Hồ Chí Minh, tháng 8/2024 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC DẪN XUẤT 3'-FLUOROCHALCONOID, NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ VÀ ĐỘNG HỌC ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH TIỀM NĂNG NHẤT... N
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC
GVHD: PGS TS HOÀNG MINH HẢO SVTH: ĐỖ KHÁNH ĐẠT
TP Hồ Chí Minh, tháng 8/2024
SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC DẪN XUẤT 3'-FLUOROCHALCONOID, NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ VÀ ĐỘNG HỌC ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH TIỀM NĂNG NHẤT
Trang 21
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH
Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2024
Trang 32
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH
Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2024
Trang 13i
TÓM TẮT
Đái tháo đường là một căn bệnh mạn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm, biểu hiện đặc trưng của bệnh là hiện tượng tăng đường huyết và rối loạn chuyển hóa carbohydrate Nhằm tìm kiếm và bổ sung các dẫn xuất chalconoid tiềm năng, phong phú với khả năng
làm hạ đường huyết nên đề tài “Sàng lọc hoạt tính ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 3-fluorochalconoid, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất” được thực hiện nhằm mục tiêu sàng lọc các dẫn xuất
3-fluorochalconoid tiềm năng, làm tiền đề phát triển thuốc hạ đường huyết Kết quả
khảo sát sàng lọc trên mô hình in vitro cho thấy, các dẫn xuất 3-fluorochalconoid đều
có hoạt tính ức chế -glucosidase Trong đó, dẫn xuất NU08 có hoạt tính mạnh nhất với
IC50 = 6,84 M nên được chọn làm hoạt chất để nghiên cứu cơ chế và động học ức chế
-glucosidase Phân tích phổ phát huỳnh quang cho thấy NU08 dập tắt huỳnh quang của
-glucosidase thông qua hai cơ chế: Dập tắt huỳnh quang động và dập tắt huỳnh quang tĩnh trong đó dập tắt huỳnh quang tĩnh chiếm ưu thế, nghĩa là ưu tiên tạo phức ở trạng thái nền Kết quả thực nghiệm thu được hằng số dập tắt huỳnh quang lưỡng phân tử
kq = 1,91 1012 M-1s-1, hằng số kết hợp Ka = 2,84 104 M-1 và số lượng khoang gắn kết
trên mỗi phân tử enzyme là n = 0,95 Để nghiên cứu cơ chế tương tác giữa NU08 và
-glucosidase, phổ phát huỳnh quang của phức chất -glucosidase với naphthalenesulfonic acid (ANS) đã được khảo sát khi không có và có NU08 ở các nồng
8-anilino-1-độ khác nhau ANS kết hợp với enzyme thông qua tương tác kỵ nước để hình thành phức chất phát huỳnh quang [-glucosidase-ANS] Kết quả cho thấy cường độ phát huỳnh quang của phức chất này giảm khi tăng nồng độ của NU08, NU08 tương tác kỵ nước với -glucosidase Kết quả động học enzyme cũng cho thấy rằng NU08 là một chất ức chế không cạnh tranh (non-competitive) đối với -glucosidase Xây dựng đồ thị
Lineweaver–Burk và Dixon đã thu được các giá trị Km = 0,23 102 M và
Ki = 6,743 10-6 M Giá trị Ki nhỏ chứng tỏ khả năng ức chế enzyme của NU08 càng mạnh
Trang 14ii
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ
Vì vậy, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả những người đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này
Đầu tiên và quan trọng nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy/Cô Bộ môn Công nghệ Hóa Học (CNHH) Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm tạo điều kiện cho tôi được học tập và đã luôn tận tâm truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt bốn năm học tập tại trường
Chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS Hoàng Minh Hảo Thầy là người đã trực tiếp hướng dẫn và luôn tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Bên cạnh đó, Thầy cho những lời khuyên, kinh nghiệm và những bài học cuộc sống để giúp tôi định hướng cho tương lai sau này
Tôi xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Mỹ Lệ đã giúp đỡ tôi về dụng cụ, máy móc và thiết bị
để tôi có thể hoàn thành khóa luận này
Tôi cũng muốn bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu Sự ủng hộ và tình cảm của họ là động lực quan trọng giúp tôi hoàn thành khóa luận
Tôi chân thành cảm ơn những người bạn cùng nhóm nghiên cứu, các bạn đã cùng tôi chia sẻ kiến thức, ý kiến và kinh nghiệm trong thời gian làm thực nghiệm
Tuy có nhiều cố gắng, nhưng kiến thức và kinh nghiệm của tôi vẫn còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót trong khóa luận Tôi kính mong nhận được những lời nhận xét và góp ý của quý Thầy/Cô để tôi được hoàn thiện hơn
Tp Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2024
Sinh viên thực hiện
Đỗ Khánh Đạt
Trang 15iii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài “SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ -GLUCOSIDASE CỦA CÁC DẪN XUẤT 3-FLUOROCHALCONOID, NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ
VÀ ĐỘNG HỌC ỨC CHẾ CỦA HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH TIỀM NĂNG NHẤT” là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của Thầy
PGS.TS Hoàng Minh Hảo Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố bằng bất kỳ hình thức nào trước đây Đề tài
là sự nỗ lực cố gắng và kiên trì nghiên cứu của tôi sau thời gian bốn năm học tại trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh Tôi xin cam đoan các nội dung được tham khảo trong khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn đầy đủ theo quy định
TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2024
Sinh viên thực hiện
Đỗ Khánh Đạt
Trang 16iv
MỤC LỤC
TÓM TẮT i
LỜI CẢM ƠN ii
LỜI CAM ĐOAN iii
MỤC LỤC iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ix
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x
MỞ ĐẦU xi
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1
1.1 Bệnh đái tháo đường 1
1.1.1 Khái niệm 1
1.1.2 Phân loại 1
1.1.3 Bệnh Đái tháo đường tuýp 2 2
1.1.4 Các biến chứng của bệnh ĐTĐ 2
1.2 Khái quát về acarbose 3
1.3 Khái quát về -glucosidase và chất ức chế -glucosidase 4
1.3.1. -Glucosidase 4
1.3.2 Cơ chế hoạt động của -glucosidase 5
1.3.3 Chất ức chế -glucosidase 5
1.4 Khái quát về chalcone và chalconoid 6
Trang 17v
1.5 Mô hình thực nghiệm hoạt tính ức chế -glucosidase trên mô hình in vitro 7
1.5.1 Mục tiêu thực nghiệm 7
1.5.2 Nguyên lý thực nghiệm 7
1.5.3 Mô hình thực nghiệm in vitro 7
1.6 Ứng dụng phổ phát huỳnh quang 8
1.7 Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang 10
1.8 Dập tắt huỳnh quang động và tĩnh 12
1.9 Phức chất phát huỳnh quang giữa -glucosidase và ANS (8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid) 13
1.10 Động học enzyme 14
1.10.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 14
1.10.2 Ảnh hưởng của chất ức chế (inhibitor) 15
1.10.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 18
1.10.4 Ảnh hưởng của pH 18
1.10.5 Ảnh hưởng của độ nhớt 18
1.10.6 Các yếu tố khác 19
1.11 Nghiên cứu động học enzyme 19
1.11.1 Lý thuyết về phương trình đồ thị Lineweaver–Burk 19
1.11.2 Lý thuyết về phương trình đồ thị Dixon 24
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1 Hóa chất – Dụng cụ và thiết bị 28
2.1.1 Hóa chất 28
Trang 18vi
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 30
2.2 Thực nghiệm 31
2.2.1 Khảo sát hoạt tính ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 3-fluorochalconoid trên mô hình in vitro 31
2.2.2 Xác định động học dập tắt huỳnh quang của -glucosidase và hợp chất NU08 36
2.2.3 Xác định cơ chế tương tác giữa -glucosidase và NU08 thông qua phổ phát huỳnh quang của phức chất [AG–ANS] 37
2.2.4 Xác định cơ chế ức chế của -glucosidase bởi NU08 thông qua đồ thị Lineweaver – Burk và Dixon 38
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41
3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 3-fluorochalconoid trên mô hình in vitro 41
3.2 Kết quả quá trình khảo sát quá trình dập tắt huỳnh quang của -glucosidase bởi NU08 44
3.3 Kết quả khảo sát cơ chế tương tác giữa -glucosidase và NU08 thông qua phổ phát huỳnh quang của phức chất [AG–ANS] 46
3.4 Kết quả khảo sát cơ chế ức chế của -glucosidase bởi NU08 thông qua đồ thị Lineweaver–Burk và Dixon 47
3.4.1 Chất đối chứng Acarbose 47
3.4.2 Hoạt chất NU08 49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
PHỤ LỤC 59
Trang 19vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của acarbose 3
Hình 1.2: Khung sườn cơ bản của chalcone 6
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của 03 amino acid lần lượt là tryptophan, tyrosine và phenylalanine 9
Hình 1.4: Phổ hấp thụ (a), phổ huỳnh quang (b) của 3 amino acid Trp, Tyr, Phe 9
Hình 1.5: Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang 10
Hình 1.6: Quá trình dập tắt huỳnh quang động và tĩnh 12
Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của ANS 13
Hình 1.8: Phổ kích thích của phức chất [AG–ANS] 14
Hình 1.9: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] 15
Hình 1.10: Kiểu ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) 15
Hình 1.11: Kiểu ức chế không cạnh tranh (non-competitive inhibition) 16
Hình 1.12: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) 17
Hình 1.13: Đồ thị Lineweaver–Burk 20
Hình 1.14: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver– Burk khi có chất ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) 21
Hình 1.15: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver– Burk khi có chất ức chế hỗn tạp (mixed inhibition) 22
Hình 1.16: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver– Burk khi có chất ức chế không cạnh tranh (non-competitive inhibition) 23
Hình 1.17: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver– Burk khi có chất ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) 24
Trang 20viii
Hình 1.18: Đồ thị Dixon của ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) 25 Hình 1.19: Đồ thị Dixon của ức chế hỗn tạp (mixed inhibition) 26 Hình 1.20: Đồ thị Dixon của ức chế không cạnh tranh (non–competitive inhibition) 26 Hình 1.21: Đồ thị Dixon của ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition) 27
Hình 2.1: pNPG bị -glucosidase chuyển hóa thành pNP (màu vàng) 31
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm ức chế enzyme tại các nồng độ
khác nhau của acarbose 42
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm ức chế enzyme tại các nồng độ
khác nhau của NU08 0,15 mM 42
Hình 3.3: Phổ phát huỳnh quang của -glucosidase khi không có và có NU08 45
Hình 3.4: Đồ thị phương trình Stern–Volmer (a) và đồ thị của phương trình (11) (b) 45 Hình 3.5: Phổ phát huỳnh quang của phức [AG–ANS] khi không có và có NU08 47 Hình 3.6: Đồ thị Lineaweaver–Burk của acarbose Vận tốc phản ứng () được biểu thị
Trang 21ix
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Ảnh hưởng của kiểu ức chế lên Vmax và Km và vị trí liên kết 24
Bảng 2.1: Thông tin về các hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu 28
Bảng 2.2: Dụng cụ và thiết bị 30
Bảng 2.3: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát IC50 trên đĩa 96 giếng 33
Bảng 2.12: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát cơ chế ức chế 40
Bảng 3.1: Bảng tổng hợp phần trăm ức chế và giá trị IC50 của acarbose và các dẫn xuất 3-fluorochalconoid 43
Bảng 3.2: Bảng tổng hợp giá trị Vmax, Km và Ki của acarbose 49
Bảng 3.3: Tổng hợp các thông số ức chế động học, số lượng khoang gắn kết và cơ chế ức chế của NU08 đối với -glucosidase 51
Trang 22x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ADA The American Diabetes Association (Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ)
AG -Glucosidase
AGIs Chất ức chế -glucosidase (-glucosidase inhibitors)
ANS 8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid
ĐTĐ Đái tháo đường
Trang 23Hiện nay, để kiểm soát mức đường huyết trong điều trị bệnh đái tháo đường, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ức chế -glucosidase là một chiến lược điều trị tiềm năng -Glucosidase (AG) đóng một vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân tinh bột thành glucose đi tuần hoàn trong máu Acarbose, voglibose, và miglitol là những chất ức chế -glucosidase được sử dụng lâm sàng để điều trị ĐTĐ Trong đó acarbose
ức chế AG thông qua ức chế cạnh tranh so với chất nền p-nitrophenyl--D
glucopyranoxide (pNPG) (P C Calder và R Geddes, 1989) Tuy nhiên, acarbose được
báo cáo là vẫn còn gây ra những tác dụng phụ nghiêm trọng như tiêu chảy, đau dạ dày
và đầy hơi (O J Phung và cộng sự, 2010) Vì vậy, việc tìm kiếm các hợp chất an toàn
và hiệu quả hơn trong việc điều trị ĐTĐ đang ngày càng trở nên cấp thiết
Tại Việt Nam, nhiều dược liệu có những hợp chất có tác dụng sinh học như flavonoid, anthocyanosid, tannin, và các polyphenol,… đã được khảo sát là có tác dụng ức chế AG một cách hiệu quả (Lê Thu Thủy và cộng sự, 2023) Tuy nhiên, theo như hiểu biết cũng như quá trình đọc và nghiên cứu tài liệu, tôi nhận thấy chưa có nhiều nghiên cứu
về tác dụng ức chế -glucosidase, cơ chế và động học ức chế từ các dẫn xuất
Trang 24xii
3-fluorochalconoid Do vậy, đề tài của khóa luận tốt nghiệp: “Sàng lọc hoạt tính
ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 3-fluorochalconoid, nghiên cứu cơ chế và động học ức chế của hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất” được thực hiện nhằm
sàng lọc các dẫn xuất tiềm năng để ứng dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc hạ đường huyết, đóng góp thêm nhiều lựa chọn cho việc điều trị bệnh đái tháo đường an toàn hơn
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Thử nghiệm hoạt tính ức chế in vitro -glucosidase của các dẫn xuất 3-fluorochalconoid, sử dụng acarbose làm chất đối chứng
Xác định cấu trúc có hoạt tính tiềm năng nhất từ các dẫn xuất 3-fluorochalconoid thông qua giá trị IC50
Nghiên cứu động học dập tắt huỳnh quang giữa -glucosidase và hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất
Xác định loại tương tác giữa -glucosidase và hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất thông qua phổ phát huỳnh quang của phức chất [-glucosidase/8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS)]
Xác định cơ chế ức chế -glucosidase bởi hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất thông qua đồ thị Lineweaver – Burk và Dixon
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
-Glucosidase, acarbose và các dẫn xuất 3-fluorochalconoid đã được tổng hợp từ nhóm nghiên cứu của PGS.TS Hoàng Minh Hảo hướng dẫn, gồm 4 hợp chất với ký hiệu lần lượt như sau: NA06, NU07, NU08, và PT09
PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Khảo sát về hoạt tính ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 3-fluorochalconoid trên
mô hình in vitro, cơ chế cũng như động học ức chế giữa -glucosidase và hợp chất có hoạt tính tiềm năng nhất
Trang 25xiii
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đo độ hấp thụ quang của dung dịch để xác định hoạt tính ức chế -glucosidase bởi các chất ức chế bằng cách sử dụng máy đọc vi đĩa Elisa
Đo phổ phát huỳnh quang của -glucosidase khi không có và có chất ức chế ở các nồng độ khác nhau
Đo phổ phát huỳnh quang của phức chất [naphthalenesulfonic acid (ANS)] khi không có và có chất ức chế ở các nồng độ khác nhau
-glucosidase/8-anilino-1-ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Các kết quả nghiên cứu về sàng lọc hoạt tính, cơ chế và động học ức chế -glucosidase lần đầu tiên được nghiên cứu trên các dẫn xuất 3-fluorochalconoid
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1 Ý nghĩa khoa học: Đóng góp chung vào việc xác định hoạt tính, cơ chế và động học ức chế -glucosidase của các dẫn xuất 3-fluorochalconoid
2 Ý nghĩa thực tiễn: Sàng lọc những dẫn xuất 3-fluorochalconoid tiềm năng, cung cấp cơ sở ban đầu cho những nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc hạ đường huyết
CẤU TRÚC KHÓA LUẬN: Khóa luận gồm 3 chương
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và bàn luận
Trang 26Bệnh đái tháo đường là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong không chỉ
ở Việt Nam mà trên toàn thế giới, đòi hỏi cần được chẩn đoán sớm, phát hiện và điều trị kịp thời để xây dựng phác đồ điều trị giúp bảo vệ sức khỏe và cải thiện chất lượng cuộc sống
➢ ĐTĐ tuýp 2: nguyên nhân là do tình trạng kháng insulin và suy giảm chức năng tiết insulin của tế bào tuyến tụy
➢ ĐTĐ thai kỳ: được chẩn đoán vào giai đoạn thứ hai hoặc thứ ba của thai kỳ, trước
đó không có dấu hiệu rõ ràng của bệnh ĐTĐ
➢ ĐTĐ do các nguyên nhân khác: bao gồm hội chứng ĐTĐ đơn gen, bệnh của tuyến tụy ngoại tiết, bệnh nội tiết, hoặc do thuốc, hóa chất như sử dụng glucocorticoid, điều trị HIV/AIDS, hoặc sau khi cấy ghép nội tạng
Trang 272
1.1.3 Bệnh Đái tháo đường tuýp 2
Bệnh ĐTĐ tuýp 2, hay còn gọi là “bệnh đái tháo đường không phụ thuộc insulin”, chiếm
từ 90 – 95% tổng số người mắc bệnh đái tháo đường [3] Có nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh đái tháo đường tuýp 2, trong đó sự đề kháng insulin và suy giảm chức năng bài tiết insulin là hai yếu tố chủ yếu [4] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cơ chế kháng insulin bao gồm sự rối loạn chức năng của các thụ thể insulin, sự không ổn định của con đường truyền tín hiệu từ thụ thể và những bất thường trong quá trình vận chuyển hoặc chuyển hóa glucose [5]
Một số tình trạng sinh lý, bệnh lý và yếu tố môi trường cũng góp phần lớn trong cơ chế phát sinh bệnh ĐTĐ tuýp 2 như béo phì, thai kỳ, bệnh cấp tính, ít luyện tập thể thao, tuổi cao,… Phần lớn các bệnh nhân mắc đái tháo đường tuýp 2 bị thừa cân hoặc béo phì Việc thừa cân sẽ dẫn đến tình trạng kháng insulin ở một mức độ nào đó [3] Ở người béo phì, nồng độ acid béo tự do trong máu cao sẽ ức chế cạnh tranh với glucose, từ đó gây ra tình trạng kháng insulin [5] Tăng acid béo tự do còn ức chế trực tiếp quá trình gắn insulin với các thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào và hoạt động của insulin tại tế bào gan [6]
Khi nồng độ glucose huyết tăng, insulin sẽ được bài tiết nhiều hơn để kiểm soát nồng
độ glucose Tuy nhiên, nếu glucose huyết vẫn tiếp tục tăng cao, thì khả năng bài tiết insulin của tuyến tụy sẽ không thể đáp ứng kịp Việc tăng đường huyết quá mức sẽ dẫn đến suy giảm chức năng của tế bào và hậu quả là tế bào giảm tiết insulin [6]
1.1.4 Các biến chứng của bệnh ĐTĐ
Bệnh ĐTĐ là bệnh đe dọa đến tính mạng và gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm Theo Hiệp hội ĐTĐ quốc tế, ĐTĐ là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 4 hoặc thứ 5 tại các quốc gia phát triển và đang được coi là một đại dịch ở các nước đang phát triển Khoảng 50% bệnh nhân ĐTĐ gặp phải các biến chứng như bệnh mạch vành, tim mạch, đột quỵ, bệnh lý thần kinh do ĐTĐ, cắt đoạn chi, suy thận, và mù lòa Những biến chứng này dẫn đến tình trạng tàn tật và giảm tuổi thọ [7]
Đối với các biến chứng mạn tính, người bệnh cần được kiểm tra sức khỏe thường xuyên Bệnh thận do ĐTĐ cần được đánh giá albumin niệu và mức lọc cầu thận ít nhất một lần
Trang 283
mỗi năm Bệnh lý võng mạc do ĐTĐ cũng cần được khám mắt toàn diện và đo thị lực định kỳ hằng năm để kiểm soát tiến triển của bệnh và giảm nguy cơ mù lòa [4] Tóm lại, các biến chứng do bệnh ĐTĐ gây ra sẽ ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe và chất lượng cuộc sống của người bệnh Nếu không được điều trị tích cực, các biến chứng này có thể dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng
1.2 Khái quát về acarbose
Acarbose là thuốc điều trị đái tháo đường với chất chuyển hóa hữu cơ oligosaccharide có tác dụng ức chế thuận nghịch -glucosidase và tuyến tụy dưới
pseudo-dạng hợp chất enzyme tiêu hóa Các hợp chất có thể được tìm thấy trong Actinophanes
sp một họ chi của sinh vật Micromonosporacae Các enzyme chuyển hóa oligosaccharide thành glucose và monosaccharide ở ruột non của động vật có vú, sự ức chế này làm giảm đường huyết sau mỗi bữa ăn mà không làm tăng insulin máu hoặc kháng insulin [8] Nó cũng tạo điều kiện chữa lành những vết thương [9], giảm các biến chứng của bệnh đái tháo đường bao gồm HbA1c, tryglyceride huyết thanh và nồng độ
chylomicron sau bữa ăn [10] Cấu trúc hóa học của acarbose được thể hình ở Hình 1.1
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của acarbose
Như vậy, acarbose được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh đái tháo đường tuýp 2, giúp
ổn định lượng đường trong máu của bệnh nhân Theo đó, nó có thể được sử dụng riêng
Trang 294
lẻ hoặc kết hợp với insulin trong thuốc điều trị đái tháo đường Acarbose là một thành phần quan trọng trong điều trị bệnh đái tháo đường tuýp 2 và nó đã được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới từ những năm 1990 Đây là một trong những sản phẩm thành công mới nhất được phân lập từ các chất chuyển hóa thứ cấp của vi khuẩn được giới thiệu trên thị trường dược phẩm toàn cầu [11]
Tính đến nay, acarbose đã được khai thác hơn ba thập kỷ kể từ năm 1990 và sản xuất
số lượng lớn từ Actinoplanes sp Trong môi trường lên men Actinoplanes sp của
acarbose chúng cũng là chất nền của protein, glucose, maltose và các dẫn xuất acarbose Hiệu suất loại bỏ glucose và maltose sẽ hỗ trợ tạo ra acarbose với độ tinh khiết cao Hoạt động ức chế tăng đường huyết là kết quả của sự ức chế cạnh tranh thuận nghịch của -amylase tuyến tụy và enzyme glycolytic trong màng ruột kết Quá trình tiêu hóa thức ăn gây ra lượng đường trong máu đã giảm do việc giữ acarbose trong quá trình tiêu hóa carbohydrate ở ruột non Kết quả là, thuốc điều trị đái tháo đường có tác dụng giảm đường huyết sau ăn và nồng độ insulin trong huyết tương [12]
1.3 Khái quát về -glucosidase và chất ức chế -glucosidase
1.3.1 -Glucosidase
-Glucosidase (E.C.3.2.1.20) là một nhóm các enzyme, như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase–glucoamylase, -glucopyranosidase, -D-glucosidase,
-glucoside hydrolase, -1,4-glucosidase, -D-glucoside glucohydrolase
-Glucosidase là một exohydrolase điển hình, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết
-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrate giải phóng các phân tử
-D-glucose Chất nền đặc trưng của -glucosidase là các disaccharide, oligosaccharide, các aryl- và alkyl--glucopyranoside khác [13]
-Glucosidase là một trong những enzyme thuộc lớp glucoside hydrolase (GH), là một lớp các enzyme thường tách các liên kết glycoside giữa hai phân tử carbohydrate (một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer tự nhiên) Khả năng phân cắt các liên kết glycoside của enzyme nhanh hơn 1017 lần so với phản ứng không có enzyme xúc tác [14]
Trang 305
Khi thức ăn được cơ thể hấp thụ, các carbohydrate trong thức ăn được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn nhờ các enzyme ở ruột non Quá trình này yêu cầu tụy tạng phải tiết ra -amylase dùng để phân hủy các phân tử carbohydrate lớn thành các oligosaccharide Tiếp theo, -glucosidase ở màng ruột non tiếp tục phân giải oligosaccharide thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa trước khi thẩm thấu vào máu [15]
1.3.2 Cơ chế hoạt động của -glucosidase
Carbohydrate là chất dinh dưỡng đa lượng chính trong chế độ ăn của con người Khi thức ăn được đưa vào cơ thể, các phân tử carbohydrate bị thủy phân thành các phân tử đường đơn bởi hệ enzyme ở ruột non Cụ thể, sau khi nguồn carbohydrate này
đi vào cơ thể sẽ được -amylase ở tuyến tụy và -glucosidase ở ruột non tiết ra, tiếp tục
bị thủy phân thành những phân tử glucose nhỏ hơn rồi thẩm thấu vào máu [13]
1.3.3 Chất ức chế -glucosidase
Chất ức chế -glucosidase (-glucosidase inhibitors – AGIs) là các chất làm chậm quá trình hấp thụ carbohydrate từ ruột non, giúp giảm lượng đường trong máu sau bữa ăn Hầu hết các AGIs có thể gắn vào vị trí liên kết carbohydrate của -glucosidase vì chúng
có cấu trúc tương tự disaccharide hoặc oligosaccharide Phức hợp này có ái lực mạnh hơn so với phức hợp carbohydrate-glucosidase, gây ức chế cạnh tranh, làm cho hoạt động của -glucosidase trong niêm mạc ruột non bị ức chế Carbohydrate không được hấp thụ trong đường ruột có thể bị thủy phân từ từ ở tá tràng, hỗng tràng, và hồi tràng,
và từ đó làm chậm quá trình hấp thụ glucose [16]
Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng các loại thuốc AGIs điển hình như acarbose, voglibose, và miglitol, có thể tăng cường tiết GLP-1 (glucagon-like peptide-1), giúp giảm cảm giác thèm ăn [16] Acarbose làm chậm quá trình tiêu hóa carbohydrate bằng cách ức chế -glucosidase ở ruột non, dẫn đến làm giảm đường huyết sau khi ăn Tuy nhiên acarbose thường gây các tác dụng phụ không mong muốn như đầy bụng, tiêu chảy, buồn nôn,…[17] Vì thế, việc nghiên cứu và phát triển các AGIs mới có thể cải thiện hiệu quả điều trị đái tháo đường tuýp 2 Hiện nay, chất ức chế -glucosidase được tìm thấy ở nhiều loại sinh vật khác nhau, trong đó nguồn gốc từ thực vật là phổ biến nhất
Trang 316
1.4 Khái quát về chalcone và chalconoid
Chalcone là một hợp chất hữu cơ có công thức phân tử là C15H12O và được biết đến với tên gọi khác là 1,3-diphenyl-2-propen-1-one Hợp chất này có hai vòng thơm liên kết với nhau thông qua hệ thống cầu nối gồm 3 carbon: , và carbonyl bất bão hòa Chalcone có trong tự nhiên thường tồn tại ở dạng rắn kết tinh và có nhiều màu sắc khác nhau Hòa tan tốt trong alcohol, dung dịch acid, kiềm cũng như các dung môi hữu
cơ khác như acetone, chloroform và dichloromethane Chalcone trải qua các phản ứng đồng phân hóa để tạo ra flavonoid Về mặt hóa học lập thể, chúng có thể tổn tại ở cả
đồng phân (Z) và (E), nhưng đồng phân (Z) không ổn định do hiệu ứng không gian của
vòng A (Hình 1.2) với nhóm carbonyl [18]
Hình 1.2: Khung sườn cơ bản của chalcone
Trên 2 vòng thơm có thể được gắn kèm các nhóm thế như amino, hydroxyl, methoxyl tạo thành các dẫn xuất chalconoid Các chalconoid xuất hiện nhiều trong tự nhiên và được tìm thấy trong hoa, lá, rễ của các loài thực vật Chalconoid có tác dụng kháng viêm, giảm đau, và hạ sốt Một số loại chalconoid có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và diệt côn trùng [19] Trong lĩnh vực y học, chalconoid được sử dụng để điều trị các bệnh như ung thư, viêm, đau và các bệnh lý liên quan đến tim mạch và có khả năng kháng đái tháo đường [20, 21] Ngoài ra chalconoid còn có nhiều hoạt tính sinh học khác như kháng ung thư, kháng ký sinh trùng, kháng sốt rét, kháng oxy hóa, kháng nấm, ức chế miễn dịch, kháng loạn nhịp tim, kháng bệnh gout, kháng vi khuẩn và kháng steroid [22]
Trang 327
Các nhóm halogen mang lại những ảnh hưởng nhất định đến hoạt tính sinh học của chalcone Trong đó, việc lựa chọn dẫn xuất chalconoid có nhóm thế fluoro để thử nghiệm hoạt tính kháng -glucosidase dựa trên một số căn cứ lý thuyết như sau [23]:
− Cấu trúc hóa học và tính chất điện tử: Các nguyên tử fluorine có độ âm điện
lớn, có thể ảnh hưởng đến sự phân bố điện tử trong phân tử và tạo ra các tương tác mạnh với enzyme/protein mục tiêu
− Khả năng tạo liên kết hydro: Các dẫn xuất fluoro có thể hình thành liên kết
hydro mạnh với các nhóm chức năng trong enzyme, giúp tăng khả năng ức chế enzyme
− Ảnh hưởng đến dược động học: Nguyên tử fluorine có thể ảnh hưởng đến tính
chất dược động học của hợp chất, như tăng độ bền sinh học, khả năng thẩm thấu
qua màng tế bào, và tăng cường khả năng chống lại sự phân hủy của enzyme
− Khả năng thay thế nhóm chức: Nguyên tử fluorine có thể thay thế các nhóm
chức khác trong phân tử mà không làm mất đi hoạt tính sinh học, đồng thời còn
có thể cải thiện tính chất hóa lý của hợp chất
1.5 Mô hình thực nghiệm hoạt tính ức chế -glucosidase trên mô hình in vitro 1.5.1 Mục tiêu thực nghiệm
Thực nghiệm hoạt tính ức chế -glucosidase nhằm đánh giá khả năng của chất ức chế trong việc kháng -glucosidase Mục tiêu là tìm ra các chất ức chế tiềm năng có thể được sử dụng để phát triển thành thuốc trong việc điều trị bệnh đái tháo đường tuýp 2
1.5.2 Nguyên lý thực nghiệm
-glucosidase phân giải các oligosaccharide thành glucose Việc ức chế enzyme này sẽ ngăn chặn quá trình phân giải, từ đó làm giảm lượng glucose được hấp thụ vào máu
1.5.3 Mô hình thực nghiệm in vitro
+ Chuẩn bị enzyme: -glucosidase được chiết xuất từ nguồn gốc thực vật để sử dụng
trong các thí nghiệm in vitro
Trang 338
+ Chất nền (Substrate): Chất nền được sử dụng trong khóa luận này là
p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (pNPG) Khi bị enzyme xúc tác, pNPG giải phóng p-nitrophenol (pNP), chất này có màu vàng đặc trưng khi được kích thích ở bước sóng max = 405 nm
+ Quy trình thực hiện:
1 Trộn enzyme, chất nền, và hợp chất thử nghiệm trong điều kiện thích hợp (nhiệt độ, pH)
2 Đo độ hấp thụ của p-nitrophenol được giải phóng ở bước sóng 405 nm
3 So sánh hoạt tính ức chế -glucosidase của mẫu thử (có chất ức chế -glucosidase)
so với mẫu chuẩn (không có chất ức chế -glucosidase) So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu không có chất ức chế và có chất ức chế để xác định % ức chế
ba amino acid bao gồm: tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr), phenylalanine (Phe) Cấu trúc
hóa học của ba amino acid trên được biểu diễn ở Hình 1.3
Như vậy, để xác định động học của quá trình dập tắt huỳnh quang của enzyme bởi các chất ức chế thì khi có sự hiện diện của chất ức chế thì cường độ phát huỳnh quang của enzyme sẽ thay đổi
Trang 34Hình 1.4: Phổ hấp thụ (a), phổ huỳnh quang (b) của 3 amino acid Trp, Tyr, Phe
phân tử mol (molar absorptivity) Đây là một thước đo khả năng hấp thụ ánh sáng của một chất ở một bước sóng nhất định và được sử dụng trong phương trình Lambert-Beer
Hệ số là một hằng số đặc trưng cho từng chất và bước sóng ánh sáng cụ thể, cho biết
mức độ mạnh yếu của một chất trong việc hấp thụ ánh sáng ở bước sóng đó
Trong phổ phát huỳnh quang, hệ số ảnh hưởng đến cường độ phát huỳnh quang vì
cường độ huỳnh quang phát ra phụ thuộc vào lượng ánh sáng được hấp thụ bởi chất huỳnh quang Một chất có hệ số lớn sẽ hấp thụ nhiều ánh sáng hơn, dẫn đến cường độ
huỳnh quang cao hơn nếu các yếu tố khác như hiệu suất lượng tử huỳnh quang (quantum yield) cũng cao
Trang 3510
1.7 Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang
Khi chiếu xạ liên tục vào phân tử có khả năng phát huỳnh quang F (fluorophore) Phân tử phát huỳnh quang sẽ chuyển từ trạng thái cơ bản (F) lên trạng thái kích thích (F * ) (Hình 1.5) [24] Từ trạng thái kích thích, F * có thể quay về trạng thái nền thông qua quá trình phát xạ và quá trình phi phát xạ
Hình 1.5: Hiện tượng phát huỳnh quang và dập tắt huỳnh quang
Tốc độ quá trình phát xạ được xác định bởi phương trình (1):
(Trong đó: kf là hằng số tốc độ quá trình phát xạ)
Tốc độ quá trình phi phát xạ được xác định bởi phương trình (2):
(Trong đó: kt là tổng các hằng số tốc độ của các quá trình phi phát xạ)
Trong điều kiện kích thích liên tục thì tốc độ hình thành F * và tốc độ giảm hoạt F * → F
là như nhau Nồng độ F * được xác định bởi phương trình (3):
[𝑭∗] = 𝐈𝒂
(Trong đó: I a là tốc độ hình thành (F *))
Trang 3611
Nếu trong dung dịch có phân tử dập tắt huỳnh quang Q thì ngoài hai quá trình phát xạ
và phi phát xạ để F * quay về trạng thái nền F thì F * có thể giảm hoạt thông qua quá trình dập tắt huỳnh quang lưỡng phân tử theo phương trình (4):
𝒌 𝒇 + ∑ 𝒌 𝒕 là thời gian sống của F * khi không có Q (𝝉𝟎 = 10-8 s) [25]
Phương trình Stern-Volmer với Ksv là hằng số Stern-Volmer được xác định theo phương
trình (8) [25] Hằng số Ksv là tỷ lệ giữa hằng số dập tắt lưỡng phân tử so với hằng số dập tắt đơn phân tử và thứ nguyên là L/mol
Vì hiệu suất lượng tỉ lệ với cường độ phát huỳnh quang Nếu gọi F 0 và F là cường độ phát huỳnh quang khi không có và có Q trong dung dịch thì phương trình (8) trở thành:
𝐅𝟎
Như vậy, hằng số Stern–Volmer Ksv là hệ số góc của phương trình (9)
Dựa vào giá trị Ksv thu được từ thực nghiệm, có thể xác định hằng số tốc độ dập tắt
lưỡng phân tử kq
Trang 3712
Trong cơ chế dập tắt huỳnh quang động học, giai đoạn quyết định tốc độ phản ứng là
giai đoạn hình thành phức chất trung gian [FQ] * với hằng số tốc độ kd (diffusion controlled limit)
Giá trị kd được tính toán theo phương trình Smoluchowski (kd = 4N rAB DAB)
Trong đó: N là số Avogadro (N 6 1023 mol-1, rAB = 4 10-10 m là giá trị xấp xỉ của
tổng bán kính phân tử của chất tan A (rA) và B (rB), DAB = 2 10-9 m2s-1 là hệ số khuếch tán)
Từ đó tính toán được giá trị kd 6 109 M-1s-1 và thường được lấy giá trị xấp xỉ
1010 M-1s-1 [25]
1.8 Dập tắt huỳnh quang động và tĩnh
Khi có mặt của chất dập tắt huỳnh quang Q thì quá trình dập tắt huỳnh quang F * bởi Q
có thể xảy ra theo hai cơ chế hoặc dập tắt huỳnh quang động (dynamic quenching) hoặc
dập tắt huỳnh quang tĩnh (static quenching) hoặc cả hai [25] theo Hình 1.6
Trong đó: là năng lượng được giải phóng dưới dạng bức xạ nhiệt
Hình 1.6: Quá trình dập tắt huỳnh quang động và tĩnh
Cơ chế dập tắt huỳnh quang động: F * và Q tương tác với nhau Quá trình dập tắt này không phát xạ Ngoài ra, chất dập tắt huỳnh quang phải khuếch tán và va chạm với F * trong suốt thời gian sống của F * Vì Q tương tác với F * nên quá trình dập tắt huỳnh
quang động làm thay đổi thời gian sống của F *
Trang 3813
Cơ chế dập tắt huỳnh quang tĩnh: F và Q tương tác hình thành phức chất [FQ] ở trạng thái nền Quá trình này không làm thay đổi thời gian sống của F *
Nếu có sự tham gia của quá trình dập tắt huỳnh quang tĩnh thì thông tin về quá trình tạo
phức chất giữa F và Q được biểu diễn bằng phương trình (11) [26, 27]
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) được sử dụng rộng rãi như là một đầu dò huỳnh quang để xác định tính kỵ nước bề mặt của -glucosidase [29, 30], cấu trúc hóa
học của ANS được thể hiện ở Hình 1.7
Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của ANS
Trang 3914
Nếu một chất ức chế có tương tác với enzyme thông qua tương tác kỵ nước thì chất ức chế này có thể cạnh tranh vào việc tạo phức giữa ANS với enzyme hay nói cách khác cường độ phát huỳnh quang của phức [ANS–AG] sẽ giảm khi có mặt của chất ức chế Bằng phương pháp này có thể xác định được loại liên kết của chất ức chế so với enzyme
Kết quả đo phổ kích thích của phức chất [AG–ANS] được trình bày như Hình 1.8 [24],
cường độ phát xạ của phức chất cho khoảng kích thích tốt tại 370 – 400 nm, kết quả này phù hợp với những công bố trước đó [29, 30] Dựa vào đây, lựa chọn bước sóng tại
375 nm làm bước sóng kích thích để đo phổ phát huỳnh quang của phức chất [AG–ANS] khi không có và có NU08 ở các nồng độ khác nhau để xác định tương tác kỵ nước giữa
-glucosidase và NU08
Hình 1.8: Phổ kích thích của phức chất [AG–ANS]
1.10 Động học enzyme
1.10.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện dư thừa chất nền, nghĩa là nồng độ chất nền (substrate) [S] >> nồng độ enzyme [E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [S], v = K [E] có dạng y = ax Nhờ đó,
đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác Sự phụ thuộc của vận tốc
phản ứng vào nồng độ enzyme được thể hiện trong Hình 1.9 Có nhiều trường hợp trong
môi trường có chứa chất ức chế hay hoạt hóa thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó
Trang 4015
Hình 1.9: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]
1.10.2 Ảnh hưởng của chất ức chế (inhibitor)
Là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme không còn khả năng xúc tác để biến chất nền thành sản phẩm Nó có thể là chất ức chế thuận nghịch (reversible inhibitors) hay bất thuận nghịch (irreversible inhibitors)
Ức chế thuận nghịch có thể là ức chế cạnh tranh (competitive), không cạnh tranh competitive): làm giảm hiệu quả enzyme, kháng cạnh tranh (uncompetitive): làm giảm tốc độ phản ứng enzyme, hay hỗn tạp (mixed)
(non-1.10.2.1 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
Trường hợp ức chế cạnh tranh là do chất nền (Substrate) (S) và chất ức chế (Inhibitor) (I) đều liên kết vào khoang gắn kết của enzyme Chất ức chế sẽ choán chỗ của chất nền
ở enzyme như Hình 1.10
Hình 1.10: Kiểu ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
