Báo cáo công nghệ sinh học sản xuất enzyme amyla

LỜI MỞ ĐẦUNgày nay, Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, đem lại những lợi ích kinh tế, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm như công

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  

BÁO CÁO CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SẢN XUẤT ENZYME AMYLA

ĐOÀN HOÀNG TÙNG DH62112607 D21_TP01 0338643165

LÊ TRIỀU VỸ DH62100803 D21_TP01 0909802336

VŨ MINH KHÔI DH62101152 D21_TP01 0769150148

GVHD:

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, đem lại những lợi ích kinh tế, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước ép trái cây, bánh kẹo, bánh mì

Việc nghiên cứu và sản xuất enzyme từ vi sinh vật đã và đang trở thành một hướng đi quan trọng trong công nghệ sinh học hiện đại Enzyme amylase, đặc biệt được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus oryzae, có vai trò quan trọng trong nhiều quá trình công nghiệp Đề tài này nhằm xây dựng và tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae, sử dụng các nguồn nguyên liệu như tinh bột, cám gạo và trấu Thông qua nghiên cứu, chúng tôi hy vọng sẽ cung cấp một quy trình sản xuất hiệu quả và tiết kiệm chi phí, đồng thời mở ra những ứng dụng mới cho enzyme này

Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau Đặc điểm này

có liên quan đến cơ thể đơn bào Cơ thể đơn bào phải thực hiện tất cả chức năng của sự sống, do đó chúng phải tạo ra nhiều loại enzyme khác nhau để đảm bảo sự sống phát triển tốt Nhiều vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme amylase như: nấm mốc, vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn Trong đó nấm mốc có khả thu được một lượng đáng kể enzyme ngoại bào do nấm mốc tiết ra môi trường Vì thế, giá thành sản phẩm sẽ giảm và có thể sản xuất

ở mọi nơi trên thế giới, mang lại hiệu suất kinh tế cao

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE

I Giới thiệu về enzyme amylase:

1 Khái niệm về enzyme amylase:

Enzyme amylase là một trong số các enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về

enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 –

1814 Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga, Viện sĩ K.S Kirhof Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch này mầm và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã tách được chất phân giải tinh bột đó là từ đại mạch này mầm Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dung dịch chiết malt và thu được enzyme ở dạng bột, đồng thời đặc tên là diaslase Sau này theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột gọi là amylase

Các enzyme amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn, nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm Bây giờ, người ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men

Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm

polysaccharide với sự tham gia của nước

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Đối với enzyme amylase có trong nấm mốc, khi nuôi nấm mốc tạo enzyme

amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tạo ra enzyme amylase trong tế bào hay ngoài môi trường Ở một số

vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase xảy ra song song với quá trình sinh trưởng, sự tạo ra enzyme amylase phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng sinh khối Sự tạo thành enzyme amylase cực đại xảy ra sau khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng

2 Phân loại:

Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã hồ hóa Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase ra các loại sau: a-amylase, -amylase, Glucoamylase ẞ-amylase, Glucoamylase

Tốc độ phản ứng của Enzyme Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của cơ chất Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất,

cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau

II NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE

1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật

Người ta đã biết cách chiết xuất enzyme amylase từ hạt nảy mầm để sử dụng trong ngành công nghiệp chế biên thực phẩm và như kẹo mạch nha, bia khi đó, hạt ngũ cốc được cho này màm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp và khi đó ta thu được malt

2 Thu nhận enzyme từ động vật:

Enzyme từ động vật chủ yếu thuộc nhóm Protease Enzyme được khai thác từ các tuyến dịch, hoặc những cơ quan trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình tiêu hóa của động vật

Sản xuất Enzyme từ động vật không khả thi do nó chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong khối lượng của động vật

3 Vi sinh vật

Trong ba nguồn thực vật, đông vật, vi sinh vật thì vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất

để thu nhận enzyme Cơ bản là do các lí do sau:

- Có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn khác

- Hệ enzyme từ vsv vô cùg phong phú

- Giá thành môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền

- Tốc độ sinh sản rất nhanh

- Dễ kiểm soát quá trình sx và mở rộng ở quy mô công nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ NGUỒN GIỐNG VSV

I Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme

Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:

• Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy

• Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tỉnh enzyme)

• Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất

• Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm

II Vi sinh vật dùng để sản xuất enzyme Amylase

1 Các giống vi sinh vật sản xuất enzyme amylase

Các giống vi sinh vật sản xuất enzyme Amylase Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên Vì sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn còn xa khuẩn thì ít hơn

Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus Nấm men

và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces, Endomycopsy, Endomyces cũng tạo amylase

Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac polymyxa,

Phytomonas destructans, Cassavanum các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm vi sinh vật khác

Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt Micromonospora vugaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ a-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác

2 Giới thiệu Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae

Đặc điểm cấu trúc hình thái mốc Aspergillus của Chùng nấm Oryzae Aloryzae

Ưu điểm:

+ Không sinh tổng hợp độc tổ

+ Sinh tổng hợp chất chính cao

+ Thích nghi nhanh, sinh tổng hợp mạnh sinh

+ Điều kiện nuôi cấy đơn giản rẻ tiền

+ Dễ dàng tách khỏi môi trường nuôi cấy lòng để thu enzyme ngoại bào

Aspergillus Oryzae là một loại nấm vì thế thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomyctes (năng khuẩn) Cơ thể sinh trường của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mánh, chiều ngang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn, chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào) Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thẳng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính

Cuống định bào tử của Aspergillus Oryzae thường dài 1-2mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phía đầu cuống đình bào từ phồng lên gọi là bọng Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử Đính bào

tử của Aspergillus Oryzae có màu vàng lục hay mau vàng hoa cau Bào tử cùng thành phần môi trường được sấy khô ở nhiệt độ <50°C cho đến khi độ ẩm<8°C, đưa vào bao, hàn kín và bảo quản ở nhiệt độ thường

Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu cả enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasae, ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lõi ngô, bã sắn chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu đen, vàng màu

do các bào từ già có màu sắc các bào từ này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mới

CHƯƠNG 3: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYM AMYLASE TỪ

ASPERGYLLUS ORYZAE

1 Bảo quản giống Aspergyllus oryzae:

- Cho cát vào ống nghiệm, tiệt trùng trong autoclave 130°C trong 30 phút

-Trộn bào tử vào cát

- Sấy chân không < 40°C (độ ẩm 5%)

- Dùng parafin rắn đun chảy và đổ lên nút bông

- Thời gian bảo quản: 1 năm hoặc hơn

2 Nguyên liệu:

- Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10-15% chất béo, 10-14% protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nito 37-59%

- Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%

- Thêm trấu để tăng độ thoáng khí cho môi trường nuôi cấy

3 Sơ đồ công nghệ: sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt

Nuôi cấy bề mặt: Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc

do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương)

Người ta thường dùng cảm mì, cám gạo, ngô mành có chất phụ gia là trấu Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc

Quy trình sản xuất:

Thành phẩm

Sấy Bao gói

Sắc Ký

Kết tủa enzym

Lọc Trích ly

Nghiền mịn

Giống

VSV

Sấy

Thu nhận enzym thô

Làm nguội

Phối trộn

Thanh trùng

Xử lý Nguyên liệu

Nuôi cấy

Thuyết minh quy trình:

- Xử lý nguyên liệu: cám gạo, trấu và mạt cưa được xử lý để loại bỏ các tạp chất Trấu cho vào với tỉ lệ 20-25% so với khối lượng cám gạo

- Thanh trùng: Nhiệt độ thanh trùng là 95°C trong 60 phút Đồng thời phải thanh trùng khay lên men

- Rải nguyên liệu lên khay có kích thước 2x3 m, độ dày 2-3 cm, dùng 3kg môi

trường/khay

- Sau khi làm nguội, tiến hành cấy mốc giống với nồng độ 5-10% so với khối lượng của môi trường ở mỗi khay

- Đưa khay lên các giá đỡ

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ở 25-30°C, độ ẩm 60-65%, đồng thời phải thoáng khí

- Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô Cần thu nhận enzyme thô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm sinh bào tử là lúc quá trình tổng hợp enzyme đa yếu đi Do đó cần một bước nuôi cấy thử nghiệm để xác định thời điểm thu nhận enzyme thô Chế phẩm enzyme thô thu được chứa tế bào nấm, cơ chất, nước và enzyme

-Để giữ hoạt tính của enzyme, sấy chế phẩm thô này ở nhiệt độ 30-40°C, độ ẩm sau sấy

là 10%

- Nghiền mịn: chế phẩm enzyme thô được nghiền với cát và bột thạch anh Cát và bột thạch anh được rửa sạch, sấy khô trước Trích ly sau khi nghiền, dùng nước để trích ly

Cứ l lít enzym thô, cho 4-5 lít nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch

-Lọc dịch sau trích ly lọc bằng lọc tiếp tuyến

- Kết tủa enzyme: kết tủa được thực hiện băng ethanol phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tỉnh Nhiệt độ từ 3-10°C và dùng 2 lít ethanol cho 1lit enzyme Enzyme thu được là 1 hỗn hợp

nhiều enzyme khác nhau như amylase, proteinase, cellulase Do đó, phải tiến hành sắc ký lọc gel để thu được enzyme amylase Gel sử dụng là Sephadex G200

- Sấy sản phẩm sau sắc ký được sấy ở nhiệt độ 30-40°C để bảo đảm hoạt tỉnh cho

enzyme, độ ẩm sản phẩm là 5%

4 Ưu và nhược điểm của phương pháp này:

a Ưu điểm:

Quy trình công nghệ thường không phức tạp Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm

- Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước) Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém

- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, rất dễ xử lý Môi trường đặc là môi trường tỉnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn

bộ khối nuôi cấy

b Nhược điểm:

Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường nên cần nhiều diện tích

5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

Để được hiệu suất cao cần phải chú ý đến các yếu sau:

 Nhu cầu dinh dưỡng

 Độ ẩm của môi trường

 Nhiệt độ : Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của chùng nấm mốc này và sự tạo thành các enzyme amylase Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme là 28-32°C Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể nóng lên 40°C hoặc hơn Do

vậy cần gửi cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27°C và không cao hơn 36°C e

 Ảnh hưởng thời gian nuôi nấm mốc: Hầu hết các chủng nấm mốc

Asp.oryzea a có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ thứ 30-38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36-42 f

 pH: thích hợp cho Asp oryzae là môi trường acid yếu khoảng 5,5-6,5

6 Một số thiết bị sử dụng trong quá trình sản xuất enzyme

a Máy sấy phun sương

Công dụng: Sấy và tạo hạt từ dung dịch

Nguyên lý hoạt đông cơ bản:

Máy sấy phun li tâm tốc độ cao chuyên dùng trong sấy cao Đông y là ứng dụng của công nghệ sấy khô phun kiểu li tâm trong sấy nguyên liệu đặc định, tức là sử dụng bộ phun li tâm tốc độ cao làm nguyên liệu bị phân tán thành dạng sương mù, tiếp xúc đầy

đủ với không khí nóng và được sấy khô trong thời gian rất nhanh, tạo ra thành phẩm có dạng bột mịn Máy sấy phun ly tâm tốc độ cao chuyên dụng cho thuốc cao lòng Đông y

là thiết bị sấy phun chuyên dùng, giải quyết vấn đề sấy khô thuốc cao và thu dịch chiết thực vật trong Đông y, thiết bị này đã giải quyết đượcnhững vấn đề tồn tại của dạng máy sấy phun li tâm thông thường

Các hạn chế của mấy sấy khô phun li tâm tốc độ cao LPG:

- Vật liệu bám trên thành ống năng suất tạo bột thấp

- Vật liệu bám trên thành trong một thời gian dài, gây biến chất

- Khó vệ sinh, không phù hợp với yêu cầu GMP

- Công suất đầu ra thấp: với các máy sấy LPG-150 chỉ có thể cung cấp mức 50 đến

60 kg/h

b Máy nghiền siêu mịn khí nén:

Nguyên lý hoạt động :

Máy nghiền khí nén dùng luồng khí tốc độ cao tác động nghiền tán nguyên liệu bột dạng khô Hệ thống máy bao gồm đầu nghiền, bộ phân ly, bộ trục vít tiếp liệu, khi máy hoạt độ, nguyên liệu được đưa vào trong buồng nghiền, tại đây, nguyên liệu gặp luồng khí tốc độ cao và hạt nguyên liệu tự va đập lẫn nhau vỡ vụn thành các hạt nhỏ hơn Sau

đó bộ phân ly làm nhiệm vụ tách các hạt nhỏ, còn lại hạt to hơn vẫn tiếp tục được lưu lại buông nghiền

Đặc tính

- Ứng dụng nghiền các nguyên liệu có độ cứng dưới cấp 9

- Khả năng nghiền đạt độ mịn d = 2~15um

- Trong quá trình không bị lẫn tạp chất do bản thân nguyên liệu tự va đập Trong quá trình nghiền không sinh nhiệt

- Khí nén nghiền có thể dùng loại khí trơ nhằm tránh cháy nổ ô xi hóa đối với một số nguyên liệu đặc thù