Tách chiết collagen từ da cá tra và Ứng dụng trong mỹ phẩm kem dưỡng Ẩm

Các điều kiện tách chiết collagen từ da cá tra và ứng dụng tạo thành sản phẩm kem dưỡng ẩm cho da mặt. Song song đó, đánh giá tính chất vật lý và hoa học, độ ổn định của sản phẩm kem dưỡng ẩm chứa collagen.

Và trong hơn nửa thế kỷ nay thì vấn đề tách chiết collagen trong xưong và da cá

đã được nghiên cứu nhiều và cũng đạt nhiều thành công đáng kể Vì vậy vấn đề quantrọng hiện nay là cần phải tiếp tục nghiên cứu cải thiện quá trình tách chiết sao chohiệu suất tách chiết thật cao và nghiên cứu ứng dụng collagen vào các ngành côngnghiệp nhằm nâng cao giá trị kinh tế của collagen, đồng thời giải quyết được vấn đề ônhiễm môi trường

Trong đồ án này ta sẽ đi tách chiết collagen từ da cá tra, sau đó thủy phân để thuđược sản phẩm collagen phù hợp ứng dụng vào công nghệ mỹ phẩm (có khối lượngphân tử nhỏ, an toàn, tính chất cảm quan…) Phối trộn collagen vào kem dưỡng da vớicác nồng độ khác nhau bằng các cách khác nhau, sau đó đánh giá hoạt tính dưỡng ẩm,

độ bền của các mẫu kem để tìm ra nồng độ collagen thích hợp cho việc ứng dụngcollagen vào kem dưỡng ẩm sao cho vừa đem lại hiệu quả dưỡng ẩm tốt vừa có tínhkinh tế

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Collagen

1.1.1 Giới thiệu sơ lược về collagen

Collagen là loại protein chính của mô liên kết, chiếm khoảng 25-35% tổnglượng protein trong cơ thể ở các động vật có vú Trong mô cơ, collagen chiếm khoảng

từ 1-2% Trong cơ thể người, collagen chiếm từ 20-25% protein của cơ thể Collagen

có tác dụng như một chất keo liên kết các tế bào lại với nhau để hình thành các mô và

cơ quan nền tảng trong cơ thể [17]

Collagen được phân bố rộng khắp trong các bộ phận như: da, cơ, sụn, răng, hệthống mạch máu của động vật và có mặt trong các lớp màng liên kết bao quanh các cơ

và là thành phần chính của dây chằng, gân, …

Ngày trước collagen được sản xuất từ da và xương của động vật có vú như: trâu,

bò, lợn…, phế thải của ngành chế biến gia cầm Tuy nhiên nguồn động vật trên cạn nàykhông phù hợp với nhiều vùng tín ngưỡng, tôn giáo, và có thể lây nhiễm một số bệnhnhư: BSE (bệnh bò điên), FMD (bệnh lỡ mồm long móng) Vì thế hiện nay người tatìm các nguồn thu nhận collagen mới từ các loài cá và thủy sản khác [6]

1.1.2 Thành phần hóa học và cấu trúc của collagen

Bảng 1.1 Thành phần các acid amin trong collagen từ vảy cá Rohu và cá Catla (số

b) Cấu trúc phân tử collagen

Về cấu trúc của phân tử collagen, phân tử collagen hay còn gọi là tropocollagen

là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1,5 nm Mỗisợi collagen này được cấu ctạo từ ba chuỗi polypeptide nối với nhau bằng các liên kếthydro và xoắn lại với nhau giống như sợi dây thừng

Hình 1.1 Tropocollagen [2].

Mỗi một vòng xoắn có độ dài là 3,3 gốc amino acid, chiều cao là 2,9 A° Mỗimột chuỗi polypeptide trong collagen được cấu tạo từ các amino acid theo một trật tự,thông thường là Gly - Pro - Y, hoặc Gly - X - Hyp Trong đó, X, Y là những đơn vịamino acid khác Proline (Pro) và hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chuỗi,glycine chiếm khoảng 1/3 chuỗi Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline, vàglycine chiếm 1/2 chuỗi collagen Các amino acid còn lại chiếm ½ [11]

Hình 1.2 Liên kết peptide Hình 1.3 Liên kết Hydro.

1.1.3 Phân loại collagen

Tính đến thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng.Chúng được mã hóa bởi 41 loại gen khác nhau, tạo thành 27 loại collagen Họ collagenđược phân loại thành những phân họ khác nhau dựa vào sự tổ hợp của các siêu phân tử

Dựa theo cấu trúc và cách tổ chức sắp xếp các phân tử trong chuỗi, collagenđược phân chia thành 7 nhóm chính: collagen dạng hình sợi, FACIT collagen, collagendạng mạng, collagen dạng giữ chặt, collagen chuyển màng, collagen màng nền và các

loại collagen có chức năng duy nhất khác Những loại collagen này khác nhau về chiềudài của chuỗi xoắn ốc cũng như bản chất và kích cỡ của những phần không xoắn ốc[9]

Trên 90% collagen trong cơ thể là dạng I, II, III, IV Những loại collagen khácchỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt

Bảng 1.2 Phân loại collagen [12]

chằng

α3[IV]α4[IV]α5[IV]

α5[IV]2α6[IV]

mạc, nhau thaiα1[V]2α2[V]

α1[V]α2[V]α3[V]

VI Mạng lưới α1[VI]α2[VI]α3[VI] Xương, gân, sụn

α1[VI]α2[VI] α4[VI]

VIII Mạng lưới α1[VIII]3 α2[VI]3 Gân, não, tim, thận

α1[VIII]2α2[VIII]

IX Collagen dạng sợi kết

hợp với xoắn gián đoạn

(Fibril-associatedcollagens withinterrupted triple helices-

α1[IX]α2[IX]α3[IX] Sụn, giác mạc

trong biểu mô

trứng

độ nhớt của collagen theo nhiệt độ người ta xác định được nhiệt độ biến tính củacollagen [2]

Độ nhớt của collagen giảm dần theo chiều tăng của nhiệt độ Theo đồ thị hình1.4 ta thấy độ nhớt của collagen bắt đầu giảm ở 300C và đạt ổn định tại 42,50C Khi độnhớt của collagen giảm xuống thấp hơn ½ giá trị ban đầu (tại nhiệt độ phòng) thìcollagen xem là biến tính Như vậy theo đồ thị thì collagen biến tính tại 37,50C Khibiến tính cấu trúc xoắn ba sợi của collagen bị phá vỡ, collagen chuyển sang dạng lỗixoắn ngẫu nhiên do có sự phá vỡ liên kết hydro giữa các sợi collagen trong cấu tạo của

nó [15]

Hình 1.4 Đường cong biến tính nhiệt của collagen, gelatin, collagen thủy phân [15]

b) Khả năng trương nở

Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, cứ 100g collagenkhô có thể hút được khoảng 200g nước Nguyên nhân là do tương tác giữa các mạchpolypeptide làm cho phân tử collagen có những vùng kỵ nước và vùng phân cựcmang điện tích tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen Collagen kết hợpvới nước nở ra, độ dày tăng lên chừng 25% nhưng độ dài tăng lên không đáng kể, tổngthể tích của phân tử collagen tăng lên 2-3 lần [1]

Do nước phân cực nên sẽ tác dụng lên liên kết hydro trong collagen, làm giảmtính vững chắc của sợi collagen từ 3-4 lần Khi nhiệt độ tăng cao mạch polypeptide sẽ

bị yếu đi và bắt đầu đứt thành những mạch nhỏ hơn Nếu nhiệt độ tăng đến 60-65oC,collagen sẽ bị phân giải Đây là những đặc điểm cần lưu ý trong quá trình xử lý thunhận collagen [20]

c) Tính kỵ nước

Tính kỵ nước của collagen được quyết định bởi các gốc kỵ nước của acid amin(gốc R – không phân cực) trong chuỗi polypeptide của collagen hướng ra ngoài, các

gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ nước [1].

d) Tác dụng với acid và kiềm

Collagen có thể tác dụng với acid và kiềm, do trên mạch của collagen có gốccarboxyl và gốc amin Hai gốc này quyết định hai tính chất của nó Trong môi trườngacid, ion của nó tác dụng với gốc amin, điện tích trên carboxyl bị ức chế (hình thànhacid yếu có độ ion hóa thấp) Ngược lại trong môi trường kiềm, gốc amin bị ion hóa tạo

ra NH3 [1]

Acid và kiềm có thể thủy phân collagen, mức độ thủy phân của collagen đượcbiểu thị bằng độ keo phân giải Độ keo phân giải là chỉ số keo sinh thành sản phẩm cóthể tan trong nước (thường là trong điều kiện đun nóng), những sản phẩm này dướinồng độ tương ứng tiến hành làm lạnh có thể biến thành keo [20]

1.1.5 Thu nhận collagen

Hiện nay, ở Việt Nam đã có một vài công trình nghiên cứu tách chiết collagen

từ da cá trong phạm vi đối tượng nghiên cứu còn hạn hẹp

Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn An Giang phối hợp với nhóm nghiêncứu của trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh (2010) đã nghiên cứu thành côngviệc tách chiết collagen từ da cá Tra bằng hai phương pháp hóa học

Nhóm tác giả Trần Thị Huyền, Nguyễn Anh Tuấn, Hoàng Ngọc Anh, Vũ LệQuyên của trường đại học Nha Trang (2012) đã nghiên cứu thành công việc tách chiếtcollagen từ da cá Tra Pangasius hypophthalmus bằng phương pháp hóa học để ứngdụng trong sản xuất mỹ phẩm

Tác giả Lê Thị Thanh Vân (2012) đã nghiên cứu thủy phân collagen từ da cá trabằng enzyme Neutrase kết hợp với enzyme Flavourzyme

Trên thế giới, việc nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá được tiến hành từnăm 1990 và từ collagen đã tạo ra nhiều sản phẩm ứng dụng trong công nghiệp, y học

và dược phẩm

Nhóm tác giả Sitthipong Nalinanon, Soottawat Benjakul, Wonnop Visessangun,Hideki Kishimura (2007) đã tách chiết thành công collagen từ da cá Priacanthustayenus bằng phương pháp sinh học (sử dụng enzyme pepsin)

Tác giả Raed Al Zahrani (2010) đã tách chiết thành công collagen loại I từ da cáBơn bằng phương pháp hóa học

Các phân tử collagen không có khả năng đi qua màng tế bào, cho nên cần phá

vỡ cấu trúc để chuyển collagen vào dung dịch Người ta có thể phá vỡ cấu trúc tế bàobằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồnghóa bằng thiết bị nghiền đồng thể (homogenizator) Thiết bị này có chày thủy tinh gắnvới motor quay và có thể điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào giữa chàythủy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy Để tiện cho việc phá vỡ màng tế bào, các mô tếbào thường được cho trương nước Ngoài ra còn có thể dùng sóng siêu âm, dùng các

việc phá vỡ các bào quan của tế bào do trong các cơ quan này thường chứa mỡ Điềunày có thể giải thích tại sao trước khi tách chiết collagen, da cá thường được tẩy rửavới các hóa chất trên, một mặt là để loại sạch các tạp chất, mặt khác là để cho da đượctrương nở hoặc thành tế bào bị phá vỡ, giúp collagen dễ dàng đi vào dung dịch táchchiết [2]

Sau khi cấu trúc tế bào bị phá vỡ việc tách chiết collagen dễ dàng hơn, có thểtách chiết bằng các dung dịch acid, bazơ hoặc enzyme theo quy trình sau:

Acid/bazơ/enzyme

BãNaCl

Hình 1.5 Sơ đồ tách chiết collagen

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly chẳng hạn như loại acid,phương pháp trích ly, thời gian trích, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly,… Kích cỡnguyên liệu và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi được xem là hai thông số quan trọng bởi vìquá trình tiếp xúc giữa hai pha rắn - lỏng càng tốt khi bề mặt tiếp xúc pha càng lớn.Nguyên liệu có kích thước nhỏ sẽ làm tăng diện tích tiếp xúc pha làm quá trình trích lyxảy ra hoàn toàn, ngược lại thì trích ly sẽ bị hạn chế do không có sự tiếp xúc tốt giữahai pha Tỉ lệ da/dung dịch acid lớn thì da sẽ phân tán đều trong dung dịch, nếu lượngacid quá ít thì bề mặt da không được tiếp xúc hoàn toàn với dung dịch, trích ly không

Nguyên liệu

Chiết

Collagen sạch

Ly tâmKết tủaTinh chế

hoàn toàn Thông số thời gian quyết định hiệu suất trích ly Nếu thời gian ngắn thìcollagen hòa tan vào acid chưa nhiều nên hiệu suất thấp Tuy nhiên, thời gian quá dàicũng không tốt vì mạch collagen có thể bị cắt sâu xuống hình thành gelatin [1].1.1.6 Ứng dụng

Hình 1.6 Sản phẩm kẹo dẻo có vỏ màng làm từ collagen hydrolate

Trong công nghiệp sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa, collagen thủy phân(gelatin) được sử dụng như một phụ gia tạo cấu trúc, giúp ngăn cản sự rỉ nước trongsản phẩm, giúp ổn định các bọt khí, tạo bọt, giữ hương,… cho một số sản phẩm như

kem, yogurt, pho mai, các sản phẩm sữa lên men qua xử lý nhiệt [2]

Trong công nghiệp sản xuất đồ uống như rượu vang, bia, nước quả (nước táo,nước nho,…) collagen được sử dụng vào công đoạn làm trong sản phẩm do phản ứngtạo phức giữa các hợp chất polyphenol với protein (collagen) giúp quá trình kết tủa củacác tạp chất diễn ra nhanh, cải thiện độ trong và kéo dài thời gian bảo quản cho sảnphẩm

Hình 1.7 Collagen hydrolysate được dùng làm trong các loại thức uống.

Trong công nghiệp chế biến thịt, collagen được sử dụng trong việc chế biến thịtđông, thịt hộp, pate, xúc xích nhằm tạo cấu trúc, tạo liên kết và là tác nhân ổn định cấutrúc, làm vỏ bao cho sản phẩm

b) Trong y học và dược phẩm

Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, tác dụng của collagendựa trên sự kết hợp khả năng tạo màng và tạo gel một cách tự nhiên Collagen được sửdụng trong lĩnh vực y dược có mùi vị trung hòa, không gây dị ứng và được hấp thụhoàn toàn trong cơ thể con người, có tính tương thích sinh học cũng như khả năng cầmmáu nên có thể được chế tạo thành những dạng khác nhau, là một loại vật liệu sinh học

lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm y học [2]

Collagen được chế tạo thành màng bao thuốc có tác dụng bảo vệ thuốc chốngnhững tác nhân có hại như ánh sáng, oxy, dịch vị

Hình 1.8 Viên nang mềm có lớp vỏ ngoài làm từ collagen

Trong nha khoa, collagen được chế tạo thành các mảnh bọt biển (sponges),chúng là một tác nhân cầm máu Collagen còn được làm thành lớp men răng nhân tạo

có chứa ion calcium, phosphate, fluoride áp lên bề mặt răng thật để bảo vệ răng khỏinhững tác nhân gây sâu răng

Hình 1.9 Sản phẩm bọt biển trong nha khoa

Collagen ở dạng sợi được dùng trong việc làm lành các vết thương, vết rạchtrong phẫu thuật Sợi collagen có thể được xử lý để tạo cấu trúc sợi thẳng, dài dùng làmnhững sản phẩm y học cho gân, dây chằng Những ống collagen được sử dụng thay thếcho các cấu trúc như thực quản, dây thần kinh ngoại biên, niệu quản Nó cũng được sửdụng trong nuôi cấy tế bào [1]

Trong phẫu thuật nội soi, collagen được sử dụng để bôi vào các ống nội soi, cótác dụng bôi trơn và collagen sẽ phân hủy trong cơ thể sau 40-60 phút mà không gâyhại gì

c) Trong mỹ phẩm

Collagen chứa các tác nhân làm ẩm tự nhiên đối với cơ thể, có vai trò chốngnhăn, giữ cho da mềm và sáng Collagen còn dùng làm nguyên liệu sản xuất các sảnphẩm như: mặt nạ, kem dưỡng ẩm cao cấp, dầu gội, các sản phẩm dưỡng tóc cũng nhưcác loại sữa tắm,…

Hình 1.10 Sữa tắm và mặt nạ collagen hydrosate.

Collagen được dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ như bơm môi, căng da mặt…

Hình 1.11 Collagen dùng trong phẫu thuật thẩm mỹ

1.2 Ứng dụng collagen vào mỹ phẩm cho da

 Là cơ quan xúc giác và cảm giác

 Cách ly và cung cấp một cơ chế điều hòa nhiệt độ đặc biệt thông qua cáchoạt động bay mồ hôi, co mạch…

 Tổng hợp vitamin D

 Bao bọc các bộ phận bên trong

 Đóng góp vào việc tạo nên đặc điểm sinh lí và hình thể của chúng tathông qua màu sắc, bố cục và số lượng lông mao trên da

 Là cơ quan biểu thị hoạt động giao tiếp (đỏ mặt, tái nhợt, đổ mồ hôi) và

là hệ liên kết xúc giác với bên ngoài

b) Cấu trúc của da[18]

Da được cấu tạo từ 2 lớp chính: biểu bì và bì Tương quan và độ dày của 2 lớpthì khác nhau ở các bộ phận khác nhau của cơ thể

Hình 1.12 Cấu trúc da

 Biểu bì: là lớp ngoài cùng của da, có cấu tạo đa lớp Trong đó các tế bào

ở các lớp khác nhau có cấu tạo khác nhau phù hợp với mục đích

Biểu bì được phân chia thành 5 lớp tế bào từ dưới lên trên là: (1) Lớp tế bào đáy(còn gọi là lớp sinh sản), bao gồm một hàng tế bào vuông hay trụ đơn; trong lớp sinhsản có các tế bào sắc tố, bên trong bào tương có rất nhiều hạt bọc chứa melanin Việc

điều hòa và chế tiết melanin của các tế bào sắc tố phụ thuộc trước hết vào yếu tố ditruyền và các yếu tố môi trường, nội tiết, thần kinh (2) Lớp Malpighi (còn gọi là lớpgai), bao gồm nhiều hàng tế bào đa diện, liên kết nhau bằng hình thức "khớp mộng"cho hình ảnh các "gai" dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại lớn, đây là những tếbào trưởng thành của biểu bì (3) Lớp hạt bao gồm vài hàng tế bào mà bên trong bàotương có nhiều hạt keratohyalin tiền sừng, thể hiện hình ảnh đã có sự thoái triển củacác tế bào biểu mô (4) Lớp bóng chỉ có ở da dày lòng bàn tay, lòng bàn chân, có vân,không có lông và tuyến bã) thể hiện các tế bào biểu mô đã chết (5) Lớp sừng, khôngcòn cấu trúc tế bào, có bản chất là mô chết đã được sừng hóa (lớp sừng còn được phân

ra lớp phụ là lớp bong vảy thể hiện sự bong tróc có tính chu kỳ của biểu bì)

Trong lớp biểu bì thì lớp sừng đóng vai trò quan trọng 80% hoạt động dẫntruyền xảy ra tại đây

 Bì: là một lớp mô nhớt, bên dưới lớp biểu bì, chứa các mạch máu, dâythần kinh, nang lông, và các tuyến mồ hôi Cấu trúc gồm một số tế bào nhỏ nằm bêntrong một mạng lưới các kết cấu protein và được bao quanh bởi một lớp thạch vô địnhhình gọi là chất nền Tế bào chủ yếu của lớp hạ bì là fibroblast, chịu trách nhiệm tổnghợp 2 loại protein chính là collagen và elastin

Collagen là một trong những thành phần chính của mô da, có dạng sợi, chiếm

khoảng 70 – 80% khối lượng khô của mô da Nó giúp hình thành một giá đỡ bền vữngxuyên suốt lớp hạ bì

Elastin chiếm khoảng 2% thể tích lớp hạ bì Là một loại sợi linh động chịu trách

nhiệm cho sự co giãn và kéo duỗi của da

Chất nền chủ yếu được tạo ra từ một lớp phân tử gọi là proteoglycans Những

phân tử này có một phần là đường và một phần là protein Chúng giúp duy trì sự cân bằng của nước và các ion, hỗ trợ các thành phần khác của da, gián tiếp kết nối của các nguyên bào sợi, và hỗ trợ cho các nhân tố trong quá trình sửa lỗi da

1.2.2 Làn da khoẻ:

Làn da khỏe là làn da có:

- Màu đồng đều, mịn

- Chứa đủ lượng nước, mướt

- Không bị các rối loạn liên quan đến da

1.2.3 Mỹ phẩm cho da

a) Sản phẩm cho da [5]

- Làm sạch da: sữa rửa mặt, xà phòng, chất tẩy rửa…

- Giữ ẩm cho da: kem dưỡng ẩm, mặt nạ dưỡng ẩm…

- Bảo vệ da: kem chống nắng sữa dưỡng thể…

- Trang điểm: kem lót, kem nền…

b) Một số sản phẩm cho da có chứa collagen

CB Collagen Exclusive dùng để dưỡng da ở mặt và cổ với thành phần: 100%tinh chất thiên nhiên, 5% collagen nguyên chất được chiết xuất từ Cá

Hình 1.13 Mỹ phẩm dưỡng da CB collagen

Pilaten crystal collagen facial mask có tác dụng dưỡng da, làm trắng, xóa mờ tànnhang với thành phần: Plant Collagen, NMF, Haluronic acid, Rose Essential Oil,Arbutin, Moutain Lily, Hydrolyzed Glycosaminoglycans, Colloidal Minerals, SodiumPCA, Purified Water, etc

Hình 1.14 Mặt nạ collagen.

Collagen Firming Cream Tonymoly dưỡng da giúp cho da khỏe và có khả năngđàn hồi với thành phần: collagen; men giá đỗ; men gạo; tinh chất từ: cam thảo, lựu,chanh, cà chua, mật ông, dầu oliu, chất béo từ sữa

Hình 1.15 Kem dưỡng da ban đêm Collagen

1.2.4 Cơ chế giữ độ ẩm của da

Trong lớp biểu bì thì lớp sừng bên ngoài có tác dụng ngăn cản sự mất nước của

da, và bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân lý hóa bên ngoài Trong lớp sừng chứa nhiềuhợp chất như corneocyte, keratin, lipid đặc biệt là chất giữ ẩm tự nhiên (NMF) đóngvai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe của da

Chất giữ ẩm tự nhiên là một hỗn hợp các chất tan, bao gồm các chất: aminoacid, pyrrolidone carboxylic acid, magnesium/calcium/ potassium/ sodium lactate,

chloride, phosphate, citrate và formiate có tác dụng liên kết được với các phân tử nước

và giữ chúng ở lại tế bào Điều này làm cho các corneocyte trương lên, tạo thành ràocản chống lại tác nhân bên ngoài nhằm duy trì sự linh hoạt và tính đàn hồi của da, hạnchế sự thất thoát nước ra ngoài

Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng nước có trong da:

 Sebum: tạo lớp màng dầu mỏng trên da nhằm ngăn cản sự bay hơi củanước, giữ ẩm cho da

 Chất giữ ẩm tự nhiên (natural moisturizing factor NMF):

 Lipid gian bào: chiếm khoảng 14% khối lượng lớp stratum corneum, cócấu trúc lamellar nhiều lớp Lipid da có thành phần gồm ceramide (40-50%), acid béo

tự do (15-25%), cholesterol (20-25%), cholesterol sulphate (5-10%), đây là các chất cótính dầu nên không hòa tan được trong nước, có tác dụng ngăn cản sự mất nước, giữnước lại trong lớp stratum corneum

Nhờ vậy, nước được giữ lại sâu trong lớp hạ bì rồi đến lớp thượng bì của da,giúp da mềm mại, linh động, không gây khô da Da khỏe khi hàm lượng nước trong lớpstratum corneum tối thiểu là 30%

1.2.5 Kem dưỡng ẩm

Kem dưỡng ẩm là hỗn hợp phức tạp của các chất hóa học thiết kế đặc biệt đểlàm cho các lớp bên ngoài của da mềm và mịn hơn. Chúng làm tăng độ ẩm của da bằngcách giảm sự mất nước [19]

Thành phần quan trọng của kem dưỡng ẩm là chất giữ ẩm và chất làm mềm:

 Chất giữ ẩm là chất có thành phần tương thích hay giống với các thànhphần trong chất giữ ẩm tự nhiên Chất giữ ẩm hoạt động bằng cách giả hay thay thế cácthành phần trong chất giữ ẩm tự nhiên để gia tăng khả năng giữ ẩm của da

 Chất làm mềm phổ biến hiện nay ở dạng ester, dầu, và silicon, hay chất

có thành phần tương thích hay giống lớp lipid gian bào Chất làm mềm hoạt động bằngcách tạo một lớp film mỏng trên bề mặt, có tác dụng ngăn cản sự thoát nước, làm mềm

lớp sừng khô ráp bên ngoài, cải thiện lại độ đàn hồi cho da Do đó khi sử dụng chất làmmềm trong công thức mỹ phẩm ta sẽ cảm nhận được da mềm mại và mượt.

Công dụng của việc dưỡng ẩm: giữ ẩm sẽ cải thiện những cảm nhận và kết cấu

của da , và giúp ngăn sự hình thành các nếp nhăn do da khô Giữ ẩm làm giảm sự mấtnước trong tự nhiên của da và da sẽ giữ được chức năng của nó như là một rào cản khi

nó được dưỡng ẩm

Một loại kem dưỡng ẩm da tốt cũng có thể giảm thiểu quá trình lão hóa trên dacủa bạn Giữ ẩm là một bước mà sẽ bảo vệ làn da của bạn chống lại các tác động củamôi trường bên ngoài Da sẽ liên tục được tái tạo

1.2.6 Collagen trong kem dưỡng da

a) Tác dụng của collagen đối với da

Trong thành phần của da collagen chiếm 70% cấu trúc da và được phân bố chủyếu ở lớp hạ bì, tạo ra một hệ thống năng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da

Collagen có tác dụng giúp duy trì độ ẩm cho da, chống lão hóa, ngăn ngừa vàcải thiện nếp nhăn, ngoài ra collagen còn đảm bảo sắc tố da, làm sáng da, mờ sẹo Vớilàn da, ngoài nhiệm vụ liên kết collagen còn có nhiệm vụ tạo sự đàn hồi Da mặt chúng

ta có thể giãn ra khi cười, nói chuyện hay nheo mắt, và co lại như cũ khi ngừng cáchoạt động này là do sự chuyển động của cơ và độ đàn hồi của da Da mặt có thể căngmịn khi còn trẻ và chùng nhão nhiều nếp nhăn khi về già là do sự thay đổi về tính chấtcủa collagen vì thế nó chính là nhân tố quan trọng nhất giúp chúng ta duy trì sự trẻtrung của mình

Sự suy giảm về số lượng cũng như chất lượng collagen sẽ dẫn đến da trở nênkhô, mất độ căng, đàn hồi và thúc đẩy quá trình lão hóa cơ thể

Hình 1.16 Vai trò của collagen đối với da [1].

b) Ưu điểm khi sử dụng collagen vào công thức kem dưỡng ẩm

Collagen được chiết xuất từ nguồn gốc tự nhiên, an toàn và có thể sử dụng chomọi đối tượng, không gây dị ứng, không có tác dụng phụ

Collagen có khả năng hút nước mạnh do đó giúp dưỡng ẩm tốt, ngoài ra còn cóthêm nhiều tác dụng tốt khác như: chống lão hóa, mờ sẹo,… Collagen giúp lớp trêncùng của da giữ nước bằng cách hút nước và giữ lại tại lớp trên cùng của da Hơn nữa,collagen có khối lượng phân tử nhỏ có thể đi vào lớp hạ bì bổ sung, cải thiện da, giảmthiểu xuất hiện các đường và nếp nhăn nhỏ hình thành

Khi sử dụng kem dưỡng ẩm collagen, collagen giữ nước lưu lại trên da nhưngkhông gây tắc nghẽn hay viêm nhiễm các lỗ chân lông của da

1.2.7 Một số sáng chế về collagen ứng dụng vào kem dưỡng ẩm

Xu hướng mỹ phẩm hiện nay là có nguồn gốc từ thiên nhiên, có hiệu quả cao, antoàn, dễ sử dụng Và collagen thủy phân được chú ý và trở thành cái tên quen thuộctrong mỹ phẩm dưỡng da trong nữa thế kỷ qua

Sáng chế năm 1990 của Helen M Fernandez, 20933 Bandera St., WoodlandHills, Calif 91364 về: “Skin moisturizing product and process”, thiết kế một sản phẩm

dưỡng ẩm mà người sử dụng nhanh chống và dễ dàng ở bất cứ nơi đâu bằng cách trộncollagen với nước và một số phụ gia được phun lên da với dạng sương Sáng chế có haicông thức, một dành cho da thường bao gồm: 1-2% collagen, 0,03% -0,05 % DMDMHydantoin và nước cho đủ 8 ounces (=28,3495g); hai dành cho da nhờn và mụn baogồm: 1-2% collagen, 1-2% chiết xuất dưa chuột, 0,03% -0,05 % DMDM Hydantoin vànước cho đủ 8 ounces [8].

Sáng chế năm 2000 của Rita Redlinger , San Diego, California về:

“Moisturizing skin cream”, xây dựng kem dưỡng ẩm sử dụng cho cổ và mặt với mụcđích dưỡng ẩm và ngăn ngừa sự lão hóa vừa an toàn vừa hiệu quả Kem dưỡng da đặcbiệt xây dựng để cung cấp collagen , dầu bơ , lô hội và quan trọng các chất dinh dưỡngtheo yêu cầu của da như vitamin A , C, D và E cho da Công thức của kem: 0,01% -5,00% Aloe Barbadensis Gel; 0,9 % - 1,10% Tocopheryl Acetate; 0,01% - 1,00%Vitamin A & D3 lỏng; 4,90 % - 5,10% dầu bơ; 1.50% - 2.00 % Collagen hòa tan;0,01% - 1,00% về Vitamin C & E và C và các thành phần khác như: chất làm mềm da ,chất làm trơn , chất nhũ hoá , chất làm đặc, chất giữ ẩm , chất bảo quản , thuốc khángnấm , chất tạo mùi và chất làm ướt [13]

Sáng chế năm 2006 của Ibrahim Hanna, Kearny, NJ (US) về: “Skin nourishingand moisturizing cream”, xây dựng công thức kem dưỡng ẩm và chống lão hóa bằngcách kết hợp một pha dầu và một pha nước để tạo ra hỗn hợp đồng nhất Pha dầu baogồm: 3% theo thể tích Spermacetti, 10% theo thể tích Lanolin khan, 3% theo thể tíchSáp ong tinh khiết, 15% khối lượng dầu quả hạnh nhân, 15% khối lượng dầu dừa Phanước bao gồm: 7,5% theo thể tích Glycerin, 12,5% theo thể tích nước hoa hồng, 2%theo thể tích collagen thủy phân, 2% theo thể tích axit Hyaluronic, 30% lượng nước cất[16]

1.2.8 Tiêu chuẩn đối với collagen thủy phân từ da cá tra

Dựa vào bảng dự thảo 2 của tiêu chuẩn quốc gia 2012 về tiêu chuẩn collagenthủy phân từ da cá tra

Chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm: các chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm được quyđịnh trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Các chỉ tiêu cảm quan của collagen thủy phân [4]

Vị Không vị hoặc vị ngọt đạm nhẹ, không có vị lạ

Chỉ tiêu lý - hóa của sản phẩm: các chỉ tiêu lý – hóa của sản phẩm được quyđịnh trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Yêu cầu lý hóa đối với collagen thủy phân [4]

Khối lượng phân tử trung bình tính bằng Da ≤ 3000

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị

a) Dụng cụ:

- Cốc thủy tinh loại 10ml, 250ml, 450ml, 1 lít, 2 lít

- Cân phân tích – Precisa

- Máy khuấy từ – AND EK-200i

- Bơm chân không – Value

- Tủ sấy – Memmert

- Máy ly tâm – Hettich Zentrifugen

- Máy siêu âm – Power Sonic 410

- Máy đo pH – HANNA pH 210

- Máy đo độ ẩm – Skincore

- Máy sắc ký lọc gel – Agilent GPC-Addon Rev.B01.01

- Máy đông khô – Eyela FDU-2100

- Máy soi da – Skin Scope, model SC-31 OUCM

2.1.2 Nguyên vật liệu

a) Da cá: Da cá tra được mua từ công ty cổ phần thủy sản Vinh Quang, lô

37-40, KCN Mỹ Tho – Tiền Giang

b) Enzyme: Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chế phẩm enzyme do

phòng Hóa Sinh thuộc Viện Công nghệ Hóa học cung cấp

Enzyme bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC- 3.4.22.33 được thunhận từ họ Bromeliaceae, hoạt tính 200 U/g Bromelain là nhóm endoprotease có khảnăng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển phân tử proteinthành các đoạn nhỏ gọi là các peptide Trong phân tử bromelain chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầunối disulfite Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn2+ Enzyme Bromelain hoạtđộng ở nhiệt độ từ 45oC - 65oC, trên nhiệt độ đó hoạt tính giảm nhanh.

c) Kem nền: sử dụng kem Hand And Body Lotion được cung cấp bởi Công

Ty Franciacosmetic, Lô I-8B, Đường CN 11, Nhóm CN I Khu Công nghiệp Tân Bình,Quận Tân Phú, Thành phố Hồ Chí Minh

Công thức bao gồm: Carbomer, Axit stearic, Emul165, Cetyl alchol, H2O,Glyxerin, TEA

Được sản xuất theo quy trình:

biệt

cho trương nở từ từ trong 24h ở nhiệt độ phòng  đến khi tan hoàn toàn thành hệ gelđồng nhất Trong quá trình  hòa tan polymer có thể khuấy trộn nhẹ

B (acid stearic, emul 165, cetyl alchol, mineral oil, MP, PP, Tinogard TT) vào tiếp tụckhuấy trộn cho đến khi pha B tan hòa toàn trong pha A Sau khi pha B tan, tiến hànhcho pha C (trietanolamin) vào hỗn hợp rồi tiến hành giải nhiệt bằng không khí

khuấy  trộn  đến khi hết pha dầu (trong vòng 5 phút, 2,5 ml/ phút) và khuấy liên tụctrong 30  phút với tốc độ khuấy tăng dần sao cho dòng chất lỏng có độ lõm hình bầudục (nếu quan sát đuợc) Tốc độ khuấy trung bình khoảng 800 v/phút

  Để nguội đến nhiệt độ phòng có khuấy trộn vừa phải và thêm hươngliệu.

2.1.3 Hóa chất

Bảng 2.5 Các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian: từ ngày 10/2 đến ngày 30/6/2014

Địa điểm: thực hiện tại phòng thí nghiệm hóa hữu cơ thuộc Viện Công nghệHóa học, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh

2.2.2 Phương pháp tách chiết collagen từ da cá tra

STT Tên hóa chất Nơi sản xuất

Tạp chấtNước

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tách chiết collagen từ da cá tra bằng acid acetic.

a) quá trình loại tạp chất

Mục đích: làm sạch da và loại bỏ các tạp chất như: chất béo, protein hòa tan, các

sắc tố,… nhằm nâng cao chất lượng collagen và tăng hiệu quả quá trình tách chiết

Collagen thành phẩm

Nước

chất

Tạp chất

CH3COOH

0,7M

Sau đó da cá được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch NaOH 0,1M trong 24giờ ở nhiệt độ 40C, tiến hành thay dung dịch 5 lần Sau mỗi lần thay dung dịch NaOHcần rửa nhiều lần với nước sạch.

Sau khi xử lý da cá với NaOH tiếp tục xử lý với dung dịch cồn (>90%) trong 8giờ ở nhiệt độ 40C, tiến hành thay dung dịch 3 lần và rửa với nước sạch sau mỗi lầnthay dung dịch

Cuối cùng da cá được xử lý bằng dung môi cao su trong 48 giờ ở 40C và rửa lạithật sạch với nước

Hình 2.2 Da cá sau khi xử lý

b) Quá trình tách chiết

 Xoay nhuyễn

Mục đích: nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa da cá và dung môi dùng để tách

chiết, tăng hiệu suất tách chiết

Tiến hành: da cá sau khi được ngâm trong acid acetic 24h đem xay nhuyễn bằng

máy xay

 Trích ly

Mục đích: tách collagen từ da cá bằng dung dịch acid acetic.

Tiến hành: da cá sau khi đã làm sạch tạp chất được ngâm trong dung dịch acid

acetic 0,7M trong 72 giờ ở 40C với tỷ lệ khối lượng da và dung môi là 1:30 (g/ml)

Hình 2.3 Da cá ngâm sau 72 giờ.

Quá trình tách chiết colagen trong acid acetic ở thời gian 72h, nếu để càng lâuthì collagen sẽ bị phân hủy bởi acid, do đó hiệu suất thu collagen của ta sẽ thấp

c) Lọc

Mục đích: tách bã chưa thủy phân hết để thu dung dịch collagen thô

Tiến hành: dung dịch collagen thô được lọc 2 lần bằng gạc 4 lớp để loại bã tốthơn

Hình 2.4 Dung dịch collagen thô

d) Kết tủa

Mục đích: tách collagen ra khỏi dung môi acid acetic

Tiến hành: dung dịch collagen thô được tủa bằng dung dịch NaCl bão hòa với tỷ

Hình 2.7 Collagen sau khi đông khô.

2.2.3 Phương pháp thủy phân collagen bằng enzyme protamex kết hợp với sóng siêuâm

Đối với quá trình thủy phân các cơ chất có kích thước lớn, trong môi trường siêu

âm, ngoài tác động phân giải của enzyme, các cơ chất cao phân tử còn chịu sự phâncắt bởi sóng siêu âm có cường độ nhất định Hiệu ứng cơ học từ quá trình sủi bóng,

sự vỡ bong bóng đột ngột qua các chu trình nén giãn sẽ tạo nên một gradient áp suấtcao cùng với tăng tốc độ chuyển động cục bộ của lớp chất lỏng ở những vùng lâncận Sự thay đổi tuần tự này có thể tạo nên lực cắt mà không có ảnh hưởng đáng kểtrên phân tử nhỏ nhưng có thể phá vỡ cấu trúc chuỗi polymer Ngoài ra, các hiêu ứngnhiệt cục bộ và hiệu ứng hóa học (sự phân ly của H2O thành các gốc tự do) diễn racũng có thể làm mạch polymer bị đứt gãy Nhờ vào tác động này mà hiệu quả tiếpxúc của enzyme đến cơ chất có hoặc chưa bị phân giải được cải thiện nhiều hơn Sảnphẩm của quá trình phản ứng xúc tác cũng tăng lên nhanh hơn so với khi không sửdụng siêu âm kết quả dẫn đến làm tăng tốc độ phản ứng enzyme xúc tác Tuy vậy, tácđộng này là tách biệt hoàn toàn với hoạt động xúc tác và chỉ đóng vai trò hỗ trợ đểphản ứng của enzyme diễn ra dễ dàng và thuận lợi hơn

Thực hiện:

Collagen được hòa tan với nước cất theo tỷ lệ 4ml nước cất : 1g collagen Sau

đó ta cho enzyme Bromelain vào theo tỉ lệ 100g collagen : 1g enzyme và tiến hànhđánh siêu âm ở 450C trong 60 phút Tiến hành 4 lần mỗi lần 15 phút

Kết quả dung dịch trở nên trong vẫn còn phần đục nâu, ly tâm lấy dịch trongcollagen

Hình 2.8 Thiết bị thủy phân collagen thô bằng sóng siêu âm.

Hình 2.9 Dung dịch collagen thô

Hình 2.10 Dung dịch collagen sau thủy phân

2.2.4 Phương pháp pha trộn collagen vào kem dưỡng ẩm

a Độ hòa tan của kem và nước

Để xác định kem và nước có hòa tan không và ta có thể hòa được bao nhiêu %nước vào kem dưỡng ẩm ban đầu mà vẫn giữ được dạng nhũ đồng nhất của kem(không bị tách lớp)

Chuẩn bị 3 mẫu mỗi mẫu 1g kem, cho nước với hàm lượng 10%, 20%, 30% vào

3 mẫu kem, khuấy trộn thật đều, để ổn định sau vài ngày Ta thấy ở hàm lượng 30%kem vẫn giữ được dạng nhũ đồng nhất

b Độ hòa tan của collagen và nước

Để xác định collagen có tan trong nước không và cần bao nhiêu nước tối thiểu

để hòa tan hoàn toàn collagen

Cân 0,1g collagen, cho nước từ từ vào theo tỷ lệ 2:1, 1:1, 1:2…(collagen (g) :nước (ml)), khuấy đều đến khi collagen tan hết Ta thấy ở tỷ lệ 1:1 collagen đã tanhoàn toàn

c Độ hòa tan của collagen và kem

Để xác định collagen có tan trong kem không và có thể hòa được bao nhiêu %collagen vào kem mà collagen tan hết và kem vẫn giữ được dạng nhũ đồng nhất (không

bị vốn cục, khô)

Cân 0,6g kem, cho từ từ collagen (0,1; 0,2; 0,3; 0,4…g) vào trộn đều đến khithấy collagen không tan nữa Ta thấy khi cho đến 0,3g collagen vẫn tan tốt nhưng đến0,4g thì không tan nữa Vậy ở tỉ lệ 1:2 (collagen : kem) hay hàm lượng 33,33% thìcollagen vẫn tan tốt trong kem

d Pha trộn collagen vào kem dưỡng ẩm

Ta pha trộn collagen vào kem dưỡng ẩm với các hàm lượng 5%, 10%, 15%,20%, 25% theo 2 cách: pha trực tiếp collagen vào kem và pha collagen với nước trướcrồi mới pha vào kem

 Pha trực tiếp