Đánh giá tính an toàn và hiệu quả tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic Đa chủng labmix trên mô hình Động vật thí nghiệm (tt)

Sơ đồ nghiên cứu Chế phẩm LabMix được đánh giá tính an toàn bằng thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn; đánh giá hiệu quả tăng cường miễn dịch bằng xác định chỉ số IgA và

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Văn Hương Giang

ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ HIỆU QUẢ TĂNG

CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CHẾ PHẨM PROBIOTIC ĐA

CHỦNG LABMIX TRÊN MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT

Công trình được hoàn thành tại:

- Phòng Sinh học Phân tử Ứng dụng, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Trung tâm Nghiên cứu động vật Thực nghiệm, Học viện Quân

y

Người hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Văn Vinh

PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Phản biện: PGS TS Bùi Thị Việt Hà

Phản biện: TS Võ Viết Cường

Luận văn được bảo hệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại phòng 441B-T1, trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi 9 giờ ngày 09 tháng 08 năm 2024

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin – Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

Danh mục các công trình khoa học của tác giả liên quan đến

luận văn

1 Uyen N Q., Hong N N., Giang V H., Ha N D., Quyen H

N M., Huy N Q., Vinh H V (2023), “Probiotic

characteristics of the potential strain Lactobacillus acidophilus LA 304.17”, Tạp chí Y học Dự phòng, 33(3), pp

30-39 DOI: https://doi.org/10.51403/0868-2836/2023/1139

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Chế phẩm Probiotic

1.1.1 Định nghĩa

Theo FAO/WHO (2001), probiotic gồm các vi sinh vật

sống, khi đưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ

1.1.2 Vai trò của probiotic

Vi khuẩn probiotic đường ruột là những vi khuẩn có khả năng đem lại những giá trị tích cực cho sức khoẻ con người khi được đưa vào đường uống trực tiếp hoặc bổ sung vào các loại thực phẩm lên men Ngoài vai trò cân bằng giữa vi khuẩn có lợi

và vi khuẩn có hại trong đường ruột nhằm giúp hệ tiêu hóa hoạt động tốt hơn Vi khuẩn probiotic còn có khả năng trung hòa lactose ở những người không có khả năng dung nạp lactose, kích thích hệ miễn dịch đường ruột hoặc có thể làm giảm hàm lượng cholesterol cũng như các chất có hại khác trong cơ thể

1.1.3 Tiêu chuẩn của chế phẩm probiotic

1.1.3.1 Tiêu chuẩn theo WHO/FAO

Có 4 yêu cầu quan trọng cho một chủng vi khuẩn probiotic là: an toàn; chủng vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật chủ; ức chế vi sinh vật có hại cho vật chủ; chủng vi sinh vật làm tăng hiệu quả trao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ

1.1.3.2 Tiêu chuẩn theo Dược điển V

Ở Việt Nam, các yêu cầu về chủng trong sản xuất chế phẩm probiotic cũng đã được xây dựng trong Dược điển V với các yêu cầu sau đây:

- Chủng được phân lập từ hệ vi sinh vật thông thường trong cơ thể người hoặc từ vi khuẩn - vô hại, không độc

- Có tác dụng tăng cường phát triển và hoạt động của hệ

vi khuẩn đường ruột

- Đặc tính sinh hóa và đặc tính gen của chủng phải ổn định

- Phải có khả năng duy trì tình trạng sống ổn định, độ an toàn

1.1.4 Chế phẩm đa chủng chứa Lactobacillus và

Lactobacillus và Bifidobacterium được sử dụng phổ biến

trong vai trò probiotic Những vi khuẩn này đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu khoa học về chức năng và tác dụng của chúng trên con người và vật nuôi Chế phẩm probiotic có nhiều dạng khác nhau, và đôi khi, hiệu quả của chế phẩm phụ thuộc đó

là chế phẩm đơn hay đa chủng So với các chế phẩm đơn chủng, chế phẩm đa chủng chứa nhiều hơn một chủng của cùng loài, chi hoặc của những loài khác, chi khác Một số chế phẩm sinh học đơn chủng có lợi trong việc giảm bớt các bệnh liên quan tới

đường tiêu hoá Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu in-vitro cho

thấy một số chế phẩm probiotic đa chủng có tác dụng ức chế các mầm bệnh trong đường ruột tốt hơn bằng cách kết hợp tác dụng của các chủng khác nhau

1.2 Đánh giá an toàn của chế phẩm probiotic trên mô hình động vật thí nghiệm

Đây là bước bắt buộc cho việc phát triển sản phẩm probiotic trước khi sử dụng trên người Các bước đánh giá dựa theo các tiêu chí sau: (i) đánh giá sự an toàn của probiotic theo các chỉ tiêu: độc tính cấp và độc tính bán trường diễn; (ii) đánh giá cách thức sử dụng (liều) Các kết quả thu được thông qua việc

bố trí thí nghiệm trên chuột giữa lô đối chứng và lô thí nghiệm

có sử dụng probiotic

1.2.1 Thử nghiệm độc tính cấp

Nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm thử trên chuột nhắt trắng bằng đường uống dựa theo phương pháp Litchfield-Wilcoxon, hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới và thông tư hướng dẫn về thử thuốc trên lâm sàng của Bộ Y tế Trước đây, phương pháp thường được áp dụng trong tính giá trị LD50 cho những chất có độc tính cao dựa trên giá trị LD50 theo “Quy định

về thử thuốc trên lâm sàng”, ban hành kèm theo Quyết định số 01/2007/QĐ-BYT ngày 11 tháng 01 năm 2007; Bộ Y tế “Điều lệ

Y tế Quốc tế” năm 2007

1.2.2 Thử nghiệm độc tính bán trường diễn

Thử độc tính bán trường diễn chỉ được tiến hành sau khi

đã có thông tin về độc tính cấp trên động vật và mẫu thử được dự định sử dụng hoặc tiếp xúc dài ngày trên người Thực hiện theo hướng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam về nghiên cứu tính an toàn và hiệu lực của thuốc y học cổ truyền và các chất có nguồn gốc thiên nhiên (2015), và theo hướng dẫn của OECD 407

1.3 Khả năng kích thích và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic

1.3.1 Cơ chế miễn dịch

Hệ thống miễn dịch của động vật có vú bao gồm một bộ hoàn chỉnh các tế bào miễn dịch và các phân tử truyền tín hiệu tương tác với các vi sinh vật và các kháng nguyên Ruột là một

cơ quan dễ tiếp nhận, thích hợp cho các can thiệp dinh dưỡng nhằm thay đổi hoặc điều chỉnh các đáp ứng miễn dịch của vật chủ Một số cơ chế đã được biết đến là có liên quan đến sự tương tác giữa vật chủ và hệ vi sinh vật Cơ chế của động vật có vú có hai hệ thống miễn dịch: hệ thống miễn dịch bẩm sinh và hệ thống miễn dịch đáp ứng

1.3.2 Chỉ số kháng thể miễn dịch IgA

IgA là một globulin miễn dịch huyết thanh chính và là nhóm kháng thể chiếm ưu thế, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ miễn dịch IgA trong huyết thanh tồn tại chủ yếu dưới dạng monomer, IgA trong dịch tiết (IgA bài tiết, S-IgA) tồn tại dưới dạng polymer (chủ yếu là dạng dimer)

1.3.3 Chỉ số cytokine IL-6

Interleukin 6 là một cytokine đa chức năng, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vật chủ Khi nhiễm trùng hoặc tổn thương mô xảy ra, IL-6 được sản xuất kịp thời, góp phần loại bỏ các tác nhân lây ngiễm và phục hồi các mô tổn thương thông qua kích hoạt các phản ứng miễn dịch, huyết học và giai đoạn cấp tính

1.3.4 Chỉ số cytokine TNF-α

TNF là chất trung gian chính của phản ứng viêm cấp chống vi khuẩn Gram âm và một số vi khuẩn khác TNF cũng là

chất đảm nhiệm về nhiều biến chứng toàn thân khi bị nhiễm trùng nặng

1.3.5 Khả năng kích thích và tăng cường miễn dịch của chế phẩm đa chủng

Trên thế giới ngày càng có nhiều nghiên cứu về các khả năng kích thích và tăng cường miễn dịch của chế phẩm Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chế phẩm đa chủng có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch niêm mạc ruột, cải thiện khả năng miễn dịch,

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG

& PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Chế phẩm LabMix dạng bột (số lô 0221DL, ngày sản xuất 18/01/2022, HSD 18/01/2024)

Bảng 3 Các chủng vi sinh vật có trong chế phẩm LabMix

VTCC

Mật độ (CFU/g)

2.1.3 Hoá chất và thiết bị nghiên cứu

Hoá chất sử dụng trong luận văn được cung cấp bởi các hang Invitrogen, Promega, Merck, Sigma Aldrich, … đạt tiêu chuẩn sử dụng trong nghiên cứu hoá sinh và sinh học phân tử

Các thiết bị dùng trong luận văn được cung cấp bởi phòng Sinh học Phân tử Ứng dụng, Viện Vi sinh vật và Công

nghệ Sinh học – ĐHQGHN và Trung tâm Nghiên cứu động vật Thực nghiệm – Học viện Quân y

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Chế phẩm LabMix được đánh giá tính an toàn bằng thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn; đánh giá hiệu quả tăng cường miễn dịch bằng xác định chỉ số IgA và chỉ số cytokine IL-6, TNF-α khi sử dụng chế phẩm

2.2.2 Đánh giá tính an toàn của chế phẩm

2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp

Nghiên cứu được thực hiện theo hướng dẫn của Tổ chức

Y Tế Thế Giới (WHO), Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) và Bộ Y tế Việt Nam về nghiên cứu độc tính của thuốc 2.2.2.2 Phương pháp nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Nghiên cứu được thực hiện theo hướng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam về nghiên cứu tính an toàn và hiệu lực của thuốc y học

cổ truyền và các chất có nguồn gốc thiên nhiên (2015), và theo hướng dẫn của OECD 407

2.2.3 Đánh giá hiệu quả tăng cường miễn dịch của chế phẩm

2.2.3.1 Thí nghiệm đánh giá chỉ số miễn dịch ở mô hình chuột khoẻ mạnh và chuột bị tiêu chảy

 Mô hình chuột khoẻ mạnh

Chuột được chia thành 3 lô Chuột được cho uống nước cất, chế phẩm LabMix và chế phẩm đối chứng dương liên tục trong 28 ngày (1 lần/ngày) Theo dõi một số chỉ tiêu trước, trong

và khi kết thúc quá trình nghiên cứu

 Mô hình chuột bị tiêu chảy

Chuột được gây tiêu chảy bằng kháng sinh Lincomycin với liều 5 g/kg × 2 lần Chuột bị tiêu chảy được chia thành 4 lô Chuột được cho uống nước cất, kháng sinh, chế phẩm LabMix, chế phẩm đối chứng dương liên tục trong 8 ngày (1 lần/ngày) Theo dõi một số chỉ tiêu trước, trong và khi kết thúc quá trình nghiên cứu

2.2.3.2 Phương pháp định lượng chỉ số IgA

Phương pháp định lượng chỉ số kháng thể miễn dịch IgA được thực hiện với bộ Kit IgA ELISA đặc hiệu trên chuột theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2.2.3.3 Phương pháp định lượng chỉ số IL-6

Phương pháp định lượng IL-6 trong huyết thanh được thực hiện với bộ Kit IL-6 ELISA đặc hiệu trên chuột theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2.2.3.4 Phương pháp định lượng chỉ số TNF-α

Phương pháp định lượng TNF-α trong huyết thanh được thực hiện với bộ Kit TNF-α ELISA đặc hiệu trên chuột theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2.3.4 Phương pháp phân tích thống kê

Số liệu thu thập được xử lý bằng các thuật toán thống kê

và phần mềm Microsoft Excel 2013, SPSS 20.0

So sánh giá trị trung bình của hai biến chuẩn bằng Paired Sample T-Test và One Way ANOVA với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả thử nghiệm độc tính cấp

3.1.1 Kết quả theo dõi lâm sàng và khối lượng cơ thể chuột

Khối lượng chuột nhắt trung bình ở các lô đều tăng tỉ lệ thuận theo thời gian và không có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê khi so sánh giữa các lô (p>0,05)

Số lượng chuột nhắt được bảo toàn trong quá trình thử nghiệm Chuột nghiên cứu bình thường, không xuất hiện tình trạng rối loạn vận động, co giật và tím tái, xù lông hay tiêu chảy, chuột ăn uống, đi lại hoạt động bình thường

3.1.2 Quan sát dấu hiệu ngộ độc

Chế phẩm LabMix không gây độc ở liều 600×109 CFU/ kg/24 h (cao gấp 138,88 lần liều dùng cho người), không xác định được giá trị LD50, có giá trị LD50 > 5000 mg/ kg thể trọng theo đường uống thì được coi là không độc hoặc không phân loại Dựa vào kết quả thu được, chúng tôi có thể kết luận chế phẩm LabMix thuộc nhóm không gây độc theo đường uống

3.1.3 Kết quả mô bệnh học

Quan sát đại thể bằng mắt thường và dưới kính lúp có độ phóng đại 25 lần thấy: màu sắc, hình thái của gan, lách và thận ở các lô dùng chế phẩm LabMix ở tất cả các liều không khác so với

lô đối chứng

3.2 Kết quả thử nghiệm độc tính bán trường diễn

3.2.1 Kết quả theo dõi tình trạng chung

Chuột được uống chế phẩm LabMix ở cả 2 liều nghiên cứu đều ăn uống bình thường, lông mượt, không có hiện tượng

đi ngoài hoặc rối loạn thần kinh Số lượng chuột được bảo toàn

ở các lô thử nghiệm, không có chuột bị chết

3.2.2 Kết quả theo dõi khối lượng cơ thể chuột

Cân nặng của các lô nghiên cứu sau 2 tuần và sau 4 tuần đều tăng nhiều so với thời điểm xuất phát điểm Sự khác biệt có

ý nghĩa thống kê khi so sánh thời điểm sau 2 tuần với thời điểm trước nghiên cứu, thời điểm sau 4 tuần và sau 2 tuần uống LabMix Tuy nhiên, khi so sánh các lô trong cùng một thời điểm,

sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê Như vây, cân nặng của chuột cống trắng khi uống LabMix không bị ảnh hưởng

3.2.3 Kết quả huyết học

 Số lượng hồng cầu

Số lượng hồng cầu sau 2 tuần ở cả 3 lô đều giảm so với thời điểm trước nghiên cứu (p<0,05) Tại thời điểm sau 4 tuần nghiên cứu, số lượng hồng cầu tăng ở cả 3 lô và tương đương với thời điểm trước nghiên cứu (p>0,05) Khi so sánh cùng một thời điểm, số lượng hồng cầu giữa các lô được uống chế phẩm LabMix và lô chứng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

Số lượng hồng cầu vẫn nằm trong giới hạn tiêu chuẩn

 Số lượng huyết sắc tố

Khi so sánh giữa các lô tại cùng một thời điểm cho thấy hàm lượng huyết sắc tố giữa các lô được uống chế phẩm LabMix

và lô chứng không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

So sánh hàm lượng huyết sắc tố trong cùng một lô tại các thời điểm khác nhau: sau 2 tuần và sau 4 tuần, cả 3 lô đều giảm so với thời điểm trước nghiên cứu (p<0,05) Số lượng huyết sắc tố mặc

dù có sự thay đổi nhưng vẫn nằm trong giới hạn tiêu chuẩn

 Số lượng bạch cầu

So sánh số lượng bạch cầu trong cùng một lô tại các thời điểm nghiên cứu khác nhau cho thấy: sau 2 tuần ở cả 3 lô đều

giảm so với thời điểm trước nghiên cứu (p>0,05) Tại thời điểm sau 4 tuần nghiên cứu, số lượng bạch cầu giảm ở 2 lô được dùng chế phẩm LabMix so với thời điểm trước nghiên cứu (p<0,05)

Số lượng bạch cầu mặc dù có sự thay đổi ở các thời điểm xét

nghiệm nhưng đều nằm trong giới hạn tiêu chuẩn

 Số lượng tiểu cầu

So sánh trong cùng một lô tại các thời điểm nghiên cứu cho thấy sau 2 tuần và 4 tuần nghiên cứu, số lượng tiểu cầu tăng

so với điểm trước nghiên cứu (p<0,05) So sánh giữa các lô nghiên cứu tại cùng một thời điểm cho thấy: số lượng tiểu cầu giữa các lô được uống chế phẩm LabMix và lô chứng không có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Tại thời điểm trước thí nghiệm, số lượng tiểu cầu ở tất cả các lô đều thấp hơn giá trị cho phép Tại thời điểm sau 2 tuần và 4 tuần, số lượng tiểu cầu của chuột cống trắng tại các lô đều nằm trong giới hạn Vì vậy, điều này có thể giải thích bằng việc giá trị đầu vào thấp Tuy nhiên, giá trị đầu vào thấp không làm ảnh hưởng tới số lượng tiểu

cầu trong quá trình thí nghiệm

3.2.4 Kết quả sinh hoá

 Hoạt độ AST

So sánh hoạt độ enzyme AST trong cùng một lô tại các thời điểm nghiên cứu cho thấy: sau 2 tuần hoạt độ AST tăng nhẹ, sau 4 tuần giảm đến giá trị tương đương với thời điểm trước nghiên cứu Cụ thể, sau 2 tuần, hoạt độ AST ở lô chứng, lô trị 1

và lô trị 2 tăng trung bình lần lượt là 7,61 U/L, 25,31 U/L và 30,01 U/L; sau 4 tuần, hoạt độ AST ở lô chứng giảm trung bình 6,69 U/L, lô trị 1 giảm trung bình 0,43 U/L, lô trị 2 tăng trung bình 4,92 U/L Khi so sánh giữa các lô nghiên cứu tại cùng một

thời điểm, hoạt độ AST không có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê

 Hoạt độ ALT

So sánh trong cùng một lô tại các thời điểm sau 2 tuần và

4 tuần nghiên cứu cho thấy hoạt độ ALT tăng ở cả 3 lô nghiên cứu, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với thời điểm trước nghiên cứu Cụ thể, sau 2 tuần và sau 4 tuần, hoạt độ ALT ở lô chứng, lô trị 1 và lô trị 2 tăng trung bình lần lượt là 38,53 U/L và 20,12 U/L; 25,64 U/L và 18,57 U/L; 31,64 U/L và 14,08 U/L So sánh giữa các lô nghiên cứu tại cùng một thời điểm cho thấy hoạt

độ ALT không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa lô trị 1,

lô trị 2 và lô chứng (p>0,05)

 Nồng độ Bilirubin

Nồng độ Bilirubin máu chuột cống trắng tại các thời điểm trước nghiên cứu, sau 2 tuần, sau 4 tuần nghiên cứu của lô trị 1 và lô trị 2 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với

lô chứng (p>0,05) Cụ thể, sau 2 tuần và sau 4 tuần, nồng độ Bilirubin ở lô chứng tăng trung bình là 1,30 umol/L và 0,23 umol/L, lô trị 1 giảm trung bình là 0,84 umol/L và 1,05 umol/L,

lô trị 2 tăng trung bình là 0,49 umol/L và 0,10 umol/L Nồng độ Bilirubin trong máu chuột cống trắng ở các lô tại các thời điểm

đều không vượt quá giới hạn cho phép

 Nồng độ Cholesterol

Nồng độ Cholesterol mmol/L máu chuột cống trắng tại các thời điểm trước nghiên cứu, sau 02 tuần, sau 04 tuần nghiên cứu của lô trị 1 và lô trị 2 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống

kê so với lô chứng (p>0,05) Cụ thể, sau 2 tuần và sau 4 tuần, nồng độ Cholesterol ở lô chứng tăng trung bình là 0,13 mmol/L