Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Đánh giá hiệu quả phát hiện vi rút gây bệnh dịch tả heo châu phi (ASFV) của máy real-time PCR Q16 và PCR truyền thống trên các mẫu thực địa

TÓM TẮTNghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá việc sử dụng phương pháp sinh học phân tử bằng máy real-time PCR q16 Primerdesign Ltd., United Kingdom, một thiết bị cókích thước nhỏ gon, dé

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ;TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HOC

ĐÁNH GIA HIỆU QUA PHAT HIEN VI RUT GAY BỆNH DỊCH

TA HEO CHAU PHI (ASFV) CUA MAY REAL-TIME PCR q16

VA PCR TRUYEN THONG TREN CAC MAU THUC DIA

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : PHAM NGUYEN NGOC CHAU

Mã số sinh viên : 17126010

Niên khóa : 2017 - 2021

TP Thủ Đức, 08/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUÁ PHÁT HIỆN VI RÚT GÂY BỆNH DỊCH

TẢ HEO CHAU PHI (ASFV) CUA MAY REAL-TIME PCR q16

VA PCR TRUYEN THONG TREN CAC MAU THUC DIA

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS.BSTY ĐINH XUÂN PHÁT PHAM NGUYEN NGỌC CHAU

TP Thu Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi muốn cảm ơn đến ban lãnh đạo Trường Đại học Nông Lâm Thànhphố Hồ Chí Minh và khoa Khoa Học Sinh Học đã tạo môi trường học tập năng động

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tiếp đến, tôi xin chân thành cảm ơn TS.BSTY Dinh Xuân Phát, ThS Lê Thị Thu

Hà và các anh chị em, bạn bè đã hỗ trợ tôi thực hiện đề tài và những sự hỗ trợ này là

vô cùng quý giá đối với tôi

Thay Phát là giảng viên hướng dan đề tài vô cùng tâm huyết, luôn luôn lắng nghe

ý kiến, giải đáp thắc mắc cũng như các khó khăn của các bạn sinh viên trong phòng thínghiệm BIO313 trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Và cuối cùng tôi muốn cảm ơn sâu sắc đến những người thân đã luôn động viên,sát cánh, đồng hành cùng tôi trong những lúc khó khăn

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên: Phạm Nguyễn Ngọc Châu, MSSV: 17126010, Lớp: DH17SHB thuộc

ngành Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin camđoan: Đây là Khóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và

thông tin trong nghiên cứu là hoan toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn

chịu trách nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này

Hình ảnh cá nhân Tp Hồ Chi Minh, ngày thang nam 2023

Người việt cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

Phạm Nguyễn Ngọc Châu

i

TÓM TẮT

Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá việc sử dụng phương pháp sinh học phân

tử bằng máy real-time PCR q16 (Primerdesign Ltd., United Kingdom), một thiết bị cókích thước nhỏ gon, dé dang di chuyên nhiều nơi, như là một công cu chân đoán dé

xác định nhanh chóng tác nhân ASFV gây bệnh trên heo dựa trên việc so sánh hiệu

quả phát hiện ASFV giữa phương pháp đi kèm với máy real-time PCR q16 và một quy

trình PCR truyền thống Nội dung của nghiên cứu bao gồm hai phần: đánh giá hiệu

quả phát hiện vi rút ASF của phương pháp đi kèm với máy real-time PCR q16 và một

quy trình PCR truyền thống và xác định kiểu gen của vi rút ASF đang lưu hành trongmẫu thực địa Tổng cộng 41 mẫu thực địa được ly trích DNA gồm 32 mẫu máu và 9mẫu mô được thu thập từ ba tỉnh Bình Dương, Đồng Nai, Tây Ninh Kết quả cho thấy

có 24/26 (92,31%) mẫu khi thực hiện real-time PCR so với 18/26 (69,23%) mẫu khithực hiện PCR truyền thống cho kết quả đương tính với ASFV ở tỉnh Đồng Nai Cáctỉnh Bình Dương và Tây Ninh lần lượt có 13/14 (92,86%) mẫu và 1/1 (100%) mẫu chokết quả đương tính với ASFV ở cả real-time PCR và PCR truyền thống Phân tíchnhóm heo cho thấy 27/29 (93,1%) mẫu so với 22/29 (75,86%) mẫu ở heo nai, 11/12(91,67%) mẫu so với 10/12 (83,33%) mẫu ở heo thịt Tổ hợp qPCR(+)/PCR(-) là 6/41(14,63%) mẫu Một số mẫu dương tính từ ba tỉnh được tiến hành giải trình tự dựa trênvùng gen p72 dé xác định kiểu gen đang lưu hành Kết quả giải trình tự cho thấy các virút được phát hiện đều thuộc kiểu gen II So sánh kết qua của hai phương pháp, ta cóthé kết luận rằng phương pháp đi kèm với máy real-time PCR q16 cho hiệu quả pháthiện ASFV tương đối cao hơn quy trình PCR truyền thống được thử nghiệm trongnghiên cứu này Như vậy, phương pháp đi kèm với máy real-time PCR q16 bước đầu

có thể được sử dụng như một phương pháp chan đoán dé xác định nhanh và hiệu qua

sự hiện diện của tác nhân gây bệnh ASFV.

Từ khóa: African swine fever virus, ASEV, q16 real-time PCR, PCR

il

EVALUATION OF DETECTION EFFECTIVENESS OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS BY q16 REAL-TIME PCR EQUIPMENT AND TRADITIONAL PCR ON

FIELD SAMPLES

The aim of this study was to estimate the usability of molecular method with

genesig ql6 Real-Time PCR Instrument (Primerdesign Ltd., United Kingdom), a equipment has compact size and convenient delivery, as a diagnostic tool for rapid identification of causative agent for African swine fever (ASF) disease in swine based

on the determination of ASF virus detection efficiency by method of real-time PCR

ql6 equipment and an procedure of traditional PCR The study comprised two contents: evaluating the detection efficiency of ASF virus of the method of real-time PCR q16 equipment and the procedure of traditional PCR, and determining the genotypes circulating in the field samples A total of 41 field samples including 32 blood and 9 tissue samples were collected in Binh Duong, Dong Nai and Tay Ninh The results showed that 92,31% (24 out of 26) samples, 69,23% (18 out of 26) samples for real-time PCR and traditional PCR, respectively, positive with ASFV in Dong Nai Binh Duong and Tay Ninh showed that 92,86% (13 out of 14) samples, 100% (1 out of 1) samples, for the real-time PCR and the traditional PCR, respectively, positive with ASFV Analysis for the swine age, 93,1% (27 out of 29) samples compared to 75,86% (22 out of 29) samples in sow; 91,67% (11 out of 12) samples compared to 83,33% (10 out of 12) samples in growing swine The qPCR(+)/PCR(-) combination was 14,63% (6 out of 41) samples The samples were sequenced based on the p72 gene region in order to determine the genotype, all of samples belonged to genotype II Comparing to the results of two methods, it could make conclusion that the method of real-time PCR

q16 equipment has relatively higher ASFV detection efficiency than the procedure of

traditional PCR used in this research Thus, the method of real-trme PCR q16 equipment can be basically used as a diagnostic method to determine quickly and efficiently to the presence of the causative agent of ASFV.

Keywords: African swine fever virus, ASFV, q16 real-time PCR, PCR

Iv

LOT CAM 090 iXÁC NHAN VA CAM ĐOAN 2-2222222222221221122127121122121121122121121 21c xe ii

¡90 91 - iii

Ce iv EEE Vv

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT o c.cccccccccsccessesseessessesssessessuesseseeessessessnessesseessesaes vii

AT SH Bn ENG gan citiitgoaiitrngaUSEA000009)03H8 Gư9GG0 gu viiiDANH SÁCH CÁC HÌNH 2 22222 22E22E22E122112512212211221271121127121121121221 2X ixCHƯƠNG 1 MỞ DAU on eecccccccccccccccsessessessecsessesseeseseesseseesseseessessessessessesiessessesaeseeseeeaeees |1.1 Đặt vấn đề - + s22 1221221212121121111211211212112111121111211121111212122212121 221cc 11.2 Mục tiêu đề tài - +52 2< 2221221212121121121211211112112111121121121211211212111121 22211 re 2

1:5 Gì, dune sth echt 6tiyeceanssenseneeacmecoen em ee 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2 2 ©222222EE+2EE2EEEEE2EE22E2223223222222xe2 32.1 Một số đặc điểm nghiên cứu về ASEV - 2-52 2s2S22E2E22122121212112122211 212 xe 3

DM cic VAL GC ceniacarasionsninsa ancidnieinnnidaciannseasivinoaivninnabitssca'vapenaabesieardasivancreiannng'janntionstaraanelane 3

2.1.2 Cấu trúc của hạt vi rút ASF oo c.ceccecccceceeceesesesseseesceeseessesvsecssesesecsseeveeeeeeeeeveeeseeeees 3

Ag ¬ eneeneeuordrrreeetrereoaoestrtooesgtnntgtognynhorofsgg000000060800195019090100N005E 42.1.4 Khả năng dé kháng - 2-©22©222222221221221221221122122112112212112112211 21121121 e0 4

2.2 Con đường lây bệnh - 2-22 +22221£2E22E1221251221221127127112112711211211211211 2112112 e 5

2.3 Đặc điểm dich tễ 2 -Ss S22 E1 E12121121121112112111211211121111112112111211 111211 rce 5

2.7 Tình hình nghiên cứu tại Việt ÏNam - 2 5 2221221222122 E2E 251251121 11

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 22 +222222E22E22E2Ez2Ezzzz2ze2 12 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu -222222222E+2E+22E22E22E22EE2EEeExrrrrerxres 12

50 cá ST ỚớỚớ Ga lế

325L Wat WCU TP HIEH-GỦbsaeessstosiESTSSE0EEEGGGE GGUENGASGUSBRSSBSESEGEREG0SSEESIGHHS3S:8ãS03/G08S0TNGREBS2B88Sg80088 12

3.2.2 Hoa Chat st Aying N8 886 12

3.3 Thiết bị và dụng CU ccccccccccecsesssessesssessesseessessesanessesesesessessiessesatessesitsesesiesaseseeaeee 12 3.4 Phường pháp nghiên GỨU-:::-escsceesosesseecenossbsssisonegnESSiA00550000819154495346560483000:E0 13 BALL Lay wich DMA từ mẫu thự ÌM ke 021020010.000x 0e 13 3.4.2 Phản ứng PCR truyền thống 22 ©52©2222222EE22E22EE22E22E222E222221 2222, 14 3.4.3 Phan ứng real-time PCR bằng máy real-time PCR ql6 -2-52-5 15 3.4.4 Giải trình tự mẫu DNA - 5-2522 2E2E25552E52121212122112121212121112121112112 22 xe 15 3.4.5 Xử lí số liệu - 2+2 ©2+212E22EE21211212112112111211211121121111121112112101211 21220 l6 3.4.5.1 Sự đồng thuận kết quả đánh giá của hai phương pháp - 1

3.4.5.2 Ý nghĩa thống kê của số liệu nghiên cứu -2¿22222+22++2z++2zzz2zzz+- Tý CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-2222 c2 E222CEECEcrerrerree 18 4.1 Đánh giá hiệu quả phát hiện vi rút ASF của phương pháp di kèm với máy 18

4.1.1 Tỉ lệ phát hiện vi rút ASF trong mẫu thu thập ở các tỉnh thành 18

4.1.2 Tỉ lệ phát hiện vi rút ASF trong mẫu thu thập theo độ tuôi -. - 20

4.1.3 Sự tương quan kết quả giữa phương pháp đi kèm với máy real-time PCR 21 4.2 Xác định kiểu gen đang lưu hành trong mẫu thực địa -: +55 23

7S WG-0 (01 25

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ - 2: 2+22+S2SE2E12E22E221252122121221 22222 ce 27 5.1 Kết luận 2-52 222E22E2122112112112112112121121121121121121211211211121211121 re 27

BE, EEÔ ee 2 (oS tM |: eveeseeeerseesetsoronersstseweovnessgoesaessreea 28

0080059257 — ) HH ÔÒÔỒỎ

vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

ASFV : African Swine Fever Virus

ANOVA : Analysis of Variance

Ct : Cycle Threshold

CPE : Cytopathic Effect

CSFV : Classical Swine Fever Virus

DMEM : Dulbecco’s modified Eagle’s medium

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA : Enzyme — linked Immunosorbent Assay

FAT : Fluorescent Antibody Test

FMDV : Foot-and-mouth disease virus

HAD : Haemadsorption

HADU : Haemadsorption unit

IBT : Immunoblotting Test (Western Blotting)

ICTV : International Committee on Taxonomy of Viruses

IFAT : Indirect Immunofluorescence Antibody Test

IPT : Indirect Immunoperoxidase Test

Kb : Kilobase

OIE : Office International des Epizooties

ORF : Open Reading Frame

PAM : Pulmonary Alveolar Macrophage

PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cell

PBS : Phosphate Buffered Saline

PCR : Polymerase Chain Reaction

PEDV : Porcine epidemic diarrhea virus

PRRSV : Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Real-time PCR : Real-time Polymerase Chain Reaction

TBE : Tris Borate Ethylenediamine tetraacetic acid

TCIDs0 : 50% Tissue Culture Infectious Dose

TE : Tris Ethylenediamine tetraacetic acid

Vil

Bảng 3.1.

Bảng 3.2.

Bảng 3.3.

Bảng 3.4.

Bảng 3.5.

Bảng 4.1.

Bảng 4.2.

Bảng 4.3.

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Thanh phan phan ứng của phương pháp PCR truyền thống 14

Chu trình nhiệt phản ứng của phương pháp PCR truyền thống 14

Trinh tự mỗi của phản ứng PCR truyền thống -. -2 52-555-: 14 Cặp môi thiết kế dùng dé khuếch đại vùng gen p72 - 2 2552552 16 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại vùng gen p72 16

So sánh số mẫu âm tính và dương tính ở các tỉnh thành - - 18

So sánh số mẫu âm tính và đương tính theo độ tuôi . - 20

Tổ hợp phân tích thể hiện sự tương quan của hai phương pháp 22

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của hạt vi rút ASEV 2 2222222E2E32E52522122121212112121211 212 xe 4Hình 3.1 Quy trình ly trích mẫu thực địa 2-2 2522 £S22S+S2E2E££E2E£EZEzEzzzxezzcez 13

Hình 3.2 Quy trình thực hiện phản ứng real-time PCR - 5 5< c+<c+-c+ec+s 15

Hình 4.1 Biéu đồ thé hiện tỉ lệ phát hiện ASFV trong mẫu thu thập - 19Hình 4.2 Biéu đồ thé hiện tỉ lệ phát hiện vi rút ASF theo độ tuôi - 21Hình 4.3 Cây di truyền xác định kiểu gen ASF dựa trên gen p72 -2- 24

1X

CHƯƠNG 1 MỞ DAU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một quốc gia đang phát triển, có thé mạnh về nông nghiệp, là ngànhkinh tế quan trọng của nước ta Năm 2009, giá trị sản lượng của nông nghiệp đạt71,473 nghìn tỷ đồng, tăng 1,32% so với năm 2008 và chiếm 13,85% tổng sản phẩmquốc nội Trong đó, ngành chăn nuôi là ngành đóng vai trò quan trọng, góp phần đáng

kể trong cơ cấu nông nghiệp nước ta Tuy nhiên, ngành chăn nuôi hiện nay đang gặpphải nhiều thách thức, điều này gây ảnh hưởng lớn đến người chăn nuôi nói riêng cũngnhư sự phát triển bền vững của toàn ngành nói chung và mảng chăn nuôi heo là một

trong những lĩnh vực đáng chú ý.

Trong khoảng thời gian từ năm 2018 đến 2019, ngành chăn nuôi thé giới đã phảiđối mặt với một dịch bệnh rất nghiêm trọng mang tên “dịch tả heo châu Phi” do vi rút

địch tả heo châu Phi (ASFV) gây ra Đây là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm với tỉ lệ

nhiễm bệnh và tỉ lệ tử vong rất cao, đa phần heo nhiễm bệnh sẽ chết và tỉ lệ tử vongđược ghi nhận lên đến 100% (Blome và ctv, 2020) Vào ngày 19/02/2019, Chi cục Thú

y Việt Nam ghi nhận ô dịch đầu tiên tại Hưng Yên và Thái Bình đồng thời tại các khuvực khác của châu Á như Hàn Quốc, Indonesia, Philippine cũng ghi nhận nhiềutrường hợp nhiễm ASEV trước đó Theo tổ chức thú y thế giới (OIE) tinh từ đầu năm

2017 đến ngày 18/02/2019, thế giới đã có 20 quốc gia báo cáo xuất hiện dịch tả heochâu Phi (DTHCP), trong đó Trung Quốc là quốc gia chịu thiệt hại nặng nề nhất Kiểugen I và II được xác định đang chiếm ưu thé tại nhiều quốc gia xuất hiện DTHCP chothấy tỉ lệ tử vong cao hơn so với các kiểu gen còn lại, trong đó kiểu gen II được ghinhận là kiểu gen phô biến ở các nước châu Âu và chau A

Dịch tả heo châu Phi đã khiến nhiều nước buộc phải tiêu hủy số lượng heo lớn,ước tính tổng số heo buộc phải tiêu hủy trên toàn thế giới lên đến hàng trăm triệu con.Theo thống kê của OIE, tổng đàn heo của thế giới vào tháng 1 năm 2020 đạt khoảng

678 triệu con, giảm gần 12% so với cùng kỳ năm 2019 với tổng đàn heo ước tinhkhoảng 768 triệu con Trung Quốc là nước chịu thiệt hại nghiêm trọng nhất trong đợtbùng phát dịch này Cũng theo thông tin của OIE, tổng đàn heo của Trung Quốc tháng

1 năm 2020 là 335 triệu con, giảm 53% so với 710 triệu con trước khi có dịch bệnh.

Thời gian dé kiểm soát dich tại Trung Quốc là 17 tháng Tại Việt Nam, vào năm 2021

chi cục Thú y Việt Nam đã báo cáo rằng cả nước đã phải tiễn hành tiêu hủy hơn 5 triệu

cá thé tính đến ngày 22/09/2019 dé lại thiệt hại rất lớn cho nền nông nghiệp nước nha,dịch bệnh đã phát sinh tại 47 xã trong 5 tháng đầu năm 2020, cụ thé có 25 xã mới códịch và 22 xã tái phát dịch Như vậy, DTHCP đã lây lan đến nhiều quốc gia trên thếgiới, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo thế giới đồng thời ảnh hưởng đáng kếđến chuỗi cung ứng thịt heo toàn cầu Song song đó, DTHCP còn cho thấy nhữngđiểm yếu trong lĩnh vực chăn nuôi thú y, trong công tác phòng, kiểm soát dịch bệnh tạichâu Á nói chung và Việt Nam nói riêng trong bối cảnh vắc xin phòng bệnh hiệu quảchưa có Chính vì thế, việc phát hiện sớm tác nhân gây bệnh này đóng vai trò cấp thiếttrong công tác phòng chống bệnh DTHCP Hiện nay, thị trường có nhiều loại hệ thốngreal-time PCR nhưng nhược điểm chung tốn kém nhiều chi phí lắp đặt và vận hành

Với kích thước nhỏ gon, may real-time PCR q16 (Primerdesign Ltd, England) là một

thiết bị real-time PCR đi kèm với bộ kit được thiết kế đặc hiệu cho máy, được hiểu là

phương pháp real-time PCR đi kèm với máy q16, là một trong những lựa chọn hiệu

quả Đề tài này được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả phát hiện ASFV của phươngpháp đi kèm với máy real-time PCR q16 và một quy trình PCR truyền thống trên các

mẫu thực địa.

1.2 Mục tiêu đề tài

Đánh giá hiệu qua phát hiện ASFV giữa phương pháp đi kèm với máy real-time PCR

q16 và một quy trình PCR truyền thống và xác định kiểu gen lưu hành của ASFV trênmẫu thực địa

1.3 Nội dung thực hiện

1 Đánh giá hiệu qua phát hiện vi rút ASF của phương pháp đi kèm với may real-time

PCR q16 và một quy trình PCR truyền thống

2 Xác định kiêu gen của vi rat ASF đang lưu hành trong mẫu thực địa

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Một số đặc điểm nghiên cứu về ASFV

2.1.1 Phần loại học

Vi rút dich tả heo Châu Phi (ASFV) được phân loại là loài duy nhất của chi

Asfivirus, thuộc họ Asfaviridae (Dixon va ctv, 2005) Vào tháng 7 năm 2019, Uỷ ban

quốc tế về phân loại vi rút (ICTV) đã công bố rằng họ Asfaviridae thuộc bộ

Asfuvirales, lớp Pokkesviricetes (Alonso và ctv, 2018) Bên cạnh danh pháp chính thức

này, một số tranh cãi xoay quanh cách phân loại này đã xếp ASFV vào bộ Megavirales

(Andres và ctv, 2020).

2.1.2 Cau trúc của hat vi rút ASF

Hat vi rút (virion) của ASFV mang thông tin di truyén là một sợi DNA xoắn kép,

không đóng vòng, có kích thước từ 170 — 193 kb Bộ gen chứa khoảng 150 — 167

khung đọc mở (ORF) với vùng bảo tồn có kích thước khoảng 125 kb và hai đầu biếnđổi có kích thước lần lượt là 38 — 48 kb, 13 — 22 kb (Dixon và ctv, 2019) Các trình tựđầu và cuối của bộ gen là các trình tự lặp lại đối xứng đảo ngược có khả năng đóngvòng tạo thành những cấu trúc kẹp tóc (Salas và Andrés, 2013) Bộ gen mã hóa chonhiều protein khác nhau liên quan đến quá trình lắp ráp, tái bản, sửa chữa DNA (Reis

và ctv, 2017) Nhìn chung, cấu trúc của một hat vi rút rất phức tạp có đường kính là

175 — 215 nm, nằm ở trung tâm vùng nhân (nucleoid) là một axit nucleic liên kết với

protein (nucleoprotein) có đường kính 70 — 100 nm, một lớp vỏ lõi được bao bọc bởi một lớp màng don lipid, bên ngoài là lớp vỏ capsid đôi được hình thành từ 1892 —

2172 capsomer, ngoài cùng là lớp màng ngoài lipid (envelope) (Alonso và ctv, 2018; Salas va Andrés, 2013) (Hình 1.1) Theo Qu va ctv (2022), gen B646L mã hóa cho

protein p72, yếu tố lây nhiễm chủ yếu của ASFV và cho phép phân loại các chủngASFV thành 24 kiểu gen I — XXIV Có 68 protein cau trúc được xác định có hiện điệntrong các hat vi rút có đường kính 200 nm, chiếm 39% khả năng mã hóa của bộ gen,

44 polypeptide liên quan đến đóng gói hạt vi rút và một nửa trong số đó vẫn chưa xác

định rõ chức nang (Alejo va ctv, 2018) Hơn 100 protein được xác định có liên quan

đến khả năng lây nhiễm ở đại thực bao của heo nhiễm bệnh, trong số đó có ít nhất 50

protein có phản ứng huyết thanh học ở các heo bị nhiễm hoặc đã hồi phục

Hình 1.1 Cấu trúc của hạt vi rat ASFV Bên trái là hình chụp dưới kính hiển vi

điện tử của một hạt vi rút ASFV được cô định hóa học bằng resin; bên phải là hình

vé 2D mô phỏng lại cau trúc của hạt vi rút ASFV (Blome và ctv, 2020).

2.1.3 Nuôi cấy

Vi rút DTHCP xâm nhiễm các tế bào bạch cầu đơn nhân, tế bào bạch cầu trungtính, các tế bào đại thực bao ở tủy xương và trong máu, tế bao thận, tế bào gan

(Wilkinson và ctv, 1978; Casal và ctv, 1984; Sierra va ctv, 1987) Vi rút DTHCP được

nuôi cấy trên các loại tế bao như tế bao đại thực bào phế nang phối (PAM), tế bao sơcấp tủy xương (PBMC), Cos | hay Vero (Knudsen và ctv, 1987; Carrascosa và ctv,1982; Carrascosa va ctv, 2011) Trước tiên, ta áp dụng quy trình chuẩn bị mẫu nhằmthu nhận tế bào từ heo nhiễm ASFV tùy theo từng loại tế bào, chẳng hạn như tế bào sơcấp tủy xương (Enjuanes và ctv, 1976), tế bào đại thực bào phế nang phôi (Carrascosa

và ctv, 1982) Tiếp theo, ta chọn dòng tế bào mục tiêu cho quá trình nuôi cấy, các dòng

tế bào mục tiêu thường được sử dụng như Cos | hay Vero có nguồn gốc từ khi Kế đến,

tế bao sẽ được nuôi cấy trên môi trường phù hợp (phổ biến là môi trường DMEM), sau

đó tiến hành lây nhiễm và thu nhận các tế bao nhiễm ASFV đã tăng sinh

2.1.4 Khả năng đề kháng

Năm 2019, theo Cục Thú y, ASFV có sức đề kháng cao, có thê tồn tại trong máu,phân và mô, trong xác động vật, thực phẩm được chế biến từ thịt heo như xúc xích,giăm bông Vi rút tồn tại trong thịt đông lạnh đến 15 tuần, đến 6 tháng đối với giămbông bảo quản và 399 ngày đối với giăm bông Parma (Vizcaino và ctv, 2009;McKercher và ctv, 1978; Mebus va ctv, 1993) Vi rút tồn tại ở nhiệt độ 56°C trong 70

phút hoặc ở 60°C trong 20 phút (Mebus và ctv, 1997) Vi rút tồn tại trong máu dạnglỏng ở nhiệt độ phòng trong 18 tháng và lên đến 6 năm ở nhiệt độ 4°C (Blome và ctv,

2020): trong máu đã khô được 70 ngày, trong giăm bông được 140 ngày và ở nhiệt độ

50°C tổn tại trong 3 giờ (Cục Thú y, 2019); trong phân chuồng ở nhiệt độ phòng được

11 ngày (Africarne và ctv, 2019) Theo Cục thú y (2019), trong lách heo ASFV được

bảo quản ở nhiệt độ sâu (-20°C đến -70°C) có thể tồn tại trong 82 đến 105 tuần vàkhong phát hiện ASFV trong thịt heo được nấu chín ở nhiệt độ 70°C

Trong môi trường không có huyết thanh, vi rút có thể bị bat hoạt ở điều kiện pH <

3,9 hoặc pH > I1,5 (Mebus và ctv, 1997); trong môi trường với 25% huyết thanh với

pH = 13.4, vi rút có thê tồn tại được trong 7 ngày và khi không có huyết thanh vi rút cóthé tồn tại được 21 giờ (OIE, 2019) Theo Cục Thú y (2019), ASFV man cam với ether,

chloroform, có thể bất hoạt vi rút bằng 0,8% sodium chloride, hop chat iodine,

hypochlorites có chứa 2,3% chlorine, 0,3% formalin hoặc ortho-phenylphenol 3% và

phải duy trì thời gian 30 phút.

2.2 Con đường lầy bệnh

ASFV có thê lây nhiễm từ đường tiêu hóa, đường hô hấp hoặc qua các tiếp xúctrực tiếp, gián tiếp với nguồn lây bệnh như heo nhiễm bệnh, chuông trại, phương tiệnvận chuyển, dụng cụ, đồ dùng, quần áo nhiễm vi rút, thức ăn của heo nhiễm bệnh

(Penrith và Vosloo, 2009; Cục Thú y, 2019; Blome và ctv, 2020).

2.3 Đặc điểm dịch té

Montgomery là người đầu tiên mô tả DTHCP ở Kenya vào năm 1921 (Luo và ctv,2017; Tran Thanh Thi Ha, 2019; Blome va ctv, 2013) Vi rút bắt nguồn từ heo rừngsau đó lây lan từ heo rừng sang heo nhà với tỉ lệ tử vong lên đến 100% Ké từ đó, bệnhđược công nhận như một bệnh dịch địa phương ở nhiều nước Châu Phi như Angola,

Mozambique, Nam Phi, Senegal, São Tomé va Principe Sudan, Uganda và Zimbabwe

(Blome va ctv, 2013) Năm 1957, DTHCP được phát hiện lần đầu tiên bên ngoài ChâuPhi Bệnh xuất hiện ở Lisbon (Bồ Đào Nha) được xác định ở thê bán cấp tính Sau đóbệnh xuất hiện ở Malta, Sardinia (Y), Brazil, Cộng hòa Dominica, Haiti và Cuba Heonhà là loài động vật dễ bị lây nhiễm vi rút DTHCP từ tự nhiên Heo rừng Châu Âu dễ

bị nhiễm ASFV và xuất hiện các triệu chứng lâm sàng, có tỉ lệ tử vong cao DTHCPđược lưu hành ở Châu Phi bởi vòng tuần hoàn lây truyền giữa các loài heo hoang đã và

ve mềm Một số loài ve mềm như Orithodoros moubata ở Châu Phi và Orithodoroserraticus ở ban đảo Iberia là nguồn chứa và là vector sinh học của ASFV (Blome và

ctv, 2020).

2.4 Chan đoán

2.4.1 Chan đoán lâm sàng

2.4.1.1 Triệu chứng

Triệu chứng bệnh DTHCP rất giống với các bệnh địch tả heo cổ điển, bệnh heo tai

xanh, bệnh đóng dấu son, bệnh tụ huyết trùng như tím tái, nôn mửa, tiêu chảy ra máu,

sốt thể ban xuất huyết, heo nái sảy thai (Blome và ctv, 2012) Thời gian ủ bệnh của

heo nhiễm bệnh thường kéo dài từ 2 — 7 ngày, thậm chí lên tới 14 ngày (Mebus, 1987).

Tùy theo độc lực của chủng vi rút, tuổi heo, khả năng đáp ứng miễn dịch của từng cáthé mà các triệu chứng lâm sàng biểu hiện khác nhau đáng ké (Blome và ctv, 2012).Bốn giai đoạn bệnh được ghi nhận sau khi heo nhiễm bệnh gồm thé quá cấp tính, thécấp tính và bán cấp tính, thé 4 cấp tính, thé mãn tính Ở thé quá cấp tính, heo chếtnhanh, thường không có dau hiệu lâm sàng hoặc có thé nằm và sốt cao trước khi chết,

tỉ lệ heo chết đến 100% trong 7 — 10 ngày (Blome và ctv, 2012) Ở thể cấp tính và báncấp tính, heo sốt cao trên 41°C, heo không ăn, lười vận động, trên vùng da trắngchuyển sang màu đỏ ở các vùng đuôi, tai, cang chân trong 2 — 3 ngày đầu tiên Trướckhi chết, heo đi lại không vững, có bọt lẫn máu ở mũi, nôn mir, tiêu chảy đôi khi cólẫn máu, heo thường chết từ 6 — 20 ngày, tỉ lệ heo chết khoảng 70% (Dixon va ctv,2019; Cục Thú y, 2019) Ở thé 4 cấp tính, heo thường sốt nhẹ hoặc không sốt, giảmcân, lười ăn, ho và khó thở Heo chết sau khoảng 15 — 45 ngày, tỉ lệ chết ở giai đoạnnày khoảng 30 — 70%; heo không chết có thể chuyền sang giai đoạn mãn tính Ở thêmãn tính, heo bị rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy, táo bón, có thể kèm theo ho, khó thở

Tỉ lệ heo chết ở giai đoạn này không cao như các thể bệnh khác, heo khỏi bệnh nhưngvẫn còn mang vi rút và là nguồn nhiễm bệnh sau này (Dixon và ctv, 2019; Cục Thú y,

2019).

2.4.1.2 Bệnh tích

Có nhiều dạng bệnh tích khác nhau được quan sát ở các chủng độc lực khác nhau(Penrith và Vosloo, 2009) Ở thể cấp tính và bán cấp tính, bệnh tích đặc trưng là xuấthuyết lan rộng và các mô lympho bị phá hủy Đối với thể mãn tính, heo ít xuất hiện

bệnh tích và thường không xuất hiện (Carrasco và ctv, 1997; Blome và ctv, 2020) Ở

6

thé cấp tinh, bệnh tích dai thé chính được quan sát ở lách, hạch lympho, thận va tim; lálách có thé bi sam mau, sưng to, nhồi huyết; các hạch lympho xuất huyết, phù nề; thận

xuất huyết kim châm ở vỏ thận (Carrasco và ctv, 1997) Ngoài ra, heo còn xuất hiện

dịch trong các xoang, xuất huyết điểm trên niêm mạc bàng quang, phổi và trong một

số trường hợp ghi nhận hiện tượng xuất huyết ở màng ngoài tim Ở thé bán cấp tính,bệnh tích được đặc trưng bởi hiện tượng xuất huyết mảng rộng trên hạch lympho; thận,lách sưng to, xuất huyết, sung huyết và phù nề ở phối (Carrasco và ctv, 1997)

2.4.2 Chan đoán phòng thí nghiệm

2.4.2.1 Chan đoán kháng nguyên

PCR truyền thống và PCR định lượng (real-time PCR): kĩ thuật PCR cho phépphát hiện DNA của ASFV trước khi cá thé xuất hiện các triệu chứng lâm sàng Độ đặchiệu, độ nhạy, thời gian phát hiện ASFV của kĩ thuật PCR chỉ trong vai giờ thay thécho phương pháp phân lập vi rút truyền thống Song song đó, kĩ thuật real-time PCR làmột sự cải tiến từ kĩ thuật PCR truyền thống, cho phép phát hiện ASFV ở nồng độ ratthấp, ngay cả khi không phân lập được vi rút bằng phương pháp phân lập, với độ đặc

hiệu cao, độ nhạy cao, đáng tin cậy (Luo và ctv, 2017) Trong ấn phẩm “Manual of

Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Anihals” được xuat ban nim 2016,phương pháp PCR va real-time PCR được khuyến nghị sử dung va là một trong nhữngphương pháp hiệu quả, tiết kiệm thời gian và trở thành lộ trình chân đoán bệnh

DTHCP nhanh chóng qua các năm bởi OIE.

Kĩ thuật kháng thể huỳnh quang (FAT): Phương pháp được sử dụng phát hiệnkháng nguyên ASFV ở mô heo nghi mắc bệnh, mô nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và

có hiệu quả cao ở các mẫu không quan sát được hiện tượng hấp phụ hồng cầu bằngphản ứng HAD (OIE, 2019) FAT dựa trên sự kết hợp giữa kháng thể đánh dấu có gắnchất phát huỳnh quang (fluorescein isothiocyanate hoặc tetramethyl rhodamine

1sothiocyanate) và kháng nguyên trong mô, có khả năng phân biệt được các tác động

gây bệnh tế bao (CPE) do ASFV và các vi rút khác như vi rút gây bệnh Aujeszky (OIE,2019) Kết quả được quan sát dưới kính hiển vi quang học huỳnh quang có độ lọcthích hợp Tuy nhiên ở thê bán cấp tính và mãn tính, độ nhạy của FAT sẽ bị giảm đáng

ké, điều này có thé xuất phát khi xuất hiện phức hợp kháng nguyên - khang thé của

heo bệnh, những phức hợp này ngăn can quá trình tương tác của kháng nguyên ASFV

và kháng thé đánh dấu (Sánchez-Vizcaíno và Arias, 2012)

7

Kĩ thuật ELISA: ELISA cũng là một phương pháp huyết thanh học dựa trênnguyên tắc sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể ELISA không đượcxem là phương pháp tôi ưu dé phát hiện kháng nguyên ASFV vi độ nhạy thấp hon sovới phương pháp PCR va HAD Mặc dù vậy, các bộ kit được cấp phép sử dụngnguyên lý Sandwich ELISA vẫn được chấp nhận thương mại hóa, hỗ trợ phát hiệnnhanh kháng nguyên “capsid protein” trong máu, nốt lympho, lách tùy vào khuyếnnghị từ nhà sản xuất (OIE, 2019).

Phân lập vi rút: dựa trên việc nuôi cấy vi rút trên môi trường tế bào sơ cấp như môitrường chứa các tế bao bạch cầu đơn nhân, đại thực bao, tế bào tủy xương có nguồngốc từ heo không nhiễm bệnh Nếu mau hiện diện ASFV thì vi rút sẽ nhân lên trong tếbào tạo ra CPE lên tế bào bị nhiễm (OIE, 2019)

Phản ứng hấp phụ hồng cầu (HAD): dựa trên hiện tượng hấp phụ các tế bào hồngcầu trên bề mặt tế bào bị nhiễm, hầu hết mỗi chung ASFV sẽ có một kiểu hình HAD

tương ứng (OIE, 2019) Song song với việc xác định sự hiện diện của ASFV sau phân

lập bang HAD, người ta có thé thực hiện phương pháp kháng thé huỳnh quang (FAT).FAT nên được ưu tiên lựa chọn hơn vì phương pháp này không chịu tác động của kiểuhình HAD Các mau này sau đó nên được tái khang định bằng phương pháp PCR hoặcgiải trình tự nhằm thu được kết quả chính xác nhất (OIE, 2019)

2.4.2.2 Chan đoán khang thé

Ki thuật ELISA: Phuong pháp được xem là hữu ich, được sử dung phô biến nhấttrong việc xác định, sàng lọc cá thể nhiễm bệnh ở quy mô lớn Năm 2019, theo Chi

cục thú y Việt Nam, phương pháp ELISA được công nhận, sử dụng rộng rãi là ELISA

gián tiếp (Indirect ELISA) va ELISA cạnh tranh (Blocking ELISA) Hiện tại các kitELISA thương mại chan đoán khang thé dựa trên nguyên ly ELISA cạnh tranh hoặcELISA gián tiếp được chấp thuận và được áp dụng tại nhiều khu vực có đặc điểm dịch

tễ khác nhau, song kết quả ELISA cần được xác định lại bằng phương pháp khác nhưIFAT, IPT, IBT trong trường hợp ELISA không cho kết quả rõ ràng (Cục thú y, 2019)

Kĩ thuật IPT: Phương pháp IPT phát hiện phức hợp kháng nguyên — kháng thê trêncác tế bào cố định thông qua phản ứng của enzyme peroxidase Theo Gallardo và ctv(2015), IPT có độ nhạy và hiệu quả tốt nên có thể xem đây là phương pháp tốt nhấttrong việc phát hiện kháng thé ASFV trong máu, mẫu dang lỏng hoặc dich tiết từ mô.Bên cạnh đó, IPT cũng được đánh giá là một trong các phương pháp hiệu quả dé xác

§

nhận lại kết quả của các mẫu huyết thanh cho kết quả ELISA âm tính, dương tính, ké

cả các mẫu không xác định được kết quả bằng ELISA ở các vùng dịch địa phương

(OIE, 2019).

Kĩ thuật miễn dịch kháng thé huỳnh quang gián tiếp (IFAT): IFAT là phương phápphát hiện từng phan riêng biệt trong tế bao dựa trên sự liên kết đặc hiệu của khángnguyên và khang thé IFAT cũng được xem như là phương pháp xác nhận lại kết quacủa các mẫu huyết thanh có phản ứng ELISA không rõ ràng từ các vùng dịch địaphương hoặc các mẫu huyết thanh cho kết quả ELISA dương tính tại các vùng chưa

ghi nhận dịch té hoặc chưa ghi nhận dịch bệnh bùng phat (OIE, 2019).

Ki thuật IBT: IBT, còn được gọi là “western blotting”, dựa trên sự liên kết đặchiệu giữa epitope của protein mục tiêu và kháng thé Kháng thé sơ cấp liên kết đặchiệu với epitope của protein mục tiêu, trong khi đó kháng thể thứ cấp liên kết đặc hiệuvới kháng thé sơ cấp và có thé được đánh dấu bang enzyme (horseradish peroxidase),sau đó tiễn hành bổ sung cơ chat thích hợp với enzyme và kết quả được quan sát bằngphản ứng giữa enzyme và cơ chất IBT cũng được xem như phương pháp thay thế chophương pháp IPT và IFAT để xác nhận kết quả không rõ ràng cho mẫu huyết thanhcủa từng cá thê (OIE, 2019) Kĩ thuật này cũng cho kết quả phù hợp đối với các mẫudương tính yếu khi phát hiện kháng thể của ASFV từ tuần thứ hai sau nhiễm bệnh

(Pastor và ctv, 1989).

2.5 Phòng và kiểm soát dịch

Về kiểm soát, tiến hành phong tỏa ngay khi phát hiện 6 địch, tiêu hủy toàn bộ sốlượng heo nhiễm bệnh, sau đó thực hiện tiêu độc, khử trùng khu vực nhiễm bệnh Theocục chăn nuôi thú y Việt Nam, chính quyền địa phương cần thành lập các tổ công tácđôn đốc người dân thực hiện các biện pháp vệ sinh chuồng trại (bôi hóa chất, chế

phẩm sinh học, khử trùng trang trại ), khi có dịch phải xử lí 6 dịch kịp thời, không délây lan diện rộng đồng thời rà soát, thống kê số hộ nuôi heo, số lượng heo chăn nuôi tại

dia ban.

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam, tổng số đàn heo của cả nước vàothang 1 năm 2021 tăng khoảng 16,2% so với cùng thời điểm năm 2020 Tổng đàn heocủa cả nước đạt khoảng 27,3 triệu con tính đến cuối tháng 12 năm 2020, tương đương88,7% so với tổng đàn heo trước khi địch xuất hiện Trong hai tháng đầu năm 2021,

dịch chỉ xảy ra ở phạm vi hẹp, số heo phải tiêu hủy khoảng 2000 con Đây là tín hiệutốt trong công tác khắc phục, phòng, chống DTHCP tại thời điểm này.

Hiện nay, thế giới chưa có vắc-xin chính thức phòng ngừa bệnh nhưng một sốnghiên cứu vắc-xin phòng bệnh và chiến lược phát triển vắc-xin đã cho thấy tiềm năng,triển vọng đối với công tác phòng chống ASFV hiệu quả của ngành chăn nuôi heo thégiới (Trương Quang Lâm và ctv, 2020) Việt Nam đã thử nghiệm vắc-xin do chínhViệt Nam nghiên cứu và sau 5 lần thử nghiệm đều cho kết quả khả quan Vắc-xin

“made in VietNam” cho thấy kha năng bảo hộ khoảng 100% số heo được tiêm, đápứng miễn dịch 94,7%, khi áp dụng vào quy mô sản xuất thì khả năng bảo hộ là 80% sốheo được tiêm (Báo tuổi trẻ, 2022)

2.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện tại, một số gen được sử dụng để nghiên cứu tác nhân gây bệnh ASFV như

gen B646L (p72), gen E183L (p54), gen CP204L (p30), gen EP402R (CD2v), gen

D113L (DP96) Năm 2005, Zsak va ctv đã phát triển thành công quy trình one-stepTaqman real-time PCR dựa trên vùng gen p72 như một phương pháp chan đoán tiềnlâm sàng đối với heo phơi nhiễm ASFV ở giai đoạn sớm Năm 2016, Gallardo và ctv

đã sử dụng protein tái tổ hợp p30 như một kháng nguyên trong phương pháp ELISAgián tiếp vì gen CP204L mã hóa protein p30 có tính kháng nguyên cao (Olievedo vàctv, 1997), hai protein tái tổ hợp p54 và p72 là các đối chứng kiểm soát sự lây nhiễmchéo Tháng 4 năm 2020, Wang và ctv phát triển quy trình real-time PCR dựa trên

vùng gen p72 có độ bao phủ trình tự, phạm vi vật chủ rộng hơn so với phương pháp

của Zsak cho thấy độ nhạy thử nghiệm 98,4% của tất cả trình tự vùng gen p72 được

khảo sát, giới hạn phát hiện thử nghiệm là 6 plasmid/phản ứng và độ đặc hiệu thử

nghiệm là 100% Năm 2022, Yang và ctv phát triển quy trình triplex real-time PCR.dựa trên gen B646L, MGF 360-14L, và CD2v có giới hạn phát hiện lần lượt là 78,9;47; 82,1 bản sao/ul đồng thời có khả năng phát hiện các chủng vi rút thuộc kiểu gen I.Trong những năm gần đây, hàng loạt các cải tiến của kĩ thuật PCR và real-timePCR liên tục được thực hiện Tháng 7 năm 2016, Luo và ctv phat triển thành công quytrình PCR cho giới hạn phát hiện là 60 bản sao vả có 59/62 mẫu dương tính ASFV khi

sử dụng đồng thời quy trình PCR mới được phát triển và quy trình real-time PCR doOIE khuyến nghị, trong đó 2 mẫu âm tính với quy trình PCR do OIE khuyến nghịnhưng lại đương tính với quy trình PCR mới, kết qua này đã được tái khang định bang

10

phương pháp real-time PCR Tháng 3 năm 2019, Wang và ctv phát triển quy trình

real-time PCR mới dưới dạng bột đông khô cho giới hạn phát hiện ASFV là 10 bản

sao/ml cao hơn so với quy trình OIE khuyến nghị, các mẫu dương tinh cho giá trị Cr <

32 (các mẫu có nồng độ vi rút cao có giá trị Cị < 25) Tháng 4 năm 2020, Lin va ctv

xây dựng quy trình triplex — qPCR có khả năng phát hiện và phân biệt ASFV chủng

gốc khi sử dụng gen B646L trong nghiên cứu và chủng ASFV đã xóa hai genMGF360-505R và CD2v cho giới han phát hiện lần lượt là 7,9 bản sao; 9,7 bản sao;

9,6 bản sao tương ứng với các plasmid DNA tinh sạch chứa gen B646L, gen

MGF360-14L và gen CD2v Tháng 12 năm 2020, M.Agiiero va ctv xuất bản nghiêncứu sử dụng phương pháp hot start PCR với cặp môi PPAA-1/2 cho giá trị HADUso=0,12 cao hon cặp mỗi OIE khuyến nghị đối với 22 chủng từ mẫu thực địa được thuthập ở các địa điểm và thời điểm khác nhau

2.7 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam, các phương pháp phát hiện ASFV liên tục được phát triển qua cácnăm Ngày 24/12/2019, Tran Thanh Thi Ha và ctv đã công bố một nghiên cứu nhằmcải tiến độ nhạy của real-time PCR bằng mẫu dò (probe) OIE khuyến nghị kết hợpthay đổi một nucleotide trong trình tự mẫu dò Nghiên cứu cho thấy 4/7 mẫu dươngASFV đã biết cho kết quả real-time PCR dương tính khi sử dụng mau dò OIE, trongkhi đó mẫu dò được cải tiến cho kết quả 7/7 mẫu dương bao gồm phát hiện được cảmẫu gây đột biến Tháng 6 năm 2020, Trương Quang Lâm và ctv đã gây nhiễm chủng

vi rút VNUA - ASFV - L01 cho bốn cá thé lợn 6 — 7 tuần tuổi khỏe mạnh tai tinh HàNam cho kết quả phát hiện ASFV trong máu sau 2 ngày lây nhiễm bằng phương phápreal-time PCR sử dụng mỗi và mẫu dò Quantabio One-Step RT-qPCR ToughMix Kit

(Quantabio, Mỹ) với gia trị C; dao động 30,05 — 35,16 Tháng 8 năm 2020, Võ Thị

Bích Thủy và ctv bước đầu đã xây dựng được quy trình multiplex PCR đặc hiệu choASFV, đề tai dựa trên vùng gen p72 va p54 có khả năng phân loại được các kiểu genkhác nhau, có độ nhạy trên 90% đối với 6 kiểu gen I, II, IX, XXIII, VIII, X Tháng 8năm 2021, Trịnh Thị Bích Ngọc và ctv phát triển quy trình phát hiện dựa trên vùnggen p54 có thé phân biệt 15 chủng khác nhau thuộc các kiểu gen I, II, V của gen p72tại Việt Nam bang kĩ thuật real-time PCR cho giới hạn phát hiện là 2,63 bản sao/ul, kếtquả không phát hiện các vi rút gây ra các bệnh phổ biến trên heo như CSFV, FMDV,

PRRSV và PEDV.

1]

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ gen BIO313, tòa nhà A1 —

khoa Khoa học Sinh học, đại học Nông Lâm TP.HCM.

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 09 năm 2021 đến tháng 09 năm 2022

3.2 Vật liệu và hóa chất

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Bốn mươi mốt mẫu thực địa gồm 32 mẫu máu và 9 mẫu mô được thu thập từ cáctỉnh Bình Dương, Tây Ninh, Đồng Nai

3.2.2 Hóa chất sử dụng

Bộ kit genesig Easy DNA/RNA Extraction Kit (Primerdesign Ltd, England) gồm

có: Liophilised Proteinase K (Proteinase K dang đông khô) Proteinase K buffer (Dung dich đệm Proteinase K), Magnetic beads (hạt từ), Magnetic beads binding/buffer

(Dung dịch đệm hat từ), Lysis buffer (Dung dich ly giải), Internal control — IC (Đối

chứng n61), Wash buffer 1 (Dung dich rửa giải 1), Wash buffer 2 (Dung dich rửa giải

2), Ethanol 80% (Cồn 80%), Elution buffer (Dung dich pha loãng)

Bộ kit African swine fever virus genesig Easy Kit (Primerdesign Ltd, England)

gồm có: ASFV primers/probe (Mau dò và mdi đặc hiệu cho ASFV), Lyophilised oasig

Master Mix (Master mix dạng đông khô), Master Mix resuspension buffer (Dung dich

đệm pha loãng master mix), Positive Control (Đối chứng dương), Internal Control(Đối chứng nội), DNAase/RNAase free water (Nước khử DNAase/RNAase), SamplePreparation Solution (Dung dich chuan bi mau)

Phan ứng PCR truyền thống được thực hiện bằng việc sử dung DreamTaq GreenPCR Master Mix 2X (Cat#K1081, Thermo ScientificTM), sản phẩm PCR được phântích bằng TopVision Agarose (Cat#R049, Thermo ScientificTM), dung dịch đệm TBE

(Tris-Borate EDTA) 0,5X (được pha từ TBE 1X Cat#BP24301, Fisher ScientificTM),

Midori Green Advance DNA Stain (Cat#MG04, NIPPON Genetics Europe, Germany).

3.3 Thiét bi va dung cu

Thiết bị và dung cụ được sử dụng trong đề tài này bao gồm: thiết bị PCR truyền thốnghãng BIOER, thiết bị real-time PCR q16 hãng Primerdesign Ltd, máy điện di Bio-Rad,

12