Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Xây dựng quy trình phát hiện virus Zymv (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương pháp Multiplex RT_PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO -TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC KHOA LUẬN TOT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS ZYMV Zucchini yellow mosaic virus VA P

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS

ZVMV (Zucchini yellow mosaic virus)

VA PRSV (Papaya ringspot virus) BẰNG PHƯƠNG PHAP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHOA LUẬN TOT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS

ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus)

VA PRSV (Papaya ringspot virus) BẰNG PHƯƠNG PHAP

MULTIPLEX RT-PCR

Hướng dẫn khoa hoc Sinh viên thực hiện

TS HUYNH VĂN BIẾT VƯƠNG NGUYEN SÔNG HÀNG

Tp Thủ Đúc, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu, quý thầy cô khoa Khoahọc sinh hoc trường Đại học Nông Lâm TP HCM đã truyền đạt những kiến thức quýbáu và tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Em xin bay tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới HDKH- Thay TS HuỳnhVăn Biết đã tận tình hướng dẫn, quan tâm chỉ bảo em trong quá trình xây dựng ý tưởng

đề cương cũng như thực hiện đề tài

Với lòng biết ơn sâu sắc và tình cảm chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến anh

Trương Quang Toản cùng với các anh chị, các bạn và các em trong Phòng 204 — Phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Đại học Nông

Lâm TP HCM đã tận tình hỗ trợ, chia sẽ kinh nghiệm, kiến thức và giúp đỡ em rất nhiềutrong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài

Nhờ có nhưng lời góp ý day bảo tận tâm của mọi người mà em đã nam được rấtnhiều những kiến thực tế bổ ích dé có thé hoàn thiện dé tài tốt nghiệp một cách tốt nhất

và trong công việc có thể làm sau này Tuy nhiên, đề tài của em chắc chắn không thểtránh được những hạn ché, thiếu sót Em rất mong sự góp ý chân thành từ quý thầy cô

và mọi người dé có thé hoàn thành xuất sắc được bai khóa luận nay

Cuối cùng em xin được chúc tất cả quý Thầy Cô/ Anh/ Chị có thật nhiều sứckhỏe, niềm tin dé vững bước diu dat các thé hệ sinh viên tiếp theo trong sự nghiệp nghiên

cứu và phát triên này.

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Vương Nguyễn Sông Hang, MSSV: 19126043, Lớp: DH19SHD (Số

điện thoại: 0857275058, Email: 19126043 @st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ

sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan đây là khóaluận do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàntoàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng vềnhững cam kết này

Thành phố Hồ Chí Minh,ngày tháng năm 2023

Người viết cam kết

(Ký và ghi rõ họ tên)

TÓM TẮT

ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) là hai

loại virus thuộc chi Potyvirus gây bệnh phổ biến trên cây họ bau bi Chúng gây anhhưởng lớn đến năng suất cây họ bầu bí ở thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng quy trình phát hiện đồng thời ZYMV

và PRSV bằng phương pháp Multiplex RT-PCR Phương pháp đã sử dụng gen actin củacây họ bau bí như một đối chứng nội (IC) dé phát hiện đồng thời ZYMV và PRSV Hỗnhợp gồm ba cặp primer (IC F/R, ZYMV F/R, PRSV F/R) này được sử dung dé khuếchđại ba sản phẩm IC, ZYMV, PRSV có kích thước lần lượt là 626 bp, 214 bp, 331 bp.Kết quả tối ưu nồng độ primer của IC, ZYMV, PRSV lần lượt là 0,1 uM; 0,3 uM; 0,2

uM và nhiệt độ bat cặp tối ưu là 57,1 °C Nghiên cứu đã chứng minh rằng phương phápMultiplex RT- PCR được xây dựng là đặc hiệu dé phat hién ZYMV va PRSV Quy trinh

đã áp dụng thành công dé phat hiện hai loại virus từ 63 mẫu thực dia, trong đó phát hiện

31 mẫu nhiễm virus bao gồm 5 mẫu nhiễm PRSV, 1 mẫu nhiễm ZYMV và 25 mẫunhiễm đồng thời ZYMV và PRSV

Từ khoá: cây họ bầu bí, chứng nội, PRSV, Multiplex RT- PCR, ZYMV

Keywords: cucurbits, internal control, PRSV, Multiplex RT- PCR, ZYMV.

MỤC LỤC

Trang

LOI CAM 090 iXAC NHAN VA CAM 6977 ii

2.4.1 Zucchini yellow mosaic virus (ZY MV) 8 < 4

242 Papaya ringspot virus (PRS V ) sscsssssossasxecessnasci ence eR 6

2.5 Các phương pháp chân đoán ZYMV va PRSV gây bệnh trên cây ho bầu bi 7

2.5.1 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) lý 2.5.3 Phương pháp RT — PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) 8 2.5.4 Phương phap Multiplex RT- PC: c0 00211600036 6s 2438120658851 538350 545815180 9

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -©225cccsccccecce 103.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 2-2 2S22SeEE2EE2E221211212121121221112221 2112 Xe 10

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 2-2 s+2222EE+2E2E1221222122112212712112112112112212112 2e 103.2.2 Thiết bị 25+ 5c 2S212112112112112112112112112111112111121111111111112112121 re 11

22: Ss A DUINS Clbsccaseccssuscaasunse vaaeusnecumany nae tnseenic ae ar spicuasa naa caren awacaermeauena a naan ase 11

hỗ“ RA ố .ẽ ẽ ẻẽ 11

3.2.5 Các trình tu primer dùng trong nghiên CỨU ee eeeeceeeeeceeeeeeeeeeeeeeees 11 3.3 Phương pháp nghiên CỨU - cece cece cece eeeceneeeeesceseeseeesesecseesesseeneens lãi 3.3.1 Ly trích RNA tổng SỐ -22-52-22222222222212212221271221271211271 7112212122 xe 11 3.3.2 Xử ly DNA bang enzyme DNase l -2-22©22222222222E22E22ESEE 22c 12 3.3.3 Tổng hop cDNA với enzyme phiên mã ngược - 2-22-2222 13 3.3.4 Phản ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phương pháp RT — PCR dé phát iD A hfe ee ee 15 3.3.5 Phan ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phương pháp RT — PCR dé phát II i00 14

3.3.6 Điện di sản phẩm sau phản ứng khuếch dai và giải trình tự - 15

3.3.7 Thiết kế primer cho chứng nội (internal amplification control - IC) 16

3.3.8 Xây dựng phương pháp Multiplex RT-PCR phát hiện ZYMV và PRSV 17

3.3.9 Kiểm tra độ đặc hiệu của phương pháp Multiplex RT- PCR - 21

3.3.10 Phát hiện ZYMV và PRSV trên mẫu thực địa bằng Multiplex RT-PCR 32

a e 22 CHƯƠNG 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 2 22222222EE2EE2E22E222222222x22x re 23 ALL Két na gaầỒỖẦẠỀ 23

4.2 Kết quả điện di sản phẩm RT — PCR 22 2222+2222EE22E22EE22E222222E2E.zrrcrex 23 4.2.1 Kết quả điện di sản phẩm RT- PCR của ZYMV 2 22522222222z22zz>sc2 23 4.2.2 Kết quả giải trình tự sản phẩm khuếch đại của ZYMV 22-52c5522 24 4.2.3 Kết quả điện di sản phẩm RT- PCR của PRSV 2 2252222z22zz2zzzcsc2 24 4.3 Kết quả điện di sản phẩm RT- PCR của chứng nổi (IC) wcsessusscessexsenesssemscaverseeseenan 25 4.4 Kết quả xây dựng quy trình Multiplex RT-PCR phát hiện ZYMV và PRSV 26

4.5 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phương pháp Multiplex RT-PCR 30

4.6 Kết quả áp dụng quy trình vào phát hiện ZYMV và PRSV vào mẫu thực địa 31 CHƯCINGS,KITT-CHÊN Vũ TU NỈ «enseeonneennonnietiiesiidditrthdgdinggtinst/rdouageioisai 37

3 5, Tê HE Í can gang g GÌ ng gi ah DiGISSEGHSS.GSGSTHISS04/GN2MGSIGIESNGIGIN1330200.G0G080048081303008600.G 37 TIẾT LTD TTTHANIIET VŨ seiiseiuiikrsoiditoeordiinoiouthilstinodiểkdizgutninuisiirgfliuezoilörrrzugirgiiu 38

PUL) IEG wsecsonsressnneseszcs ma ts et a EA MRO WSN 9 SHURE SADR ENR IRERES

vi

DANH SÁCH CHU VIET TAT

AVRDC : Asian Vegetable Research and Development Center

bp : base pairs

cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid

CMV : Cucumber mosaic virus

ctv : cộng tác viên

DNA : Deoxyribonucleic acid

ELISA : Enzyme — Linked Immunosorbent Assay

FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations

ha : hecta

Mt : megaton

NCBI : National Center for Biotechnology Information

nm : nanômét

PMWaV-] : Pineapple mealybug wilt-associated virus-1

PMWaV-2 : Pineapple mealybug wilt-associated virus-2

PMWaV-3 : Pineapple mealybug wilt-associated virus-3

PRSV : Papaya ringspot virus

RNA : Ribonucleic acid

RT- PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction

RT-LAMP : Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification SPFMV : Sweet potato feathery mottle virus

TAE : Tris-acetate-EDTA

ToMMV : Tomato mottle mosaic virus

ToMV : Tomato mosaic virus

ZYMV : Zucchini yellow mosaic virus

vii

DANH SÁCH CÁC BANG

Bảng 3.1 Trình tự các primer dùng trong nghiên cứỨu - 55555 ++s<++sx+sc<zexssxss 11

Bang 3.2 Chu trình nhiệt độ tổng hop cDNA với enzyme phiên mã nguoc 13Bang 3.3 Thanh phan phan ứng RT- PCR phát hiện ZYMV -2-252-5 14

Bang 3.4 Chu trình nhiệt dé phát hiện Z'YMV -5252222222222222222225225223222222e2 14

Bảng 3.5 Thành phan phản ứng RT-PCR phát hiện PRSV - 2-55-5522 15Bang 3.6 Chu trình nhiệt dé phát hiện PRSV bằng phương pháp RT-PCR 15Bang 3.7 Chu trình nhiệt thử nghiệm IC bằng phương pháp RT- PCR 16Bang 3.8 Thành phần phản ứng thử nghiệm IC bằng phương pháp RT- PCR 17Bang 3.9 Tổ hợp nồng độ primer của ZYMV và PRSYV ©22272c22cccscczcee 18Bang 3.10 Chu trình nhiệt cho khảo sát nồng độ hai cặp primer ZYMV và PRSV 18Bảng 3.11 Thành phần phản ứng cho khảo sát nồng độ hai cặp primer ZYMV và

Bang 3.12 Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ bắt cặp của từng cặp primer bằng RT-PCR 20Bảng 3.13 Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ bắt cặp trong phương pháp Multiplex RT-

PK on D ĐgotELQQGGEGGEEDDIGGEGSSESGGNGiQDIDNIGIESIGIGGEONIEGSHlGREBiNtStöiI,SBSIQS4RJBNChAtgqypessuseid 20

Bảng 3.14 Khảo sát độ đặc hiệu trên các đối TƯƠNG VIEWS bynnseseessesesse23222348230003g188 21

Bảng 4.1 Nồng độ RNA được ly trích từ mẫu đối chứng đương - 23Bảng 4.2 Kết quả ứng dụng quy trình trên mẫu đại trà phát hiện ZYMV va PRSV 34

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của gen ZYMV - 23Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của gen PRSV - 24Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của gen IC - 22 2522255225 25Hình 4.4 Kết quả điện đi sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer bằng phản ứng

Multiplex RT- PCR của PRSV và ZYMV -2+©2222222221222122212221222122212222 e6 26

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer bằng phản ứng

Multiplex: RI PCR Cla TẾ, ssniessowssssiawwortvensnttoccwibstverssestnsnntiuntecsetiwvsccrdaunstiiceuuectieves 27

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát nhiệt độ bat cặp bằng phan ứng

RT-PCR của ZYMV ©22222222222112211221122112211211121112111211211211211211211 11 cee 28

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp bằng phản ứng

(ee Co) 28

Hình 4.8 Kết quả điện di sản pham PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp bang phan ứng

RT-PCR cia hi 29

Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR khảo sát nhiệt độ bat cặp bang phan ứng

Miuliplex RT-PCR của 1G, ZYMV, PRS can 2 22 va Họ nữ Giấy han 000 046 29

Hình 4.10 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng Multiplex RT-PCR 30Hình 4.11 Kết quả điện di mẫu cây bí thực địa sau phản ứng khuếch đại ở Vườn 1 31Hình 4.12 Kết quả điện di mẫu cây bí thực địa sau phản ứng khuếch đại ở vườn 2 31Hình 4.13 Kết quả điện di mẫu cây dưa lưới thực địa sau phản ứng khuếch đại ở vườn

Hình 4.14 Kết quả điện di mẫu cây bí thực địa sau phản ứng khuếch đại ở vườn 4 32Hình 4.15 Kết quả điện di mẫu cây mướp thực địa sau phản ứng khuếch đại ở vườn 5

Hình 4.16 Kết quả điện đi mẫu cây bầu thực địa sau phản ứng khuếch đại ở vườn 6.33Hình 4.17 Kết quả điện di mẫu cây bí thực địa sau phản ứng khuếch đại vườn 7 .34Hình 4.18 Sơ đồ tóm tắt tỉ lệ nhiễm bệnh của từng loại cây thuộc họ bầu bí khảo sát

HT CN | ste att Re i er ne sini sia i sine Psaiomnew wees OO

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Họ Bau bí (tên khoa học là Cucurbitaceae) là một họ thực vật bao gồm một số loài

phô biến như: dưa hau, dưa chuột, bí dao, bau, bi ngô, mướp, mướp đắng, la hán quả

Nó là một trong những họ thực vật quan trọng nhất trong việc cung cấp thực phẩm trênthế giới (Roskov, 2014)

Điều đáng chú ý là cây họ bầu bí có ưu thế hơn một số cây trồng khác về vitamin

và chất khoáng Các loại vitamin như vitamin A, BI, B2, C, E có tác dụng quan trọngtrong quá trình phát triển cơ thé, thiếu vitamin sẽ gây ra nhiều bệnh tật Chất khoángtrong họ thực vật này chủ yếu là Ca, P, Fe là những chất cần thiết cho máu và xương.Các chất khoáng có tác dụng điều hoà và cân bằng kiềm toan trong máu, làm tăng khảnăng đồng hoá protein Trong cây họ bầu bí có khối lượng chất xơ lớn tuy không có giátrị dinh dưỡng nhưng do có thể tích lớn, xốp do đó chất xơ có tác dụng nhuận trang va

tăng khả năng tiêu hoá (Tạ Thu Cúc, 2007).

Hiện nay dich hại trên cây họ bau bí rất phong phú và đa dạng như: bệnh do nam,bệnh do côn trùng, bệnh do virus Một trong các dich hại quan trong va phố biến trên

cây họ bầu bí là các bệnh virus Theo AVRDC, các virus gây hại trên cây họ bầu bí ở

châu A gồm: CMV (Cucuber mosaic virus), PRSV (Papaya ringspot virus), WMV-2

(Water melon mosaic virus — 2), ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus), SMV (Squash

leaf curl virus) và CGMMV (Cucumber green mild motle virus) Trong số này, hai loạivirus phô biến lây nhiễm trên cây họ bầu bí là ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus)

và PRSV (Papaya ringspot virus) (Ali va ctv, 2012a, 2012b) Ca 2 loại virus này đều có

bộ gen là RNA, thuộc chi Potyvirus họ Potyviridae và gây mất năng suất lên tới 100%,lây truyền phần lớn qua các loài rệp Chúng gây ra các triệu chứng giống nhau trên cây

ho bau bí như khảm và đốm đốm nên rất khó phân biệt Hai loài này gây phản ứng chéo

với nhau khi thực hiện các xét nghiệm về mặt huyết thanh học(Baker, 1989) Phương

pháp RT-PCR có thé dùng dé phát hiện hai loại virus này một cách chính xác hơn Tuynhiên, phương pháp này gây tốn thời gian, chi phí và công sức Vì vậy, cần phải pháttriển phương pháp Multiplex RT- PCR dé phát hiện đồng thời cả hai loại virus trong

một phản ứng duy nhất Do đó, đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện virus ZYMV

(Zucchini yellow mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương phápMultiplex RT- PCR” được tiến hành nhằm phục vụ sản xuất, giúp ngăn chăn kịp thời,giảm thiểu những tồn tat mà ZYMV và PRSV gây ra cho người dân Việt Nam.

1.2 Mục tiêu đề tài

Xây dựng quy trình phát hiện ZYMV va PRSV bằng phương pháp Multiplex PCR nhằm chan đoán chính xác và hiệu quả nguồn bệnh trong quá trình phòng trừ bệnh

RT-hại do virus gây ra.

1.3 Nội dung đề tài

Nội dung 1: Xây dựng được quy trình phát hiện virus ZYMV (Zucchini yellow

mosaic virus) và PRSV (Papaya ringspot virus) bằng phương pháp Multiplex RT-PCR

Nội dung 2: Áp dụng quy trình lên mẫu thực địa

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Cây họ bau bí Cucurbitaceae

Cây họ bầu bí là một họ thực vật có hoa bao gồm khoảng 98 chỉ với khoảng 975

loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Họ cây này là cây thân thảo,

cây bụi hàng năm hoặc lâu năm, rễ cây có dạng sợi hoặc củ; thân cây thường có góc

cạnh và lá mọc so le, gân đơn và có lông Hoa đơn tính, xếp thành chùm (Xu và ctv,2017) Thụ phan chủ yếu nhờ côn trùng, nhưng cũng có thê nhờ gió Cây họ bau bí có

ba chi chính: Dưa hấu (Citrullus lannatus ); dua chuột và dua lưới (Cucumis sativus vàCucumis melo); bí xanh, bí đỏ, bí và bau (Cucurbita spp) Cucurbita spp có nguồn gốckhác nhau, từ miền nam Bắc Mỹ đến Argentina Đối với dưa lưới được cho là có nguồngốc từ châu Á theo các nghiên cứu gần đây, đã được thuần hóa ít nhất hai lần ở châu Á

và châu Phi (Endl và ctv, 2018) Dưa chuột có nguồn gốc từ An Độ và Đông A, còn dưahấu có nguồn gốc từ châu Phi

2.2 Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trên thế giới

Theo FAO, sản lượng cây họ bầu bí trên toàn thế giới bao gồm 100,4 Mt (megaton)đối với dưa hấu, 87,8 Mt đối với dưa chuột, 27,5 Mt đối với các loại dưa khác và 22,9

Mt đối với bí ngô và bí đao Chỉ riêng Trung Quốc đã sản xuất hơn một phần ba sảnlượng toàn thế giới cho mỗi loại cây trồng này, đóng góp 36,7% sản lượng bí ngô và bíđao; 49,1% dưa; 60,5% dưa hấu; 80,1% đưa chuột Mặc khác, theo thống kế FAO ghinhận là hạt dua (egusi), với sản lượng trên toàn thế giới là 1,0 Mt, trong đó 94% đượcsản xuất ở Châu Phi, đặc biệt là Nigeria với 60% tổng sản lượng Hạt Egusi có thé đượcsản xuất từ nhiều loài khác nhau, phổ biến nhất là từ Citrullus mucosospermu (Levi và

ctv, 2017).

2.3 Tình hình sản xuất cây họ bầu bí trong nước

Cũng như trên thế giới, cây họ bầu bí cùng với các cây trồng họ hòa thảo, họ đậu

và họ cà là những cây trồng quan trọng nhất trong sản xuất nông nghiệp tại Việt Nam.Các cây họ bầu bí được trồng phổ biến ở Việt Nam là dưa chuột, dưa hấu, mướp hương,mướp đắng, bí ngô, bí xanh Dưa chuột là cây trong họ bầu bí được trồng với diện tíchlớn nhất tại Việt Nam Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn cho biết dưa chuột đượctrồng ở tất cả các tỉnh phía Bắc và phía Nam, nhưng diện tích dưa chuột được trồng tập

trung với diện tích lớn ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long.Các vùng trồng dưa chuột tập trung như ở Vĩnh Phúc, Hưng Yên và Hà Nam đạt năngsuất trên 230 tạ/ ha cao hơn nhiều so với trung bình cả nước Năm 2020, Sở Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn tỉnh Hà Nam cho toàn tỉnh Hà Nam có 44 hợp tác xã dịch vụnông nghiệp trồng dưa chuột với tổng diện tích cả năm khoảng 1.200 ha, năng suất dưachuột bình quân dat 28 - 33 tan/ha, giá trị sản xuất bình quân đạt 250 - 305 triệuđồng/ha/vụ, cao gấp 5 - 6 lần so với sản xuất lúa Năm 2013, xã Văn Lang thuộc tinhPhú Thọ đã trồng 65 ha bí xanh mang về nguồn thu trên 10 tỷ đồng cho xã

2.4 Những nghiên cứu về virus gây hại trên cây họ bầu bí

Cây bau bí có thé bi ảnh hưởng bởi hang chục loại virus lây truyền bằng nhiều loạivectơ truyền bệnh hoặc vết thương hở (Velasco và ctv, 2020) Virus truyền bệnh rệp

chang hạn virus thuộc chi Potyviruses như Zucchini yellow mosaic virus, Watermelonmosaic virus, Papaya ringspot virus, va Moroccan watermelon mosaic virus; virus thuộc chi Cucumoviruses như Cucumber mosaic virus; virus thuộc chi Poleoviruses như

Cucurbit aphid-borne yellows virus là những loài phân bố rộng rãi, gây ra dịch bệnhnghiêm trọng ở các vùng trồng cây họ bầu bí Sự xuất hiện của các chủng mới thuộc chiCarmovirus như Melon necrotic spot virus, do nam Olpidium truyền, cũng đang làmtăng tỷ lệ mắc bệnh liên quan đến loại virus này Các loại virus khác lây truyền qua vếtthương hở chang hạn như virus thuộc chi Tobamoviruses như Cucumber green mottle

mosaic virus va Zucchini green mottle mosaic virus (Chet và ctv, 2020).

Tất cả các loại bầu bi đều mẫn cam với chi Potyviruses Trong chi nay có 2 loạivirus ZYMV và PRSV là hai loài đang gây bệnh phô biến trên cây học bau bi ở Việt

Nam (Vũ Triệu Mân, 2016).

2.4.1 Zucchini yellow mosaic virus (ZLYMV)

2.4.1.1 Nguồn gốc va phân bố

Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) lần đầu tiên được phan lập ở Ý vào năm

1973, được mô tả vào năm 1981, và sau đó được xác định ở tat cả các châu lục trongvòng một thập kỷ, là một trong những loại virus quan trọng nhất về mặt kinh tế đối vớicây họ bau bi Nó được lây truyền hiệu quả qua rệp và hạt của bí, điều này có thé đã gópphần vào sự lây lan nhanh chóng của nó trên toàn thế giới (Desbiez và Lecoq, 1997)

Loài: Zucchini yellow mosaic virus

2.4.1.3 Dac diém ZYMV

Z.YMV thuộc chi Potyvirus có hình sợi, kích thước 11 — 15 x 650 — 950 nm Bộ

gen bao gồm một chuỗi RNA đơn dai khoảng 9600 nucleotide với đầu 5’ liên kết với

VPg (viral protein genome-linked) và 3’ đuôi poly (A) được bao bọc trong một lớp vỏ

protein 36 kDa Loài virus này gây bệnh trên thực vật, lan truyền thông qua rệp hoặc hạtgiống, chứa một sợi RNA (Balintet va ctv, 1990) ARN được dịch mã thành mộtpolyprotein duy nhất được phân cắt bởi ba protease của virus (Desbiez và Lecoq, 1997)

Các thể vùi hình trụ (pinwheels) do ZYMV gây ra ở cây nhiễm bệnh thường thuộc loại

1 theo phân loại của Christie (1986) Các thé vùi tế bào chat này xuất hiện dưới dangcác khối sợi nhỏ được nhìn thay bang cách sử dụng thuốc nhuộm màu xanh cam dé pháthiện các thé vùi virus thông qua kính hiển vi (Christie, 1986)

có thé bị biến dạng nghiêm trọng Ở dưa lưới (Cucumis melo) triệu chứng ban đầu trên

lá là hiện tượng nổi gân và khảm vàng Các lá sau đó bị giảm kích thước, biến dạng,

thường có các cạnh có răng cưa và các vết phông rộp hoặc nhữn màu xanh đậm, tương

phản với màu vàng hoặc xanh nhạt của phần còn lại của phiến lá Ở dưa hấu (Citrullus lanatus), d6m, khảm và bệnh xơ lá thường được quan sát thấy, trái nhiễm bệnh có thể

có mau sắc không đều và biến dang từ nhẹ đến nghiêm trọng ZYMV gây bệnh ở nhữngcây thuộc họ bau bí có thé có các triệu chứng bệnh khác nhau (Desbiez và Lecoq, 1997)

2.4.1.5 Biện pháp phòng ngừa

Hiện nay, biện pháp ngăn chặn sự lây lan virus này được dùng phổ biến nhất làloại bỏ, tiêu hủy các cây bầu bí có triệu chứng nhiễm bệnh và dùng thuốc tiêu điệt các

loại sâu rệp trung gian truyền bệnh, nhưng cách tốt nhất dé kiểm soát được bệnh hại này

là sử dụng nguồn giống có kiểm định chất lượng hoặc giống mang gen kháng loại virusnày Tuy nhiên, thường thì mức độ đề kháng là có hạn, nhưng các triệu chứng ít rõ rệthơn ở các giống không có tính kháng nảy Việc kết hợp sử dụng các giống kháng cùngvới chiến lược quản lý tốt sẽ mang lại cơ hội để sản xuất thành công vụ mùa (Komata

(Gonsalves, 1998) PRSV có 2 type: Type P ký hiệu là PRSV-P và Type W ký hiệu là

PRSV- W Có bằng chứng cho thấy PRSV-P tiến hóa từ PRSV-W (Bateson và ctv,1994) Theo Thomas và ctv (1993) có thé là do đột biến vì sự giống nhau về trình tự rấtgần của các vùng mã hóa protein vỏ (CP) của các chủng P và W phân lập ở Úc, và thực

tế là PRSV-W đã được phát hiện phô biến ở Uc ít nhất 20 năm trước PRSV-P xuất hiện

PRSV-P phân bố ở Trung Đông, Châu Phi, Nam và Trung Mỹ, Trung Quốc,

Pháp, Đức, Ấn Độ, Ý, Mexico, Đài Loan và Hoa Kỳ Các chủng PRSV-W đã được tìmthay ở Hoa Kỳ, Mexico, Ý, Đức, Úc, Pháp, An Độ, Trung Đông va Nam Mỹ

2.4.2.3 Đặc điểm PRSV

PRSV là một loài thuộc chi Potyvirus có kích thước sợi dai 760 — 800 nm, đường

kính 12 nm với bộ gen có kích thước tổng cộng là 12 kb Ở cây bị nhiễm virus được tìmthấy trong tất cả các phần của cây, chúng tạo nên các thể vùi hình trụ (cylindricalincusions— CI) hoặc vô định hình (amorphous inclusion— AI) trong tế bào chất, khôngbao của mô cây bị nhiễm Những tế bào này không chứa các virion, trong khi đó nhựacây thường chứa rất nhiều virion Mỗi một virion gồm khoảng 5,5 % nucleic acid va94,5% protein (Fuchs va ctv 1997) Virus lây truyền qua rệp (Aphididae), qua vết thương

hở nhưng không truyền qua hạt (Freitas và Rezende, 2008)

2.4.2.4 Triệu chứng, tác hại

Cây bị bệnh PRSV có triệu chứng đốm hình nhãn trên qua, khảm vàng và đôimàu lá, có đường sọc trên cuống lá va thân cây, làm biến dang lá non Cây phát triểnkém và còi cọc, không đậu quả hoặc quả năng suất thấp và chất lượng kém Cây bị nhiễmbệnh ở giai đoạn cây con không cho trái Tuy nhiên, một số chủng ở Đài Loan gây héo

và đôi khi làm chết cây con PRSV-P lây nhiễm đu đủ (Carica papaya) một cách tự

nhiên và là yếu tố hạn chế chính trong sản xuất du đủ trên toàn thé giới (Tomlinson,

1987) PRSV-W, ký chủ tự nhiên trong họ bau bí và không thé lây nhiễm đu đủ, đượccho 1a một trong năm loại virus quan trọng nhất trong các loại rau trồng (Purcifull va

ctv, 1984).

2.4.2.5 Biện pháp phòng ngừa

Bệnh về PRSV rất khó dé kiểm soát bằng thuốc trừ sâu Vì vậy cần theo dõithường xuyên quá trình phát triển của cây Bằng cách kiểm tra gen kháng bệnh trongcây Trồng cây ở những khu vực được biết là chưa xuất hiện virus Loại bỏ cây hoặc bộphận cây bị nhiễm virus Sử dụng lưới để ngăn chặn côn trùng lây lan virus Sử dụnghạt giống từ cây khoẻ mạnh hoặc từ nguồn được chứng nhận

2.5 Các phương pháp chan đoán ZYMV và PRSV gây bệnh trên cây họ bầu bí

2.5.1 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hoa dé phathiện kháng thé hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Phương pháp này được dùng

dé kiểm tra virus trong các lĩnh vực như nhân giống (vi dụ: đánh giá virus , kiểm dịch

(ví dụ: sàng lọc nguyên liệu nhập khẩu) và chứng nhận (ví dụ: đảm bảo vật liệu trồng

trọt không có virus) (Boonham và ctv, 2014).

Vào năm 2019, Asad và ctv đã sử dụng phương pháp DAS-ELISA phát hiện ZYMV

dé khảo sát 300 mẫu được thu thập ngẫu nhiên từ 40 vườn trồng dưa chuột từ khắp vùngPothowar thuộc Pakistan Kết quả cho tỷ lệ mắc bệnh ZYMV cao nhất là 77% ởChakwal và không có quận nào của vùng Pothowar được tìm thấy không bị nhiễm virus

Vào năm 2000, Yuki và ctv đã khảo sát trong năm loại virus gây bệnh trên cây họ

bau bí bằng phương pháp ELISA trong đó PRSV-W va ZYMV được tìm thấy lần lượt

là 100% va 82% của các vùng ở Sao Paulo thuộc Brazil Ngoài ra, tỷ lệ phát hiện đồngthời hai loại virus này là 55% trên tổng số mẫu khảo sát

Tuy nhiên, kháng huyết thanh đa dòng và kháng thé đơn dòng đối với PRSV-W (AI)cũng có thé phát hiện ZYMV HC trong xét nghiệm ELISA khi sử dụng chiết xuất thựcvật hoặc protein tinh khiết (Baker,1989)

2.5.2 Phương pháp RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification )

RT- LAMP là phương pháp khuếch đại axit nucleic trong một bước dé nhân lên

các trình tự của RNA Nó được sử dung dé chân đoán bệnh truyền nhiễm do virus RNAgây ra (Mori và Notomi, 2009) RT-LAMP không yêu cầu chu kỳ nhiệt (không giốngnhư PCR) và được thực hiện ở nhiệt độ không đôi trong khoảng từ 60 °C đến 65°C

RT-LAMP đã được sử dụng dé phát hiện virus ZYMV trên cây bí và dua Phương

pháp thực hiện trong 30 phút ở điều kiện đẳng nhiệt là 64 °C bằng cách sử dụng hỗn hợpbốn cặp primer Do đó, RT-LAMP là một trong những phương pháp hữu ích và thiếtthực dé phát hiện ZYMV trong cây họ bau bi (Kuan và ctv, 2014)

2.5.3 Phương pháp RT — PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)

Phương pháp RT-PCR kết hợp phan ứng phiên mã ngược với PCR dựa trên

khuếch dai dé tạo ra cDNA từ mRNA Một chuỗi RNA hoạt động như khuôn mẫu chophiên mã ngược DNA sợi đơn thu được sau đó dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng

PCR Phương pháp này thuận lợi do độ nhạy của nó và một lượng mẫu tương đối nhỏ

(Bachman, 2013).

Phương pháp RT-PCR được dùng để phân tích cây di truyền trong nghiên cứucủa Asad va ctv (2022) Kết qua phân tích cho thấy các cây mướp bị nhiễm ZYMV của

Pakistan (MN897100 và MN897101) có mối quan hệ chặt chẽ với các chủng ZYMV

của Hàn Quốc, Trung Quốc và Thổ Nhĩ Kỳ, đồng thời củng cô niềm tin rằng các chủng

ZYMV ở Pakistan được báo cáo trong nghiên cứu này có nguồn gốc chau A

Bên cạnh đó, RT- PCR bị hạn chế là tốn thời gian thực hiện khi muốn phát hiệnnhiều virus cùng lúc, do đó phương pháp Multiplex RT- PCR được phát triển

2.5.4 Phương pháp Multiplex RT- PCR

Multiplex RT- PCR đang ngày càng được sử dụng trong các hệ thống sinh học

và y học vì chúng cho phép khuếch đại đồng thời một số đoạn DNA trong cùng mộtphản ứng Với khả năng này thì số lượng phản ứng cần thiết để kiểm tra một mẫu chocác mục tiêu khác nhau sẽ giảm giúp tiết kiêm thời gian và chỉ phí Đồng thời, MultiplexRT- PCR đặc biệt có ích khi thực hiện trên một số lượng mẫu lớn

Vào năm 2019, Rajbanshi và Ali đã xây dựng thanh công quy trình phát hiện

WMV, ZYMV và PRSV-W và quy trình được ứng dụng thành công trên 54 mẫu thực

địa thu được ở Oklahoma.

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện dé tài: Từ thang 3/2023 đến thang 7/2023

Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng 204- Phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứuCông nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí

Minh.

3.2 Vật Liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu dương là mẫu lá dưa lưới có kết quả xét nghiệm dương tính với ZYMV vàmẫu lá bí có kết quả xét nghiệm dương tính với PRSV do Phòng 204 — phòng SHPT,

Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nông Lâm TP HCM

cung cấp

Mau lá cây họ bau bí khảo sát thực địa thu tại 7 vườn, mỗi vườn 9 mẫu:

10°31'26.9"N 105°46'17.3"E xã Mỹ Đông, huyện Tháp Mười, tỉnh Đồng Tháp,

10°52'44.6"N 106°46'50.2"E phường Linh Xuân, Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí

Minh, Việt Nam

10°52'27.3"N 106°47'18.1"E Đông Hoà, Dĩ An, Bình Dương, Việt Nam.

10

3.2.2 Thiết bị

May ly tâm Z-216 M (Hermle), máy PCR LifeEco Thermo Cycler( Bioer), tủ an

toàn Sinh học (Bioquell), máy đo quang phổ (BioDrop), tủ lạnh -20°C, lò vi sóng(Sharp), tủ lạnh -70°C, buồng soi UV , cân phân tích (Ohaus)

3.2.5 Cac trình tự primer dùng trong nghiên cứu

Bảng 3.1 Trinh tự các primer dùng trong nghiên cứu

1C626- F GGAATTGTGATGGATTCTGGTG ở

626 Tự thiệt kê ICó26-R GCAATCCACATCTGCTGG

3.3 Phuong pháp nghiên cứu

3.3.1 Ly trích RNA tổng số

Mau lá nhiễm bệnh được thu nhận và tách chiết RNA tổng số theo quy trình Spin

Column Plant RNA Mini — Preps Kit Giúp tách polysaccharides và dé dàng oxy hóa

polyphenols có trong thực vật, giải phóng RNA Suốt quá trình ly trích luôn được đảmbảo trong điều kiện nhiệt độ phòng, sạch khuẩn, các đầu típ được hấp khử trùng vàkhông có DNase và RNase Thực hiện quy trình bằng cách cho mẫu lá vào eppendorf

11

1,5 mL nghiền trong 450 uL Buffer Rlysis-PG, sau đó vortex nhẹ dé đảm bao không bịvon cục U trong 5 phút dé các tế bao được phân giải hoàn toàn Ly tâm bằng máy lytâm Hermle Z206A (Hermle, Đức) 12000 x g trong 5 phút nhằm để các mảnh vỡ tế bàothực vật, protein lắng xuống đáy eppendorf Hút khoảng 300 — 400 uL dich nổi sangeppendorf 1,5 mL mới Sau đó, thêm 1⁄2 thé tích (so với thể tích dich nổi thu được saukhi ly tâm) Ethanol, trộn đều bằng micropipette và không ly tâm Tiếp đến là chuyên tat

cả dung dịch sang cột lọc, ly tâm cột lọc ở 12000 x g trong 30 giây Loại bỏ dung dịch

đã đi qua cột lọc, thu cột lọc và đặt lại vào ống thu nhận Sau ly tâm, RNA được giảiphóng ra khỏi tế bào được giữ lại trên cột lọc nhờ lớp màng silicagel có ái lực với cácRNA Sau đó, thêm 500 pL dung dich Universal GT Solution (đã bổ sung Ethanol) vàocột loc, ly tam 12000 x g trong 30 giây nhằm loại bỏ các proteins, polysaccharides hoặccác sắc tố xanh lá còn sót lại Loại bỏ dung dịch đã đi qua cột lọc, thu cột lọc và đặt lạivào ống thu nhận Tiếp tục cho 500 pL dung dich Universal NT Solution (đã bố sung

Ethanol) vao cột lọc, ly tâm 12000 x g trong 30 giây Loại bỏ dung dich đã đi qua cột

lọc, thu cột lọc và đặt lại vào ống thu nhận Tiếp tục, ly tâm cột một lần nữa ở 12000 x

g trong 30 giây Bước nay rất quan trọng dé loại bỏ triệt dé phan Ethanol còn sót lại Đặtcột lọc vào ống eppendorf 1,5 mL mới Thêm 50 L RNase — Free Water và giữ yêntrong 2 phút để hòa tan RNA, ly tâm 12000 x g trong 30 giây để RNA rơi xuống, loại

bỏ cột lọc va thu nhận RNA trong eppendorf 1,5 mL Cuối cùng, bảo quan dung dich

RNA ở -80°C.

Chất lượng RNA được kiểm tra bang máy do quang phổ Biodrop (Anh) dé xácnhận nồng độ (ng/uL) và độ tinh sạch A26ø/A2so đạt khoảng 1,8 — 2,0 là đủ tiêu chuẩn

tinh sạch.

3.3.2 Xử lý DNA bằng enzyme DNase I

Sử dung enzyme DNase I không chứa Rnase dé phân huỷ DNA còn sót lại trong

quá trình tách chiết RNA tổng số của virus Nhờ đó, RNA sẽ được tinh sạch Quy trình

thực hiện theo hướng dan của bộ kit DNase I (Thermo Scientific) Cho 8 uL dung dich

RNA đã tách chiết vào 1 uL enzyme DNase I không chứa RNase và 1 uL Buffer ủ 37

°C trong 30 phút Sau đó cho 1 uL EDTA ủ ở 6 °C trong 10 phút dé ngừng phản ứng

12

3.3.3 Tổng hợp cDNA với enzyme phiên mã ngược

Quy trình tông hợp cDNA được tiến hành theo SensiFASTTM cDNA Synthesis Kit.RNA sau khi được tinh sạch sẽ được thưc hiện tổng hợp cDNA Quá trình phải thựchiện trong tủ cấy an toàn sinh học, RNA và các hóa chất tổng hợp luôn được bảo quảntrên khay đá dé hạn chế ảnh hưởng chat lượng mẫu phan ứng diễn ra trong 1 chu kỳ

Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 10 wL, gồm 2 pL TransAmp Buffer, 0,5 HL Reverse

Transcriptase, 2 wL RNA tổng số, 5,5 uL nước DEPC (Biobasic) Phan ứng thực hiệnbang máy PCR (Applied biosystems 2720 Thermal Cycler), chu kỳ nhiệt được thể hiện

trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2.Chu trình nhiệt độ tổng hop cDNA với enzyme phiên mã ngược

Nhiệt độ (°C) Thời gian (phút)

13

Nước DEPC (Biobasic) 9,5 wL

Tong 25 nL

Bang 3.4 Chu trình nhiệt dé phát hiện ZYMV

Giai đoạn Nhiệt độ(°C) Thời gian Số chu kỳ

Tiền biến tính 03 °C 5 phut |

Biến tính 95 °C 30 giây

Bắt cặp 55°C 30 giây 35

Kéo dai 2G 40 giây

Hậu kéo dài 729% 7 phút |

3.3.5 Phản ứng khuếch đại đoạn gen mục tiêu bằng phương pháp RT — PCR dé

14

Nước DEPC (Biobasic) 9,5 pL

Tổng 25 nL

Bang 3.6 Chu trình nhiệt dé phát hiện PRSV bằng phương pháp RT-PCR

Giai đoạn Nhiệt độ(°C) Thời gian Số chu kỳ

Tiền biến tính 95 °C 5 phút 1

Biến tính 95°C 30 giây

Bắt cặp 55°C 30 giây 35

Kéo dai Tăng 30 giây

Hậu kéo dài MANG 7 phút |

3.3.6 Điện di sản phẩm sau phản ứng khuếch đại và giải trình tự

Sau quá trình khuếch đại sản phâm RT-PCR sẽ được điện di bằng máy điện dingang Mupid One dé kiểm tra độ đặc hiệu của primer Quá trình điện di thực hiện trên

gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE với hiện điện thế 100 V, trong 30 phút Kích

thước phân tử của sản phẩm khuếch đại RT- PCR được xác định bang cách so sánh vớiLadder Sau điện di xong, miếng gel agarose được đưa vào bộ phận soi gel và ghi nhậnkết quả

15

Sản phẩm sau phản ứng khuếch dai được gửi giải trình tự tại Công ty TNHH Dich

vụ và Thương mại Nam Khoa Sau khi có kết quả, đoạn gen sẽ được kiểm tra độ tươngđồng so với dữ kiệu gen đã được công bồ trước đó trên Ngân hàng gen NCBI bằng công

cụ Blast.

3.3.7 Thiết kế primer cho chứng nội (internal amplification control - IC)

Chứng nội là một đoạn axit nucleic, được khuếch đại đồng thời cùng với ADN

mẫu trong một ống phản ứng Mục đích của chứng nội tại là xác minh kết quả chân

đoán, tránh hiện tượng âm tính giả, gây sai sót trong chân đoán (Abdulmawjood và ctv,2002; Hartman va ctv, 2005 ) Chứng nội thường được sử dụng là các gen luôn biểu hiệnbên trong tế bào, còn gọi là các gen giữ nhà (house keeping genes) như Rnase P,GAPDH, actin, beta-globin, 18s rARN Sự biéu hiện của các gen nay hau nhu cting itbiến đổi Trong bài nghiên cứu nay, thiết kế primer phát hiện IC dựa trên gen actin cótrên cây họ bầu bí Thiết kế primer xuôi trên trình tự exon 4 của mRNA và primer ngượctrên trình tự exon 6 thêm 4 nu của exon 5 Cho sản phẩm khuếch đại có kích thước 626

bp Lựa chọn nồng độ primer của IC ít nhất có thé dé không làm ảnh hưởng đến sự tổnghợp của primer virus và đề tránh tốn quá nhiều đNTPs trong quá trình PCR Primer đượcthử nghiệm trên các mẫu cDNA tổng hợp từ mRNA lá cây họ bầu bí không bị nhiễmbệnh Tiến hành ly trích RNA va tổng hop cDNA như quy trình ở trên Sau đó thực hiệnphản ứng RT- PCR với chu trình nhiệt như Bảng 3.7 và thành phần phản ứng như Bảng

3.8.

Bảng 3.7 Chu trình nhiệt thử nghiệm IC bằng phương pháp RT- PCR

Giai đoạn Nhiệt độ(°C) Thời gian Số chu kỳ

Tiền biến tính 95% 5 phút 1

Bién tinh 95°C 30 giây

Bat cap °C 30 giây 35

Kéo dai 2c 30 giây

Hậu kéo đài ZC 7 phút 1

16

Nước DEPC

9,5 uL (Biobasic)

PCR làm tăng cơ hội thu được các sản phẩm khuếch đại giả hoặc các cặp primer ức chế,

bắt cặp chéo lẫn nhau dẫn đến không phát hiện được gen đích quan tâm (Brownie vactv, 1997) Các sản phâm không đặc hiệu này có thé được khuếch đại hiệu quả hơn mụctiêu mong muốn, lãng phí các thành phần phản ứng và làm cho hiệu suất bắt cặp và kéodai bị suy giảm Do đó, việc tối ưu hóa quy trình phản ứng Multiplex RT-PCR nhằmmục đích giảm thiểu các tương tác không đặc hiệu như vậy Trong nghiên cứu này, tiếnhành khảo sát nồng độ primer và nhiệt độ bắt cặp dé phản ứng Multiplex được thực hiệntốt nhất

3.3.8.1 Khảo sát nồng độ primer của ba cặp primer cho phương pháp Multiplex

RT- PCR

Khảo sát nồng độ hai cặp primer của ZYMV và PRSV

Trong phản ứng Multiplex RT- PCR nông độ primer thường nằm trong khoảng 0,1uM- 0,5 1M (Markoulatos và ctv, 2002) Việc tăng giảm nồng độ primer có thé làm cảithiện đến kết quả phản ứng, tuy nhiên việc tăng giảm không đúng cách có thể làm gây

17

ức chế phản ứng Do đó, cần phải khảo sát nồng độ primer Chu kỳ nhiệt như Bảng 3 10.Nông độ primer của ZYMV và PRSV khảo sát từ 0,1 ¡M đến 0,3 uM Tổ hợp nồng độprimer như Bảng 3.9 Thành phần phản ứng được tiến hành theo Bảng 3.11 Sản phẩmMultiplex RT- PCR mang đi điện di so sánh độ sáng giữa các băng để chọn ra nồng độtối ưu nhất cho phản ứng.

Bang 3.9 Tổ hợp nồng độ primer của ZYMV và PRSV

‹ Nong độ primer PRSV(uM)

Bảng 3.10 Chu trình nhiệt cho khảo sát nồng độ hai cặp primer ZYMV và PRSV

Giai đoạn Nhiệt d6(°C) Thời gian Số chu kỳ

Tiền biến tính 95°C 5 phút 1

Bién tinh 95°C 1 phút

Bắt cặp 55 *C 1 phút 35

Kéo dai T8 1 phút 20 giây

Hậu kéo đài 72°C 7 phút 1

18

Bang 3.11 Thanh phan phản ứng cho khảo sát nồng độ hai cặp primer ZYMV và PRSV

Thành phần Nồng độ lúc đầu Nôồng độlúcsau Thể tích (uL)

Tổng 25 nL

Khảo sát nồng độ primer của ba cặp primer IC, ZYMV, PRSV

Sử dụng nồng độ đã được tối ưu của hai virus kết hợp khảo sát với nồng độ primer

IC C626 F/R) từ 0,05 uM đến 0,4 pM Chu kỳ nhiệt tiến hành như Bảng 3.10 Đối vớiMultiplex RT-PCR, thành phan phản ứng gồm 12,5 L MyTaq Mix (2X); thé tích nồng

độ tối ưu hai virus cộng với thể tích 0,05uM, 0,1 uM, 0,2 uM, 0,3 uM hoặc 0,4 uMprimer IC626 F/R; 2 pL mau cDNA và còn lai là Nước DEPC sao cho tổng thể tích là

25 uL Sản phẩm Multiplex RT- PCR mang đi điện di so sánh độ sang giữa các băng dé

chọn ra nồng độ tối ưu nhất cho phản ứng

3.3.8.2 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của phương pháp Multiplex RT — PCR

Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của từng cặp primer bằng phương pháp RT-PCR

Sử dụng nồng độ primer đã được tối ưu IC, ZYMV, PRSV tiến hành khảo sát nhiệt

độ bắt cặp từng cặp primer cho từng loại virus bằng phương pháp RT- PCR bằng cách

chạy gradient nhiệt độ bắt cặp từ 52- 62°C để xác định khoảng nhiệt độ thích hợp cho

phương pháp Multiplex RT — PCR Thành phan phản ứng gồm 12,5 pL MyTaq Mix(2X), thé tích nồng độ từng cặp primer đã tối ưu, 2 pL mẫu cDNA và còn lại là nướcDEPC sao cho tổng thể tích là 25 wL Chu kỳ nhiệt như Bảng 3.12

19

Bảng 3.12 Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ bắt cặp của từng cặp primer bằng RT-PCR

Giai đoạn Nhiệt độ(°C) Thời gian Số chu kỳ

Tiền biến tính 95°C 5 phut |

Biến tính 95°C 1 phut

Bat cap 52°C -62 °C 1 phút 35

Kéo dai 2 1 phút 20 giây

Hậu kéo dài 72% 7 phút 1

ưu nhất cho phản ứng Multiplex RT- PCR phát hiện 2 virus ZYMV và PRSV

Bảng 3.13 Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ bắt cặp trong phương pháp Multiplex RT-PCR

Giai đoạn Nhiệt độCC) Thời gian Số chu kỳ

Tiền biến tính 95°C 5 phut 1

giây

T90 Hau kéo dai 7 phút 1

20