khảo sát các điều kiện nuôi cấy và phương pháp tách chiết enzyme

Kết quả thu được cho thấy ở nhiệt độ 40oC, pH=7,0 và thời gian nuôi 30h, lượng enzyme cellulase sinh ra là lớn nhất.. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme cellulase Chúng tôi sử

KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH

CHIẾT ENZYME CELLULASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

INVESTIGATION OF CULTURING AND EXTRACTING CELLULASE OF

BACILLUS SUBTILIS

SVTH: Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy

Lớp 05SH, Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách khoa

GVHD: PGS.T.S Trần Thị Xô, ThS Ngô Thái Bícch Vân, KS Phạm Trần Vĩnh Phú

Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách khoa

TÓM TẮT

Enzyme cellulase được tổng hợp nhiều ở Bacillus subtilis và có nhiều ứng dụng quan trọng Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy Bacillus subtilis và

phương pháp tách chiết để thu nhận enzyme cellulase Kết quả thu được cho thấy ở nhiệt độ

40oC, pH=7,0 và thời gian nuôi 30h, lượng enzyme cellulase sinh ra là lớn nhất Phương pháp tách chiết cellulase bằng dung môi aceton cho hiệu quả cao hơn dung môi ethanol

ABSTRACT

Cellulase, which produced in a great quantity by Bacillus subtilis, has many important

applications In this project, we investigated cultivation conditions and methods to obtain cellulase

from the culture of Bacillus subtilis The results show that at 400C, pH=7,0 and 30 hour of cultivation, cellulase production is highest That extracting celluase by using aceton is more effective than using ethanol

1 Mở đầu

Chủng Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872.[1] Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram dương, kích thước (3- 5) × 0.6µm, có khả năng sinh

bào tử và là loài sinh vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi.[2]

Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease,[6] amylase,[7] glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase [5] Bacillus subtilis

đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase [1] Đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của

Bacillus subtilis trong chế biến thực phẩm, trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc [3]

Cùng với Bacillus subtilis, hệ enzyme cellulase cũng được nghiên cứu từ lâu

[4]Enzyme này là một phức hệ gồm nhiều enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa cellulose[14][15]

Enzyme exoglucanase hay C1

Enzyme endogluconase hay Cx

Enzyme  -1,4-glucosidase

Cellulase đã được sản xuất với qui mô công nghiệp và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chế biến thực phẩm; trong nông nghiệp, cellulase được dùng trong xử lý đất để tăng độ màu mỡ ; trong công nghiệp, cellulase được ứng dụng trong công nghệ sản xuất ethanol [4]

2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng

Chủng Bacillus subtilis (V5) được nuôi cấy và bảo quản tại phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học, khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp hoạt hóa chủng Bacillus subtilis

Chủng Bacillus subtilis được hoạt hóa trên môi trường với thành phần: NaCl 0,5%,

pepton 1 %, Cao nấm 1 %, Cao thịt 0,3 %, Agar 0,7 %, pH = 7.[3]

2.2.2 Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme cellulase

Chúng tôi sử dụng phương pháp cấy điểm trên môi trường hoạt hóa có bổ sung CMC 1 %, ủ ở nhiệt độ 300C trong 24h Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol và đo đường kính vòng thủy phân

2.2.3 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô

Nuôi cấy chủng Bacillus subtilis trong môi trường lỏng với thành phần CMC 1 %,

Glucose 0,1 %, Pepton 5 %, Cao nấm 2,5 % ở các thời điểm, nhiệt độ và pH khác nhau Sau đó ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút, thu dịch nổi enzyme.[3]

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Phương pháp đục lỗ thạch: Môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase là

CMC 1%, Agar 2% Đường kính thủy phân được xác định tương tự như phần 2.2.3

Phương pháp đường khử Bernfeld : Nguyên tắc phương pháp này dựa vào phản

ứng màu của nhóm C=O với 3, 5-dinitrosalicilic acid (DNS), giá trị mật độ quang đo được

ở bước sóng 540 nm phản ánh lượng đường được tạo thành từ quá trình phân cắt phân tử cellulose của enzyme cellulase.[8][10][13]

Phương pháp chiết tách enzyme

Sử dụng hai dung môi hữu cơ : aceton và etanol 900 Tiến hành kết tủa dịch chiết enzyme thô theo tỉ lệ 1 :4 (Vdịch chiết :Vdung môi), ủ hỗn hợp ở -200

C trong 60 phút, ly tâm

13000 vòng/phút, thu cặn So sánh hiệu quả chiết tách của aceton và etanol 900

bằng phương pháp đục lỗ thạch (xem phần 2.2.5)

3 Kết quả

3.1 Kết quả hoạt hóa và định tính khả năng sinh enzyme cellulase của chủng V5

Để kiểm tra khả năng sống sót của chủng sau quá trình bảo quản ở - 200

C, chúng tôi tiến hành hoạt hóa trên môi trường tối thiểu (Hình 1.a), đồng thời xác định khả năng sinh enzyme cellulase (Hình 1.b) Kết quả hoạt hóa cho thấy khuẩn lạc lên rất mạnh, ít ghồ ghề, màu trắng, có hình răng cưa

3.2 Kết quả khảo sát sự tăng trưởng và khả năng sinh enzyme cellulase theo thời gian

3.2.1 Kết quả đường cong tăng trưởng

Chúng tôi tiến hành nuôi mẫu ở các thời điểm 0h, 4h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 32h, 34h và 36h, ở nhiệt độ 300C xác định giá trị mật độ quang ở bước sóng 600nm Kết quả

đường cong tăng trưởng của Bacillus subtilis (V5) ở các thời điểm khác nhau được biểu

diễn ở biểu đồ hình 2

Dựa vào đồ thị chúng tôi nhận thấy chủng V5 bắt đầu tăng trưởng sau 6h nuôi cấy,

từ thời điểm 18h - 30h chủng đi vào pha ổn định và thời điểm 32-36h là giai đoạn suy tàn

3.2.2 Kết quả đường kính thủy phân

Đồng thời với việc đo giá trị đo OD600, chúng tôi tiến hành thu dịch enzyme thô và khảo sát khả năng sinh cellulase theo thời gian của chủng V5 Kết quả phân giải CMC 1 % trên môi trường thạch rắn cho thấy hoạt độ của cellulase tăng tuyến tính theo thời gian và đạt giá trị lớn nhất ở thời điểm 30h

Hình 1 Kết quả hoạt hóa (Hình a) và định tính khả năng sinh

enzyme (Hình b)

Hình 2 Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian

Hình 3 Kết quả đường kính thủy phân theo thời gian

b Nồng độ Glucose sinh ra trong phản ứng thủy phân CMC 1% của cellulase

Trước tiên chúng tôi tiến hành dựng đồ thị tương quan giữa nồng độ Glucose chuẩn

và giá trị OD540 (Hình 4) Nồng độ Glucose giải phóng theo thời gian được ngoại suy từ đường chuẩn Kết quả cho thấy tại thời điểm 32h và 34h nồng độ Glucose là lớn nhất Như vậy, từ kết quả của đường kính thủy phân và nồng độ Glucose giải phóng, chúng tôi nhận thấy hoạt độ của enzyme cellulase mạnh nhất trong pha ổn định của đường cong sinh trưởng

3.3 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase theo nhiệt độ

Chúng tôi tiến hành nuôi mẫu ở nhiệt độ 300

C, 400C, 500C và 600C trong thời gian 30h Sau đó xác định hoạt độ enzyme dựa vào nồng độ Glucose sinh ra trong phản ứng thủy phân CMC 1%

Hình 4 Đồ thị thể hiện tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và giá trị mật độ quang 540nm

Hình 5 Đồ thị biểu diễn nồng độ Glucose giải phóng theo thời gian

Dựa vào đồ thị chúng tôi nhận thấy tại nhiệt độ 500C nồng độ Glucose sinh ra là lớn nhất Kết quả thu được cho phép kết luận chủng Bacillus subtilis có khả năng chịu nhiệt độ cao Sau 30 giờ nuôi cấy, 500C là khoảng nhiệt độ tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase

3.4 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase theo pH

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng Bacillus subtilis trong môi trường có tính axit

(pH=5 và pH=6), môi trường trung tính (pH=7) và môi trường kiềm (pH=8 và pH=9) ở nhiệt độ 300C, trong thời gian 30h Sau đó xác định hoạt độ enzyme dựa vào nồng độ Glucose sinh ra trong phản ứng thủy phân CMC 1 %

Kết quả cho thấy trong môi trường trung tính và môi trường có tính kiềm, Bacillus subtilis sinh tổng hợp enzyme cellulase tốt hơn môi trường có tính axit, thể hiện qua nồng

độ Glucose được giải phóng (Hình 7)

3.5 Kết quả kết tủa enzyme cellulase từ dịch nuôi lắc Bacillus subtilis ở 300C trong 30 giờ

Chúng tôi tiến hành tủa dịch nuôi cấy lắc Bacillus subtilis để thu nhận enzyme cellulase bằng hai loại dung môi là aceton và etanol 900 (xem phần 2.2.6) So sánh hiệu quả chiết tách của 2 dung môi dựa vào đường kính thủy phân CMC 1 % của dịch tủa

Hình 6 Đồ thị biểu diễn nồng độ Glucose giải phóng theo nhiệt

độ

Hình 7 Đồ thị biểu diễn nồng độ Glucose theo pH

Aceton 2,2 2,4

Như vậy, phương pháp tủa sử dụng dung môi hữu cơ aceton và etanol 900

đều làm tăng hoạt độ của enzyme cellulase Trong đó, kết tủa enzyme bằng aceton làm tăng 9,1 %

và kết tủa bằng etanol 900

làm tăng 4,5% hoạt độ enzyme ban đầu

4 Kết luận

Từ những kết quả thu được, chúng tôi kết luận:

Khi nuôi cấy ở 300

C, sự tăng trưởng của chủng Bacillus subtilis ổn định trong

khoảng thời gian 18-30 giờ và sau thời điểm này (từ 32 -34 giờ), lượng enzyme cellulase sinh ra là lớn nhất

Môi trường trung tính (pH=7) là môi trường thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp

cellulase của chủng Bacillus subtilis khi nuôi cấy ở 300

C

Chủng Bacillus subtilis sử dụng trong đề tài này có khả năng chịu nhiệt độ cao, từ

300 đến 500C

Phương pháp tủa enzyme cellulase từ dịch nuôi cấy lắc bằng dung môi aceton tỏ ra

có hiệu quả hơn dung môi etanol 900

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Thị Xuân Hiền, Nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của bào tử và enzym protease của Bacillus subtilis, khóa luận tốt nghiệp, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng [2] Lê Xuân Phương , Vi sinh vật học công nghiệp (2001), NXB Xây dựng Hà Nội

Hình 8 Kết quả đường kính thủy phân của enyme trước và sau khi kết tủa bằng acetone và etanol 90 0

[3] Phạm Thi Hồng Thắm, Nghiên cứu phân lập và bước đầu khảo sát một số vi sinh vật phân huỷ cellulose từ vỏ lụa sắn, khóa luận tốt nghiệp, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng [4] Trần Xuân Ngạch, Công nghệ enzyme, (2005), Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

[5] D.R.Kashyap, S.Chandra, A.Kaul, R.Tewari, “Production, purification and characterization of pectinase from a Bacillus sp DT7”, World Journal of Microbiology & Biotechnology Vol 16, (2000), tr 277-282

[6] Harry P Rappaport, “A Bacillus Subtilis Proteinase”, The Journal of Biological Chemistry, (1965), Vol 240, No 1,

[7] Konsoula Z., Kyriakides M.L, “α-amylase production in aqueous two-phase systems

by Bacillus subtilis”, FEBS Journal 272, (2005), tr 2

[8] Kwong-Yu Chan, K S Au, “Studies on cellulase production by a Bacillus subtilis” Antonie van Leeuwenhoek 53, (1987), tr 125-136

[9] Maria Y Yang và cộng sự, “Cloning of the Neutral Protease Gene of Bacillus subtilis and the use of the Cloned Gene to Create an In Vitro – Derived Deletion Mutation”, Journal of Bacteriology, tr 15-21

[10] Po-Jui Chen, Tao-Chun Wei, Yao-Tsung Chang, Lương-Ping lin, “Carboxymethyl

xenlulaza”, CBhote.n

[11] J Perez J Munoz-Dorado, “Biodegradation and biological treatments of cellulose,

hemicellulose and lignin”, Dd Microbio,( 2002)

[12] Zhi W., Song J., Bi J and Ouyang F., “Partial purification of α-amylase from culture supernatant of Bacillus subtillis in aqueous two-phase systems”, Bioprocess Biosyst Eng.27, (2004), tr 3-7

[13] http://www.springerlink.com/content/x111666875j6lhw8/

[14] http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm

[15] http://www.worthington-biochem.com/CEL/default.html