Chẩn Đoán trong phòng thí nghiệm lâm sàng nha khoa Ứng dụng phương pháp vi sinh

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH• Cung cấp bằng chứng hỗ trợ để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ra quyết định của bác sĩ trong các ca lâm sang • Sử dụng các chất kháng khuẩn, được hỗ t

NHÓM 6

DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM 6

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH

• Cung cấp bằng chứng hỗ trợ để tạo điều kiện thuận lợi

cho quá trình ra quyết định của bác sĩ trong các ca lâm

sang

• Sử dụng các chất kháng khuẩn, được hỗ trợ bởi phân tích

vi sinh, có thể mang lại kết quả điều trị dễ dự đoán hơn ở các dạng viêm nha chu chịu lửa hoặc xảy ra sớm

• Ngăn ngừa nhiễm trùng thứ cấp, nhờ xác nhận ống tủy

vô trùng

• Xét nghiệm tính nhạy cảm của các mẫu thu được từ áp-xe

có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn phương

pháp điều trị kháng sinh thích hợp để ngăn ngừa sự lây

lan thêm của nhiễm trùng

KHÁI QUÁT

Khoang miệng bị xâm chiếm bởi một số lượng lớn vi khuẩn, bao gồm hơn 700 loài Hệ vi sinh vật miệng và gen của

chúng rất cần thiết để điều chỉnh hệ thống miễn dịch của

chúng ta như một con dao hai lưỡi Mặc dù chúng có thể tạo

ra phản ứng miễn dịch có lợi hoặc thiết lập một cuộc cạnh

tranh số lượng chống lại mầm bệnh ngoại sinh, nhưng việc bãi bỏ quy định khu vực về mối tương quan giữa hệ vi sinh vật và phản ứng của vật chủ ("rối loạn sinh lý") chắc chắn sẽ dẫn đến các bệnh răng miệng, chẳng hạn như viêm nướu,

viêm nha chu, sâu răng, nhiễm trùng tủy răng hoặc nấm

candida miệng

KHÁI QUÁT

Quan trọng là phải phân biệt giữa phân tích vi khuẩn cho

mục đích nghiên cứu thí nghiệm, được thực hiện để khám

phá chủ đề và xác nhận khái niệm, và phân tích phòng thí

nghiệm lâm sàng, được thực hiện trên cơ sở bệnh nhân để

hỗ trợ chẩn đoán và kết quả điều trị mục đích chính của việc thực hiện phân tích mẫu vi sinh vật miệng lâm sàng trong

chăm sóc nha khoa là tiến hành đánh giá rủi ro sớm cho việc phát triển bệnh miệng, hỗ trợ trong việc chẩn đoán bệnh

miệng, thu thập thông tin phụ trợ để hỗ trợ lập kế hoạch

điều trị, và theo dõi kết quả điều trị

BỆNH NHA CHU - CÂU HỎI

CHẨN ĐOÁN MỞ

Bệnh nha chu hay viêm nha chu, được bắt đầu bởi màng sinh học hình thành trên bề mặt răng gây ra phản ứng miễn dịch viêm bởi mô nha chu xung quanh Do đó, viêm nha chu

nguyên nhân là do vi khuẩn; nghiên cứu dần mở đường cho phân tích vi sinh vật toàn diện tại chỗ, chúng tôi nhằm mục đích tóm tắt và làm mới các phương pháp tiếp cận" cổ điển" hơn có thể thu hẹp khoảng cách hiện tại giữa chẩn đoán lâm sàng và phòng thí nghiệm cho các bệnh nha chu việc xác

định loài, có thể hữu ích khi sử dụng phương pháp sinh học

hoặc phân tử để xác định hoặc thậm chí đo lường sự biểu

hiện của các yếu tố độc hại cụ thể cho từng loài, chẳng hạn như leukotoxin của A.actinomycetemcomitans hoặc

proteinase cysteine( gingipains) của P gingivalis

BỆNH NHA CHU - CÂU HỎI

chúng Dù thế nào đi nữa, mối liên hệ rõ ràng của gram

dương với căn bệnh này biểu thị một lập luận để điều tra sự hiện diện của chúng tại một vị trí nha chu bị ảnh hưởng cho mục đích chẩn đoán

BỆNH NHA CHU - CÂU HỎI

trong các điều kiện môi trường khác nhau

BỆNH NHA CHU - CÂU HỎI

CHẨN ĐOÁN MỞ

Trong những năm gần đây, các phương pháp khuếch đại axit nucleic hoặc lai hóa cũng như các nền tảng giải trình tự thế

hệ mới đã được phát triển, góp phần mở rộng đáng kể số

lượng các ngành, giống và loài vi khuẩn được xác định trong khoang miệng Một trong những cuộc tranh luận lớn nhất về việc sử dụng các phương pháp dựa trên nuôi cấy so với các phương pháp dựa trên axit nucleic là những phương pháp

này không phân biệt được vi khuẩn sống và chết

HÌNH 1: Các khuẩn lạc của Porphyromonas gingivalis được nuôi kỵ khí trên môi trường thạch máu Colombia có màu nâu và

phản ứng với indol âm tính (A) Các khuẩn lạc của Tarinerella forsythia được nuôi kỵ khí trên môi trường thạch máu Colombia có dạng đốm và cho phản ứng dương tính với chất nền N-acetyl muramic acid (B).

HÌNH 2: Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi tối của mẫu sinh phim khuẩn lấy từ túi nướu Mẫu được thu bằng que bông và vận

chuyển đến phòng thí nghiệm trong môi trường vận chuyển kỵ khí Mẫu sau đó được phân tán, và một lượng nhỏ huyền phân

của mẫu được đặt trên kính vật, sau đó được quan sát dưới kính hiển vi tối trường Tỷ lệ cao các xoắn khuẩn (A) và các que cong

di động dài (B) được quan sát thấy Đây là các "hình thái" vi khuẩn rất đặc trưng tìm thấy trong các túi nướu sâu.

HÌNH 3: Quan sát mẫu từ túi nướu dưới kính hiển vi soi tối Ở hình bên trái, các vi khuẩn dạng que kéo dài và dạng thoi được

nhìn thấy Các bạch cầu trung tính cung cấp tuyến phòng thủ trước tiên chống lại biofilm đang phát triển trong túi nướu nhiễm trùng Do đó, chúng thường được phát hiện bằng kính hiển vi trong các mẫu từ túi nướu Trong hình, các vi khuẩn dạng que kéo

dài và dạng thoi có thể được nhận dạng (A) Cả bạch cầu trung tính đã được kích hoạt và chưa được kích hoạt (có nhiều hạt tế bào chất hơn) cũng có thể được nhận dạng (B).

HÌNH 3: Quan sát mẫu từ túi nướu dưới kính hiển vi soi tối Ở hình bên trái, các vi khuẩn dạng que kéo dài và dạng thoi được

nhìn thấy Các bạch cầu trung tính cung cấp tuyến phòng thủ trước tiên chống lại biofilm đang phát triển trong túi nướu nhiễm trùng Do đó, chúng thường được phát hiện bằng kính hiển vi trong các mẫu từ túi nướu Trong hình, các vi khuẩn dạng que kéo

dài và dạng thoi có thể được nhận dạng (A) Cả bạch cầu trung tính đã được kích hoạt và chưa được kích hoạt (có nhiều hạt tế bào chất hơn) cũng có thể được nhận dạng (B).

HÌNH 4: Phân tích nuôi cấy tế bào kỵ khí của mẫu biofilm dưới lợi, thu được từ túi nướu Mẫu

được thu bằng giấy thấm và vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong môi trường vận chuyển kỵ khí Sau đó, mẫu được phân tán bằng "vortexing" và pha loãng lên đến 10.000 lần trước khi

được cấy trên các đĩa thạch máu Colombia chứa máu, heme và vitamin K và trên môi trường

đặc hiệu cho Aggregatibacter actinomycetemcomitaris (TBV) (không chứa huyết thanh, [9])

Các đĩa thạch máu được ủ kỵ khí trong 1 tuần, và các đơn vị tạo khuẩn lạc (đại diện cho vi

khuẩn sống) được đếm (A) Các khuẩn lạc quan sát được đại diện cho Prevotella

intermedia/nigrescens (có sắc tố đen) và Parvimonas micra (màu trắng ở phía dưới) (B) Các

khuẩn lạc quan sát được đại diện cho Porphyromonas gingivalis (khuẩn lạc dạng thô, có sắc tố đen), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (khuẩn lạc trắng với hình thể dạng ngôi sao bao quanh khuẩn lạc P gingivalis) và Tannerella forsythia (khuẩn lạc đơn lẻ màu trắng nhỏ ở phía

phải) (C) Các khuẩn lạc Aggregatibacter actinomycetemcomitans phát triển trên môi trường

TBV, được ủ trong 3-5 ngày trong môi trường hiếu khí có 5% CO2.

Loại vi khuẩn Điều kiện oxy

Hiếu khí bắt buộc Khoảng 20% oxy

Hiếu khí không bắt buộc Oxy và 5-10% carbon

Vi hiếu khí 1-5% oxy

Kị khí không bắt buộc Có hoặc không có oxy

Kị khí bắt buộc Không có oxy (khả năng oxi hoá - khử thấp)

ĐIỀU KIỆN PHÁT TRIỂN CỦA CÁC VI KHUẨN

KHÁC NHAU TRONG KHÔNG KHÍ

Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm

Nuôi cấy

Có thể phát hiện được vi khuẩn

Có thể phân biệt được các loài hiếu khí và kỵ khí

Phát hiện ra vi khuẩn nuôi cấy không mong muốn

Sử dụng tiêu chuẩn trong nước

Vi khuẩn không thể nuôi cấy sẽ không được phát hiện và do đó bị bỏ qua

Xác định các chủng vi khuẩn yêu cầu có kiến thức và kinh nghiệm

Chỉ có thể phát hiện vi khuẩn tốt và xấu khi còn sống

Cần có môi trường vận chuyển để giữ vi khuẩn sống

Mất thời gian

Kị khí không

bắt buộc

Có thể phát hiện được vi khuẩn không thể nuôi cấy

Xử lý mẫu nhanh chóng - sớm có kết quả để phân tích cho bác sĩ

Không thể thu thập các chủng vi khuẩn không thể nuôi cấy

Không thể phân biệt giữa vi khuẩn sống và chết

Hàm lượng DNA khác nhau giữa các loài vi khuẩn tạo ra sự không nhất quán trong việc hình thành tiêu chuẩn nội bộ cho phép định lượng tuyệt đối.

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT

Do các ưu và nhược điểm khác nhau, việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán vi sinh vật tối ưu là gần như không thể Đối với việc xác định lượng tối ưu của mẫu lâm

sàng, cả hai phương pháp đều được khuyến nghị Việc diễn giải kết quả nên được

thực hiện cẩn thận vì, khác với các bệnh trùng đơn, sự hiện diện của một loài không nhất thiết ngụ ý xảy ra bệnh.

Các phương pháp lấy mẫu khác nhau có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng vi

khuẩn trong túi nha chu Ví dụ, tần suất phát hiện A actinomycetemcomitans khác nhau khi lấy mẫu bằng đầu giấy so với cây nạo Tuy nhiên, các loài "phức hợp đỏ" thường được phát hiện nhất quán

Phát triển các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn nha chu giúp xác định các loài vi

khuẩn dưới kính hiển vi Các phương pháp miễn dịch huỳnh quang và FISH (lai

huỳnh quang tại chỗ) (hình 5) là công cụ chẩn đoán nhạy cảm phát hiện các tác

nhân gây bệnh về nha chu.

GENOTYPING VI KHUẨN ĐỂ HỖ TRỢ CHẨN

ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI NGUY CƠ

Mục đích: Phân biệt độc tính vi khuẩn dựa trên sự đa dạng di truyền.

• Gen JP2 là chỉ số đáng tin cậy cho viêm nướu ở người trẻ.

• Các mẫu huyết thanh B chứa cả gen JP2 và non-JP2, cung cấp thêm biến thể gen.

Ý nghĩa: Theo dõi đặc điểm genotypic của A actinomycetemcomitans giúp xác định nguy cơ mắc bệnh nướu ở người trẻ.

Mục đích: Phân biệt độc tính vi khuẩn dựa trên sự đa dạng di truyền.

• Gen JP2 là chỉ số đáng tin cậy cho viêm nướu ở người trẻ.

• Các mẫu huyết thanh B chứa cả gen JP2 và non-JP2, cung cấp thêm biến thể gen.

Ý nghĩa: Theo dõi đặc điểm genotypic của A actinomycetemcomitans giúp xác định nguy cơ mắc bệnh nướu ở người trẻ.

GENOTYPING VI KHUẨN ĐỂ HỖ TRỢ CHẨN

ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI NGUY CƠ

Hình 5: Ảnh hiển vi của mẫu màng sinh học dưới nướu từ các túi nha chu của 2 bệnh nhân viêm nha chu Kính hiển vi huỳnh

quang và kính hiển vi lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) của các mẫu tương tự sử dụng các đầu dò 16S rRNA-oligonucleotide được gắn huỳnh quang đặc hiệu cho Aggregatibacter actinomycetemcomitans và Porphyromonas gingivalis (tỷ lệ = 10 micro mét)

VÍ DỤ VỀ A.ACTINOMYCETEMCOMITANS TRONG

CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN NHA CHU

Tầm quan trọng:

• Phát hiện A actinomycetemcomitans trong túi nướu là một công cụ

chẩn đoán quan trọng cho viêm nướu trẻ em, do vi khuẩn này có thể chiếm hơn 90% các vị trí bị ảnh hưởng.

Trường hợp cụ thể:

• Bệnh nhân: 33 tuổi, được chẩn đoán mắc viêm nha chu.

• Kết quả nuôi cấy: Màng sinh học túi nha chu cho thấy tổng lượng

vi khuẩn là 1,1 triệu vi khuẩn kỵ khí, 78% trong số đó là A

actinomycetemcomitans (nhánh JP2).

• Phát hiện: Không có các vi khuẩn gingivalis, Porphyromonas

intermedia/Porphyromonas nigrescens, T forsythia, Campylobacter rectus, hoặc Parvimonas micra.

• Kết quả: Loại bỏ A actinomycetemcomitans dưới nướu và cải thiện lâm

sàng, với sự vắng mặt của vi khuẩn lên đến 96,6%.

Tỷ lệ mắc bệnh:

• Nghiên cứu trên 1,445 bệnh nhân trẻ và già cho thấy tỷ lệ lưu hành và

mảng bám của A actinomycetemcomitans cao hơn ở bệnh nhân trẻ dưới

35 tuổi.

Khuyến nghị cho bác sĩ lâm sàng:

• Sử dụng chẩn đoán vi sinh vật để lựa chọn chiến lược điều trị hiệu quả.

• Giảm thiểu hoặc loại bỏ tác nhân gây bệnh để giảm nguy cơ tái phát bệnh

và duy trì kết quả điều trị thành công trong thời gian dài.

NHIỄM TRÙNG NỘI NHA

Nguyên nhân:

• Sâu răng không được điều trị lan tới mô tủy, gây nhiễm trùng ống tủy

• Nhiễm trùng nội nha nguyên phát: Vi sinh vật xâm lấn tủy ban

đầu trong giai đoạn sâu răng

• Nhiễm trùng nội nha thứ phát: Vi sinh vật đưa vào ống tủy sau trị liệu

Các loại nhiễm trùng nội nha:

• Viêm quanh chóp nguyên phát

• Viêm quanh chóp thứ phát

• Áp xe vùng chóp

HỆ VI SINH VẬT

Hệ vi sinh vật:

• Vi khuẩn gram dương và gram âm, vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí

• Sự khác biệt về vi sinh vật giữa các dạng nhiễm trùng có triệu chứng và không có triệu chứng chưa rõ ràng

• Nhiễm trùng liên tục/thứ phát do vi sinh vật kháng lại quá trình làm sạch

Đặc điểm vi sinh vật:

• Nhiễm trùng nguyên phát: < 50 loài vi khuẩn kỵ khí gram âm

• Nhiễm trùng liên tục/thứ phát: ~20 loài vi khuẩn kỵ khí gram dương, bao gồm Streptococcus spp., Lactobacillus spp.,

Actinomyces spp., và Enterococcus spp

HỆ VI SINH VẬT

Lấy mẫu và phân tích:

• Lấy mẫu từ ống tủy bị nhiễm trùng hoặc vùng quanh chóp có thể cản trở độ chính xác

• Lấy mẫu và nuôi cấy trước khi hàn trám để đảm bảo ống tủy vô trùng

• Lấy mẫu bằng côn giấy vô trùng, nuôi cấy trên đĩa thạch máu tối

đa 1 tuần ở điều kiện kỵ khí

HỆ VI SINH VẬT

Điều trị:

• Khử trùng ống tủy trước khi trám bít và phục hồi răng

• Xác nhận sự vắng mặt của vi khuẩn sống sót trong ống tủy đảm bảo kết quả điều trị thành công

• Nếu ống tủy nhiễm trùng liên tục, cần khử trùng thêm trước khi trám bít

Thông điệp cho bác sĩ lâm sàng

Xác nhận sự vắng mặt của vi khuẩn sống sót trong ống tủy để đảm bảo kết quả điều trị nội nha thành công và ngăn ngừa nhiễm trùng ống tủy thứ phát

ÁP XE RĂNG

Tiến triển và biến chứng:

• Nhiễm trùng ống tủy có thể lan ra ngoài chân răng, dẫn đến tụ mủ

và nhiễm trùng mô vùng miệng

• Tình trạng có thể trở nặng, đe dọa tính mạng, cần sử dụng kháng sinh

• Nhiễm trùng có thể lan qua xương ổ răng đến niêm mạc nướu

mềm hoặc tiền đình, gây áp xe răng

Chẩn đoán và lấy mẫu:

• Mẫu áp xe có thể được lấy bằng ống tiêm và xử lý trong phòng thí nghiệm vi sinh

• Mẫu được ủ trên đĩa nuôi cấy ít nhất một tuần trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí

ÁP XE RĂNG

Vi sinh vật thường gặp trong áp xe:

• Streptococci

• Actinomyces israelii

• Vi khuẩn kỵ khí như Parvimonas spp

Xử lý mẫu và kiểm tra kháng sinh:

• Các khuẩn lạc vi khuẩn được tách riêng và kiểm tra độ nhạy với

kháng sinh (AST) để xác định phương pháp điều trị hiệu quả

Tóm lại: Nhiễm trùng ống tủy có thể tiến triển thành các biến chứng nghiêm trọng, cần chẩn đoán và điều trị kịp thời để ngăn ngừa nguy

cơ đe dọa tính mạng Chẩn đoán bao gồm lấy mẫu áp xe và phân tích

vi sinh, với kiểm tra độ nhạy kháng sinh để xác định phương pháp

điều trị thích hợp

XÉT NGHIỆM ĐỘ NHẠY KHÁNG SINH

Hạn chế sử dụng kháng sinh:

• Kháng kháng sinh: Sự gia tăng tình trạng kháng kháng sinh

toàn cầu và giảm hiệu quả trong màng sinh học đa vi khuẩn

• Lựa chọn kháng sinh: Khó khăn trong việc chọn kháng sinh phù

hợp do tính đa vi khuẩn và khả năng kháng kháng sinh của chúng

Kháng sinh trong điều trị viêm nha chu:

• Thuốc thường dùng: Amoxicillin kết hợp metronidazole.

• Vi sinh vật mục tiêu: A actinomycetemcomitans trong viêm nha

chu tiến triển

Khó khăn: Thiếu điểm cắt đặc hiệu cho amoxicillin và metronidazole trong kiểm tra độ nhạy (AST), chưa có báo cáo về chủng kháng

amoxicillin của A actinomycetemcomitans

Điều trị nhiễm trùng ống tủy:

• Kháng sinh ít được dùng: Thường không sử dụng kháng sinh

trong điều trị nhiễm trùng ống tủy

• Cần thiết khi lan rộng: Khi nhiễm trùng phát triển thành áp xe

hoặc lan ra mô mềm, cần dùng kháng sinh phù hợp

Kiểm tra độ nhạy kháng sinh (AST) đối với áp xe:

• Phương pháp AST: Pha loãng thạch, pha loãng nước cất, và thử

nghiệm khuếch tán đĩa

• Kháng sinh thường dùng: Benzyl-penicillin, amoxicillin,

erythromycin, hoặc metronidazole

• Thách thức: Áp xe răng thường là nhiễm trùng đa vi khuẩn, việc

chọn một kháng sinh duy nhất phù hợp có thể khó khăn

XÉT NGHIỆM ĐỘ NHẠY KHÁNG SINH

Ý nghĩa của AST trong điều trị áp xe răng:

• AST cần thiết: Áp xe răng có thể nguy hiểm đến tính mạng nếu

không điều trị đúng cách

• Chọn kháng sinh dựa trên AST: Đảm bảo điều trị thành công

và ngăn ngừa hậu quả nghiêm trọng

Tóm lại: Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh về răng

miệng cần thận trọng do kháng kháng sinh và tính đa vi khuẩn của

nhiễm trùng AST là công cụ quan trọng giúp lựa chọn kháng sinh phù hợp, đặc biệt trong điều trị áp xe răng để đảm bảo hiệu quả và an

toàn

XÉT NGHIỆM ĐỘ NHẠY KHÁNG SINH