Chọn tạo giống nhờ công nghệ tế bào doc

TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY BAO PHẤN, HẠT PHẤN Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội

Những người thực hiện:

1 Phạm Lê Ngọc Băng Dương

2 Nguyễn Huỳnh Thảo Yến

3 Từ Thị Thanh Sơn

4 Nguyễn Văn Tiền

5 Đinh Thj Thắm

6 Châu Thị Kim Ngọc

A TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI CẤY

BAO PHẤN, HẠT PHẤN

Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân trên môi

trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để

kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội.

 3 ph ng th c sinh s n đ n tính đ c khi 3 ph ng th c sinh s n đ n tính đ c khi ươ ươ ứ ứ ả ả ơ ơ ự ự

nuôi c y h t ph n đ n nhân in vitro ấ ạ ấ ơ

nuôi c y h t ph n đ n nhân in vitro ấ ạ ấ ơ

 Sinh sản đơn tính trực tiếp:

Hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) → Phôi → Cây đơn bội.

 Sinh sản đơn tính gián tiếp:

Hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) → Mô sẹo → Chồi → Cây đơn bội.

Giống sinh sản đơn tính đực gián tiếp nhưng sự thành mô sẹo ngắn,khó nhận biết

Mô hình phát sinh đ n tính ơ

Mô hình phát sinh đ n tính ơ

đ c ự

đ c ự

 Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn

bắt đầu từ thể 4 nhân đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất Bao phấn của các hoa đầu tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn

 Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau

khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt phấn và từ đó tạo cây đơn bội

 Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng

nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng

 Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn

bội như: làm tiêu bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích thước

 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn

B KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CÂY

ĐƠN BỘI.

cây trồng.

công tác chọn tạo giống vì toàn bộ các gen đều ở trạng thái đồng hợp tử nên kể cả đặc tính lặn cũng được thể hiện.

truyền các tính trạng.

Các thành t u c a vi c ự ủ ệ

nuôi c y cây đ n b i ấ ơ ộ

PHẦN 2:

TẠO CÂY ĐƠN BỘI BẰNG NUÔI

CẤY NOÃN CHƯA THỤ TINH.

 Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh được gọi là

sự sinh sản đơn tính hay trinh nữ sinh (gynogensis).

 Thành công đầu tiên trong lĩnh vực nghiên cứu tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh đã được ghi nhận trên mô sẹo đơn bội từ nuôi cấy noãn cây Ginkgo biola (Tulecke,

1964).Mặc dù trong thời gian này người ta tập trung vào nuôi cấy cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn tạo được cây đơn bội

ở nhiều đối tượng thực vật khác nhau.Nhưng ở những loại cây như hành,củ cải đường, Việc tạo cây đơn bội bằng con

đường sinh sản đơn tính đực không đạt kết quả.

 Chính vì vậy đến khoảng những năm 70, các nhà nghiên cứu

đã tập trung giải quyết vấn đề tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh và đã được nhiều thành tựu.

 Tỷ lệ tạo cấy đơn bội bằng con đường trinh nữ sinh biến

động ở các loại cây khác nhau Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây tổn thương Nhằm nâng

cao hiệu quả, người ta đang tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen của cây mẹ và giai đoạn phát triển của túi

phôi,

Cá thể đơn bội

Sơ đồ các hướng ứng dụng đơn bội

Chọn giống ưu thế lai dòng đồng

hợp tử tuyệt đối Dòng thuần ổn định (F1,F2)

Nhị bội hóa số lượng nhiễm sắc thể (Tự phát, xử lí colchicin)

Nguyên liệu khởi đầu cho chọn giống

Tái sinh cây Gây đột biến, chọn lọc in vitro

Lai với các thể đơn bội khác

bằng dung hợp protoplast

(Lai soma)

Nuôi cấy protoplast các thể đơn bội

PHẦN 3:

KĨ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN

VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG

TÁC GIỐNG CÂY TRỒNG.

A GIỚI THIỆU CHUNG

Các tế bào thực vật có tính toàn năng, có thể nuôi cấy điều khiển sự

phát triển sinh thái của chúng cho đến khi hình thành 1 cây hoàn chỉnh

phát triển sinh thái của chúng cho đến khi hình thành 1 cây hoàn chỉnh

Cụ thể, bên trong vỏ tế bào trong đó các vật chất chính là các thông tin

di truyền chứa trong nhân của tế bào đã quyết định mọi đường hướng của quá trình thực hiện tính toàn năng của tế bào Vì thế hoàn toàn có thể nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh từ khối nguyên sinh chất chứa nhân của tế bào Việc nuôi cấy tế bào trần thực vật còn gọi là protoplast.

Ý nghĩa: Nuôi cấy tế bào trần thành công sẽ cho phép mở ra khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị

vỏ tế bào ngăn cản cũng như tạo ra khả năng dung hợp tế bào.

Ví dụ: hiện tượng co nguyên sinh và và qua đó con người cũng rất

muốn tách lớp vỏ tế bào tiến hành trên chính tế bào Sự ra đời

Protoplast đã mở ra cho con người hàng loạt triển vọng mới trong lĩnh vực giống cây trồng kĩ thuật nuôi cấy tế bào trần là một kĩ thuật phức tạp, hiện đại của nuôi cấy mô tế bào thực vật Kĩ thuật này đã được tiến hành thành công trên nhiều cây đặc biệt là cây họ cà và hòa thảo

B PHƯƠNG PHÁP TÁCH TẾ BÀO TRẦN

 Sức trương của tế bào sống luôn cân bằng với áp luật cơ học của thành tế bào Vì vậy, khi tách vỏ tế bào bị vỡ khi không còn lực nén của vỏ.Để khắc phục hiện tượng, dùng dung dịch đường mannitol, sorbitol để gây hiện tượng co nguyên sinh khi tách vỏ tế bào Nồng độ dung dịch từ 0.3 đến 0.7 mol tùy theo đối tượng

thực vật

 Để phá vỡ thành tế bào ,người ta sử dụng enzim tiếp xúc từ

sinh vật chứa nhiều enzim phân giải Nồng độ enzim thường là

pH từ 5.5 đến 5.8 trong 3 đến 4 giờ.

 Sau khi rửa sạch enzym bằng cách li tâm trong các dung dịch rửa khác nhau, ta thu được protoplast Protoplast có thể đem nuôi cấy, dung hợp hay chuyển nạp gen.

 Quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh

từ tế bào trần

 Sau một thời gian nuôi cấy (1-2 tuần), các

protoplast tái tạo vỏ và phân chia tạo nên các microcallus (mô sẹo) Chuyển các

microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các microcallus.

 Từ đó chuyển sang môi trường tái sinh

chồi và cây hoàn chỉnh Ở mỗi một giai

đoạn, người ta sử dụng các môi trường

nuôi cấy đặc hiệu khác nhau.

Tái sinh cây từ tế bào trần (protoplast)

 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào trần

 Nuôi cấy protoplast thường yêu cầu một số

thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình

thường do bản chất của protoplast.

 Các thay đổi thường liên quan đến sự điều

chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào.

C Ứng dụng công nghệ tế bào trần

trong chọn tạo giống.

 Dung hợp protoplast (lai soma, lai vô tính tế bào

thực vật):

lẫn vào nhau (dung hợp) và thành một tế bào lai mang

trong mình vật chất di truyền của cả hai tế bào

protoplast là một trong những thành tựu tuyệt vời của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào.Phương pháp này cho phép tiến hành lai xa giữa các loài – điều không thể thực hiện được bằng các phương pháp lai hữu tính thông thường

 Có hai phương pháp dung hợp protoplast:

- Dung hợp bằng hóa chất: là chất có tác dụng dính kết

protoplast để dung hợp chúng (thương sử dụng

polyotylenglycol 5 - 25%) Quá trình dung hợp sẽ được cải thiện hơn nếu xảy ra trong môi trường kiềm (pH 8 – 10) và

- Dung hợp bằng điện: Đưa dung dịch hỗn hợp protoplast vào điện trường, các protoplast sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi nằm giữa hai bản cực Khi có một xung điện cao

(750 – 1000V) trong một thời gian rất ngắn (1-200 mili giây) vùng tiếp xúc giữa 2 màng tế bào sẽ bị vỡ, 2 tế bào trần

hòa nhập vào nhau, quá trình dung hợp sẽ xảy ra

Qúa trình dung hợp protoplast

 Ng Ng ườ ườ i ta cũng phân bi t 2 lo i i ta cũng phân bi t 2 lo i ệ ệ ạ ạ

dung h p: ợ

 Dung hợp đối xứng (sysmetric): khi dung hợp 2

protoplast cùng có nhân ở mức bội thể như

nhau.

 Dung hợp không đối xứng (asyametric): tạo ra

các thể lai tế bào chất hay còn gọi là cybrid Ở đây chủ yếu chỉ là trộn tế bào chất để chuyển nạp các vật chất di truyền tế bào chất (AND của

ti thể và lạp thể) Một trong hai protoplast sẽ bị diệt nhân trước khi dung hợp.

Sản phẩm của quá trình dung hợp

Ch n l c các th lai ọ ọ ể

Ch n l c các th lai ọ ọ ể

soma

các protoplast, nên trong một hỗn hợp hai loại protoplast A

và B có thể xảy ra các trường hợp dung hợp sau:

A + B AB Heterocariot fusion (dung hợp dị nhân)

A + A AA Homocariot fusion (dung hợp đồng nhân)

B + B Homocarriot fusion

nên việc tách được các cá thể lai heterocariot (dị nhân) ra khỏi các cá thể đồng dung hợp hay chưa dung hợp khi tái sinh là hết sức quan trọng

Quá trình lai tế bào soma

Nguyên lí di

này xảy ra ở các cây tái sinh từ nuôi cấy mô có thể xảy ra ở mức nhiễm sắc thể và

do sự đa dạng tế bào trong cùng một mẫu mô nuôi cấy gây ra tình trạng không đồng nhất ở cây tái sinh

(polysomatic)

Ngoài ra còn có các nguyên nhân biến dị di truyền ở các dòng vô tính.

một số cây trồng như chuối việc cải tiến di truyền là rất khó khăn

vì chúng rất hiếm khi sinh sản các hạt có khả năng sinh sản Dựa vào các đột biến

vô tính tự nhiên xảy ra với tần số cao nên đã tận dụng hệ thống tái sinh tế bào tạo phôi vô tính tính trong quá

trình nuôi cấy mô và cho ra kết quả của việc tạo đột biến thông qua invitro rất thuận lợi.

Nguyên nhân gây ra biến dị tế bào trong nuôi cấy mô

cacbon dẫn đến mất khả năng quang hợp, sinh tổng hợp protein, tổng hợp caroren đồng hóa nitrogen

và sự kháng các kháng sinh do vậy

có thể tạo ra các biến dị định hướng thông qua nuôi cấy invitro và trọ cảm ứng biến dị trực tiếp.

Sử dụng các yếu tố chọn lọc

tận dụng hệ thống nuôi cấy tế bào để xử lí và thanh lọc các dòng tế bào chịu đựng được các chất độc của nấm bệnh phytoptorin- chất độc của nấm Phytoptora Các dòng tế bào chọn lọc này khi tái sinh sẽ cho các cá thể mang tính chống chịu với các bệnh nấm trên

môi trường:

ở các cây một và hai lá mầm bằng phương pháp chọn dòng biến dị soma để tạo ra được các dòng tế bào và tái sinh chúng thành cây mang đặc tính chống chịu

mặn chịu hạn