Tiểu Luận Hóa Sinh Thực Phẩm Đề Tài Các Kỹ Thuật Hóa Sinh.pdf

Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyên với

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

a c2

TIỂU LUẬN MÔN: HÓA SINH THUC PHAM

Đề tài:

CÁC KỸ THUẬT HÓA SINH

HỌC VIÊN: Cao Hồ Kim Ngân

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HCM

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

a c2

TIỂU LUẬN MÔN: HÓA SINH THUC PHAM

Đề tài:

CÁC KỸ THUẬT HÓA SINH

Tháng 12 /2020

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH 55-2222 22212222112211112111221112111211 111221122111 ee i CHUONG I: PHUONG PHAP SAC KY LONG HIEU NANG CAO (HIGH

1.2 Cấu tao cia hé thong sac ky long hiéu nang CaO cccecessesesessesesseseveesevseseeees l

1.2.7 Bộ xử lý đữ liệu - S1 22221221121 122111 12112 111212011112 01211111 2111111111 ke 4 1.2.8 Dung môi thải - L2 0020102011201 1211112111111 1 1111151111011 1 11111111 1111 ke 4

1.2.9 Day ẽ Ư AaaaaI 4

1.2.10 Thiét ké gradients 0 0.cccccccccsceccssesscsessesessesevsesecsevecsesersecsesessesscsessesseevessesees 4

1.3 Phân tích bằng HPLC - - + 111 111151111E11E1111111 1111211211111 011111121 6

1.3.1 Phân tích định tính - 2 s s11 1111111211 11115 1115511251111 1 1251555511111 k ky 115111511 kxy 6 1.3.2 Phân tích định lượng G0 22 0220122211131 11131 1111111131111 1111111111111 k2 7

0n 0 nh 7 1.4.1 Chiết lỏng - lỏng - - c sn 111 1111E11112112171121111211111111 11 n1 011gr nở § 1.4.2 Chiết pha rắn 1 1111111111 1211E1111 11117111121121111211111121 11 111gr ng §

VSL UU GIG n-:: 9

1.5.2 Nhược Gi6t oes ccccccccccccccccececevsesesssssevevevsvsvsssssesssevevevscevevsesssessvevsvevsvevscstsveceess 9

II acid jýgaidddtdầaŸặ 9

1.6.3 Hình dạng đỉnh kém - L2 2221221121231 15211 1211112111581 1 118811111122 xk 10

2.1.1 Giai đoạn biến tính -::222+:22211222111211121111211112211.11 11.111 ll

2.1.3 Giai đoạn kéo đài - cQ 01 0000121112556 2551111111111 1 1k n cv vu 15 1111k y c1 51554 12

2.2 Thành phần chủ yếu của phương pháp PCR 55 S121 EE1211115111E111 11x 1xe 14

2.2.2 DNA polymerase (Taq polyimmeras€) c0 0 0 201111222111 111221 111112 re 14

2.2.4DNA đích từ mẫu -25:2222222212211211221122112212211211121111111211211 21c tre 15

2.2.5 Dung dịch đệm - 2L 2 0201112011 1211 1211151111211 1111 11111110111 ng x khe na 15 2.2.6 Magle clorua (MpỹC]¿) - c2 1201110111111 111 1111111111111 11 1111111111111 11 re 15

2.3 Phat hién va phan tich san pham PCR cccccccccccscesecsesessesessesscsesesevevsesesesesesees 15

2.4 Ưu và nhuoc diém cia phurong phap cccccccccccccccsccscsessesesseescsessesesseseseseseseeees 15

2.4.1 Ưu điểm s22 221 22212221121122112111121112111211121112111211211211211 re l5

PS In n .14 ÔỐ 16 2.5 Sự cố và xử lý Sự CO cece ccccsescssessesessesssesevseserseseesecsvsessvessvecevecsvivevstsesevsvscseees 16 2.5.1 Không khuếch đại DNA - 5 c1 212 SE12211121111211211111111 111 1g na l6 2.5.2 Sản phâm không đặc hiệu 52 S111 111115111111 111121171111 121121 re 17

CHƯƠNG 3: ENZYMEE-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 17 3.1 Nguyên tắc chung của ELIS A - 5c s11 E1 1111211111121 21111212111 111gr 17

3.4.3 Các bước phân tích - c1 2.11112111121111 1111111112 1110111101112 111kg 24 3.4.4 Giai đoạn đọc kết QUẢ Q2 2.00220122011110 11131 11311111111 111 1110111101112 111g 25

3.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp ELIS.A 2-52 S2 1111211111111 te 26

3.5.1 ƯU điểm - 2: 222222223122212221122112271117112211171111111111111120121121 12 xe 26

CHƯƠNG 4: PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) ca 26

4.1 Nguyên tẮC ác n1 n1 n1 ng n1 1211111111111 rau 26 4.2 Thiết bị và quy trình thực hiện - - 5 1 SE 121 521211112111111111111 1 1x etxe 27

4.3.1 Thời gian xung (thời gian chuyên đối, khoảng thời gian chuyên đổi) 28

4.3.2 Cường độ trường 22s t1221111111122111111120111110002111111101211122211 2x6 30

4.3.3 Dinh hurdng lat 260.0 30 4.3.4 Nong d6 agarose trong Gel cccccccccsscsessessssessesecsessvsessesssesevseseeseversevsesesees 31

4.3.5 Thanh phan va nhiét độ của đệm điện di 52 2s SE SE1E1112252222225e2 31

4.4.1 Ưu điỂm - 22c: 221 222112221121211111111211121 12111 1110112121 1c 31

`” nan 31 CHƯƠNG 5: SẮC KÝ KHÍ (GC) 5c 22122211111 1211212 1 21g 32

5.2 Chọn điều kiện chạy sắc 5 34 9 34 5.2.2 Lựa chọn khí mang 2L 22 2201112111223 1 1511 1121111811 1211110111 1811 081118 k4 34

5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lò cột - ¿+ tt 1E 1121 111111111 1x 35

5.2.4 Tối ưu hóa loại đầu phun, nhiệt độ và thể tích tiêm 2222222252 5252 c2 35

5.2.6 Tối ưu hóa đầu dò và nhiệt độ đầu dò :22- 22222 22222222E22zzzxrsrve 36

SAV UU GIG n ẽ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Sn212155211 1151251 121121112151 12218 E 2tr re 39

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC - G101 1111111111 n 1 111111155 12511 115155555551 xxx 5

Hinh 1.4 So sánh hai giản đồ của sự phân tách bằng chế độ đăng dòng (trái) và bắr-1I19)11845):7:raãaaaaaaảaaẦẼÕẼỶÝỶÊÝỶÝỶÝ 6

Hình 2.1 Giai đoạn biến tính DNA mẫu - 22:22 22222222222E223222312221222322222 222 12

linh ¡ 0ì ¡8 /Ni :oo-äyỶáảã 12 Hinh 2.3 Giai đoạn kéo đài 0102211221111 11111111 n ng ST n TT ng g 1111111111111 x5 xe cty 13

Hình 3.2 ELISA trực tiếp để phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b) 18

Hình 3.3 ELISA cạnh tranh đề phát hiện kháng nguyên (a) và kháng thể (b) 19

Hình 3.4 ELISA gián tiếp đề phân tích kháng thể 5-5 T EEEEE12E221222222222ee2 21 Hình 3.5 ELISA cạnh tranh gián tiếp đề phát hiện kháng nguyên 55-52 5¿ 22

Hình 3.7 Máy rửa (a), đầu đọc kết quả (b) và máy in (e) được sử dụng trong quy trình ELIS A 2002012022111 121101111121 1111111 221111111 Tg T1 TH HH HH H111 1111 HH HH kg 25

Hình 4.1 Sơ đồ thế hiện cơ chế phân đoạn DNA trong quá trình điện di trên gel trường

Hình 4.2 Giản đồ thể hiện hình dạng điện cực trong các dụng cụ thường dùng cho điện

đi geÏ trường XUNE - 2 20 0221110111101 1111111111 11111112 1111111 1112 1110111011018 k 28 Hình 4.3 Ví dụ về phân đoạn và xác định kích thước của DNA nhiễm sắc thê bằng điện

Hình 5.I Sơ đồ của hệ thống sắc ký khí - - + tt 1E EE121121211211 111111116 ren 33

CHƯƠNG I: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY - HPLC)

1.1 Nguyén tac chung cua sac ky long (Meyer, 2005)

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng) Mẫu phân tích được chuyền lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyên với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

1.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (1⁄eyer, 2005)

Nên mua dung môi có chuyên dụng cho máy HPLC Ngay cả nước, một thành phần phỏ biến của chất rửa giải, phải đạt cấp HPLC nếu phòng thí nghiệm không được trang bị hệ thống lọc nước tạo ra nước siêu tính khiết Các chất phụ gia cũng phải tương thích với máy đò

Pha động có thé chia lam 2 loai:

- Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên dé phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha ngược

- Pha động có độ phân cực thấp: là các dung môi ít phân cực như cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS›), CCH4, toluene

Đề tách một nhóm chất thông thường pha động một thành phần đôi khi không

đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi đề có

l

được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp nảy người ta gọi là gradient pha dong

1.2.2 Bộ phận khử khi (degasser)

Bộ khử khí là một phần của thiết bị HPLC Khử khí cho phép máy bơm va may

đò hoạt động binh thường

Ngoài ra, nó làm giảm nhiễu của đường cơ sở của sắc ký đồ, do đó khử khí là bắt buộc trong phân tích vết Nó có thê được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống chân không đòng chảy có màng thấm khí hoặc bằng cách làm sạch bình chứa dung môi

bằng heli

1.2.3 Bơm (pump)

Quá trình phân tách HPLC được thực hiện ở áp suất 50-300 bar (0,5-3 x 107 Pa) Tốc độ dòng chảy thường nằm trong khoảng từ 0,5 đến 2 ml/phút (hoặc trong khoảng 0,1 ml /phút nêu sử dụng cột có lỗ hẹp)

Máy bơm phải cung cấp dong pha động chính xác ở bất kỳ tốc độ dòng nào mà không có xung nhịp, bất kế độ nhớt của dung môi và áp suất ngược của cột

Tiêm mẫu thủ công cũng là một lựa chọn nếu không có đủ mẫu Thay vì các lọ, cũng có thé tiêm trực tiếp từ các đĩa giếng nếu sử dụng giá đỡ thích hợp

1.2.5 Cột sắc ký

Cột là phần quan trọng nhất của máy sắc ký vì sự phân tách diễn ra ở đây Nó là

một ống thép không øỉ có đường kính trong 2 — 4,6 mm và chiều đài 5-30 em.

Cột được nhồi các hạt có cở đường kính 3, 4, 5, 10 um Chat nhdi trong cét

thường là silicagen hoặc silicagen có bọc hoặc gắn hóa học một màng mỏng chất hữu

cơ Bên cạnh silicagen người ta còn dùng Al;O›, hạt polime xốp, hạt chất trao đôi ion Các cột vi mô có đường kính trong nhỏ hơn | mm cũng có sẵn và chỉ nên được

sử dụng với các thiết bị HPLC vi mô được thiết kế đặc biệt Cột được lắp đặt giữa van

kim phun và đầu báo

Hình 1.1 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao Hầu hết các cột đều không có hướng dòng chảy định trước nhưng một khi cột đã được sử dụng, dòng chảy không được đảo ngược

Tiền cột là bộ phận được gan gitra kim phun và cột để bảo vệ cột khói bụi bân hoặc các chất gây tắc nghẽn Tiền cột khá rẻ và được thay thế khi cần thiết

Đối với nhiều sự phân tách, cần phải kiêm soát nhiệt độ cột hoặc làm việc ở nhiệt

độ cao Do đó, lò cột là một phần tiêu chuẩn của nhiều thiết bị HPLC, nhưng chúng cũng có thể được lắp đặt sau

1.2.6 Dau do (detector)

Trong HPLC, mẫu được bơm vào một đầu của cột và các peak đã tách được rửa giải ở đầu kia Do nồng độ thấp và dải rửa giải hẹp nên cần một thiết bị có độ tỉnh vi cao đề phát hiện chúng

Một số máy dò đo đặc tính phần lớn của chất rửa giải như chiết suất hoặc độ dẫn điện Tuy nhiên, hầu hết các máy dò được xây dựng để phát hiện các hợp chất có các đặc tính nhất định Một số đầu dò thông dụng là UV/VIS, huỳnh quang, chỉ số khúc

xạ, độ dẫn điện, điện hóa, tán xạ ánh sáng bay hơi (đối với các hợp chất không bay hơi) hoặc máy dò phân cực

Ngoài ra, có thê ghép nối trực tuyến HPLC với phô khối phổ MS hoặc phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Máy dò biến đôi hiện tượng quan sát được thành tín hiệu điện, thường là điện áp

1.2.7 Bộ xử Ïÿ dữ liệu

Các tín hiệu của máy dò được trình bày trên màn hình hoặc giấy đưới dạng đồ thị của cường độ so với thời gian Những sắc ký đồ này cung cấp thông tin định tính (có các peak rửa giải không, chúng xuất hiện tại thời điểm nảo?) Và cả thông tin định lượng (kích thước của các pie là bao nhiêu?)

Việc xác định và tính toán kích thước pIc cần thiết thường được thực hiện bằng máy tính, nó cũng được sử dụng đề điều khiến toàn bộ thiết bị HPLC

1.2.8 Dung môi thải

Một nhược điểm của HPLC là đắt tiền và trong một số trường hợp phải sử dụng các dung môi độc hại hoặc có hại cho môi trường Cách tốt nhất đề giữ cho khối lượng dung dịch rửa giải mới và cả lượng dung môi thải ở mức thấp là sử đụng các cột có đường kính bên trong nhỏ, ví dụ: 3, 2 hoặc I mm thay vì các cột 4,6 mm thường được

sử dụng

1.2.9 Dây nối

Các bộ phận khác nhau của máy sắc ký được nối với các ng mao dẫn có đường kính trong 0,25 hoặc 0,18 mm và các phụ kiện thích hợp Chúng được làm từ thép không gỉ hoặc nhựa chịu hóa chất Không phải tất cả các vật liệu đều tương thích với tất cả các pha động có thể có, và nhựa có giới hạn áp suất trên nhất định tùy thuộc vào thành phần hóa học, độ dày thành và pha động được sử dụng

1.2.10 Thiết ké gradients

detector data processing unit mobile h

phase ị waste

Hình 1.2 Sơ đồ cầu tạo hệ thống HPLC

Hình 1.2 cho thấy chỉ có một bình chứa dung môi, do đó chế độ chạy nảy gọi là

sự phân tách đăng đòng Trong chế độ này, thành phần của pha động không đổi trong toàn bộ thời gian của sắc ký đồ Đỉnh càng muộn thì hình dạng của nó cảng rộng và ít cao hơn

Đối với các hỗn hợp phức tạp, cần phải làm việc ở chế độ được gọi là chế độ gradient noi thanh phan của dung dịch rửa giải bị thay đổi trong quá trình phân tách Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng hai (hoặc nhiều) máy bơm, một máy bơm cho mọi dung môi được sử dụng và một bộ phận trộn, đây là thiết kế gradient ap suất cao Một giải pháp thay thế rẻ hơn là sử dụng một máy bơm duy nhất

và thay đôi các tý lệ cần thiết của các dung môi khác nhau bằng van chuyên mạch điều khiển bang may tinh, day la thiét ké gradient ap suất thấp

Với gradient, thoi gian tách có thể kéo đài đến một giờ và có thể phân tích các hỗn hợp rất phức tạp Các hợp chất có thế có các đặc tính tương tự hoặc khác nhau mạnh Không có sự mở rộng đỉnh cao đáng chú ý theo thời g1an

1.3 Phan tich bang HPLC (Meyer, 2005)

UV, MS và NMR cho phép làm sáng tỏ cấu trúc ngay lập tức

Trong nhiều trường hợp, bản chất của các chất phân tích được biết đến và chúng

có thể được xác định băng cách tiêm chất chuẩn Sự đồng nhất chỉ được chứng minh

6

nếu chất chuẩn và hợp chất chưa biết có thời gian lưu giống hệt nhau trong nhiều hệ thống phân tách, tốt nhất là có các ký tự khác nhau như pha bình thường và pha đảo ngược hoặc pha đảo ngược và trao đối ion

1.3.2 Phân tích định lượng

Có thê sử dụng điện tích peak hoặc chiều cao peak để định lượng

Mỗi quan hệ giữa lượng chất phân tích được bơm vào và kích thước peak chỉ có thể được mô tả bằng hệ số đáp ứng thực nghiệm, do đó cần phải thực hiện phân tách hiệu chuân với lượng hoặc nồng độ đã biết của chất phân tích nếu cần định lượng Nếu peak của chất phân tích được phân giải tốt khỏi các peak lân cận thì có thế

sử dụng hợp chất chuẩn tỉnh khiết Nếu không, tốt hơn là sử dụng chất đối chiếu hỗn hợp với một lượng chất phân tích đã biết hoặc đề hòa tan hợp chất đối chiếu trong hỗn hợp nhân tạo Cách tiếp cận này cho phép hiệu chuẩn trong các điều kiện thực tế Đường chuân theo thể tích có 5-8 điểm tham chiếu với nồng độ khác nhau, nồng

độ chất phân tích dự kiến của mẫu phải nằm ở giữa dải hiệu chuẩn

1.3.3 Phương pháp nội chuẩn

Đối với nhiều phép phân tích định lượng, nên làm việc với chất nội chuẩn Đây là

một hợp chất có độ tương đồng hóa học cao với các chất phân tích được quan tâm, ví

dụ như đồng phân Do đó, nó sẽ hoạt động tương tự trong quá trình chuẩn bị mẫu và sắc ký

Ban đầu, chất nội chuẩn được thêm vào cả mẫu thử và mẫu tham chiều với lượng giống hệt nhau Từ ty lệ khối lượng hoặc nồng độ đã biết của chất nội chuẩn và chất phân tích trong mẫu chuẩn, có thể tính được lượng "thực" của chất phân tích trong mẫu băng cách so sánh với tỷ lệ kích thước peak

Sự mất mát của chất phân tích trong quá trình chuân bị mẫu hoặc các vấn đề về tiêm mẫu có thê được bù đắp ở mức độ cao với phương pháp này

1.4 Chuan bi mau (Meyer, 2005)

Nhiều chế phẩm thuốc chứa các chất phân tích ở nồng độ khá cao và ở dạng hỗn hợp tương đối đơn giản

Với các mẫu có nguồn gốc sinh học, tình hình hoàn toàn khác Máu, nước tiêu hoặc các mô đại diện cho một lượng lớn các hợp chất, nhiều trong số chúng ở nồng độ rất thấp Đề tìm và thậm chí định lượng một chất phân tích nào đó không đơn giản chút nào, và các bước chuẩn bị mẫu phức tạp là cần thiết đề phân lập và cô đặc

7

Hơn nữa, hầu hết các quy trình HPLC không cho phép tiêm trực tiếp dịch cơ thé chưa được xử lý do có thê nhiễm bân hoặc tắc nghẽn cột nhanh chóng Theo nguyên tắc chung, khi kết thúc quá trình chuẩn bị mẫu, các chất phân tích quan tâm phải được hòa tan trong pha động được sử dụng đề tách HPLC, có thể có ngoại lệ nhưng theo yêu cau tối thiếu là dung dịch mẫu phải hòa tan dễ dàng trong pha động

- Lắc đều và đề yên để hỗn hợp tách pha

+ Làm bay hơi dụng môi hữu cơ

+ Sử dụng nước để chiết lại thành pha nước (chất phân tích hòa tan chất vào dung môi hữu cơ), lắc dung địch với đệm bazo sau đó sử dụng sắc ký pha đảo hoặc trao đối ion đề tách

- Hòa tan chất cần phân tích vào dung môi pha động

Bước 2: Cho mẫu vào cột chiết

Bước 3: Các chất trong mẫu được hấp phụ vào cột

Bước 4: Rửa giải các tạp chất hoặc chất ảnh hưởng bằng đung môi B

Bước 5: Rửa giải chất phân tích bằng dung môi C

1.5 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Meyer, 2005)

1.5.1 Uu điểm

- Độ nhạy cao

- Khả năng định lượng tốt, độ chính xác cao

- Có khả năng định lượng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau

- Lượng mẫu phân tích nhỏ

1.5.2 Nhược điểm

- Thời gian làm sạch và ôn định cột sau các lần chạy lâu

- Thiết bị đắt tiền

- Hao tốn dung môi

- Cột dễ bị nghẹt nếu không xử lý mẫu kỹ

1.6 Su cé va xir ly (Meyer, 2005)

1.6.1 Đường nền bị nhiễu

Bộ phận của máắy HPLC' hoạt động kém

- Thay thế khóa của bơm Làm sạch van một chiều của bơm hoặc thay thế chúng

- Kiểm tra tất cả các bộ phận xem có rò rỉ không

- Thay đèn ỦV hoặc đèn huỳnh quang sau khoảng thời gian được ghi trong sách hướng dẫn

- Di chuyền thiết bị đến nơi không làm ảnh hướng đến điện trường, gió lùa, đao động nhiệt độ hoặc ánh nắng trực tiếp

Pha động không được hòa trộn đều

- Đối với phân tách đắng đòng, nên chuẩn bị dung dịch rửa giải trong một chai duy nhất thay vì trộn các thành phần trong thiết bị

- Ngay cả với phân tách gradient, đường nền bị nhiễu thấp hơn có thế được quan sát nếu pha động ban đầu (chẳng hạn như 80% nước với phụ gia /20% dung môi hữu cơ) được trộn sẵn trong binh chứa A

- Bộ khử khí kém cũng ảnh hưởng Trong một số trường hợp, ví dụ: với phát

hiện điện hóa, quy trình khử khí hai bước (helium cộng với chất khử khí màng) là cần

thiết

Dung môi và thuốc thử phải tương thích với đầu đò

- Để sử dụng với chất lượng tốt, không nên sử dụng thuốc thử có khả năng tương thích hoàn hảo với tia UV dé phát hiện điện hóa và ngược lại

- Trong nhiều trường hợp, không sử đụng hệ pha mà detector có thể làm phát sinh các hiện tượng không mong muốn như các cực đại phụ hoặc cực đại âm (ví dụ, nếu cần phát hiện tia cực tím ở 210 nm hoặc thấp hơn)

Hằng số thời gian của máy dò quá thấp

- Chọn hằng số thời gian cao hơn trong lần tiếp theo (nhưng hãy cần thận với hằng số thời gian quá cao có thê dẫn đến các đỉnh bị cắt)

1.6.2 Trôi đường nền cơ sở

Trôi đường cơ sở rất phổ biến với sự phân tách gradient Độ đốc của nó phụ thuộc vào thành phần pha động và máy dò được sử dụng Thuốc thử và đung môi chất lượng cao là yêu cầu bắt buộc, như đã đề cập ở trên Một số nguyên tắc phát hiện như

phát hiện chỉ số khúc xạ không tương thích với gradient

Có thể quan sát thấy hiện tượng trôi khi dao động nhiệt độ, với sự thay đổi thành phần của các pha động đã trộn săn (bay hơi, khử khí heli quá mạnh), với việc bom không hoàn toàn hoặc thời gian cân bằng cột quá ngắn khi dung dịch rửa giải bị thay

do làm việc với hệ thống không có bộ đệm mặc dù bộ đệm là cần thiết và do việc sử

dụng hệ thống pha không thuận lợi

10

CHƯƠNG 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

2.1 Nguyên tắc của phương phap PCR (K Kadri, 2019)

PCR là kỹ thuật tạo ra một lượng lớn chuỗi DNA từ một mẫu DNA ban đầu Khuôn mẫu DNA có thể là bộ gen hoặc DNA thu được bằng cách phiên mã

ngược từ RNA hoặc có thé la DNA ty thé

Kỹ thuật này được chia thành ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn lai phép với mỗi và giai đoạn kéo dài Sản phâm của mỗi bước tông hợp đóng vai trò là khuôn mẫu cho các bước sau, do đó đạt được sự khuếch đại theo hàm mũ

Phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện trong một hỗn hợp phản ứng bao gồm chiết xuất DNA (DNA khuôn mẫu), Taq polymerase, các đoạn mỗi và bốn deoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) dư thừa trong dung dịch đệm

Các ông chứa hỗn hợp mẫu phải chịu các chu kỳ nhiệt độ lặp đi lặp lại vài chục lần trong khối gia nhiệt của bộ tuần hoàn nhiệt (thiết bị có vỏ bọc nơi các ống mẫu được lắng đọng và trong đó nhiệt độ có thê thay đổi, rất nhanh và chính xác, từ 0 đến 100°C bởi hiệu ứng Peltier)

Thiết bị này cho phép lập trình khoảng thời gian và sự liên tiếp của các chu kỳ của các bước nhiệt độ Mỗi chu kỳ bao gồm ba khoảng thời gian vài chục giây Quy trình của PCR được chia thành ba giai đoạn như sau:

2.1.1 Giai đoạn biến tính

Đây là giai đoạn phân tách của hai sợi DNA, thu được bằng cách tăng nhiệt độ

Thời kỳ đầu tiên thực hiện ở nhiệt độ 94°C, gọi là nhiệt độ biến tính Ở nhiệt độ nảy,

DNA mau, đóng vai trò là chất nền trong quá trình sao chép bị biến tính

H

me °

95°C

° IIHIHIIIHIIHIIHIHHHIU È

x _ HIHHIIIHHIIIIHIIIIHHIHHIID ;

Hình 2.1 Giai đoạn biến tính DNA mẫu

Các liên kết hydro không thê duy trì ở nhiệt độ cao hơn 80°C do đó DNA sợi kép

bị tách thành 2 DNA sợi don (single-stranded DNA)

2.1.2 Giai đoạn lai ghép

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ từ 40 đến 70°C, đây được gọi là nhiệt độ lai mỗi

Giảm nhiệt độ cho phép các liên kết hydro mới được hình thành và do đó các sợi đơn được bỗ sung dé lai hóa

2.1.3 Giai đoạn kéo dài

Giai đoạn thứ ba được thực hiện ở nhiệt độ 72°C, gọi là nhiệt độ kéo dài Đây là giai đoạn tổng hợp các sợi bổ sung

12

Ở 72°C, Taq polymerase liên kết với DNA sợi đơn đã được mỗi vả xúc tác sao chép bằng cách sử dụng deoxyribonucleoside triphosphat có trong hỗn hợp phản ứng

Do đó, các vùng của DNA khuôn mẫu ở cuối của mỗi được tổng hợp một cách chọn

° IIHIIHIIIHIIIHIH + _ IIHHIHHHI(HHILIHHIHH“E ss (Oye 4 Hình 2.3 Cai đoạn kéo dai Trong chu kỳ tiếp theo, các đoạn được tông hợp ở chu kỳ trước lần lượt là khuôn mẫu va sau một vài chu kỳ, đoạn gen ưu thế tương ứng với trình tự DNA giữa các vùng mà mỗi lai với nhau

Cần 20-40 chu ky dé tổng hợp một lượng DNA có thể phân tích được (khoảng 0,1 uø) Theo lý thuyết, mỗi chu kỳ sẽ tăng gấp đôi số lượng DNA có trong chu kỳ trước

PCR có thê khuếch đại các trình tự DNA có kích thước nhỏ hơn 6 kilobase Phản ứng PCR cực kỳ nhanh chóng, chỉ kéo dài vài giờ (2-3 giờ đối với phản ứng PCR 30 chu kỳ)

13

<— -Primer -dNTP -DNA polymerase

<<<

(Ba

Double stranded DNA Denaturation 94C Annealing 54C Prime cau ty ponent

72C ‘=e

, nnealing 3'

a Ƒ——

Double stranded Double stranded

DNA DNA

Denaturation Denaturation

Next Cycle Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp các bước của phương pháp PCR

2.2 Thành phần chủ yếu của phương phap PCR (Dey P, 2018)

2.2.1 Doan moi (primers)

Các đoạn mỗi là những đoạn nhỏ của chuỗi DNA nhân tạo, đây là những đoạn bỗ Sung ở đầu 3' của mỗi sợi DNA đích

Các đoạn mỗi thường bao gồm 20-30 nucleotide

Mỗi là các DNA soi đơn mà sự lai ghép trên các trình tự nam bên cạnh trình tự yêu cầu sẽ cho phép sao chép của nó một cách có chọn lọc

2.2.2 DNA polymerase (Taq polymerase)

Taq polymerase la mét loai enzyme DNA polymerase c6 tac dung tong hop soi DNA mới Nó kết hợp ở phần cuối của đoạn mỗi và sau đó liên tiếp thêm các nucleotide mới vào sợi DNA ở đầu 3' bổ sung cho DNA dich

Nhiét d6 cao (94°C) la can thiét dé tach DNA soi kép DNA polymerase théng thường bị phá vỡ trong nhiệt độ này Tuy nhiên, Taq polymerase có đặc điểm duy nhất

là hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ cao hơn

Taq DNA polymerase nay được chiết xuất từ vi khuẩn 7J£zus aquaficus Những vi khuẩn này sống trong suối nước nóng và có thể tồn tại ở đó

2.2.3 Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)

14

Deoxynucleotide triphosphat (dNTP) là dATP, dCTP, dGTP va dTTP Day la nguyên liệu cơ bản của các sợi DNA mới Taq polymerase bắt các đNTP này từ dung dịch làm việc và gắn chúng vào phần cuối của mỗi đề kéo dải chuỗi DNA

Magie clorua hoạt động như một đồng yếu tô của enzym Taq polymerase

2.3 Phát hiện và phân tích san pham PCR (Dey P, 2018)

Sản phẩm của PCR bao gồm một hoặc nhiều doan DNA (trình tự hoặc các trinh

tự quan tâm) Việc phát hiện và phân tích các sản phẩm có thể được thực hiện rất nhanh chóng bằng điện đi trên gel agarose (hoặc acrylamide)

DNA được phát hiện bằng cách nhuộm ethidium bromide Do d6, các san pham

có thê nhìn thây ngay lập tức bằng cách chiếu tia cực tim (280-320 nm) Cac san pham rất nhỏ thường có thế nhìn thay rất gần với mặt trước di chuyên dưới dạng nhiều hoặc

ít đải khuếch tán Chúng tương ứng với các chất dimer của mỗi và đôi khi với chính các mồi

Tùy thuộc vào các điều kiện phản ứng, các đoạn DNA không đặc hiệu có thé được khuếch đại ở mức độ lớn hon hoặc nhỏ hơn, tạo thành các dải lưới hoặc “vết bân” Trên các hệ thống tự động, máy phân tích mảnh hiện được sử dụng Thiết bị này

sử dụng nguyên tắc điện di mao quản Phát hiện phân mảnh được thực hiện bởi một diode laser Điều nay chỉ có thể thực hiện được nếu PCR được thực hiện với các mỗi kết hợp với fluorochromes

2.4 Ưu và nhược điểm của phương phap (Dey P, 2018)

15

- PCR còn có thê cho ra kết quả định lượng chính xác số bản copies virus/l mÍ máu Từ đó hỗ trợ rất đắc lực cho bác sĩ đánh giá được hiệu quả điều trị, cũng như tiên lượng giai đoạn bệnh

- Phát hiện các đột biến gen gây ung thư, gây các bệnh đi truyền khác nhằm có biện pháp phòng ngừa bệnh

- Xác định mối quan hệ huyết thống giữa những cá thể khác nhau

2.4.2 Nhược điểm

- Ngoại nhiễm cao do khả năng nhân bản DNA mạnh

- Sai sót của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp

- Kết quả phụ thuộc rất lớn vào toàn bộ thao tác

- Thuốc thử không ở nồng độ tối ưu hoặc hết hạn sử dụng: Thuốc thử phải được làm mới và thay đổi một thuốc thứ mới tại một thời điểm để tìm ra vấn đề của thuốc thử nảo

- Nhiệt độ biến tính quá cao hoặc quá thấp: Trong điều kiện đó, thay đôi nhiệt

độ thấp hoặc cao 1°C tại một thời điểm

- Nhiệt độ ủ mỗi quá cao: Trong trường hợp này, hãy hạ nhiệt độ xuống 2°C cùng một lúc

- Hình thành mỗi mới: Hai mồi có thể tự ủ hoặc ủ với nhau Trong trường hợp này, điện di trên gel cho thấy một sản phẩm nhỏ có ít hơn 100 cặp bazơ Việc bổ sung

16

DMSO có thể giải quyết vấn đề này Ngoài ra, chu kỳ nhiệt có thê giải quyết vấn đề nảy

- Số chu kỳ nhiệt dưới mức tối ưu: Số chu kỳ nhiệt dưới mức tối ưu có thê tạo

ra lượng sản phẩm PCR ít hơn Trong điều kiện đó, tăng thêm 5-10 số chu kỳ nhiệt

- Mỗi bị lỗi: mỗi có thế bị lỗi và đo đó PCR có thể không hoạt động Trong

trường hợp đó, hãy thiết kế lại môi

- Nồng độ magie quá cao: Điều chỉnh nồng độ và giảm nồng độ xuống thấp

- Mỗi bị lỗi: Thiết kế lại môi

- Bị ô nhiễm: Thay đôi nơi thực hiện PCR

CHUONG 3: ENZYMEE-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 3.1 Nguyén tac chung cia ELISA (Sakamoto S và cộng sự, 2017)

ELISA dựa trên khái niệm về phản ứng kháng nguyên - kháng thẻ, đại diện cho

sự tương tác hóa học giữa các kháng thể được tạo ra bởi tế bào B của bạch cầu va kháng nguyên Phản ứng miễn dịch cụ thế này đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thê khỏi những kẻ xâm lược như mam bệnh và độc tố

Bằng cách khai thác phản ứng này, ELISA cho phép phân tích định lượng/định tính có độ nhạy cao và chọn lọc đối với các kháng nguyên, bao gồm protein, peptit, axit nucleic, hormone, thuốc diệt cỏ và các chất chuyền hóa thứ cấp của thực vật

Đề phát hiện các phân tử này, một kháng nguyên hoặc kháng thê được đánh dấu bằng cách sử đụng các enzym, cái gọi là xét nghiệm miễn dịch enzym, trong đó alkaline phosphatase (ALP), horseradish peroxidase (HRP), và B-galactosidase thường được sử dụng

17