luận văn đa dạng hóa các môi trường sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn acetobacter xylinum part 2

Hình 2.3: Vi khuẩn Acetobacter xylinum [24; 31] 2.2.2.2 Đặc điểm sinh lí – sinh hoá Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cho phản ứng catalase dương tính; có khả năng

Trong môi trường lỏng, sau 24h nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên Sau 36 – 48h, hình thành một lớp trong và ngày càng dày [Lê Thị Khánh Vân, 1985]

Hình 2.3: Vi khuẩn Acetobacter xylinum [24; 31]

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lí – sinh hoá

Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cho phản ứng catalase

dương tính; có khả năng oxy hoá tiếp tục ethanol thành acid acetic CH3COOH, CO2 và

H2O; chuyển hoá được glucose thành acid, glycerol thành dihydroxyaceton; tổng hợp được cellulose nhưng không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer và không tạo sắc tố nâu [Nguyễn Lân Dũng, 1978]

Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A xylinum phát triển là 4,5 và nó không phát

triển ở 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu Theo Bergey, nhiệt độ tối ưu

để A xylinum phát triển là 25 – 300

C Còn theo Marcormide (1996) thì A xylinum có

thể phát triển ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 12 – 350

C và nồng độ ethanol lên đến 10% [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]

Nguồn carbohydrate mà A xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là

glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol, lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose, cellobiose, erythritol, ethanol và acetat [Julian a Ba, 1990 - dẫn liệu của Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy, 2003]

2.2.2.3 Chức năng sinh lí của cellulose đối với Acetobacter xylinum

Theo Costeron (1999), trong môi trường tự nhiên, vi khuẩn có khả năng tổng hợp các polysaccharid ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bảo vệ bao quanh tế bào, và màng BC là một ví dụ như thế Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm cho tế bào thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn

so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose Một vài tác

giả cho rằng cellulose được tổng hợp bởi A xylinum còn đóng vai trò tích trữ và có thể

được sử dụng khi vi sinh vật này thiếu nguồn dinh dưỡng Sự phân hủy cellulose đuợc xúc tác bởi enzyme exo – hay endo – glucanase, sự hiện diện cả hai loại enzyme này

được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng A xylinum

Nhờ vào tính dẻo và tính thấm nước của lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật gây bệnh Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng

23% số tế bào A xylinum được bao bọc bởi BC sống sót sau 1giờ xử lí bằng tia cực

tím Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [theo Ross và ctv, 1993 - dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]

2.3 Bacterial cellulose (BC)

2.3.1 Sơ lƣợc về lịch sử nghiên cứu sự hình thành BC

Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A xylinum được nhà

bác học Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886 Tuy nhiên đến nửa sau thế kỉ XX, các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi về BC

Năm 1943 – 1954, Hestrin và các cộng sự nghiên cứu về khả năng tổng hợp BC

của vi khuẩn Acetobacter xylinum, họ chứng minh rằng A xylinum có thể sử dụng

đường và O2 để tạo nên cellulose

Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được A xylinum tổng

hợp trong môi trường có đường và ATP Càng ngày, cấu trúc của BC càng được hiểu

rõ theo tiến bộ của khoa học kĩ thuật

Năm 1989, nhóm I.M Saxena trường Đại học Texa thu nhận được enzyme

cellulose synthase tinh sạch của A xylinum Enzyme này gồm 2 chuỗi polypeptid có

trọng lượng phân tử là 83 và 93kD Trong đó, tiểu phần 83kD liên quan đến quá trình sinh tổng hợp cellulose tinh khiết Năm 1990, nhóm đã xác định được gen tổng hợp

cellulose ở A xylinum (dòng hoá và giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose)

Ngày nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm về cấu trúc,

cơ chế tổng hợp và ứng dụng của BC [Trương Thị Anh Đào, 2004]

2.3.2 Cấu trúc của BC

BC có cấu trúc hóa học tương tự như cấu trúc của cellulose thực vật (plant cellulose - PC), là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua cầu nối

- 1,4 – glucan Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der Waals Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5 nm Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích thước từ 3 – 4 nm và chiều rộng 70 – 80 nm

Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dải là 3,2 x 133 nm; còn theo Brown và cộng sự (1976) thì là 4,1 x 177 nm So với PC thì BC có độ polymer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn, BC có độ polymer hóa từ 2000 – 6000, có trường hợp lên đến

16000 hay 20000 Trong khi đó, khả năng polymer hóa của PC chỉ từ 13000 – 14000 [dẫn liệu của Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]

Hình 2.4: Cấu trúc BC và PC [26; 27]

Trong tự nhiên, cellulose kết tinh phổ biến ở dạng I và II Cellulose I có thể chuyển thành cellulose II nhưng cellulose II thì không thể chuyển ngược lại thành cellulose I Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy mà cellulose dạng nào chiếm

ưu thế Thông thường, dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn

Cellulose I: dài 0,05 – 0,1 m; được tổng hợp bởi đa số thực vật và vi

khuẩn A xylinum trong môi trường lên men tĩnh Các chuỗi - 1,4 –

glucan xếp song song với nhau theo một trục

Năm 1984, Atalla và V Hart đã xác định được cấu trúc của cellulose I

và cellulose I cấu tạo bởi glucose dạng hay

Cellulose II: được tổng hợp ở một số nấm mốc và vi khuẩn như

Sarcinaventriculi Là dạng sợi cellulose ổn định nhất về nhiệt động lực

học, các chuỗi glucan xếp đối song nhau hay phân bố tự do Cellulose II thường được tổng hợp trong môi trường nuôi cấy lắc Khi đó BC tạo ra ở dạng huyền phù phân tán, các sợi cellulose thường uốn cong, đường kính khoảng 0,1 – 0,2 m [Trương Thị Anh Đào, 2003; Fumihiro Y., 1997]

2.3.3 Đặc điểm của BC

A.J Brown (1986), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn A.xylinum tạo ra

trên môi trường lên men và thấy có bản chất là hemicellulose Hemicellulose là những polysaccharid không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính

Một số tính chất của BC:

Độ tinh sạch: độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn

Độ bền cơ học: có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng (đặc biệt là cellulose I)

Tính hút nước: có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính xốp,

ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học cao)

[Trần Thị Diễm Chi, 2000]; [25]; [32]

2.3.4 Quá trình sinh tổng hợp BC từ vi khuẩn A xylinum

Khi nuôi cấy vi khuẩn A xylinum trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy

đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12… và các chất kích thích sinh trưởng),

chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ

môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một

phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường Ta thấy các sợi tơ nhỏ phát triển

ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [Đinh Thị Kim

Nhung, 1996]

Thiaman (1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: các tế bào

A xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của

mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền

chất nằm ở màng tế bào Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên

màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose [J A

Bazon, 1984 - dẫn liệu của Đinh Thị Kim Nhung, 1996]

Hình 2.5: Con đường dự đoán quá trình sinh tổng hợp cellulose trong tế

bào vi khuẩn Acetobacter xylinum [Trần Thị Ánh Tuyết, 2004]

Tương tự như các thực vật thượng đẳng, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các

oligo và polysaccharid nội bào, lượng oligo và polysaccharid nội bào đạt tới 60% khối

lượng khô tế bào, còn polysaccharid ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi

sinh vật Thành tế bào cũng chứa một lượng lớn polysaccharid Tất cả các oligo và

polysaccharid được tổng hợp bằng cách thêm một đơn vị monosaccharid vào chuỗi saccharid có trước Đơn vị monosaccharid tham gia phản ứng dưới dạng nucleotid, monosaccharid được hoạt hóa thường là dẫn xuất của uridin – diphosphat (UDP – X) nhưng đôi khi là các nucleotid purin và pyrimidin khác Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng chung sau:

…X-X-X-X + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP

n nhánh (n + 1) nhánh

Trong trường hợp polysaccharid gồm 2 loại monosaccharid liên tiếp (X và Y) thì phản ứng chung xảy ra theo 2 bước sau:

Bước 1: XYXYXYXY + UDP-X = XYXYXYXYX + UDP Bước 2: XYXYXYXYX + UDP-Y = XYXYXYXYXY + UDP

Cơ chế của quá trình tổng hợp các loại polysaccharid phân nhánh hiện nay vẫn còn chưa rõ Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharid phụ thuộc vào các loại enzyme transferase [Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến, 1980]

Cellulose

(NAD)

G6PD PGI (NADP) Chu trình

Frc F6P phosphate

Hình 2.6: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose của A.xylinum

PGM

FHK

1PFK

Glc: glucose UDPG: uridin diphosphate glucose

GHK: glucose hexokinase UGP:uridin glucose pyrophosphorylase G6PD: glucose – 6 – phosphate PGM: phosphoglucomutas

G1P: glucose – 1 – phosphate G6P: glucose – 6 – phosphate

PGI: phosphoglucose isomerase FHK: fructose hexokinase

PGA: phosphogluconic acid PTS: phosphotransfer system

F1P: fructose – 1 – phosphate 1PFK: fructose – 1 phosphate kinase

2.3.5 Ứng dụng của BC

Dựa vào những đặc tính ưu việt mà BC có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực:

Thực phẩm: - Thức ăn tráng miệng (thạch dừa, cocktail,

Kombucha, trà Manchurian…)

- Các loại bánh snack, kẹo có năng lượng thấp

- Chất làm đặc để bổ sung trong kem, dầu trộn salad

- Màng bao thực phẩm, màng bảo quản trái cây

- Chất ổn định thực phẩm

Y tế: - Chất thay thế da tạm thời (da nhân tạo)

- Bột cellulose ứng dụng làm tá dược trong bào

chế viên nén

- Băng gạc, băng trị phỏng

- Chất làm se (astringent)

- Chất làm đặc và làm chắc trong thuốc sơn

móng tay Môi trường: - Làm miếng bọt để xử lí sạch các vết dầu tràn

- Hấp thu và loại bỏ những nguyên vật liệu độc

Xăng dầu và than đá: - Phát hiện và thu hồi các mỏ khoáng, dầu

Công nghiệp dệt: - Sợi nhân tạo cao cấp

- Các loại lều, bạt, tã lót có thể vứt đi hay tái sử dụng

Công nghiệp giấy: - Làm giấy cao cấp (có độ dai, độ bền cao, vì vậy

ứng dụng làm giấy lưu trữ tài liệu, làm tiền, giấy vẽ…)

Công nghiệp gỗ: - Ván mỏng nhân tạo (plywood laminate)

- Chất tạo độ dai cho giấy, container

Công nghiệp máy: - Chế tạo thân xe hơi, các thành tố cấu trúc máy

bay, tên lửa…

- Màng siêu âm thanh

- Thiết bị siêu lọc nước

- Màng thẩm thấu 2 chiều [Trần Thị ÁnhTuyết, 2004]; [32]

2.4 Thành phần nguyên liệu sử dụng trong sản xuất BC

2.4.1 Nước dừa già

Hiện nay tại Việt Nam và một số quốc gia, nguồn nguyên liệu chính để sản xuất thạch dừa là nước dừa Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hoá học trong nước dừa có khác nhau Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau đó giảm dần) Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol

Bảng 2.3: Lượng đường khử và protein có trong nước dừa vào các giai đoạn khác

nhau [Angaido và ctv, 1985]

Tuổi

(tháng)

Đường khử tổng

(g/100g)

Protein

(g/100ml)

4

5

6

7

8

9

10

2,20 2,25 2,39 2,56 2,63 2,89 2,79

0,140 0,210 0,262 0,356 0,504 0,512 0,512

Bergonia và ctv (1984) đã phân tích thành phần carbohydrate trong nước dừa bằng HPLC, thấy:

Nồng độ tổng của sucrose, glucose, fructose 3,0 3 gr/100ml

mannose, galactose 2.23gr/100ml mannitol 0.3gr/100ml

 nồng độ đường tổng 5,15 gr/100ml Ngoài ra, trong nước dừa già còn chứa nhiều vitamin, acid amin, chất kích thích

sinh trưởng… rất tốt đối với sự phát triển của A xylinum

Bảng 2.4: Thành phần hoá học của nước dừa già

[Anzaldo và ctv, 1985]

Tỷ trọng

Chất rắn tổng số

Đường tổng số

Tro

Dầu béo

Protein

Clorua

pH

Nước

1,02 4,71 2,56 0,46 0,74 0,55 0,17 5,60 90,81

Bảng 2.5: Hàm lượng vitamin và chất khoáng trong nước dừa

[ Vanderberlt, 1945; Trần Phú Hòa, 1996]

( g/ml)

Acid ascorbic

Acid nicotinic

Acid pantothenic

Acid folic

Biotin

Riboflavin

Thiamine

Pyridoxine

2200 – 3700 0,64 0,52 0,003 0,02 0,01 dạng vết (trace)

dạng vết (trace)

K

Na

Ca

Mg

Fe

Cu

S

P

3,12 1,50 2,09 3,00 0,01 0,04 3,40 3,70