báo cáo khoa học ''''nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của loài lactobacillus plantarum l24''''

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOXIN CỦA LOÀI Lactobacillus plantarum L24 Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP

BACTERIOXIN CỦA LOÀI Lactobacillus plantarum L24

Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy

Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

I MỞ ĐẦU

Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), không sinh bào

tử, có khả năng lên men đường để tạo axitlactic Vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi trong đời sống như chế biến thức ăn lên men, ủ chua thức ăn cho gia súc, sản xuất

axitlactic và xử lý môi trường để tránh mùi hôi thối Tuy nhiên vi khuẩn lactic còn được quan tâm nhiều do chúng có khả năng sinh bacterioxin, một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacterioxin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào

peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Vì vậy

bacterioxin được dùng nhiều trong bảo quản thực phẩm, sữa tươi, nước giải khát cũng như trong xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi Trong báo cáo này chúng tôi giới thiệu một chủng vi khuẩn lactic sinh bacterioxin mới phân lập tù nước dưa

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

a Vi sinh vật

Chủng vi sinh vật được phân lập từ nước dưa và được giữ

và bảo quản tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội

b Môi trường MRS dùng trong nghiên cứu có thành phần sau (g/l): Casein peptone, tryptic digest 10, cao thịt - 10, cao nấm men - 5, glucose -20 Tween 80, K2HPO4 - 2, Na-acetate - 5, (NH4)2 citrate - 2.00, MgSO4 7 H2O - 0.20, MnSO4 H2O - 0.05, nước 1000 ml, pH to 6.2 - 6.8 Khử trùng 121oC trong 15 phút

c Xác định hàm lượng bacterioxin theo phương pháp

Brarford [1]

d Xác định bacterioxin trên gel polyacrylamit

(SDS-PAGE) theo phương pháp của Laemmli [4 5]

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

a Đặc điểm hình thái nuôi cấy

Chủng vi khuẩn L24 phân lập từ nước dưa có khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào đều có dạng hình que, bắt màu Gram dương, không có khả năng di động, không sinh bào tử, phản ứng catalaza âm tính, có khả năng đồng hoá cacbonhydrat amygdalin, arabinnoza, xenlobioza, fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, manitol, melezitoza, saccaroza, nhưng không sử dụng sorbitoi Căn cứ vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá, dựa theo khoá phân loại

Bergey’s [5], chủng L24 được xác định thuộc chi

Lactobacillus

Hình 1 Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn lactic

L24 chụp dưới kính hiển vi điển tử ở độ phóng đại x 20 000 lần

b Xác định thành phần của axit diaminopimelic (DAP) trong thành tếa bào của chủng vi khuẩn lactic L24

Các tác giả Schliifer và Kandlu [3] cho rằng đồng phân DAP có trong thành phần peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn Gram dương đặc biệt đối với xạ khuẩn và vi khuẩn lactic Để xác định đồng phân DAP của chủng L24 chúng tôi tiến hành lấy 50mg tế bào ướt cho vào ống thuỷ tinh nút xoáy (cỡ 3x100mm), thuỷ phân bằng 1ml 6N HCl trong nồi

ổn nhiệt 100oC trong 16 giờ Làm nguội dịch thuỷ phân tới nhiệt độ phòng Dùng giấy sắc ký bản mỏng TLC để xác

định meso-DAP Chấm chừng 3 l dung dịch lên giấy sắc

ký bản mỏng TLC Dùng 1l của 0,01M DL-

diaminopimelic axit (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) làm dung dịch chuẩn Đặt giấy sắc ký bản mỏng

trong bồn thuỷ tinh chứa 50ml hỗn hợp methanol - nước - 6N HCl - pyridine (80:26:4:10, v/v) trong 3 giờ hoặc lâu hơn Phun dung dịch 0,2% ninhydrin (trong nước bão hoà n

- butanol) lên giấy sắc ký bản mỏng, đặt trong tủ sấy ở

nhiệt độ 100oC trong 5 phút) Vết meso-DAP tách rời, xuất hiện từ TLC như là các vết màu xanh đen

Hình 2 Kết quả xác định meso-DAP của chủng vi khuẩn

lactic trên sắc ký bản mỏng

Chú thích: Chẩm 1 - meso-DAP chuẩn (Sigma)

Chấm 4: Meso - DAP của chủng L24

Kết quả sắc ký cho thấy chủng L24 chứa meso-DAP và do

đó vi khuẩn có thành tế bào thuộc nhóm IV Dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hoá và typ thành tế bào của chủng L24, đối chiếu với khoá phân loại của Ber’sgey có thể xác

định chủng này thuộc chi Lactobacilus [2]

Việc đưa các chủng vi sinh vật sống vào môi trường là một việc làm hệ trọng, phải đảm bảo chắc chắn rằng chủng đó không gây hậu quả xấu đối với sức khoẻ con người và môi trường, do vậy chúng tôi tiến hành xác định trình tự rADN 16S để định danh chính xác đến loài Sau khi tiến hành

phản ứng PCR, trình tự rADN 16S được đọc trên máy đọc trình tự tự động 3100 Avant bằng đoạn mồi đặc hiệu Trình

tự đoạn gen được tổng hợp có chiều dài 645bp Đây là đoạn

ít bền vững so với trình tự đoạn rADN 16S của

Lactobacillus plantarum, ký hiệu AL 935261 trong ngân

hàng dữ liệu gen của Nhật Bản thì độ tương đồng lên đến

98%

Dưới đây là số liệu vế kết quả so sánh trình tự gen của sản phẩm đã được tổng hợp bằng phản ứng PCR với trình tự của đoạn gen trong ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản

Hình 3 Điện di sản phẩm PCR của chủng L24 trên gel

agaroza 5%, được nhuộm bạc Chú thích: M - ADN chuẩn 1kb Ladder (10 000bp) Băng 1 biểu hiện đoạn được tổng hợp của chủng L24

c Xác định bacterioxin của loài Lactobacillus plantarum L24 trên gel polyacrylamit 15%

Bacterioxin do vi khuẩn lactic sinh ra là các phân tử protein

mang điện tích dương, kích thước nhỏ gồm 30 - 60 axit amin, có điểm đẳng điện cao và có khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần với vi khuẩn sinh ra

bacterioxin đó [4]

Bacterioxin có mặt trong tất cả các nhóm của vi khuẩn

lactic như: Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus,

Streptococcus, Leuconostoc và, Pediococcus, Trong đó,

hai nhóm chính là: Lactobacillus, Lactococcus đóng vai trò

quan trọng Theo hệ thống phân loại do Kleen - hammer, các bacterioxin được chia thành 4 nhóm, dựa trên trọng lượng phân tử, độ bền nhiệt, sự có mặt của các axit amino

Do đó, để xác định rõ Lactobacillus plantarum L24 chúng

tôi nghiên cứu thuộc nhóm sinh bacterioxin nào Chủng L24 được nuôi cấy tĩnh sau 24 giờ tiến hành phá vỡ tế bào

và hạ pH xuống 2.5, để qua đêm ở 4oC Sau đó chỉnh pH về 7,0 và đem tủa với aceton 100%, lạnh (giữ ở -22oC) với thể tích bằng thể tích mẫu Ly tâm 10000vòng trong15 phút Làm khô mẫu và hoà tan trở lại bằng dung dịch đệm l mẫu bacterioxin thô được tra vào mỗi giếng trên gelmSorensen

pH = 7,0 Lấy 10 polyacrymit 15% Chạy với cường độ

dòng điện 1,5A/giếng Cuối cùng nhuộm bạc

Kết quả được trình bày ở hình 34

Hình 4 Điện di đồ gel polyacrylamit 15%

Chú thích: Giếng 1 protein chuẩn 200 kDa (Sigma) Giếng 2 băng bacterioxin của Lactobacillus plantarum L24,

trọnglượng phân tử 15kDa

Kết quả cho thấy trọng lượng phân tử của bacterioxin của

Lactobacillus plantanrum L24 thuộc nhóm lớn, nhóm

bacterioxin II, protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử nhỏ từ 10 - 30kDa

d Ảnh hưởng của nguồn nitơ (N) vô cơ đến khả năng

sinh trưởng và sinh tổng hợp bacterioxin của

Lactobacillus plantarum L24

Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là muối amon còn muối nitrat là nguồn thức ăn không thích hợp đối với nhiều loại vi khuẩn Hầu như các loại vi sinh vật đều có khả năng đồng hoá muối amôn Đôi khi có loài không sử dụng được muối này thì nguyên nhân không phải

do bản chất của NH4+ mà do sau khi đồng hoá gốc amôn, môi trường sẽ tích lũy các gốc anion vô cơ như SO4-,

HPO42-, làm giảm pH của môi trường Đối với vi khuẩn lactic thì đây là một đặc điểm rất quan trọng vì quá trình sinh trưởng của chúng phụ thuộc rất nhiều vào pH

Lactobacillus plantarum L24 được tiến hành nuôi tĩnh ổn

nhiệt trên môi trường dịch thể MRS, với tỷ lệ giống 0.5%,

có bổ sung các nguồn nitơ vô cơ 0,1% khác nhau thời gian nuôi 48 giờ Xác định khả năng sinh trưởng và sinh tổng

hợp bacterioxin của Lactococcus plantarum L24 Kết quả

trình bày trên hình 5

Hình 5 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả năng sinh trưởng

và sinh tổng hợp bacterioxin của loài Lactobacillus plantarum L24

Một điều dễ nhận thấy khi bổ sung vào môi trường một lượng nitơ định trước đã có ảnh hưởng đến sinh trưởng và

sinh tổng hợp bacterioxin của Lactobacillus plantarum

L24 Rõ ràng là amoni photphat là nguồn nitơ vô cơ thích

hợp nhất cho sinh tổng hợp bacterioxin của Lactobacillus

plantarum L24 Nguyên nhân gây ra sự khác nhau này có

thể do gốc phọtphat có tính đệm cao và tính axit yếu nên không làm giảm pH của môi trường nhiều như các gốc

khác Trên các môi trường thường sử dụng nguồn nitơ vô

cơ khác, sinh trưởng mật độ OD của tế bào đạt 2 2 và sinh tổng hợp bacterioxin đạt là 52g/ml Điều này rất thuận lợi khi bổ sung các chất khoáng khi nuôi cấy vi sinh vật

IV KẾT LUẬN

Chủng vi khuẩn lactic L24 có khuẩn lạc tròn, nhẵn, màu trắng sữa, tế bào đều có dạng hình que, bất màu Gram

dương, không có khả năng di động, không sinh bào tử,

phản ứng catalaza âm tính Có khả năng đồng hoá

cacbonhydrat đặc biệt là xyloza Chủng L24 vừa có khả năng sinh axitlactic vừa có khả năng sinh bacterioxin II, protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10-30kDa Các phân tích trình tự rADN 16S cho thấy chủng L24 là

Lactobacillus plantarum

SUMMARY

STUDY ON BACTERIOCIN PRODUCTION OF

NEWLY ISOLATEDSTRAIN Lactobacillus plantarum

L24

Nguyen Thi Hoai Ha et al

The strain of lactic acid bacteriocin L24 was isolated from fermented sour vegetables cell are rods, non sporing, non-notile, catalase negative Metabolision was predominantly fermentative, lactic acid being formed from glucose

homofermentatively, xylose was fermented The analysis of 16S rDNA sequence shows that this strain L24 was

identified as Lactobacillus plantarum Bacteriocin II was

produced Antibacterial protein with molecular weigh

15kDa were detected by using gel electrothesis SDS-PAGE method

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bradford, M M 1976 Arapid and Sensitive- Method for

the Quantitation of Laemmli, U K.1970 Nature Vol 227 680-685

2 Buchanan, R.E., and Gillons, N.E Bergey s Manual Determinative Bacteriology 8 Ed William Wilkins Co., Baltimore, 1974

3 Helo, H; Nilssen O; 1991 Lactococcin A, new

bacteriocin from Lactococcus lactis subsp cremoris

isolation and characterization of the protein and it’s gene J Bacteriol 173, 3879 – 3887

4 Kelly, W J 1998 Charaterization of Lactococci isolated from minimally processed fresh fruits and vegetables Int

J Food Microbiol., 45 85-92

5 Yang, R, Johnson, M and Ray, B.1992 Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid

bacteria Appl Environ Microbiol 38 3355-3559