Bài báo cáo hóa phân tích 2 chủ Đề sắc kí lỏng hiệu năng cao

Nguyên lý: Các phân tử hợp chất hữu cơ hấp thu ánh sáng UV và độ hấp thu tỷ lệ với nồng độ của chúng trong dung dịch.. So sánh độ lớn các tính hiệu dt Peak hoặc chiều cao Peak trong mẫu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ

KHOA DƯỢC - -

BÀI BÁO CÁO

HÓA PHÂN TÍCH 2 Chủ đề: Sắc kí lỏng hiệu năng

cao

TIỂU NHÓM: 2

LỚP: DH22DUO01

GVHD: Huỳnh Phương Thảo

Sinh viên thực hiện:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ

KHOA DƯỢC - -

BÀI BÁO CÁO

HÓA PHÂN TÍCH 2 Chủ đề: Sắc kí lỏng hiệu năng

cao

TIỂU NHÓM: 2

LỚP: DH22DUO01

GVHD: Huỳnh Phương Thảo

Sinh viên thực hiện:

SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

A TỔNG QUAN VỀ NỘI DUNG:

1 Tổng quan về sắc kí lỏng hiệu năng cao

1 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích trong hóahọc và sinh học dùng để tách, nhận diện và định lượng các hợp chất cótrong một mẫu

- Sắc kí đồ HPLC cho cả hai thông tin về định tính và định lương

Là chất liệu cố định (thường là các hạt silica được chức năng hóa) trong cột sắc ký.

3 Nguyên lý:

Khi mẫu được tiêm vào hệ thống, các thành phần của nó sẽ di chuyển qua cột sắc ký với tốc độ khác nhau, dựa trên mức độ tương tác của chúng với pha động và pha tĩnh Điều này tạo ra sự phân tách giữa các thành phần

1 Bình chứa dung môi.

Dùng để chứa dung môi, thường bằng thủy tinh trung tính, có nắp đậy kín tránh bay hơi

Dung môi khi pha sẽ lẫn một lượng nhỏ tạp chất gây nghẽn cột nên cần qua bước lọc để loại bỏ.

Tùy vào dung môi là nước, hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước hoặc dung môi hữu cơ ta dùng các màng lọc:

3 Hệ thống bơm cao áp.

Hầu hết các loại bơm trên thị trường đều dựa trên mô hình piston thuận nghịch

Bơm HPLC dùng để hút pha động từ bình chứa đẩy qua cột sắc ký

Bơm piston thuận nghịch

Một số loại bơm:

Bơm có lưu hằng định: lưu lượng và áp suất không đổi, bao gồm 1

piston hoặc 2 piston

Bơm đẳng dòng: lhỉ lấy 1 loại dung môi, không tự pha trộn được Bơm nhị phân: lấy được đồng thời 2 loại dung môi.

Bơm tứ phân: lấy được đồng thời 4 loại dung môi.

5 Cột sắc ký.

Thường bằng thép không rỉ, ống thủy tinh đặc biệt hoặc polyethylen Gồm 2 loại cột chính:

a Cột phân tích:

Pha tĩnh: pha tĩnh lỏng được tẩm vào chất mang bằng liên kết hóa

học rồi nhồi vào cột

Chất mang: không được có hoạt tính, không còn khả năng hấp

phụ

Một số cột sắc ký thường gặp: Novapak C18, Nuclecil C18,

Zorbak,

Cột sắc ký Shinwa Ultrol

b Cột chế hóa:

Thường có đường kính trong lớn hơn so với cột phân tích

Tốc độ dòng nhanh, ứng dụng nhiều trong lĩnh vực dược liệu

- Một bộ phát hiện lý tưởng phải thỏa mãn các yêu cầu:

+ Độ nhạy cao: khả năng phát hiện nhỏ hơn 0,1 microgam/1 cm3 pha

• Flow cell (cốc đo cho dòng chảy đi qua)

• Bộ phận đo sự thay đổi cường độ ánh sáng khi đi qua cốc đo

Máy dò hấp thụ tia cực tím

b Bộ phát hiện đa sóng – PDA

Được xem là bộ phận phát hiện đo độ hấp thu UV Vis đa kênh, mỗikênh phát hiện ánh sáng ở bước song nhất định

Nguyên lý: Các phân tử hợp chất hữu cơ hấp thu ánh sáng UV và

độ hấp thu tỷ lệ với nồng độ của chúng trong dung dịch

c Bộ phận phát hiện huỳnh quang.

Phát hiện các hợp chất, dư lượng các thuốc trừ sâu, carbamat, aflatoxin, vitamin,

Thuận lợi: độ nhạy cao hơn so với hấp thu UV.

Khóa khăn: sử dụng phức tạp, một số chất như Oxy làm nhiễu kết

quả nên cần loại khí thật kĩ

Thiết bị phân tích quang phổ

Khúc xạ kế vi sai

Ngoài ra còn một số bộ phát hiện khác tùy mục đích sử dụng như:

• Bộ phát hiện tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD)

• Bộ phát hiện điện hóa

• Bộ phát hiện khối phổ

• Bộ phát hiện cường độ xung,

● Dựa vào phương pháp thêm chất dẫn.

● Thu sản phẩm ra khỏi cột và định danh bằng những kỹ thuật khác nhau khối phổ, hồng ngoại, cộng hưởng từ

Định lượng:

1 Dựa vào chiều cao Peak.

Khi Peak có hình dạng không đổi thì chiều cao Peak là một đại lượng tỷ lệvới diện tích của Peak và cũng có thể được dungf để định lượng

Điều kiện để sử dụng chiều cao Peak là các chỉ số k (capacity factor) phải hằng định

2 Dựa vào diện tích Peak.

- Diện tích Peak của một chất tương đương với tổng lượng chất đó

- Sử dụng dt Peak trong trường hợp yếu tố dung lượng k (capacity factor) thay đổi vì ảnh hưởng của các chất khác.

a Chuẩn hóa với chất ngoại.

So sánh độ lớn các tính hiệu (dt Peak hoặc chiều cao Peak) trong mẫu thử chưa biết với dd chuẩn đối chiếu các chất đó

Trong phương pháp chuẩn 1 điểm, nồng độ của mẫu có thể được tính như sau:

Ca =Sa × Cst

Sst

Ca: Nồng độ của mẫut ử ℎ

Cst : Nồng độ chất chuẩn

Sa: Độ lớn của Peak mẫuthử

Ss t : Độ lớn của Peak mẫu chuẩn

b Chuẩn hóa với chất nội.

Để giảm sai số và độ lặp lại cao người ta sử dụng phương pháp chuẩn hóa với chất thứ 2 thêm vào chất chuẩn ngoại và mẫu thử Chất này gọi là chấtnội

Chất nội phải có cấu trúc hóa học tương ứng với chất khảo sát

Công thức tính yếu tố hiệu chỉnh Fx:

Cx :nồng độ dd c uẩn ℎ Cis: nồng độ dd c ất ℎ c uẩn ℎ nội

Sx :độ lớn của Peak c uẩn ℎ Sis: độ lớn của Peak c uẩn ℎ nội

c Chuẩn hóa bằng phương pháp thêm.

Dung dịch mẫu thử được thêm một lượng xác định của chất chuẩn, các Peak thu được của cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn phải được khảo sát trong cùng điều kiện sắc ký

Ưu điểm: độ chính xác cao, loại trừ được các yếu tố ảnh hưởng khác.

Công thức tính nồng độ chưa biết Ca:

Ca =Sa × ∆ C

∆ S

Ca: Nồng độ mẫu

∆ C :C ên ℎ ℎlệcℎnồng độ

∆ S :độ tăng của độ lớn Peak

d Phương pháp qui về 100% diện tích Peak.

Phương pháp này ứng dụng hạn chế trong HPLC, thường sử dụng trong sắc ký khí

Đòi hỏi mọi cấu tử phải được rửa giải và phát hiện

Công thức này chỉ đúng trong HPLC khi sự đáp ứng của bộ phận phát hiện trên các cấu tử X, Y, Z là như nhau:

• Pha dung dịch chuẩn và mẫu thử metformin trong nước hoặc dung dịch đệm

• Lọc qua màng lọc 0,45 µm

2 Điều kiện sắc ký:

• Cột: C18 (5 µm, 250 × 4,6 mm)

• Pha động: Dung dịch đệm phosphat (pH 6,0) và acetonitril (70:30 v/v)

• Detector: UV-Vis, bước sóng 232 nm

• Lưu lượng: 1,0 mL/phút, nhiệt độ cột 30–40°C, thể tích tiêm 10 µL.

3 Quy Trình:

• Định tính: So sánh thời gian lưu (Retention Time) giữa mẫu thử và dung dịch

chuẩn

• Định lượng: Lập đường chuẩn (diện tích đỉnh vs nồng độ), tiêm mẫu thử và

tính hàm lượng dựa trên phương trình đường chuẩn

• Phương trình đường chuẩn: y = ax + b, với

R^2 >=0,999 (đạt yêu cầu tuyến tính)

• Hàm lượng metformin đo được thường nằm trong khoảng 90–110% so với tiêu chuẩn ghi nhãn

• Độ thu hồi: 98–102%, đảm bảo độ đúng

Đánh giá tổng thể:

• Phương pháp đạt các tiêu chí về độ chính xác, độ lặp lại (RSD ≤ 2%), và độ đặc hiệu

HPLC Atorvastatin

*Quy trình định tính Atorvastatin bằng HPLC.

1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

• Cân chính xác một lượng atorvastatin chuẩn, hòa tan trong dung môi pha động

(acetonitril và đệm phosphate)

• Pha loãng đến nồng độ khoảng 10 µg/mL

2 Chuẩn bị dung dịch mẫu:

• Nghiền mịn viên thuốc, lấy lượng mẫu tương đương liều lượng công bố (ví dụ: 10 mgatorvastatin)

• Hòa tan trong dung môi pha động, siêu âm và lọc qua màng 0,45 µm

3 Điều kiện sắc ký:

• Cột sắc ký: C18 (5 µm, 150 x 4,6 mm hoặc tương đương).

• Pha động: Acetonitril:đệm phosphate (pH 3,0) = 60:40 (v/v).

• Tiêm mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, xác định thời gian lưu (Rt) của atorvastatin

• Tiêm mẫu thử và so sánh Rt với mẫu chuẩn Nếu Rt tương ứng, mẫu thử có chứa atorvastatin

*Quy trình định lượng Atorvastatin bằng HPLC.

1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và mẫu:

• Pha dung dịch chuẩn với các nồng độ khác nhau (5, 10, 15, 20 µg/mL) từ dung dịch gốc

• Chuẩn bị dung dịch mẫu giống như phần định tính

2 Xây dựng đường chuẩn:

• Tiêm các dung dịch chuẩn vào hệ thống HPLC, đo diện tích pic

• Vẽ đồ thị diện tích pic (trục y) theo nồng độ (trục x).

• Xác định phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan (R², yêu cầu ≥ 0,99)

3 Tiêm dung dịch mẫu:

• Tiêm dung dịch mẫu vào hệ thống HPLC, đo diện tích pic

• Dựa trên phương trình đường chuẩn, tính toán nồng độ atorvastatin trong dung dịch

 Định lượng

*Kết quả thu được

Định tính:

• Thời gian lưu (Rt) của mẫu thử trùng với mẫu chuẩn atorvastatin, thường trong

khoảng 5–10 phút (tùy điều kiện sắc ký)

• Khẳng định sự hiện diện của atorvastatin trong mẫu

Định lượng:

• Hàm lượng atorvastatin trong viên nén (mg/viên hoặc % so với công bố)

• Ví dụ: Kết quả thu được cho viên nén atorvastatin 10 mg:

• Hàm lượng trung bình: 9,9 mg/viên (99% so với công bố)

• Độ lặp lại: RSD ≤ 2%

Độ chính xác và độ lặp lại:

• Độ thu hồi: Trong khoảng 98–102%

• RSD (Relative Standard Deviation): ≤ 2% (phù hợp yêu cầu tiêu chuẩn)

*Quy trình định tính Omeprazole bằng HPLC.

1 Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử:

 Dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng xác định omeprazole chuẩn (đã được

chuẩn hóa) trong dung môi phù hợp (thường là methanol hoặc acetonitril phaloãng với nước có pH điều chỉnh) để đạt nồng độ khoảng 10–50 µg/mL

 Dung dịch thử: Hòa tan mẫu cần phân tích (thuốc, hỗn hợp) với dung môi

tương tự

 Cột sắc ký: C18 (ODS), kích thước hạt 5 µm, kích thước cột 150 × 4.6 mm.

 Pha động: Hỗn hợp acetonitril và đệm phosphate (pH 7.4) theo tỷ lệ (v/v)

 Tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống HPLC

 So sánh thời gian lưu của omeprazole trong mẫu chuẩn và mẫu thử Nếu thời gian lưu trùng khớp, omeprazole có mặt trong mẫu thử

=> Kết quả thu được: Thời gian lưu của dung dịch chuẩn, thời gian lưu của

dung dịch thử, dạng pic sắc ký

*Quy trình định lượng Omeprazole bằng HPLC.

1 Chuẩn bị dung dịch:

Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị ít nhất 5 nồng độ khác nhau (ví dụ: 10, 20, 30, 40,

50 µg/mL) để xây dựng đường chuẩn

Dung dịch thử: Chuẩn bị dung dịch mẫu cần phân tích, thường có nồng độ tương

tự trong khoảng đường chuẩn

=> Kết quả định lượng:

- Mục tiêu: xác định được nồng độ và hàm lượng của omeprazole trong mẫu thử.

- Tính hàm lượng omeprazole trong mẫu thử

HPLC Losartan

*Quy trình định tính Losartan bằng HPLC.

1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Cân chính xác một lượng losartan chuẩn, hòa tan trong dung môi pha động (acetonitril và đệm phosphate)

Pha loãng đến nồng độ khoảng 10 µg/mL

2 Chuẩn bị dung dịch mẫu:

Nghiền mịn viên thuốc, lấy lượng mẫu tương đương liều lượng công bố (ví dụ:

50 mg losartan)

Hòa tan trong dung môi pha động, siêu âm và lọc qua màng 0,45 µm

3 Điều kiện sắc ký:

Cột sắc ký: C18 (5 µm, 150 x 4,6 mm hoặc tương đương).

Pha động: Acetonitril:đệm phosphate (pH 3,0) = 55:45 (v/v).

* Quy trình định lượng Losartan bằng HPLC.

1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và mẫu:

• Pha dung dịch chuẩn với các nồng độ khác nhau (5, 10, 15, 20 µg/mL) từ dung dịch gốc

• Chuẩn bị dung dịch mẫu giống như phần định tính

2 Xây dựng đường chuẩn:

• Tiêm các dung dịch chuẩn vào hệ thống HPLC, đo diện tích pic

• Vẽ đồ thị diện tích pic (trục y) theo nồng độ (trục x)

• Xác định phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan (R², yêu cầu ≥ 0,99)

3 Tiêm dung dịch mẫu:

• Tiêm dung dịch mẫu vào hệ thống HPLC, đo diện tích pic

• Dựa trên phương trình đường chuẩn, tính toán nồng độ losartan trong dung dịch

4 Tính toán hàm lượng:

* Kết quả thu được.

Hàm lượng losartan trong viên nén (mg/viên hoặc % so với công bố)

Ví dụ: Kết quả thu được cho viên nén losartan 50 mg:

Hàm lượng trung bình: 49,5 mg/viên (99% so với công bố)

Độ lặp lại: RSD ≤ 2%

Độ chính xác và độ lặp lại:

Độ thu hồi: Trong khoảng 98–102%.

RSD (Relative Standard Deviation): ≤ 2% (phù hợp yêu cầu tiêu chuẩn)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Giáo trình Hóa phân tích 2 (TRƯỜNG ĐẠI HỌC NAM CẦN THƠ).

2 Các nguồn nước ngoài:

● Pharma Innovation Journal: HPLC Analysis of Metformin

● ScienceDirect: Analytical Methods for Metformin Determination

● ScienceDirect - Methods for Determination of Atorvastatin

● USP - Atorvastatin Analysis by HPLC

● USP - Omeprazole Analysis • ScienceDirect - HPLC Methods for Omeprazole Determination

● ScienceDirect - Analytical Methods for Losartan Determination • USP - LosartanAnalysis