Đánh giá tính an toàn và hiệu quả tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic Đa chủng labmix trên mô hình Động vật thí nghiệm

Hoàng Văn Vinh – cán bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hướng ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Văn Hương Giang ĐÁNH GIÁ T

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Văn Hương Giang

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU QUẢ TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC ĐA CHỦNG LABMIX TRÊN MÔ HÌNH ĐỘNG

VẬT THÍ NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2024

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Văn Vinh – cán

bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hướng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Văn Hương Giang

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU QUẢ TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC ĐA CHỦNG LABMIX TRÊN MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Hoàng Văn Vinh

PGS TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2024

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Văn Vinh – cán

bộ Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để em có thể hoàn thành luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Nguyễn Quang Huy – Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử - Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giúp đỡ, chỉ bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho

em trong thời gian thực hiện luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ Trung tâm Nghiên cứu động vật Thực nghiệm – Học viên Quân y đã tạo điều kiện giúp đỡ, truyền kinh nghiệm và đưa ra những góp ý bổ ích trong suốt thời gian thực nghiệm thí nghiệm tại trung tâm

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ thuộc phòng Sinh học phân tử ứng dụng, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học và các thầy cô bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn giúp

đỡ, động viên và ủng hộ em rất nhiều, giúp em vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2024

Văn Hương Giang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 CHẾ PHẨM PROBIOTIC 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Vai trò của probiotic 3

1.1.3 Tiêu chuẩn của chế phẩm probiotic 4

1.1.4 Chế phẩm đa chủng chứa Lactobacillus và Bifidobacterium 7

1.2 ĐÁNH GIÁ AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRÊN MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 9

1.2.1 Thử nghiệm độc tính cấp 11

1.2.2 Thử nghiệm độc tính bán trường diễn 12

1.3 KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH VÀ TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC 13

1.3.1 Cơ chế miễn dịch 13

1.3.2 Chỉ số kháng thể miễn dịch IgA 16

1.3.3 Chỉ số cytokine IL-6 17

1.3.4 Chỉ số cytokine TNF-α 18

1.3.5 Khả năng kích thích và tăng cường miễn dịch của chế phẩm đa chủng 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 NGUYÊN LIỆU 21

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 21

2.1.2 Động vật thí nghiệm 22

2.1.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 23

2.2.2 Đánh giá tính an toàn của chế phẩm 24

2.2.3 Đánh giá hiệu quả tăng cường miễn dịch của chế phẩm 28

2.2.4 Phương pháp phân tích thống kê 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CẤP 34

3.1.1 Kết quả theo dõi lâm sàng và khối lượng cơ thể chuột 34

3.1.2 Quan sát dấu hiệu ngộ độc 37

3.1.3 Kết quả mô bệnh học 37

3.2 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN 39

3.2.1 Kết quả theo dõi tình trạng chung 39

3.2.2 Kết quả theo dõi khối lượng cơ thể chuột 39

3.2.3 Kết quả huyết học 40

3.2.4 Kết quả sinh hóa 45

3.2.5 Kết quả mô bệnh học 51

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM LABMIX TRÊN CHUỘT CỐNG TRẮNG 56

3.3.1 Hiệu quả của chế phẩm LabMix đến cân nặng chuột cống trắng 56

3.3.2 Ảnh hưởng đến chỉ số IgA máu, IgA niêm mạc 57

3.3.3 Ảnh hưởng đến chỉ số IL-6 và TNF-α 59

3.3.4 Kết quả mô bệnh học đường ruột của chuột 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Ngoại suy liều tương đương giữa các loài 11

Bảng 2 Phân loại độc tính cấp theo giá trị LD50 gần đúng 12

Bảng 3 Các chủng vi sinh vật có trong chế phẩm LabMix 21

Bảng 4 Thời điểm và nội dung thử nghiệm 24

Bảng 5 Thể tích thuốc cho chuột nhắt uống 25

Bảng 6 Thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm LabMix trên mô hình chuột khỏe mạnh 29

Bảng 7 Thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm LabMix trên mô hình chuột tiêu chảy 30

Bảng 8 Kết quả theo dõi tỷ lệ sống chết của chuột 36

Bảng 9 Kết quả các chỉ tiêu theo dõi toàn thân của chuột nhắt trắng 36

Bảng 10 Mô bệnh học gan chuột cống trắng 53

Bảng 11 Mô bệnh học thận chuột cống trắng 54

Bảng 12 Mô bệnh học lách chuột cống trắng 55

Bảng 13 Mô bệnh học ruột chuột cống trắng 62

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Một số ứng dụng của probiotic 3

Hình 2 Cơ chế miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng hệ vi sinh vật 14

Hình 3 Cấu trúc của Immunoglobulin A 17

Hình 4 Chế phẩm LabMix 21

Hình 5 Sơ đồ nghiên cứu 23

Hình 6 Hình ảnh chuột cống trắng ở các lô nghiên cứu độc tính bán trường diễn uống chế phẩm LabMix 28

Hình 7 Thao tác cho chuột cống uống thuốc 28

Hình 8 Hình ảnh chuột cống trắng khỏe mạnh ở các lô nghiên cứu đánh giá IgA 29 Hình 9 Kết quả cân nặng chuột nhắt trắng 34

Hình 10 Kết quả tỷ lệ tăng cân nặng chuột nhắt trắng 35

Hình 11 Hình ảnh đại thể gan, lách, thận của chuột nhắt nghiên cứu 38

Hình 12 Kết quả cân nặng chuột cống trắng 39

Hình 13 Số lượng hồng cầu của chuột cống trắng 41

Hình 14 Số lượng huyết sắc tố của chuột cống trắng 42

Hình 15 Số lượng bạch cầu của chuột cống trắng 43

Hình 16 Số lượng tiểu cầu của chuột cống trắng 44

Hình 17 Hoạt độ AST của chuột cống trắng 45

Hình 18 Hoạt độ ALT của chuột cống trắng 47

Hình 19 Nồng độ Bilirubin của chuột cống trắng 48

Hình 20 Nồng độ Cholesterol của chuột cống trắng 49

Hình 21 Nồng độ Creatinin của chuột cống trắng 50

Hình 22 Hình ảnh đại thể gan, lách, thận của chuột cống nghiên cứu 51

Hình 23 Hình ảnh mô bệnh học gan, lách, thận của chuột cống nghiên cứu (HE, 100X) 52 Hình 24 Hiệu quả của chế phẩm LabMix đến cân nặng chuột cống trắng 56

Hình 25 Hàm lượng IgA của chuột cống trắng 57

Hình 26 Hàm lượng IgA của chuột cống trắng bị tiêu chảy 58

Hình 27 Kết quả định lượng IL-6, TNF-α của chuột khi sử dụng LabMix 60

Hình 28 Kết quả định lượng IL-6 và TNF-α chuột cống trắng bị tiêu chảy được điều trị bằng LabMix 61 Hình 29 Hình ảnh mô bệnh học manh tràng chuột cống 63

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALT Alanine aminotransferase

CFU Colony Forming Units Đơn vị hình thành khuẩn lạc

FAO Food and Agriculture

Organization of the United

Nations

Tổ chức lương thực và nông nghiệp liên hợp quốc

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và

Dược phẩm Hoa Kỳ GRAS General Recornized as Safe Chứng nhận an toàn

IBD Inflammatory Bowel Disease Bệnh viêm ruột

IBS Irritable Bowel Syndrome Hội chứng ruột kích thích

OECD Organization for Economic

Cooperation and Development

Tổ chức Hợp tác và Phát triển

Kinh tế

TNF Tumor Necrosis Factors Yếu tố hoại tử khối u

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), các chủng vi sinh vật được sử dụng với vai trò probiotic cần có nguồn gốc và tên khoa học rõ ràng, mang các đặc tính probiotic cần thiết, đồng thời phải đáp ứng được các tiêu chí an toàn Các

chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus (đặc biệt là L acidophilus và L casei) và Bifidobacterium (đặc biệt là B bifidum) đã được nhiều nghiên cứu chứng minh về

những tác dụng tích cực trong chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ, và được xem là thuộc nhóm vi khuẩn an toàn (GRAS)

Kế thừa và phát triển kết quả của các nghiên cứu trước đây, đề tài này tập trung

vào việc thử nghiệm chế phẩm probiotic LabMix, bao gồm ba chủng L acidophillus VTCC 60013, L casei VTCC 60014 và B bifidum VTCC 60015 trên mô hình chuột

nhắt trắng và chuột cống trắng Nghiên cứu không chỉ đánh giá tính an toàn mà còn xem xét sự biến động của chỉ số kháng thể IgA và các chỉ số cytokine IL-6 và TNF-

α để đánh giá hiệu quả tăng cường miễn dịch của chế phẩm

Chính vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Đánh giá tính an toàn

và hiệu quả tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic đa chủng LabMix trên mô hình động vật thí nghiệm” để có cơ sở khoa học và làm tiền đề cho những

nghiên cứu tiếp theo trong việc ứng dụng chế phẩm probiotic này vào chăm sóc sức khoẻ con người

2

Mục tiêu của luận văn:

Đánh giá độ an toàn và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic LabMix

(gồm 3 chủng Lactobacillus acidophilus VTCC 60013, Lactobacillus casei VTCC

60014 và Bifidobacterium bifidum VTCC 60015) trên mô hình động vật thí nghiệm

Nội dung luận văn bao gồm:

1 Nghiên cứu, đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên mô hình động vật thí nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix

2 Xác định sự biến động chỉ số IgA trong huyết thanh và niêm mạc ruột, chỉ

số cytokine IL-6 và TNF-α trong huyết thanh của động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Chế phẩm Probiotic

1.1.1 Định nghĩa

Theo FAO/WHO (2001), probiotic gồm các vi sinh vật sống, khi đưa vào cơ

thể với một số lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ [43]

1.1.2 Vai trò của probiotic

Một số chức năng của probiotic được thể hiện trong Hình 1

Hình 1 Một số chức năng của probiotic [12]

Vi khuẩn probiotic đường ruột là những vi khuẩn có khả năng đem lại những

giá trị tích cực cho sức khỏe con người khi được đưa vào qua đường uống trực tiếp

hoặc bổ sung vào các loại thực phẩm lên men Ngoài vai trò cân bằng giữa vi khuẩn

có lợi và vi khuẩn có hại trong đường ruột nhằm giúp hệ tiêu hóa hoạt động tốt hơn,

probiotic còn được cho là tác nhân chống lại các vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột như

Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori và Rotavirus Vi

khuẩn probiotic còn có khả năng trung hòa lactose ở những người không có khả năng

dung nạp lactose, kích thích hệ miễn dịch đường ruột hoặc có thể làm giảm hàm lượng

cholesterol cũng như các chất có hại khác trong cơ thể Để thực hiện được các chức

năng đó, vi khuẩn probiotic thường có 2 đặc tính quan trọng là sản sinh

β-Tăng cường chức năng hàng rào ruột

Điều hoà phản ứng trao đổi chất toàn thân

Điều hoà hệ

vi sinh vật đường ruột

Tín hiệu hệ thần kinh trung ương

Điều hoà hệ thống miễn dịch

Điều hoà

hệ vi sinh vật đường ruột

Probiotic không những sử dụng cho con người mà còn được sử dụng cho vật nuôi Trong những năm gần đây, để hạn chế việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi, người ta đã sử dụng nhiều probitic và đạt được những tác dụng tích cực Một số tác dụng của probiotic đến vật nuôi phải kể đến như: tăng trọng lượng, tăng cường khả năng tiêu hóa thức ăn, cải thiện chất lượng thịt, tăng cường sức đề kháng, …

Một số loại vi khuẩn an toàn khác như Bacillus spp cũng được sử dụng làm probiotic

cho vật nuôi

1.1.3 Tiêu chuẩn của chế phẩm probiotic

1.1.3.1 Tiêu chuẩn theo WHO/FAO

Có 4 yêu cầu quan trọng cho một chủng vi khuẩn probiotic là: an toàn; chủng

vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật chủ; ức chế vi sinh vật

có hại cho vật chủ; chủng vi sinh vật làm tăng hiệu quả trao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ

 An toàn:

Một trong những yêu cầu tiên quyết của vi sinh vật probiotic là phải an toàn cho vật chủ Theo khuyến cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO), vi sinh vật an toàn cho sản xuất probiotic cần có nguồn gốc, tên khoa học rõ ràng với một số yêu cầu cụ thể như: (i): thuộc nhóm GRAS (General Recornized as Safe) Theo yêu cầu này, tổ chức FDA của Mỹ khuyến cáo các chủng vi sinh vật được xếp vào GRAS là các chủng vi sinh vật được xem là an toàn và đã được sử dụng từ trước cho đến ngày 1/1/1958; (ii) Các chủng vi sinh vật có nguồn gốc phân lập từ ruột người và động vật hoặc từ thực phẩm lên men và được định danh thuộc đối tượng an toàn và (iii) là

5

nhóm các vi sinh vật được các tổ chức khoa học có năng lực bảo quản trong bộ sưu tập vi sinh vật có tên khoa học, nguồn gốc và kết quả nghiên cứu đảm bảo an toàn

sinh học (Bio Safety level 1) [43]

 Sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nội tạng vật chủ (đường tiêu hoá (gastrointestinal tract/GIT), pH thấp, có mặt của muối mật, enzyme và kháng sinh)

Các nghiên cứu chỉ ra, lượng vi sinh vật probiotic đưa vào cơ thể dao động

108-1010/ngày trong khi đó quần xã vi sinh vật dao động từ 108-1011/ml/g (tùy thuộc vào vị trí trong hệ tiêu hóa vật chủ), như vậy để probiotic có tác dụng thì các chủng lựa chọn phải thích ứng với môi trường sinh thái trong hệ tiêu hóa vật chủ như pH thấp (2-4), chịu enzyme tiêu hóa (pepsin, kimotripsin), axit và muối mật (0,1-0,3%),

và có mặt của kháng sinh [43]

 Ức chế vi sinh vật có hại

Vi khuẩn probiotic sinh các chất kháng khuẩn (bacteriocin như: nisin,

acidophilin, plataricin, enterocin, lactococin ); sinh axit hữu cơ như lactic, acetic

làm thay đổi pH môi trường ức chế vi sinh vật gây bệnh và trung hòa độc tính, phân

giải muối mật, giảm cholesterol Đây được xem những đặc tính quan trọng có tác

dụng trực tiếp ức chế nhóm vi sinh vật có hại như E coli, Staphylococus, Clostridium, Literia monocytogenes

 Tăng hiệu quả trao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ

Khả năng bám dính và tạo khuẩn lạc tại thành ruột được xem là một đặc tính

quan trọng có tác dụng kích thích miễn dịch cũng như ức chế vi sinh vật gây hại thông qua cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột và khả năng loại vi sinh vật gây hại và độc

tố thông qua cơ chế hấp phụ Vi khuẩn probiotic còn sinh các enzyme tiêu hóa galactosidase, protease, lipase, amylase, cellulose), vitamin (B12, K, B5, B2, B3) và tăng hiệu quả hấp thụ thức ăn

(β-Quá trình để có thể ứng dụng một chủng probiotic làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng theo hướng dẫn của WHO/FAO bao gồm 03 giai đoạn chính

đó là:

6

 Giai đoạn 1: Sàng lọc các chủng phù hợp cho nghiên cứu và ứng dụng phát triển sản phẩm: Phân lập, tuyển chọn, định danh các chủng lợi khuẩn; Khảo nghiệm đặc tính thích nghi với các điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa như muối mật,

pH thấp ; Xác định chủng tự nhiên hay biến đổi gen - GMO

 Giai đoạn 2: Xác định đặc tính phù hợp để ứng dụng phát triển sản phẩm theo

tiêu chuẩn của WHO/FAO để thiết lập tiêu chuẩn và đánh giá ở mức độ in vitro và in vivo (trên mô hình động vật) về đặc tính hiệu quả và an toàn:

+ An toàn: Tập trung vào các chỉ tiêu như kháng kháng sinh, trao đổi chất, độc

tố, tan huyết…

+ Hiệu quả: Đặc tính probiotic (chịu được các điều kiện trong đường tiêu hóa như pH, muối mật; khả năng bám dính; hoạt tính kháng khuẩn; ức chế tác nhân gây bệnh; điều hòa miễn dịch; hoạt tính thủy phân muối mật; hoạt tính thủy phân liên kết glycoside…)

+ Tính khả thi về kỹ thuật/công nghệ: Khả năng chống chịu với các điều kiện đặc thù trong quá trình sản xuất (pH, NaCl, nhiệt độ…); Độ ổn định trong các điều kiện hiếu khí/kị khí; Khả năng sống sót trong quá trình chế biến và bảo quản

 Giai đoạn 3: Xác định chủng phù hợp cho sản xuất và thử nghiệm/đánh giá an toàn và hiệu quả trên người

Theo khuyến cáo của WHO/FAO, một chủng vi sinh vật được sử dụng trong vai trò probiotic cần phải tiến hành qua nhiều nghiên cứu Đối với một sản phẩm probiotic dùng cho người, yêu cầu về tính an toàn của chủng vi sinh vật sử dụng phải được kiểm soát theo tiêu chuẩn GRAS và QPR Theo tiêu chuẩn này, các chủng probiotic nói trên phải được khẳng định tính an toàn thông qua các chỉ tiêu đánh giá theo tiến trình từ giai đoạn 1 đến giai đoạn 3 Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu trong nước về vấn đề này chưa được quan tâm thực hiện đầy đủ

1.1.3.2 Tiêu chuẩn theo Dược điển V

Ở Việt Nam, các yêu cầu về chủng trong sản xuất chế phẩm probiotic cũng đã được xây dựng trong Dược điển V [1] với các yêu cầu sau đây:

7

- Chủng được phân lập từ hệ vi sinh vật thông thường trong cơ thể người hoặc

từ vi khuẩn - vô hại, không độc

- Có tác dụng tăng cường phát triển và hoạt động của hệ vi khuẩn đường ruột

- Đặc tính sinh hóa và đặc tính gen của chủng phải ổn định

- Phải có khả năng duy trì tình trạng sống ổn định, độ an toàn

Các chủng vi sinh vật được ứng dụng cho sản xuất chế phẩm probiotic hầu hết

là các loài thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium [21] Tuy nhiên, có thể thấy,

việc lựa chọn các chủng này để có thể phát triển sản phẩm probiotic an toàn và hiệu quả là một quá trình phức tạp Việc này đòi hỏi phải có sự đầu tư về kinh phí, thời gian và nhân lực để có thể thực hiện các giai đoạn theo quy trình nghiên cứu một cách bài bản Đồng thời, những vấn đề lý thuyết và thực tiễn để giải quyết một cách triệt

để cũng cần có sự phối hợp của nhiều chuyên ngành nghiên cứu khác nhau trong lĩnh vực khoa học sự sống Cho đến nay, ở Việt Nam, việc áp dụng theo quy trình thực hiện như trên còn nhỏ lẻ, chưa được đồng bộ và còn tồn tại nhiều hạn chế

1.1.4 Chế phẩm đa chủng chứa Lactobacillus và Bifidobacterium

Hầu hết các loài thuộc chi Lactobacilli, Bifidobacteria, Lactococci và một số

nấm men thuộc GRAS [50] Tuy nhiên, để sử dụng làm chế phẩm probiotic dùng cho người, các chủng vi sinh vật này vẫn phải trải qua quy trình đánh giá tính an toàn

[44]

Lactobacillus và Bifidobacterium được sử dụng phổ biến trong vai trò

probiotic Những vi khuẩn này đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu khoa học

về chức năng và tác dụng của chúng trên con người và vật nuôi Chế phẩm probiotic

có nhiều dạng khác nhau, và đôi khi, hiệu quả của chế phẩm phụ thuộc đó là chế phẩm đơn hay đa chủng So với các chế phẩm đơn chủng, chế phẩm đa chủng chứa nhiều hơn một chủng của cùng loài, chi hoặc của những loài khác, chi khác Một số chế phẩm sinh học đơn chủng có lợi trong việc giảm bớt các bệnh liên quan tới đường

tiêu hoá Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu in-vitro cho thấy một số chế phẩm

probiotic đa chủng có tác dụng ức chế các mầm bệnh trong đường ruột tốt hơn bằng cách kết hợp tác dụng của các chủng khác nhau [21]

8

Gần đây, sự phổ biến và lây lan cao của các mầm bệnh kháng thuốc kháng sinh (AMR) trên toàn thế giới ngày càng gia tăng Bệnh nhân điều trị kéo dài với kháng sinh phổ rộng có nguy cơ cao bị tiêu chảy do kháng sinh và viêm đại tràng

màng do C difficile và các vi khuẩn gây bệnh khác kháng kháng sinh [19] Nghiên

cứu của Lakhtin và cộng sự (2010) đã báo cáo rằng chế phẩm sinh học đa chủng bao

gồm L acidophilus (chủng NK1, K3III24, 100ash), B teecentis MC 42, B bifidum và

B gallinarum GB có khả năng đồng sản xuất lectin có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các chủng C albicans, S aureus [22] Nghiên cứu của Kondepudi và cộng sự (2014) cho thấy chế phẩm sinh học đa chủng chứa L plantarum F44, L paracasei F8, B breve 46, và B lactis 8:8 có tác dụng ức chế C difficile trên mô hình chuột thí nghiệm bị gây nhiễm C difficile [19]

Các chế phẩm men vi sinh đa chủng khác nhau ức chế vi khuẩn gây bệnh như

Vibrio cholerae (in-vitro), S aureus, S epidermidis, S pneumoniae, S pyogenes, Propionibacterium acnes, Moraxella catarrhalis và Proteus mirabilis [7, 9] Một số

vi khuẩn probiotic này có khả năng tạo ra các chất có hoạt tính kháng khuẩn Chế

phẩm sinh học đa chủng có chứa L rhamnosus và L reuteri thay đổi hệ vi sinh vật

âm đạo để giảm vi khuẩn và nấm men trong âm đạo ở bệnh nhân viêm âm đạo do vi

khuẩn [34] Chế phẩm sinh học đa chủng có chứa các chủng Lactobacillus khác nhau gồm L acidophilus NCIMB 30184 (PXN 35), L fermentum NCIMB 30226 (PXN 44), L plantarum NCIMB 30187 (PXN 47) và L rhamnosus NCIMB 30188 (PXN 54) cản trở sự bám dính của E coli NCTC 9001 và Enterococcus faecalis NCTC

00775 đến các dòng tế bào bàng quang, không giống như các chế phẩm probiotics đơn lẻ [10]

Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy một số chế phẩm sinh học hữu ích trong việc điều trị các bệnh về đường tiêu hóa (Gastrointestinal - GI) như viêm bệnh ruột (Inflammatory Bowel Disease - IBD), hội chứng ruột kích thích (Irritable Bowel Syndrome - IBS) [8, 14] Chế phẩm sinh học đa chủng chứa hỗn hợp các chủng men

vi sinh Bifidobacterium, Lactobacillus và Streptococcus làm giảm đáng kể các chỉ số

của IBS bao gồm đau bụng/chướng bụng, đầy hơi và cải thiện thành phần của hệ vi

và điều chỉnh hệ vi khuẩn trong ruột non của bệnh nhân bị IBS sau khi sử dụng chế

phẩm 30 ngày [25] Chế phẩm sinh học đa chủng gồm B bifidum W23, B lactis W52,

L acidophilus W37, L brevis W63, L casei W56, L salivarius W24, L lactis W19

và L lactis W58 có thể hạ thấp mức độ nội độc tố vi khuẩn đáng kể ở bệnh nhân đái

tháo đường tuýp II sau 6 tháng sử dụng Điều đó cho thấy, chế phẩm probiotic đa chủng là một sản phẩm đầy hứa hẹn điều trị bổ trợ chống đái tháo đường [35] Hỗn

hợp L bulgaricus 151 và S thermophilus MK-10 được nuôi cấy từ sữa chua cũng

làm giảm triệu chứng viêm đại tràng ở chuột bằng cách tăng số lượng và sự đa dạng của vi khuẩn liên kết niêm mạc (vi khuẩn đường ruột, cầu khuẩn ruột) và khả năng đáp ứng viêm của vật chủ Sự giảm mức độ axit béo chuỗi ngắn có hoạt tính trong manh tràng của bệnh viêm đại tràng do muối dextran natri-sulphat gây ra ở chuột BALB/c đã được báo cáo trong nghiên cứu của Wasilewska và cộng sự (2019) [41] Một nghiên cứu khác cũng cho thấy sự cải thiện của các triệu chứng tương tự bởi chế

phẩm sinh học Dahi (gồm 2 chủng L acidophilus LaVK2 và B bifidum Bbvk3) thông

qua việc giảm hoạt động của myeloperoxidase cũng như mức TNF-α, IL-6, và IFN-γ

ở chuột [16]

1.2 Đánh giá an toàn của chế phẩm probiotic trên mô hình động vật thí nghiệm

Đây là bước bắt buộc cho việc phát triển sản phẩm probiotic trước khi sử dụng trên người Các bước đánh giá dựa theo các tiêu chí sau: (i) đánh giá sự an toàn của probiotic theo các chỉ tiêu: độc tính cấp và độc tính bán trường diễn; (ii) đánh giá cách thức sử dụng (liều) Các kết quả thu được thông qua việc bố trí thí nghiệm trên chuột giữa lô đối chứng và lô thí nghiệm có sử dụng probiotic

Nhằm đánh giá tính an toàn và hiệu quả của chế phẩm, việc thử nghiệm trên

mô hình động vật sẽ được thực hiện trên chế phẩm probiotic tổ hợp 03 chủng – chế phẩm LabMix với các liều sử dụng khác nhau Nghiên cứu này, có ý nghĩa cho việc

10

đưa ra dẫn liệu khoa học làm cơ sở cho cách thức sử dụng phù hợp của chế phẩm trước khi ứng dụng đánh giá trên người

Theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc

từ dược liệu” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015 [3], một số điểm trước khi tiến hành đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn cần lưu ý như sau:

Động vật nghiên cứu: Nguồn cung cấp động vật thí nghiệm đóng vai trò quan

trọng trong việc đảm bảo chất lượng của nghiên cứu nên động vật của các cơ sở chăn nuôi có uy tín được sử dụng để đảm bảo chất lượng nghiên cứu

Động vật phải có đủ chuồng nuôi giữ trong điều kiện thí nghiệm, yên tĩnh, thoáng khí, nhiệt độ từ 20-30oC, độ ẩm 60-75% Chuồng phải có kích thước phù hợp,

có đủ chỗ để thức ăn, nước uống, thoáng, sạch sẽ và dễ làm vệ sinh Các đặc điểm sinh lý của động vật theo mùa cần lưu ý để đề ra kế hoạch nghiên cứu thích hợp trong năm

Thức ăn của động vật thí nghiệm cần hợp lý, phù hợp, đáp ứng yêu cầu của thí nghiệm và đảm bảo chế độ ăn suốt quá trình nghiên cứu Động vật được cho ăn đúng giờ để không ảnh hưởng đến hấp thụ thuốc và tránh sự căng quá mức của dạ dày Động vật thí nghiệm thường được cho uống chế phẩm vào sáng hôm sau tức là sau khoảng 16 giờ kể từ khi cho ăn bữa cuối cùng của ngày hôm trước

Số lượng động vật thí nghiệm được quy định để đảm bảo cho phép tính xác suất thống kê có độ tin cậy cao

Chia lô thí nghiệm: Số lô nghiên cứu tuỳ thuộc vào dự đoán tác dụng của thuốc

và cách chia lô thí nghiệm được sử dụng phổ biến là:

- Lô trắng không dùng gì

- Lô chứng dùng nước cất hoặc dung môi

- Lô chứng dương dùng một thuốc đã biết tác dụng (nếu có)

- Lô trị cần chia nhiều nhóm khác nhau tuỳ theo liều lượng thuốc dự đoán tác dụng

11

Liều thực nghiệm: Xác định đúng liều dùng trong thực nghiệm góp phần quan

trọng cho sự thành công của thí nghiệm, thường phải căn cứ vào liều có thể gây đáp ứng Xác định liều thực nghiệm bằng cách tham khảo tài liệu, tính từ liều lâm sàng

đã có hoặc dò liều Dò liều là phương pháp tốt nhất kể cả khi đã có liều thí nghiệm

do tài liệu và lâm sàng cung cấp

1.2.1 Thử nghiệm độc tính cấp

Theo trang Human Sociaty International, hằng năm có hơn 115 triệu cá thể động vật được sử dụng với mục đích thí nghiệm Tuy nhiên, con số này vẫn nhỏ hơn con số thực tế vì nhiều quốc gia chưa thể kiểm soát số lượng động vật thí nghiệm này Theo thống kê tại Mỹ năm 2019 số lượng động vật thí nghiệm các loài như sau: chuột bạch 23%, thỏ 18%, chuột thường 12%, linh trưởng 9%, chó 7%, lợn 6%, mèo 2%, cừu 2% và còn lại 21% các loài động vật khác Từ một liều thử nghiệm mẫu thử trên

mô hình ĐVTN bất kỳ, áp dùng quy ước ngoại suy liều giữa các loài có thể ước tính liều dùng trên các loài khác (Bảng 1) [3]

Bảng 1 Ngoại suy liểu tương đương giữa các loài [3]

Loài ngoại suy

Loài thực nghiệm Chuột nhắt

12

tính cao dựa trên giá trị LD50 theo “Quy định về thử thuốc trên lâm sàng”, ban hành kèm theo Quyết định số 01/2007/QĐ-BYT ngày 11 tháng 01 năm 2007; Bộ Y tế

“Điều lệ Y tế Quốc tế” năm 2007 [2]

Bảng 2 Phân loại độc tính cấp theo giá trị LD50 gần đúng [4]

a: Sự khác biệt về liều giữa hai liều liên tiếp

b: Tỷ lệ tử vong trung bình của hai nhóm liên tiếp

1.2.2 Thử nghiệm độc tính bán trường diễn

Thử độc tính bán trường diễn nhằm xác định khả năng dung nạp của động vật thí nghiệm khi dùng sản phẩm nhiều lần Thông tin cần xác định có những biểu hiện độc tính sau khi dùng dài ngày, bao gồm:

- Mức liều không hoặc có gây thay đổi đáng kể tới chức năng, cơ quan hoặc một số biểu hiện sống có thể quan sát được trên động vật thí nghiệm

- Những độc tính có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục nếu

có

Liều dùng: Sản phẩm được dùng chủ yếu qua đường uống bằng dụng cụ

chuyên biệt Liều thử phải được lựa chọn sao cho có ý nghĩa trong việc đánh giá về khả năng an toàn hay mức độ gây độc của mẫu thử khi dùng nhiều ngày trên động vật Liều thử thường được tính từ các thông tin thu được từ thử độc tính cấp, và được quy đổi tương đương theo liều giữa các loài nếu thử trên loài khác nhau Với những nghiên cứu đầy đủ, thử nghiệm được thiết kế với 3 mức liều (tương đương 3 nhóm thử):

- Liều thấp: mức liều đủ để sản phẩm có tác dụng dược lý hoặc điều trị (tức là tương đương mức liều dự kiến dùng để điều trị cho người);

- Liều trung bình: mức liều có thể không gây những độc tính quan sát được hoặc gây ảnh hưởng không đáng kể;

- Liều cao: mức liều dự kiến sẽ quan sát được biểu hiện ngộ độc trên cơ quan của động vật thí nghiệm hoặc đến mức thể tích giới hạn cao nhất mà động vật thí nghiệm có thể dùng được

Thử nghiệm nên được tiến hành song song với một nhóm chứng trong cùng điều kiện với cùng số lượng động vật đã dùng trong nhóm thử Tuy nhiên, trong thời điểm hiện tại phần lớn các nghiên cứu có thể chấp nhận với một nhóm chứng và hai nhóm thử (liều thấp và liều cao)

1.3 Khả năng kích thích và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic 1.3.1 Cơ chế miễn dịch

Hệ thống miễn dịch của động vật có vú bao gồm một bộ hoàn chỉnh các tế bào miễn dịch và các phân tử truyền tín hiệu tương tác với các vi sinh vật và các kháng nguyên Ruột là một cơ quan dễ tiếp nhận, thích hợp cho các can thiệp dinh dưỡng

14

nhằm thay đổi hoặc điều chỉnh các đáp ứng miễn dịch của vật chủ Một số cơ chế đã được biết đến là có liên quan đến sự tương tác giữa vật chủ và hệ vi sinh vật Cơ chế của động vật có vú có hai hệ thống miễn dịch [13]:

Hình 2 Cơ chế miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng hệ vi sinh vật [48]

- Hệ thống miễn dịch bẩm sinh cho phép phản ứng nhanh chóng và triệt để với các kích thích gây ra bởi các tác nhân lây nhiễm Các đáp ứng là phản ứng viêm tự nhiên và chủ yếu gồm các tế bào thực bào (các đại thực bào, các bạch cầu trung tính, các tế bào giết tự nhiên) [13]

- Hệ thống miễn dịch đáp ứng, sau khi được hoạt hóa bởi các tế bào trình diện kháng nguyên, sẽ huy động các tế bào T và B đặc hiệu, thông qua việc sản xuất các phân tử truyền tín hiệu đặc hiệu (các cytokine, chemokine), sẽ hỗ trợ điều chỉnh các phản ứng miễn dịch, cả phản ứng miễn dịch tự nhiên và thích nghi Các tế bào B tiết

ra các kháng thể (tạo ra miễn dịch thể dịch), trong khi các tế bào T được chia thành các tế bào T trợ giúp (CD4+, hay Th) và các tế bào T gây độc (CD8+, hay Tc) Các

tế bào trình diện kháng nguyên trong niêm mạc ruột tiếp tục lấy mẫu các kháng nguyên ở trong lòng ống ruột Thách thức chính của hệ thống miễn dịch ở ruột phải liên tục cân bằng qua sự phòng vệ bằng cách dung nạp: lựa chọn hoạt hóa các tế bào

T đáp ứng để tăng cường sự phòng vệ chống lại các tác nhân gây bệnh, hoặc thúc đẩy

sự biệt hóa thành các loại tế bào T điều hòa khác nhau để tạo ra khả năng dung nạp Các cơ chế cho phép dung nạp bảo vệ vật chủ khỏi phản ứng viêm quá mức trong quá

15

trình nhiễm trùng, hoặc giúp tái cân bằng lại hệ thống miễn dịch khi bị rối loạn Vì thế, các tế bào miễn dịch bẩm sinh sẽ cần phải sử dụng các dấu hiệu bề mặt đặc hiệu Trong số các kháng nguyên được tìm thấy, lipopolysaccharide (LPS) của thành tế bào

vi khuẩn gram âm thuộc nhóm làm tăng các phản ứng viêm mạnh nhất LPS được cho là tham gia vào tình trạng viêm sinh lý mạn tính, gặp điển hình ở các bệnh nhân béo phì Ngược lại, peptidoglycans (PGNs) từ vi khuẩn Gram dương (như lactobacilli) có thể tham gia vào hoạt tính chống viêm của probiotic [13]

Các tác động của probiotic có thể được thực hiện qua sự tương tác của chúng với các thụ thể trong các tế bào tua (DC) hoặc trong các tế bào biểu mô của ruột DC, được hoạt hóa bởi probiotic, tạo ra các cytokine và biểu hiện các phân tử được kích thích; đồng thời sẽ cho phép phân cực các tế bào T chưa biệt hoá theo hướng biệt hóa thành các tế bào T điều hòa (Tregs), đặc biệt là Tregs CD4+, CD25+ và FoxP3 hoặc các tế bào Th1, Th2, Th17 [13] Do đó, các tế bào Th1 sẽ kích thích sự thực bào và giúp chống lại các vi khuẩn gây bệnh, nhưng chúng cũng có thể có liên quan đến các bệnh lý qua trung gian miễn dịch, như viêm khớp hoặc đa xơ cứng Các kháng nguyên không phải từ vi sinh vật probiotic có thể ảnh hưởng đến sự biệt hoá tế bào T thành các tế bào Th2, tạo ra các cytokine như IL-4, IL-5, IL-6 và IL-13, giúp chống lại các

ký sinh ngoại bào, nhưng cũng được phát hiện trong các phản ứng dị ứng Cả hai loại

tế bào Th1 và Th2 có tác động trái ngược nhau nên sự cân bằng giữa việc sản xuất các cytokine của Th1 và Th2 sẽ xác định chiều hướng của một phản ứng miễn dịch Trong quá trình này, các tế bào Treg và các tế bào T trợ giúp type 3 (các tế bào Th3)

có thể can thiệp Các tế bào Treg có các đặc tính điều hòa miễn dịch qua trung gian IL-10 và TGF-β trong khi các tế bào Th3 chủ yếu tiết ra TGF-β.14 [23] Các cytokine IL-10 và TGF-β, với sự hỗ trợ của các tế bào T CD4+ từ GALT sẽ thúc đẩy sự biệt hóa các tế bào B thành các tế bào tiết kháng thể IgA trong huyết thanh Các tế bào niêm mạc ruột sẽ tiết ra các kháng thể IgA vào lòng ống ruột non, nơi chúng bất hoạt các kháng nguyên và các tác nhân gây bệnh (các virus, vi khuẩn, độc tố) [24] Một nhóm khác gồm các tế bào Th CD4+, tế bào Th17 đặc trưng cho việc sản xuất chủ yếu IL-17 (ngoài IL-21 và IL-22) và bằng sự biệt hóa các cytokine TGF-β và IL-6,16

tế bào vi sinh vật, nơi chúng tạo thành các các cấu trúc giống như lỗ rỗng, làm khiếm khuyết màng tế bào vi khuẩn IL-22 được tiết ra bởi các tế bào Th17 không chỉ làm tăng tiết β-defensin 2 và β-defensin không những hỗ trợ trực tiếp trong việc bảo vệ chống lại nhiễm trùng do vi khuẩn mà còn thông qua các đường truyền tín hiệu của các cytokine sẽ liên kết với các nhánh khác của hệ thống phòng vệ của vật chủ [20]

Hệ tiêu hóa của cơ thể con người chứa một hệ vi sinh đường ruột phức tạp Hệ

vi sinh này thay đổi tùy theo từng cá thể và tính đặc trưng của nó phụ thuộc vào yếu

tố di truyền và môi trường Các tế bào miễn dịch ở ruột chiếm tổng số 70-80% các tế bào miễn dịch trong cơ thể người và hệ vi sinh đường ruột đóng một vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa các tế bào miễn dịch đó Sự mất cân bằng các vi sinh đường ruột sẽ dẫn đến sự teo niêm mạc và không phát triển các tế bào miễn dịch cũng như

giảm tiết các kháng thể đặc biệt là các Immunoglobulin A (IgA) Bifidobacterium và Bacteroides fragilis là những vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong sự đáp ứng

miễn dịch của cơ thể, làm gia tăng các tế bào sản sinh Immuniglobulin IgA [20]

1.3.2 Chỉ số kháng thể miễn dịch IgA

IgA (Immunoglobulin A) là một globulin miễn dịch huyết thanh chính và là nhóm kháng thể chiếm ưu thế, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ miễn dịch Mặc dù IgA chỉ chiếm 10-15% trổng lượng globulin miễn dịch trong huyết thanh nhưng IgA là lớp globulin miễn dịch chính trong dịch ngoại tiết như đường tiêu hoá, đường tiết niệu sinh dục, nước bọt, nước mắt, dịch nhày phế quản IgA trong huyết thanh tồn tại chủ yếu dưới dạng monomer thì IgA trong dịch tiết (IgA bài tiết, S-IgA)

tồn tại dưới dạng polymer (chủ yếu là dạng dimer)

17

Hình 3 Cấu trúc của Immunoglobulin A [45]

Tế bào tiết IgA tập trung ở bề mặt màng nhày và có xu hướng di chuyển vào khu vực dưới niêm mạc Thụ thể được thể hiện dưới dạng một màng tích hợp protein trên bề mặt tế bào biểu mô liên kết với polyme mới được tổng hợp IgA ở bề mặt Phức hợp thụ thể-IgA được nhập bào và di chuyển khắp tế bào thông qua các bọng

sẽ được đưa đến bề mặt Phần ngoại bào gắn kết với IgA, liên kết disulphide với IgA dạng polyme (bao gồm 5 Ig-like domains), sau đó được phân cắt và toàn bộ phức hợp được giải phóng dưới dạng S-IgA [29]

1.3.3 Chỉ số cytokine IL-6

Interleukin 6 là một cytokine đa chức năng, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vật chủ Khi nhiễm trùng hoặc tổn thương mô xảy ra, IL-6 được sản xuất kịp thời, góp phần loại bỏ các tác nhân lây nhiễm và phục hồi các mô tổn thương thông qua kích hoạt các phản ứng miễn dịch, huyết học và giai đoạn cấp tính [40]

IL-6 chủ yếu làm tăng tổng hợp IL-1 và TNF để phối hợp kích thích đáp ứng miễn dịch, nhất là đáp ứng của gan trong giai đoạn đầu và có tác dụng làm tăng sao chép, tăng biệt hoá, tăng tiết kháng thể của tế bào B, tăng phối hợp kích thích sinh máu và sản xuất thrombopoietin, kích thích phát triển tế bào gan và tế bào myeloma

18

ở tổ chức nuôi cấy Mới đầu IL-6 được xem là interferon - p2 (IFN-P2) vì chúng có hoạt tính chống virus và có kháng thể phản ứng chéo với IFN, nhưng qua nhiều nghiên cứu người ta đã chứng minh rằng tự bản thân IL-6 không có tác dụng chống virus mà tác dụng chống virus của IL-6 là kích thích sản xuất IFN [6]

IL-6 được sản xuất từ nhiều tế bào khác nhau: Tế bào T và B đã hoạt hoá, monocyt, tế bào nội mạc, tế bào gan, tế bào B bị nhiễm EBV, tế bào xơ non IL-6 có một số tác dụng sinh học như tham gia vào đáp ứng miễn dịch ở giai đoạn đầu ở gan, sản xuất ra các yếu tố đề kháng không đặc hiệu giống như tác dụng của IL-1 và TNF, phát triển tế bào B và tương bào để tăng tạo kháng thể dịch thể, phối hợp với IL-1 và TNF tác dụng làm tăng sản xuất IL-2 IL -1 và TNF cùng tham gia kích thích phát triển tế bào xương, tế bào da, tham gia kích thích sinh máu IL-6 có hai loại tác dụng chính: tham gia kích thích phát triển miễn dịch và kích thích tạo máu [6]

1.3.4 Chỉ số cytokine TNF-α

TNF là chấ t trung gian chính củ a phản ứng viêm cấp chống vi khuẩn Gram âm

và một số vi sinh vật khác TNF cũng là chất đảm nhiệm về nhiều biến chứng toàn thân khi bị nhiễm trùng nặng TNF lầ n đầ u tiên được tìm thấy trong huyết thanh động vật xử lý với nội độc tố vi khuẩn (LPS) và có tác du ̣ng gây ra sự hoa ̣i tử của các khối

u trong cơ thể khi hiện diện với lượng lớn Nguồn sản xuất TNF chủ yếu là thực bào đơn nhân, tuy nhiên một số tế bào khác như lympho T, NK, dưỡng bào cũng có thể tiết ra chấ t này Kích thích mạnh nhất đối với đa ̣i thực bào để dẫn đến sản xuất TNF

là LPS Ngoài ra, một lượng lớn cytokin này còn được sản xuất bởi các vi khuẩn Gram

âm Các interferon γ do tế bào T và NK sản xuất cũng có tác du ̣ng khuyếch đa ̣i sinh tổng hợp TNF của đa ̣i thực bào đã được LPS kích thích [6]

Chứ c năng sinh lý chính của TNF là kích thích tập trung tế bào trung tính và tế bào đơn nhân đến nơi nhiễm trùng và hoa ̣t hóa những tế bào này để tiêu diệt vi khuẩn TNF làm bộc lộ các phân tử kết dính trên tế bào nội mô làm dính la ̣i tế bào

bạch cầu, trung tính và tế bào đơn nhân ta ̣i đây Hai phân tử kết dính quan tro ̣ng là selectin và ligand dành cho integrin bạch cầu TNF kích thích tế bào nội mô và đa ̣i thực bào tiết ra chemokin nhằ m tăng cường ái lực của integrin ba ̣ch cầu đối với ligand

Sự kích thích sản xuất TNF đủ ma ̣nh có thể gây ra sản xuất thừa TNF và lượng này

sẽ chuyển vào máu để gây ra các tác động ở xa vi ̣ trí nhiễm trùng như một hooc-môn Các tác động toàn thân của TNF bao gồm: TNF tác động lên vùng dưới đồi để gây ra sốt, gọi là chất gây sốt nội sinh (phân biệt với LPS là chất gây sốt ngoa ̣i sinh) Do vậy, các chấ t kháng prostaglandin có thể giả m sốt do TNF và IL-1 TNF tác động lên tế bào gan làm tăng tổng hợp protein huyết thanh Những protein huyết tương do gan

sản xuất dưới tác động của TNF, IL-1 và IL-6 ta ̣o nên đáp ứng pha cấp của phản ứng viêm Sự sản xuất TNF kéo dài gây ra tiêu hao tế bào cơ và mỡ và cuối cùng dẫn đến suy kiệt Khi một lượng lớn TNF được sản xuất thì khả năng co cơ tim và cơ trơn thành mạch bi ̣ ức chế gây ra tu ̣t huyết áp và đôi khi cả sốc [6]

TNF gây ra huyết khối nội mạch do tế bào nội mô mất tính chất chống đông bình thường TNF kích thích tế bào nội mô bộc lộ yếu tố mô là một chất hoa ̣t hóa đông máu ma ̣nh Khả năng của chất này trong việc hoa ̣i tử u như tên gọi của nó là kết quả của huyết khối trong các ma ̣ch máu của u Lượng TNF lớn lưu thông trong máu còn có thể gây ra rối loạn chuyển hóa, cu ̣ thể là ha ̣ đường huyết do tăng tiêu thu ̣ đường nhưng gan không bù la ̣i được Một biến chứng nặng của nhiễm trùng Gram âm là sốc nhiễm trùng (còn gọi là sốc nội độc tố) Bệnh cảnh sốc bao gồm tru ̣y tim ma ̣ch, đông máu nội mạch rải rác và rối loa ̣n chuyển hóa Hội chứng này chính là do TNF và một số cytokin khác như IL-12, INF-γ và IL-1 mà được sản xuất ra nhiều dưới tác động

củ a LPS vi khuẩn Đo nồng độ TNF huyết thanh có thể dự báo được bệnh cảnh sốc này Các chấ t đối kháng TNF có thể ngăn ngừ a tử vong trong mô hình thực nghiệm nhưng trên lâm sàng thì không có tác dụng đó Điều đó có thể do ngoài TNF, các cytokin khác cũng có tác động như TNF và ma ̣nh không kém [6]

20

1.3.5 Khả năng kích thích và tăng cường miễn dịch của chế phẩm đa chủng

Nghiên cứu của Paturi G và cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng khi bổ sung L acidophilus LAFTI L10 và L paracasei LAFTI L26 có khả năng tăng cường miễn dịch hệ đường ruột ở chuột Chuột (BALB/c) được cho uống L acidophilus hoặc L paracasei với liều 108 CFU/50 μl mỗi ngày trong 14 ngày đã cho thấy ảnh hưởng của các chủng này lên tế bào sản xuất immunoglobulin A, interleukin-10 và interferon gamma trong hệ thống miễn dịch ruột Các phản ứng miễn dịch được thực hiện để định lượng các cytokine như IL-10 và IFN-γ bằng phương pháp ELISA Các chủng

L acidophilus và L paracasei đã cho thấy tác dụng làm tăng IgA, cytokine chống

viêm (IL-10 và IFN-γ) trong ruột non [32] Một nghiên cứu khác của Steinberg R.S

và cộng sự (2014) cho thấy 2 chủng L salivarius L38 và L acidophillus L36 phân

lập từ phân bò có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch niêm mạc ruột, bảo vệ

chống lại bệnh nhiễm khuẩn Salmonella Sự tăng cường biểu hiện IL-10 ở các vị trí

khác nhau trong hệ tiêu hoá của động vật được cho uống chủng L38 có tác dụng chống viêm [38] Theo nghiên cứu của Li A và cộng sự (2019), probiotic gồm 2

chủng B subtilis và B velezensis được phân lập từ bò Tây Tạng có khả năng cải thiện

các thông số trong máu liên quan tới viêm nhiễm và khả năng miễn dịch của chuột Những con chuột được điều trị bằng chế phẩm probiotic có IgG, IgM và IgA và yếu

tố chống viêm IL-10 trong huyết thanh cao hơn; trong khi đó TNF-α, IL-6, IL-8 giảm

so với nhóm đối chứng [26]

Do vai trò quan trọng và các ứng dụng ngày càng rộng rãi của chế phẩm

probiotic nên trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi tiến hành “Đánh giá tính an toàn

và hiệu quả tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic đa chủng LabMix trên mô hình động vật thí nghiệm” để có cơ sở khoa học cho việc sử dụng chế phẩm

probiotic tổ hợp 3 chủng đem lại hiệu quả và an toàn khi sử dụng

21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Chế phẩm LabMix dạng bột (số lô 0221DL, ngày sản xuất 18/01/2022, HSD 18/01/2024) là sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu đánh giá vai trò cải thiện tích cực hệ

vi sinh vật đường ruột và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic” mã số ĐTĐL: CN-61/19 và được cung cấp bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Chế phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở được sử dụng làm đối tượng đánh giá độc tính cấp trên chuột nhắt trắng và độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng Các chủng vi sinh vật trong chế phẩm LabMix có trong Bảng 3

Bảng 3 Các chủng vi sinh vật có trong chế phẩm LabMix

Địa điểm tiến hành: Trung tâm Nghiên cứu động vật Thực nghiệm – Học viện Quân y

Thời gian tiến hành: Tháng 1-3/2022

2.1.3 Hoá chất và thiết bị nghiên cứu

 Hoá chất

 Bộ kit IgA Rat Uncoated ELISA Kit with Plates (Invitrogen, Mỹ)

 Bộ kit Rat IL-6 ELISA Kit (Invitrogen, Mỹ)

 Bộ kit Rat TNF alpha ELISA Kit (Invitrogen, Mỹ)

 Các hoá chất khác đạt tiêu chuẩn dùng trong hoá sinh và miễn dịch

 Thiết bị nghiên cứu

 Máy xét nghiệm sinh hoá tự động (AU480 - Beckman Coulter, Nhật Bản)

 Máy xét nghiệm huyết học tự động (Erba Elite – 3, Đức)

 Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ (Everbest, Pakistan)

 Cân chính xác 10-2 mg (DJ6000TW, Nhật Bản)

 Bơm kim tiêm (iBalance 211, Mỹ)

23

 Máy ly tâm (Hettich- Đức)

 Máy đồng hoá mô Wiggens D-5000 (Wiggens, Đức)

 Máy đọc Elisa Chromate 4300 (Awareness, Mỹ)

 Chuồng và dụng cụ nuôi chuột

 Một số thiết bị khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 5 Sơ đồ nghiên cứu

24

 Thời điểm và nội dung thử nghiệm

Bảng 4 Thời điểm và nội dung thử nghiệm

Tên thí nghiệm Trước thí nghiệm

(4-5 ngày)

Ngày cân trọng lượng

và lấy máu

Ngày mổ giải phẫu

Ngày 0; 14; 28: Cân trọng lượng và lấy máu xét nghiệm

Ngày 0; 14; 28: Cân trọng lượng và lấy máu xét nghiệm

2.2.2 Đánh giá tính an toàn của chế phẩm

2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp

Thử độc tính cấp nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của sản phẩm, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính và tác dụng cũng như phạm vi nghiên cứu tính an toàn của sản phẩm tiếp theo [3]

Nghiên cứu được thực hiện theo hướng dẫn của Tổ Chức Y Tế Thế Giới (WHO), Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) và Bộ Y tế Việt Nam về nghiên cứu độc tính của thuốc [5, 30, 42]

- Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 10 con

- Chuột dừng ăn 12 giờ trước khi uống chế phẩm LabMix

- Chuột uống chế phẩm LabMix pha với nước cất theo tỉ lệ 1:1,5 (g/ml) bằng kim cong chuyên biệt

- Chuột được nuôi dưỡng phù hợp với nghiên cứu, thức ăn và nước uống do trung tâm nghiên cứu động vật thực nghiệm cung cấp, hoạt động tự do và được theo

25

dõi liên tục trong 14 ngày

- Khoảng cách giữa mức liều cao nhất chưa gây chết một con chuột nào và mức liều thấp nhất gây chết 100% số chuột trong nhóm được sử dụng để tính toán LD50

Thể tích cho chuột nhắt trắng uống thuốc theo từng lô nghiên cứu được thể hiện trong Bảng 5 Lô chứng uống nước cất, lô trị 1, 2, 3 uống chế phẩm LabMix

Bảng 5 Thể tích thuốc cho chuột nhắt uống

STT Lô NC

(n=10)

V thuốc (ml/10g/24h)

Lần 1 (ml/10g)

Lần 2 (ml/10g)

Lần 3 (ml/10g)

Lần 4 (ml/10g)

Chỉ tiêu theo dõi lâm sàng:

- Số lượng chuột chết (con)

- Cân nặng của chuột (g)

- Số lượng chuột có bất thường về vận động tự động (đi lại bình thường, co cụm một góc ở lồng nuôi chuột, rối loạn vận động) so với số lượng chuột bình thường

- Số lượng chuột có biểu hiện co giật, run, vã mồ hôi, tím tái so với số lượng chuột bình thường

- Số lượng chuột có thay đổi bất thường về tiêu hóa (ỉa chảy) so với số lượng chuột bình thường

- Thời gian theo dõi: Các chỉ tiêu trên được theo dõi ở các thời điểm: Trước khi uống thuốc (Ngày 0); sau 3 ngày (Ngày 3), sau 6 ngày (Ngày 6), sau 9 ngày (Ngày 9), sau 13 ngày (Ngày 13)

Theo dõi giải phẫu bệnh:

26

- Kết thúc nghiên cứu, tiến hành mổ, quan sát đại thể và vi thể các tạng gan, lách và thận dưới kính lúp phóng đại 25 lần

2.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Thử độc tính bán trường diễn chỉ được tiến hành sau khi đã có thông tin về độc tính cấp trên động vật và mẫu thử được dự định sử dụng hoặc tiếp xúc dài ngày trên người

Thực hiện theo hướng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam về nghiên cứu tính an toàn

và hiệu lực của thuốc y học cổ truyền và các chất có nguồn gốc thiên nhiên (2015),

và theo hướng dẫn của OECD 407 [3, 30]

Chuột cống trắng, được nuôi trong môi trường phòng thí nghiệm 5-10 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm

Chuột cống trắng được chia thành 03 lô, mỗi lô 10 con:

- Lô chứng (n = 10): chuột cống trắng được cho uống nước cất với thể tích 5 ml/1 kg/24 h

- Lô trị 1 (n = 10): chuột cống trắng được uống chế phẩm LabMix với liều 2,52x109 CFU/kg (tương ứng với liều dùng trên người 2 g/50 kg/24 h, hệ số 7), tương ứng với thể tích chế phẩm là 5 ml/1 kg/24 h

- Lô trị 2 (n = 10): chuột cống trắng được uống chế phẩm LabMix với liều 12,6x109 CFU/kg (gấp 5 liều dùng trên người, hệ số 7), tương ứng với thể tích chế phẩm là 5 ml/1 kg/24 h

Các lô chuột được uống liên tục trong 28 ngày, mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng

và sau 28 ngày, chuột được ngừng uống

Các chỉ tiêu đánh giá

Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu:

- Tình trạng chung, thể trạng của chuột được đánh giá thông qua cân nặng, ăn uống, vận động, các rối loạn…

- Chức năng tạo máu được đánh giá thông qua số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu

27

- Chức năng gan được đánh giá thông qua định lượng một số enzym và chất chuyển hóa trong máu: ALT, AST, bilirubin toàn phần, protein toàn phần và cholesterol

- Chức năng thận được đánh giá thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết thanh

- Chỉ số glucose

Các thông số theo dõi được kiểm tra tại 3 thời điểm: trước lúc uống, sau 2 tuần

và sau 4 tuần uống chế phẩm

Mô bệnh học: Sau 4 tuần uống chế phẩm, 30% số chuột cống trắng ở mỗi lô được phân tích để kiểm tra mô bệnh học (đại thể, vi thể) Trong trường hợp có biểu hiện bất thường như viêm, sưng, hoại tử mẫu sẽ được cố định trong formol 10% để làm tiêu bản giải phẫu bệnh học

Trước xét nghiệm (Ngày 0), sau 2 tuần (Ngày 14) và 4 tuần (Ngày 28) uống chế phẩm, chuột được lấy máu để thực hiện xét nghiệm huyết học và hoá sinh

Đối với các phân tích hoá sinh, mẫu máu được thu thập như sau:

- Máu được để tĩnh 1 giờ trong ống ly tâm

- Ly tâm máu ở 3500×g trong 10 phút

- Huyết thanh được chuyển sang ống Eppendorf mới

- Lưu trữ và bảo quản huyết thanh ở -80oC

Các thông số hóa sinh huyết thanh được phân tích bằng cách sử dụng hệ thống máy tự động để xác định cholesterol toàn phần, alanin aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) và creatinin, bilirubin, glucose từ đó đánh giá chức năng gan, thận

Đối với phân tích huyết học, máu được thu thập trong các ống lấy máu được ion hóa heparin và phân tích bằng máy phân tích huyết học tự động Các thông số của máu được nghiên cứu là số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu

28

Hình 6 Hình ảnh chuột cống trắng ở các lô nghiên cứu độc tính bán trường diễn

uống chế phẩm LabMix

(A: Chuột cống, lô chứng, B: Chuột cống, uống chế phẩm LabMix liều

2g/50kg/24h, C: Chuột cống, uống chế phẩm LabMix liều 10g/50kg/24h)

Hình 7 Thao tác cho chuột cống uống thuốc

2.2.3 Đánh giá hiệu quả tăng cường miễn dịch của chế phẩm

2.2.3.1 Thí nghiệm đánh giá chỉ số miễn dịch ở mô hình chuột khoẻ mạnh và chuột

bị tiêu chảy

 Mô hình chuột khoẻ mạnh

Lô chứng dương Chế phẩm đối

chứng dương

3×109 CFU/kg (5 ml/kg/24h)

Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu như sau:

- Tình trạng chung, thể trạng của chuột: cân nặng, ăn uống, vận động, các rối loạn…

- Đánh giá kháng thể miễn dịch IgA huyết thanh và IgA niêm mạc ruột

- Đánh giá cytokine IL-6 và TNF-α trong huyết thanh

- Mô bệnh học: đại thể, vi thể

30

 Mô hình chuột tiêu chảy

Chuột cống trắng được gây tiêu chảy bằng kháng sinh Lincomycin với liều 5 g/kg

x 2 lần Toàn bộ chuột ở các lô thí nghiệm sau khi đã bị tiêu chảy được bố trí thí nghiệm như sau:

Bảng 7 Thí nghiệm đánh giá hiệu quả chế phẩm LabMix trên mô hình chuột

Lô chứng dương Chế phẩm đối

chứng dương

3×109 CFU/kg (5 ml/kg/24h)

Các chỉ tiêu đánh giá

Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu như sau:

- Tình trạng chung, thể trạng của chuột: cân nặng, ăn uống, vận động, các rối loạn…

- Thu mẫu máu: Xác định chỉ số kháng thể miễn dịch IgA huyết thanh, cytokine IL-6 và TNF-α huyết thanh

- Manh tràng: Xác định IgA niêm mạc ruột

- Mô bệnh học: Kết thúc thí nghiệm ruột của 5 con chuột ở mỗi nhóm được tiến hành giải phẫu vi thể

2.2.3.2 Phương pháp định lượng chỉ số IgA

 Xử lý mẫu

 Mẫu máu:

- Mẫu máu mắt chuột (sau 02 tuần) và máu tim chuột (sau 04 tuần) lấy vào ống giữ máu xét nghiệm được đậy nắp kín

31

- Ly tâm máu ở 3500×g trong 10 phút tại 4oC

- Chuyển huyết thanh sang ống eppendorf mới

- Lưu trữ và bảo quản huyết thanh ở -80oC

 Mẫu manh tràng:

Thu mẫu: Chuột được mổ giải phẫu và manh tràng sau khi lấy được bảo quản

ở -80oC đến khi thực hiện thí nghiệm

Xử lý mẫu:

- Cân 0,1g mô niêm mạc ruột vào ống eppendorf;

- Bổ sung 1ml Tissue Extraction Reagent I vào ống epp đã chứa mô;

- Đồng nhất mẫu mô bằng máy đồng hoá mô;

- Li tâm mẫu mô đã được đồng nhất 10000 rpm trong 5 phút;

- Thu phần dịch nổi phía trên;

- Bảo quản ở -80oC

 Định lượng chỉ số IgA

Phương pháp định lượng chỉ số kháng thể miễn dịch IgA được thực hiện với

bộ Kit IgA ELISA đặc hiệu trên chuột theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Các bước thực hiện:

Chuẩn bị đĩa ELISA gắn kháng thể (capture antibody)

- Bổ sung 100 µl/ giếng kháng thể bắt giữ trong Coating Buffer vào đĩa;

- Đậy kín và ủ qua đêm ở 4oC;

- Rửa hai lần bằng đệm rửa;

- Bổ sung 250 µl Blocking Buffer và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ;

- Rửa hai lần bằng đệm rửa

Xây dựng đường chuẩn với 7 điểm chuẩn

- Pha loãng chất chuẩn (theo hệ số 2) với Assay Buffer A (1X);

- Bổ sung 100 µl Assay Buffer A (1X) vào tất cả các giếng sử dụng cho chất chuẩn;

- Bổ sung 100 µl chất chuẩn vào giếng đầu tiên; trộn đều và tiến hành pha loãng bậc 2 để có 7 giếng chứa chất chuẩn