 Mau not sân của cây đậu den 50 ngày

tuôi, đất cát pha trồng cải

Mẫu nốt san của cây đậu trắng 50 ngày

iu tràng NHÀ gi ý tuổi, đất cát pha trồng cải.

Đầu xanh 29/01/2023 3 Mẫu nốt san của cây đậu xanh 50 ngày

tuổi, đất cát pha trồng cải.

4.1.2 Hình thái các dòng vi khuẩn Rhizobia được phân lập

Nốt san rễ đậu sau khi được thu thập sẽ được chuyền về phòng thí nghiệm trongngày và bảo quản ở nhiệt độ 4°C nhằm tăng tỉ lệ sống của các chủng vi khuẩn cộng sinhtrong nốt san Mẫu nốt san ở rễ được nuôi cấy và phân lập trên môi trường Yeast extractmannitol Congo red agar (YMCA) có chứa CaCO; (4 g/l), ở diéu kién 28°C trong 3đến 7 ngày Các dong vi khuẩn phân lập phát triển trên môi trường YMCA được lựachọn dựa vào hình thái khuẩn lạc với những tiêu chí khác nhau về màu sắc, kích thước,hình dạng, dạng viền và độ ướt của khuẩn lạc

Từ sự quan sát hình thái của các dòng vi khuẩn trên môi trường YMCA có thénhận thấy rằng: Các dòng vi khuẩn đa dạng trong hình thái khuẩn lạc sau 3 đến 7 ngày

nuôi cấy Các khuẩn lạc được chia làm các nhóm có màu trắng đục, hồng nhạt, hồng

đậm, tím hoặc tím nhạt, có tâm hoặc không có tâm bên trong Tổng số 59 dòng vi đãđược phân lập với hình thái khuẩn lạc được trình bay ở Hình 4.2 và Bảng 1 — Phụ lục 2

Trong thí nghiệm này, môi trường YMCA được xem là môi trường đặc hiệu được

sử dụng cho quá trình phân lập và chọn lọc vi khuẩn Rhizobia Congo red và CaCO3

được bổ sung vào môi trường như những chat chi thị màu dé chọn lọc và phân nhóm các

dòng vi khuẩn Rhizobia từ môi trường YMCA Khuan lạc của Rhizobia thường có mautrắng nhưng thường quan sát thấy màu có vẻ đậm hơn trên bề mặt thạch YMCA - màu

đỏ cam Nếu môi trường không bổ sung CaCOs, các chủng vi khuẩn sinh ra axit sẽ làm

cho khuẩn lạc và môi trường chuyên sang mau tím (Kneen va LaRue, 1983) Khả năng

hap thụ Congo red là là đặc điểm để nhận định hình thái khuẩn lạc của Rhizobia Vềhình thái, khuẩn lạc các dòng Rhizobia sẽ có màu trang vì không hap thụ Congo Red,hoặc mau hing nhạt vì có thé hấp thụ lượng nhỏ Congo Red trên môi trường ở điều kiện

26

bóng tối (Somasegaran và Hoben, 1985; Somasegaran và Hoben, 2012) Tuy nhiên, cónhững trường hợp ngoại lệ của các chủng Rhizobia có thé hap thụ Congo red tùy thuộcvào độ tuổi nuôi cấy hoặc nồng độ thuốc nhuộm và mức độ tiếp xúc với ánh sáng dé tạo

ra các khuẩn lạc có màu cam hoặc màu hồng đậm (Kneen và LaRue, 1983; Somasegaran

và Hoben, 1985; Howieson và Dilworth, 2016) Do vậy, những dòng khuẩn lạc được

phân lập có hình thái về màu sắc tương đồng với những mô tả trong những nghiên cứu

về Rhizobia trước đó được lựa chọn

Ngoài ra, theo Soto va ctv (2006), vi khuẩn Rhizobia là một nhóm vi khuẩn gồmnhiều chi và loài khác nhau, không có hình thái điển hình, diễn tả thống nhất cho cácloài thuộc nhóm này (Soto và ctv, 2006) Vì vậy, nhằm tăng khả năng chọn lọc được cácdong vi khuẩn thuộc nhóm Rhizobia, 59 dong phân lập dựa trên hình thái khuẩn lạc đềuđược giữ lại toàn bộ cho các thí nghiệm tiếp theo

4.1.3 Phân loại gram các dòng vi khuẩn đã chọn lọc từ môi trường VMCA

Theo Ormeño-Orrillo va ctv (2016), Rhizobia là nhóm vi khuẩn gram âm, có khảnăng cô định đạm thuộc họ Rhizobiaceae (Ormeño-Orrillo và ctv, 2016) Do đó, phương

pháp nhuộm gram giúp xác định được các dong vi khuan gram âm, đồng thời loại bỏ

các dòng vi khuẩn gram âm giúp cho quá trình chọn lọc và phân lập tiếp cận gần với

mục tiêu phân lập hơn Kết quả nhuộm gram của 59 dòng vi khuẩn chọn lọc dựa trên

hình thái khuẩn lạc trên môi trường YMCA được trình bày trong Bảng 4.2

Bang 4.2 Kết quả nhuộm Gram (G) vi khuẩn phân lập được

TT MẫuG TT MẫuG TT MẫuG TT MawG TT MẫuG

Kết quả nhuộm gram ở Bảng 4.2 cho thấy có 39/59 dòng vi khuẩn thuộc nhóm

vi khuân gram âm, chiếm 66% tông số dòng vi khuan phân lập được Các dòng vi khuẩn

gram âm sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm kế tiếp, 20 dòng vi khuẩn gram dương

được loại ra Một số dong vi khuẩn gram âm bắt màu hồng với thuốc nhuộm được quansát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40X (Hình 4.3)

Hình 4.3 Hình vi khuẩn gram âm của một số dong vi khuẩn ở vật kính 40X

28