Đề Tài: Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện ASPERGILLUS FLAVUS sinh độc tố AFLATOXIN trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang potx

Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện đặc tính sinh aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang.. flavus sinh độc tố Aflatoxin B1 trong ngũ cốc và thức ăn chăn nuô

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÕ THỊ THANH TRANG

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

PHÁT HIỆN ASPERGILLUS FLAVUS

SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRÊN NGŨ CỐC

BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 4240

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LÝ THỊ THANH LOAN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2009

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

TS LÝ THỊ THANH LOAN

Giám Đốc Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa

dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ

Cô là người đã truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu, những bài học thật bổ ích giúp em phát triển trong công việc và trong nghiên cứu khoa học, là người luôn động viên và tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành luận văn này Em xin chúc Cô thật nhiều sức khỏe để tiếp tục niềm đam mê nghiên cứu khoa học của mình và luôn tìm thấy niềm vui trong công việc và cuộc sống

Tiếp đến tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt khóa học

Xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong khoa sinh học đã tận tình giảng dạy trong suốt thời gian học đại học và cao học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp HCM

Xin cảm ơn Thạc sĩ Nguyễn Tiến Dũng, anh vừa là một người thầy vừa là một người cấp trên thật đáng quý Anh đã luôn động viên, định hướng cho những người trẻ như chúng em có thêm nghị lực phấn đấu vươn lên trong học tập cũng như trong công việc

Cảm ơn các Anh, Chị, các bạn và các em đang làm việc tại Phòng Kiểm nghiệm Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 đã luôn nhiệt tình giúp

đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Trung tâm Kỹ thuật 3, Viện Pasteur Tp.HCM, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này

Xin cảm ơn Anh đã luôn động viên em để em có thể vượt qua những khó khăn trong cuộc sống

Con cũng xin cảm ơn gia đình đã luôn khuyến khích và hỗ trợ để con có được ngày hôm nay

Trang 3

MỤC LỤC

Lời cảm ơn -i

Mục lục -ii

Danh mục chữ viết tắt - iv

Danh mục Bảng -v

Danh mục Hình - viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1.Vài nét về đối tượng nghiên cứu 5

1.1.1 Hình thái: 5

1.1.2 Sinh thái 5

1.1.3 Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus sản sinh 8

1.1.4 Biện pháp phòng ngừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm: 13

1.2.Tổng quan về Aflatoxin 16

1.2.1 Lịch sử phát hiện aflatoxin [8]: 16

1.2.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hoá của Aflatoxin [8] 16

1.2.3 Sự hiện diện và phát triển của Aflatoxin B1 trong tự nhiên: 17

1.2.4 Tác hại của Aflatoxin: 19

1.2.5 Mức cho phép tối đa của các loại độc tố trong thức ăn chăn nuôi [2]: .24

1.3.Phương pháp phát hiện A flavus 27

1.3.1 Dựa vào đặc điểm hình thái [17], [18]: 27

1.3.2 Dựa trên phương pháp sinh học phân tử [18]: 28

1.4.Đặc tính và ứng dụng Cylodextrin [19] 30

1.4.1 Đặc tính 30

1.4.2 Cấu trúc và tính chất của các cyclodextrin 32

1.4.3 Đặc điểm của phức bao cyclodextrin 33

1.4.4 Ứng dụng của phức bao: 35

1.4.5 Tương tác của cyclodextrin với aflatoxin [12, 15] 35

1.5.Một số khái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực của phương pháp [14].37 1.5.1 Giới hạn phát hiện 37

1.5.2 Độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả 37

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38

2.1 Vật liệu: 38

2.1.1 Chủng chuẩn Aspergillus và mẫu thực phẩm 38

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ chính 39

2.1.3 Môi trường và hóa chất 40

2.2 Phương pháp nghiên cứu 40

Trang 4

2.2.1 Phương pháp chuẩn bị phòng ẩm nuôi cấy mốc [13] 40

2.2.2 Phương pháp định danh nấm mốc theo FAO – 1992 [10] 41

2.2.3 Phương pháp gây nhiễm chủng nấm mốc vào mẫu thực phẩm [14] 41

2.2.4 Phương pháp tách chiết mẫu (đĩa thạch) để phân tích HPLC [11] 44

2.2.5 Phương pháp khảo sát sự phát huỳnh quang của các chủng Aspergillus flavus sinh aflatoxin 44

2.2.6 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện đặc tính sinh aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang .45

2.2.7 Phương pháp xác định giới hạn phát hiện [14] 47

2.2.8 Xác định các thuộc tính của phương pháp [14] 48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51

3.1.Kết quả khảo sát đặc tính sinh Aflatoxin (dựa vào đặc điểm phát huỳnh quang trên môi trường thạch) của một số chủng Aspergillus flavus .51

3.2.Kết quả khảo sát các điều kiện tác động đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A flavus 56

3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A flavus: 57

3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A flavus: 61

3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A flavus: 66

3.2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A flavus: 70

3.2.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A flavus: 74

3.2.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ảnh hưởng của kháng sinh (Chloramphenicol) đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A flavus: 78

3.3.Xây dựng dự thảo phương pháp phát hiện A flavus sinh độc tố Aflatoxin B1 trong ngũ cốc và thức ăn chăn nuôi dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang của Aflatoxin khi kết hợp với cyclodextrin 80

3.4.Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp mới xây dựng .80

3.5.Xác định các thông số phương pháp mới: 85

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 90

4.1.Kết luận 90

4.2.Đề nghị: 90

TÀI LIỆU THAM KHẢO 91

PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG 94

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ KIỂM TRA AFLATOXIN BẰNG HPLC 97

PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH ĐỀ XUẤT 98

Trang 5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 ATCC: American Type Collection Culture: Bộ sưu tập chủng chuẩn của Mỹ

2 FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations: Tổ chức nông

Trang 6

Bảng 1.5 Những quy định về hàm lượng Aflatoxin B1 tối đa trong thức ăn gia súc,

gia cầm ở các nước thuộc EU: - 26

Bảng 2.1 Danh mục các chủng A flavus sử dụng trong nghiên cứu khảo sát chủng

có và không có khả năng sinh độc tố Aflatoxin B1 - 38

Bảng 2.2 Cách sắp xếp tần suất 4 nhóm kết quả: - 50 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát đặc tính sinh Aflatoxin dựa vào đặc điểm phát huỳnh

quang của các chủng A flavus - 54

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra mối tương quan giữa việc sinh Aflatoxin và việc phát

huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc A flavus - 56

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng

phát huỳnh quang của các chủng A flavus có mã số 02 - 58

Trang 7

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả

năng phát huỳnh quang của các chủng A flavus có mã số 02 - 63

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ methyl-β-cyclodextrin đến sự

phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A flavus có mã số 02 - 75

Trang 8

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ảnh hưởng của kháng sinh

(Chloramphenicol) đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng

Bảng 3.23 Kết quả khảo sát các thông số của phương pháp khi phân tích mẫu bằng

phương pháp mới xây dựng và các phương pháp tham chiếu: - 87

Bảng 3.24 Các thuộc tính của phương pháp trên nền mẫu thức ăn dạng hạt - 88

Trang 9

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái nấm mốc A flavus -5

Hình 1.2 Nấm mốc A flavus trên hạt đậu -7

Hình 1.3 Nấm mốc A flavus trên lạc -7

Hình 1.4 Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 (Vitoria, 2001) - 17

Hình 1.5 (a) A flavus trên môi trường AFPA, sau 7 ngày nuôi cấy ủ ở 25ºC, với đặc tính chuyển màu ở mặt sau môi trường thành màu cam - 28

(b) A flavus sinh độc tố Aflatoxin phát triển trên đĩa CCA nhỏ được quan sát dưới đèn UV, sau 7 ngày ủ; đĩa CCA lớn không cấy chủng nấm A flavus - 28

Hình 1.6 Cyclodextrin α, β, γ - 31

Hình 1.7 Cấu trúc không gian của phức bao cyclodextrin với phân tử khách thể - 33 Hình 1.8 Mô hình tương tác giữa cyclodextrin và Aflatoxin dạng HINT/GOLD - 36 Hình 1.9 Bản đồ đường mức cực kỵ nước của AFB1, phần kỵ nước màu xanh lá và phần hiếu nước màu xanh da trời - 36

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình gây nhiễm bào tử nấm mốc vào mẫu - 43

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình xác định giới hạn phát hiện của phương pháp - 48

Hình 3.1 Khuẩn lạc A flavus trên SAB sau 3 ngày - 52

Hình 3.2 Hình thái A flavus (thân nhám) - 52

Hình 3.3 Bào tử A flavus - 52

Hình 3.4 Bọng hình chùy đến cầu A flavus - 52

Hình 3.5 Chủng A oryzae không phát huỳnh quang (trái), nấm A flavus phát huỳnh quang (phải) trên môi trường SAB 0,3% methyl-β-cyclodextrin trong 3 ngày

ở 28oC - 53

Trang 10

Hình 3.6 Chủng A ochraceus không phát huỳnh quang (trái), chủng A flavus phát

huỳnh quang (phải) trên môi trường SAB 0,3% methyl-β-cyclodextrin trong 3 ngày

ở 28oC - 53

Hình 3.7 Chủng A flavus phát huỳnh quang trên cả hai đĩa thạch YES (bên trái

không bổ sung và bên phải có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin) trong 3 ngày ở

28oC - 62

Hình 3.8 Chủng A flavus phát huỳnh quang trên đĩa thạch YES có bổ sung 0,3%

methyl-β-cyclodextrin (phải), không phát huỳnh quang trên PDA có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin (trái) trong 3 ngày ở 28oC - 62

Trang 11

MỞ ĐẦU

Hiện nay, chất lượng thực phẩm được quan tâm nhiều bởi có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người Có rất nhiều mối quan tâm, bên cạnh vấn đề giá trị dinh dưỡng, vấn đề an toàn thực phẩm được đặc biệt chú trọng, trong đó nhiễm các chất gây hại cho người như các độc tố nấm mốc, vi khuẩn, kim lọai nặng, dư lượng thuốc trừ sâu, dư lượng phân bón,…

Trong điều kiện khí hậu nước ta, khí hậu gió mùa, chế độ mưa ẩm cao, điều kiện bảo quản trong các kho nhỏ lẻ chưa được quan tâm gây ảnh hưởng đến chất lượng lương thực thực phẩm cung cấp cho người dân Trong điều kiện như vậy, nấm mốc có thể phát triển sinh độc tố được gọi là độc tố nấm (mycotoxin), gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt là gây ung thư Trong đó, có thể kể đến Aflatoxin B1 (AFB1)

Độc chất Aflatoxin được tạo ra từ các lọai nấm mốc thuộc giống Aspergillus,

mọc trên các loài ngũ cốc, trong đó Aflatoxin B1 (AFB1) chủ yếu do loài

Aspergillus flavus sinh ra có độc tính rất cao (Nabil Saad, 2004; Victoria, 2001;

Roberts, 2002) [8] Các loài động vật, kể cả con người, nếu ăn phải thức ăn có chứa AFB1, hoặc sử dụng nguyên liệu, thức ăn có nguồn gốc từ ngũ cốc bị nhiễm nấm

mốc Aspergillus flavus có thể nguy hại đến tính mạng Trong khi hầu hết các chủng

Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố thì ở Aspergillus flavus sự sản sinh độc tố

Aflatoxin thay đổi theo từng chủng Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sự sản sinh Aflatoxin là kết quả của sự tác động qua lại giữa kiểu gen của chủng đó và điều kiện phát triển của nó [3]

Phương pháp phân tích định danh loài nấm mốc Aspergillus flavus hiện nay

chủ yếu dựa vào các đặc tính hình thái như: Tiêu chuẩn ngành y tế 52 TCN – TQTP

0001:2003: “Thường quy kỹ thuật định danh nấm mốc Aspergillus flavus,

Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus trong thực phẩm” [1] dựa trên các đặc

điểm hình thái khuẩn lạc và đặc điểm tế bào để định danh Tuy nhiên, đối với phương pháp định danh dựa vào hình thái và màu sắc thì rất khó phân biệt với loài

Trang 12

Aspergillus oryzae mà chỉ có các chuyên gia có kinh nghiệm mới phân biệt được hai

loài này Do đó, để kiểm soát được chất lượng nông sản, các nhà quản lý cần kiểm

soát cả hai yếu tố : sinh học - có nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus hay không và

yếu tố hóa học - có nhiễm độc tố Aflatoxin vượt ngưỡng cho phép hay không từ đó

có thể đề xuất những biện pháp kỹ thuật phù hợp nhằm tránh được những nguy hại của các loại ngũ cốc có chứa Aflatoxin

Bên cạnh đó, trên thế giới để kiểm soát chất lượng thực phẩm đã sử dụng

quy trình định lượng nấm mốc A flavus theo hướng dẫn của FAO 1414-1992 chủ

yếu cũng dựa trên đặc điểm hình thái để phân lập định danh [10]

Gần đây, nhóm tác giả Fente C.A., Jaimez Ordaz J., B I., Vázquez C M

(2001) [11] đã nghiên cứu đưa ra phương pháp mới dùng để sàng lọc các chủng

nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng cách thêm cyclodextrin vào môi trường nuôi cấy nấm mốc để kích thích sự phát huỳnh quang của Aflatoxin Sự phát huỳnh quang được quan sát trực tiếp trên môi trường nuôi cấy dưới đèn UV ở bước sóng

365 nm Khả năng phát huỳnh quang của Aflatoxin có được là do sự hình thành cấu

trúc dị vòng 5 bị oxi hóa Cyclodextrin là những phân tử được hình thành do phản

ứng của enzyme cyd – transglycolase lên dextrans Các phân tử cyclodextrin có các kích thước khác nhau [cyclodextrin chứa 6- 8 đơn phân glucose liên kết với nhau bằng liên kết (1-4) do đó chúng được gọi là -, -, or -cyd] Các phân tử này được

dùng để làm tăng khả năng phát huỳnh quang của Aflatoxin

Với cơ sở lý thuyết nêu trên và với mục tiêu xây dựng phương pháp phát hiện

nấm mốc A flavus sinh độc tố Aflatoxin, được sự đồng ý của Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên và cán bộ hướng dẫn khoa học, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Bước đầu xây dựng phương pháp phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trong ngũ cốc bằng phương pháp phát quang”

Trang 13

* Mục tiêu của đề tài:

Xây dựng quy trình phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng

sinh độc tố Aflatoxin nhằm kiểm soát chất lượng ngũ cốc cũng như cung cấp những dẫn liệu khoa học về những sự tồn tại khả năng có hoặc không có sinh độc

tố Aflatoxin để có biện pháp xử lý hiệu quả

* Luận điểm mới của đề tài:

Ở nước ta hiện nay, trong các quy trình phát hiện nấm mốc A flavus dựa trên

đặc điểm hình thái là chủ yếu và do đó chỉ phân biệt được loài mà không phân biệt được khả năng sinh độc tố Aflatoxin của loài đó Vì vậy, điểm mới của đề tài là xây

dựng được phương pháp phát hiện nấm mốc A flavus trong đó có thể phân biệt

được những loài có khả năng sinh độc tố với những loài không có khả năng sinh độc tố

Với đối tượng đã chọn, chúng tôi đã khảo sát các yếu tố tác động đến việc sinh Aflatoxin để đưa ra các điều kiện tối ưu nhằm xây dựng một phương pháp mới

phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin được ghi nhận bằng

việc phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc khi quan sát dười đèn UV ở bước sóng 365nm

Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành đánh giá, xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp mới theo tiêu chuẩn ISO 16140:2003 [14] trên 2 dạng nền mẫu thức

ăn chăn nuôi có cấu trúc khác nhau: dạng hạt và dạng bột làm cơ sở để mở rộng phạm vi áp dụng trên các nền mẫu khác như ngũ cốc dạng hạt và dạng bột…

Trang 14

¾ Ý nghĩa thực tiễn:

- Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và hiệu quả hơn so với các phương pháp nuôi cấy hiện nay

- Việc phát hiện A flavus sinh độc tố Aflatoxin là công cụ quan trọng trong việc

kiểm tra, quản lý chất lượng nông sản, lương thực thực phẩm và thức ăn trong chăn nuôi

* Nội dung nghiên cứu

¾ Sàng lọc các chủng A flavus sinh Aflatoxin dựa trên đặc điểm phát

huỳnh quang

¾ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang của các

chủng A flavus sinh Aflatoxin

¾ Xây dựng dự thảo phương pháp “ Phát hiện Aspergillus flavus sinh

độc tố Aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang”

¾ Xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp

* Nơi thực hiện

- Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4

- Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

* Thời gian thực hiện:

Từ tháng 07/2008 đến tháng 7/2009

Trang 15

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vài nét về đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Hình thái:

Loài Aspergillus flavus rất dễ nhận biết bởi màu vàng hơi lục và dạng ít nhiều vón

cục của tán Ở đỉnh các cuống bào tử đính mọc thẳng đứng, có vách sần sùi, hình

thành những đầu mang bào tử đính có dạng gần hình cầu đến thuôn dài Các thể

chai hoặc đính trực tiếp vào đầu mang bào tử đính (thể bình một lớp) hoặc qua một

lớp thể bình trung gian (thể bình 2 lớp); đôi khi cả hai kiểu đồng thời tồn tại [3]

Hình 1.1: Hình thái nấm mốc A flavus

Các bào tử có kích thước khá lớn (đường kính từ 5-7μm) hình cầu, màu vàng

nâu đến hơi lục, hơi sần sùi Đôi khi người ta chỉ coi là thuộc loài A flavus những

loài nấm có cuống bào tử đính xù xì và hai lớp thể bình, còn ở loài A parasiticus thì

cuống bào tử đính nhẵn và thể bình một lớp [3]

1.1.2 Sinh thái

A flavus được xem là loài được phân bố khắp mọi nơi: dưới đất, trên các

chất hữu cơ, và các loại hạt nhất là các hạt có dầu Từ lâu, người ta đã phát hiện sự

có mặt của nó ở dưới đất, dù là trong rừng, ở vùng than bùn, vùng đất hoang sa mạc

Sahara, hoặc trong đất cày cấy, đất mùn, hệ rễ cà chua, hoặc hệ rễ lúa mì Người ta

còn coi nó là có thể nhanh chóng xâm nhập lại đất đã khử trùng bằng hơi nước Đất

đai vùng nhiệt đới chứa nhiều loài này hơn nhiều so với đất đai vùng ôn đới Nó

thường gặp trên lúa mì, bột, trên các chế phẩm bột sống, trong bánh mì

Trang 16

Ngô gạo cũng như các sản phẩm từ ngô gạo thường chứa loài này Nó có rất nhiều trên sợi bông và nhất là trên hạt bông, nó xâm nhập vào hạt qua các điểm hợp hoặc nhờ những chỗ hủy hoại do côn trùng gây ra Ngoài ra người ta còn thấy nó trên: hạt và khô dầu tương, củi dừa, sắn, nhân hạt ca cao, quả cà phê, quả hồ đào Brazin, thuốc lá, hạt lúa miến, hạt hướng dương, hạt thông, kê, ớt hạt tiêu đỏ, củ cải đường, quả lê, giăm bông, dồi thịt và nhiều thức ăn khác Sự có mặt của các loài này trong các thức ăn phức hợp của gia súc, ngay khi nuôi không có ngô lạc, trên cỏ khô gia súc cũng vậy Nếu có điều kiện thuận lợi, nó sinh sôi này nở rất nhiều; trên lúa mì tồn trữ trong kho kín có độ ẩm 15,2 % đến 17% bào tử của nó chiếm từ 50-100% tổng số bào tử có mặt, nhiều đến nỗi trên mặt kho đóng vón lại thành một lớp vỏ cứng sâu tới 0.6m Nó cũng thường có mặt trên ngô bẹ khi độ ẩm vượt quá 15,5% [3]

Nấm mốc độc Aspergillus flavus gặp nhiều ở các loại lương thực, thực phẩm

khác nhau, nhưng các loại hạt có dầu (đặc biệt là lạc) thích hợp nhất cho sự phát

triển của nó, và cũng ở lạc độc tố Aflatoxin hình thành mạnh nhất Người ta ngiên

cứu hơn 1.000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất độc - 1kg

chứa trên 0,25mg Aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của Aspergillus flavus) và 21,7% số

củ độc vừa, 75% số củ không độc Còn trên khô lạc: 42% số mẫu là rất độc, 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc Như vậy chất độc tích lũy lại trong khô lạc là

do sự chế biến, hoặc do Aspergillus flavus phát triển mạnh lên [3]

Bào tử của nấm A flavus có khả năng phát tán trong không khí, trong nước,

trong đất Đặc biệt khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát sinh phát triển trên lương thực, thực phẩm, hoa quả và thậm chí còn gây hại một số loài cây trồng Vì phạm vi

ký chủ rộng, khả năng phát tán rất lớn nên phòng trừ nấm hại này thường rất khó

khăn Nấm A flavus có thể ký sinh, gây hại các loại lương thực như: lúa, ngô, sắn,

trên một số loại hạt làm thực phẩm như: lạc, đậu, vừng , trên thực phẩm như: các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, lạc, vừng, đậu đỗ,…và thậm chí cả trên hoa quả tươi

bị dập như: thanh long, nhãn, xoài, vải,… Trong quá trình xâm nhiễm, sinh trưởng phát triển, chúng tiết ra độc tố Aflatoxin [3]

Trang 17

Lạc và các sản phẩm từ lạc chắn chắc là nơi phát triển ưa thích nhất của A

flavus Không phải chỉ có duy nhất loài này, nhiều loài nấm khác thường đi kèm với

nó, trong số này một số lớn loài cũng được xem là độc với súc vật : một số loài

Fusarium trong đó có F monoliforme, các loài Rhizopus, các loài Penicillium

Trong gạo có chứa các thành phần hoá học như ở gạo tám glucid: 82,2%, protein: 6,6%, nước:10%, lipid: 1,0%, chất khoáng: 0,4%, vitaminB1: 0,08% Do đó

Trang 18

đây là một môi trường rất thuận lợi cho nấm mốc xâm nhập và phát triển khi biện pháp bảo quản không hiệu quả So với thóc, gạo không còn lớp vỏ trấu để bảo vệ, các chất dinh dưỡng ở lớp ngoài của gạo lại nhiều nên rất dễ bị nấm mốc phá hoại Đặc biệt ở nước có khí hậu nóng ẩm, đây là một điều kiện tốt để cho nấm mốc sinh trưởng gây ảnh hưởng đến chất lượng của gạo Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều loài nấm mốc trên gạo, trong mỗi loài có nhiều chủng, nhưng có hai loài hay

gặp nhất là Aspergillus và Penicilium [4], [6], [7]

1.1.3 Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus sản sinh

Tên Aflatoxin đã được dùng để gọi một hỗn hợp độc tố do Aspergillus flavus

sinh ra trước khi bản chất phức tạp của mỗi hợp chất được biết rõ Thực ra,

Apergillus flavus chủ yếu sản sinh ra Aflatoxin B1 và các Aflatoxin khác có bản

chất hóa học tương tự gọi là Aflatoxin G1, B2, G2 Trong khi hầu hết các chủng

Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố thì ở Aspergillus flavus sự sản sinh độc tố

Aflatoxin thay đổi theo từng chủng Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sự sản sinh Aflatoxin là kết quả của sự tác động qua lại giữa genotype của chủng đó và điều kiện phát triển của nó [3]

1.1.3.1 Các chủng sinh độc tố :

Đã có một số lớn quan sát về tính chất ít nhiều sinh độc tố của nhiều chủng nấm khác nhau: những quan sát này tiến hành trên các cơ chất tự nhiên hoặc trong những điều kiện nuôi cấy nhất định Một số tác giả ghi nhận được nhiều biến đổi

quan trọng về mặt sinh độc tố tùy theo cơ chất, từ đó đã phân lập chủng Aspergillus

flavus và tùy theo nguồn gốc địa lý: trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Mỹ có 94%

số chủng sinh độc tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ lạc, và 71% cũng được phân lập từ lạc như ở Ixraen Các chủng gốc vùng nhiệt đới có nhiều loài sinh độc tố hơn vùng ôn đới [3]

Trang 19

Ngoài ra, số lượng Aflatoxin sản sinh ra cũng thay đổi rất nhiều tùy theo các chủng, người ta đã tìm thấy điều này khi nuôi cấy chúng để so sánh trên cùng một

cơ chất và trong những điều kiện như nhau Người ta đã ghi lại những mức sản sinh

từ một vài mg/kg đến 100, 200, 500, 1000 và thậm chí gần 2000 mg/kg cơ chất Gần đây hơn, ngoài việc định lượng tổng số Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ riêng phần của các Aflatoxin đã biết Nói chung, Aflatoxin B1 được tạo ra nhiều nhất trong cả thiên nhiên lẫn trong nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó là Aflatoxin B2, còn về G2 và các chất khác tỷ lệ thấy khá thấp [3]

Người ta đã thử nhận dạng các chủng sinh độc tố và các chủng không sinh

độc tố qua những đặc điểm hình thái Một số người cho rằng các chủng sinh độc tố

bao giờ cũng có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày, thể bình hai lớp, cuống bào tử đính có vách có gai, ở những chủng sinh độc tố

có sự phình to một số phần của sợi nấm tạo thành những cục nhỏ, những dị thường

đặc trưng cho các dòng sản sinh Aflatoxin Tuy nhiên thường có lẻ rất khó thăm dò biết một cách chắc chắn những chủng có sinh Aflatoxin và những chủng không sinh Aflatoxin ngoài cách dùng con đường sinh học và hóa học [3]

1.1.3.2 Cơ chất và các điều kiện xung quanh để các chủng A flavus sản

sinh aflatoxin :

Các chủng phát triển trên hạt có dầu và nhất là trên lạc và những sản phẩm

từ lạc được ghi nhận sinh đôc tố nhiều hơn các chủng phân lập từ sản phẩm ngũ cốc

ở các nước thuộc địa Các chủng phân lập từ thịt ôi, bánh mì, các thực phẩm bột sống hoặc pho mát ô nhiễm tự nhiên thường không hoặc ít sinh độc tố Ngược lại, gần một phần ba số chủng phân lập từ gia vị có sản sinh Aflatoxin [3]

Tính độc của một số chủng được giảm độc tính nếu sau này các chất độc của chúng được những vi sinh vật khác chuyển hóa thành những chất dẫn xuất không hoạt động Chính vì vậy ở Texas, người ta rất ngạc nhiên khi thấy lạc có vỏ nhiễm

Aspergillus flavus rất nặng nhưng lại có độ độc thấp Nghiên cứu các củ lạc đó, thì

phát hiện có những loài vi khuẩn và nấm có khả năng hoặc ức chế sự hình thành các

Aflatoxin hoặc biến đổi những Aflatoxin được sản sinh ra thành những chất ít độc

Trang 20

hơn Người ta đã dựa trên hiện tượng này để tìm tòi một biện pháp sinh học nhằm tẩy độc các sản vật đã bị hư hỏng [3]

Sản lượng Aflatoxin thường tỷ lệ với trọng lượng hệ sợi nấm tạo thành khi nuôi cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt trị số tối ưu thì sản lượng đó lớn nhất, nhưng

nó giảm sút rất nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự phân giải: sự phân giải này tương ứng với sự phân hủy các Aflatoxin, được đẩy mạnh khi thông khí tốt và lắc mạnh các bình nuôi cấy [3]

Nhìn chung, sự sản xuất Aflatoxin, trong điều kiện nuôi cấy thông thường,

bắt đầu từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của Aspergillus flavus, nó

tăng dần cho đến giai đoạn sinh bào tử mạnh mẻ, tức là khoảng ngày thứ 6 rồi giảm sút [3]

Nhiều yếu tố vật lý và dinh dưỡng khác cũng ảnh hưởng đến hàm lượng Aflatoxin được sinh ra trong điều kiện nuôi cấy và điều kiện tư nhiên Những biến thiên về nhiệt độ có thể thấy trong thiên nhiên, với nhiêt độ ở các đỉnh cao là 45-

50oC cho thấy không thuận lợi cho việc sản sinh Aflatoxin bằng nhiệt độ ổn định ở

25oC [3]

Hàm lượng nước của cơ chất có vai trò trong việc sản sinh Aflatoxin, gắn

liền với sự phát triển tương đối của A flavus, ở 32oC trên lạc có hàm lượng nước

trong khoảng 15 và 30% Aflatoxin hình thành sau 2 ngày Như vậy, trong điều kiện

nhiệt đới, nếu A flavus phát triển trên lạc không có Aflatoxin thì 48h sau có thể

phát hiện được Aflatoxin Trên gạo có hàm lượng nước 24-26% hoặc trên ngô

19-24%, Aflatoxin cũng hình thành nhanh chóng như vậy nếu nhiệt độ khá ấm [3]

Giá trị pH ban đầu có ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành Aflatoxin Giá trị

pH thích hợp để A flavus sinh độc tố aflatoxin ở giá trị pH giữa 4-5 Hàm lượng khí cacbonic tăng lên trong khí quyển làm hạn chế sự sinh trưởng của A flavus do đó

giảm lượng Aflatoxin sinh ra, giảm hàm lượng oxi và tăng hàm lượng nitơ trong khí quyển hàm lượng Aflatoxin cũng giảm [3]

Các Aflatoxin được xem là nhạy cảm với ánh sáng, nhưng thực tế chúng nhạy cảm với tia tử ngoại [3]

Trang 21

Người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu về tầm quan trọng của các

yếu tố dinh dưỡng khác nhau lên sản lượng Aflatoxin thể hiện qua các điều kiện

nuôi cấy khác nhau [3]:

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của chủng A flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh ra

Aflatoxin

Số lượng so sánh (% các

Aflatoxin) Chủng Môi trường

nuôi cấy

Tổng lượng Aflatoxin (mg/l hoặc mg/kg) B1 B2 G1 G2

Trang 22

Nguồn Cacbon :

Nhiều tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm các đường hexose vào

môi trường nuôi cấy chất khoáng lên hàm lượng Aflatoxin do A flavus sinh ra và

ghi nhận các đường glucose, fructose, manose thuận lợi cho sự tổng hợp Aflatoxin

[3]

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên lượng Aflatoxin sinh ra

Nồng độ Glucid

Trang 23

Nguồn đạm [3]:

Sản lượng Aflatoxin cao nhất thu được trên môi trường có tính chất nấm men hoặc có peptone hoăc tốt hơn nữa là có acid amin trong đó glycin hoặc glutamat, alanin và acid aspartic thì kém hơn một ít

Tiamin và các vitamin nhóm B kích thích sự tổng hợp các Aflatoxin

Các ion kim loại [3]:

Sự có mặt của kẽm, catmi, magie hoặc sắt kích thích sự sản sinh Aflatoxin, coban, crom, canxi, mangan chỉ có ít hiệu lực Thêm 3,9 μmol Bari acetate thì sự tạo thành Aflatoxin bị ức chế

1.1.4 Biện pháp phòng ngừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm:

Nước ta có khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, đây là một điều kiện thuận lợi để cho nấm mốc xâm nhập và phát triển gây hại nông sản thực phẩm nói chung và gây hại đến gạo, lạc nói riêng Chúng có khả năng phát triển tốt ở trong các thực phẩm

có độ ẩm trên 10%, đồng thời có khả năng sản sinh ra độc tố gây bệnh Cũng chính

từ đây chúng sẽ lây nhiễm sang người ăn và gây cho người những căn bệnh hiểm nghèo Để hạn chế và loại trừ nấm mốc ra khỏi gạo, lạc cần phải có biện pháp kiểm soát, bảo quản hữu hiệu từ giống, phân bón, đồng ruộng, thu hoạch, vận chuyển, bảo quản, chế biến…[4], [6], [7]

Chúng ta biết nấm mốc hiện diện ở rất nhiều nơi, vì thế trong lương thực thực phẩm, thức ăn gia súc hầu như bào tử nấm mốc đều ở tư thế sẵn sàng chờ "cơ hội", chúng phát triển mạnh nếu có độ ẩm, nhiệt độ môi trường thích hợp

Trang 24

dự trữ an toàn là 13% ẩm độ

9 Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt trong kho:

Người ta nhận thấy có mối liên hệ giữa sự phá hại của sâu mọt, côn trùng trong nguyên liệu và sự phát triển nấm mốc Điều này có thể giải thích bởi 2 lý do:

¾ Hoạt động trao đổi chất của côn trùng, sử dụng chất hữu cơ trong nguyên liệu, hô hấp sinh ra nước làm cho môi trường trữ thức ăn ngày càng ẩm thêm, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển

¾ Côn trùng sâu mọt đục khoét hạt, di chuyển trong nguyên liệu mang trên mình nó những bào tử nấm phát tán nhanh trong nguyên liệu Theo tài liệu FAO (1979) thì côn trùng sâu mọt có thể làm tăng sự phát triển của nấm mốc lên từ 10 - 30%

9 Sử dụng hóa chất để phòng chống nấm mốc xâm nhập vào thức ăn:

Có nhiều chất hóa học khác nhau có thể khống chế sự nhiễm nấm mốc trong thức ăn Hợp chất tương đối an toàn không độc hại và có hiệu lực ngăn chặn sự phát triển nấm mốc trong thức ăn là acid propionic và các muối của nó Theo tài liệu FAO Rome (1979) thì hợp chất này ngăn chặn nấm mốc cho kết quả đầy hứa hẹn

Trang 25

9 Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi ammoniac (NH 3 ):

Sự khử độc bằng ammoniac dưới áp suất cao đã được Dollear và Gardner (1966) thực hiện ở áp suất 1,5 - 3 bars để khử độc bánh dầu phộng và bánh dầu hạt bông Sự phá hủy gần như hoàn toàn Aflatoxin trên đậu phộng được thực hiện trên hạt bông và phương pháp này đã được ứng dụng ở Mỹ năm 1969 như là một phương pháp xử lý bánh dầu, bông vải Ở Pháp kỹ thuật này được thử trên bánh dầu phộng từ năm 1972 bởi Prevol Tuy nhiên phương pháp xử lý này làm tổn hại đến acid amin chứa lưu huỳnh trong thức ăn

9 Làm mất hiệu lực aflatoxin bởi chất hấp phụ bề mặt:

Một giải pháp khác ít tốn kém hơn mà cũng có thể cho kết quả tốt, đó là việc

sử dụng các chất hấp phụ để kết dính độc tố loại thải ra ngoài theo phân, làm giảm thiểu tính độc hại của chúng đối với cơ thể

Nếu thức ăn thường xuyên bị nhiễm độc tố nấm mốc mà không có điều kiện phân tích kiểm tra thì nên sử dụng chất hấp phụ kết dính độc tố là giải pháp dễ thực hiện và cũng có hiệu quả

Có thể lên men các sản phẩm sau thu hoạch theo nguyên lý ức chế các vi sinh vật khác có thể ức chế sinh tổng hợp Aflatoxin hay hấp thu Aflatoxin Có thể dùng các tác nhân vật lý như các tia gamma, tia cực tím và các tác nhân hóa học để chiết tách hay làm thay đổi cấu tạo phân tử của mycotoxin Tuy nhiên các phương pháp này có những hạn chế vì xử lý Aflatoxin kém hiệu quả kinh tế vì chi phí lớn [3]

Trang 26

1.2 Tổng quan về Aflatoxin

1.2.1 Lịch sử phát hiện aflatoxin [8]:

Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là « bệnh gà tây X» (Turkey X disease) Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và chết rất nhiều Qua điều tra người ta xác định được bệnh đó có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra Đến năm 1961, người ta đã tìm ra bản chất

hoá học của chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus

parasiticus Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2

Giữa 4 loại trên thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004)

Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin được sinh ra

bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u gan của động vật

(Dollar et al, 1967 ; Sanchehez, 1994) Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu

về độc tố Aflatoxin Các nhà khoa học cũng đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin :

1.2.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hoá của Aflatoxin [8]

Công thức phân tử của 4 loại Aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2):

Ngoài 4 loại trên, Aflatoxin còn có thêm hai sản phẩm trao đổi chất là Aflatoxin M1

và M2 M1 là 4-hydroxy Aflatoxin B1 và M2 là 4-hydroxy Aflatoxin B2

Trang 27

Công thức cấu tạo của 4 loại aflatoxin như sau:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2

(Vitoria, 2001)

Tính chất lý học của các loại Aflatoxin:

AFB1: có điểm nóng chảy 268-269oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang

AFB2: có điểm nóng chảy 286-289oC, có màu xanh lam trên đèn huỳnh quang

AFG1: có điểm nóng chảy 244-246oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang

AFG2: có điểm nóng chảy 229-231oC, có màu xanh lục trên đèn huỳnh quang

(Aflatoxin Home Page)

1.2.3 Sự hiện diện và phát triển của Aflatoxin B1 trong tự nhiên:

Aflatoxin thường xuất hiện trong các sản phẩm nông nghiệp trên cánh đồng trước khi thu hoạch hoặc sau khi thu hoạch nếu sản phẩm không được phơi khô ngay hay ẩm độ trong sản phẩm cao tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển Trong điều kiện bảo quản không tốt, sản phẩm bị sâu bọ hoặc các loài gặm nhấm đục khoét cũng là điều kiện thuận lợi làm cho sản phẩm bị nhiễm Aflatoxin Đôi khi sữa, trứng, thịt cũng bị phát hiện có Aflatoxin do động vật đã ăn những loại thức ăn

bị nhiễm Aflatoxin Các sản phẩm thường có nguy cơ bị nhiễm Aflatoxin cao nhất

Trang 28

là bắp, đậu phộng và hạt bông (Nabil Saad, 2004) Theo hagazy (1988), ở Ai Cập 32% số ngũ cốc và 6% số loại bột cá đem kiểm nghiệm bị nhiễm Aflatoxin từ 1-50ppb; 8% số ngũ cốc và 16% số loại bột cá bị nhiễm từ 201-2000ppb (trích dẫn

bởi Diab et al, 2000) Ở Indonesia, người ta cũng đã điều tra phát hiện Aflatoxin ở

đậu từ 40 – 4100 ppb và tỷ lệ đậu nhiễm nấm chiếm từ 60-80%, ở bắp là 5,3-291,11

ppb (Sudjadi et al, 1999) Theo Bhatti et al, (2001), trong 3320 mẫu nguyên liệu có

nguồn gốc động vật, thực vật ở Pakistan được kiểm nghiệm đều có chứa Aflatoxin B1 (AFB1) với hàm lượng thấp nhất là 13 ppb và cao nhất là 78 ppb Hầu hết các mẫu cám gạo, cám lúa mì, bột bắp, bột cá, bột hướng dương, bột đậu nành và bột hạt bông đều có hàm lượng AFB1 cao hơn mức khuyến cáo (20 ppb) của tổ chức FDA (Food and Drug Administration, Hoa Kỳ ) [8]

Aflatoxin cũng có thể hiện diện trong các loài thực phẩm chế biến, đặc biệt là các sản phẩm từ bắp Tuy nhiên, các nhà sản xuất cũng có những phương pháp thích hợp nhằm hạn chế tối đa loại độc tố này Những sản phẩm từ sữa bột, phomai, sữa chua đôi khi cũng phát hiện có Aflatoxin [8]

Nấm mốc sinh ra độc tố thường phát triển trong điều kiện tự nhiên ở những quốc gia vùng nhiệt đới Điều kiện dự trữ thức ăn và nguyên liệu thức ăn không thích hợp khi nhiệt độ môi trường trên 27oC, độ ẩm môi trường lớn hơn 62% và độ

ẩm trong thức ăn lớn hơn 14% (Juli-Anne and Yanong, 1995; Diab, 2000; Nabil Saad, 2004) và sự sâm nhập của sâu bọ là những nhân tố quan trọng nhất để nấm mốc phát triển và sinh ra độc tố Aflatoxin [8]

Những phương pháp chế biến thông thường không làm giảm Aflatoxin trong thức ăn do phân tử Aflatoxin rất bền với nhiệt, Aflatoxin chỉ bị nóng chảy ở nhiệt

độ rất cao, trên 250oC (Gayatri, 2000) [8]

Trang 29

1.2.4 Tác hại của Aflatoxin:

* Tính chất gây ung thư của các u gan liên quan đến các Aflatoxin [3]:

Vấn đề được đặt ra là tìm hiểu các u gan do Aflatoxin gây ra có bản chất ung thư thật không

Theo định nghĩa, các đặc điểm của ung thư là phải mang những tính chất vô

tổ chức, thâm nhiễm và có di căn Một sự tăng sinh bất bình thường các tế bào có thể dẫn đến hoặc là một u lành, gồm những tế bào giống hệt nhau, không có tính chất tràn lấn hoặc là một u ác tính gồm những tế bào tăng sinh vô tổ chức, tế bào này phát triển hơn tế bào kia, gạt các tế bào bên cạnh ra, thâm nhiễm vào tận các tổ chức bên cạnh, ngoài ra từ trung tâm chính có những tế bào tách ra, mượn đường các mạch máu và mạch limpho, tràn lấn các tuyến và tạo nên những trung tâm mới (gan, xương ) Trường hợp ung thư gan việc chẩn đoán sẽ dễ dàng nếu khối u có những di căn, hoặc có thể cấy sang một cơ quan khác Khi thiếu 2 tiêu chuẩn đó, thì phải dùng các tiêu chuẩn nhìn mắt thường và qua kính hiển vi Trước hết, về kích thước, người ta đề nghị một hòn nhỏ phải có đường kính tối thiểu là 1cm, khó mà khẳng định là có ung thư hay không khi các hòn nhỏ trong gan bé hơn thế nhiều Sau đó phải xuất huyết và hoại tử Về mặt mô học phải quan sát thấy một sự xâm nhập khu vực, một sự biến hình tế bào, sự mất tính phân cực và nhiều dạng gián phân Kiểu tổn thương này đã được gọi là u gan Ở đây có chỗ dễ nhầm lẫn bởi vì trong khi một số tác giả dành thuật ngữ này cho các u gan ác tính thì số khác lại dùng nó cho các tổn thương gan lành

* So sánh với tác động của Aflatoxin với những chất gây ung thư gan khác [3]:

Các tổn thương do các Aflatoxin (với liều lượng 3-4 mg/kg) về nhiều mặt, gần gũi với các tổn thương và những chất gây ung thư gan quen thuộc khác gây nên Ngoài sự tăng sinh các tế bào nhu mô lớn, chứng xơ hóa do các tác động của các Aflatoxin cũng giống chứng xơ hóa mà người ta đã thấy ở các ung thư khác

Trang 30

Do tác dụng của 4-dimetylaminoazobenzen, người ta thấy ở giai đoạn đầu của thể ác tính có sự tăng sinh hệ thống mật, những hòn nhỏ tái sinh và một vài tế bào nhu mô lớn

Nếu đem so sánh các biến đổi đó với các biến đổi do các tác nhân khác độc với gan gây ra:

• Dưới tác động của cacbontetraclorua, những biến đổi mô học nhanh chóng diễn ra, 18 giờ sau khi nhiễm độc, đã thấy rõ các vết hoại tử chúng ở trung tâm tiểu thùy (chứ không ở ngoại vi) Các tổn thương đó không làm rối loạn kiến trúc ở gan

• Chất dimetyl-nitrozamin (DMN) cũng gây những tổn thương ở trung tâm tiểu thùy, đặc trưng bởi những điểm hoại tử chảy máu, xảy ra vài giờ sau khi

có tác động của tác nhân gây độc Người ta đã chứng minh rằng, chất DMN tác động như là một chất ankyl hóa: khi nhiễm độc mãn tính nó gây ra ung thư mạnh

• Chất xiacin chiết từ hạt cây tuế Cycas circinalis, cũng có khả năng gây ung

thư gan khi nhiễm độc mãn tính Khi nhiễm độc cấp tính nó gây ra những tổn thương ở tiểu thùy rất giống các tổn thương của DMN cũng là những khối u

ở thận

• Các ancaloit của cỏ lưỡi chó Senecio, như chất laziocacpin và chất retrocxin

gây ra ở chuột, khi nhiễm độc cấp tính hoại tử giữa tiểu thùy, nhưng khi liều lượng đổi đi một chút thì gan không thể trở lại trạng thái bình thường

• Tất cả những tác nhân độc với gan đều gây ra những biến đổi ở giữa tiểu thùy Tuy nhiên một số khá ít chất gây hoại tử quanh cửa như các hoại tử thu được với Aflatoxin Các rượu alylic, chất mangan, chất photpho thuộc loại

đó nhưng chưa chứng minh được là chất gây ung thư

• Trong những tổn thương gan do chất spordesmin gây ra, người ta thấy tăng tính thấm nước ở mao mạch: Aflatoxin có tính chất tương tự nhưng cho đến lúc này Aflatoxin vẫn chưa được cho là chất gây ung thư

Trang 31

* Kết luận về khả năng gây ung thư của các Aflatoxin [3]:

Tất cả các chất gây ung thư đều sản sinh ra cùng một dạng khối u Với Aflatoxin gây bệnh chủ yếu trên tế bào gan ít nhiều có phân hóa, có sinh những di căn và thỉnh thoảng có ung thư túi mật, cũng có di căn Trong một số trường hợp những di căn như vậy có thể lan tới phổi

Có thể thấy trong khối u đủ mọi loại tế bào, từ những tế bào nhu mô phân hóa rõ rệt qua các ung thư túi mật đến những ung thư giảm biệt hóa

Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư mạnh nhất tác động qua đường miệng Nếu hấp thu một tổng lượng 2,5mg Aflatoxin trong thời gian 89 ngày

sẽ đưa đến ung thư gan sau hơn một năm Nếu so sánh các liều lượng có thề hình thành ung thư trong những điều kiện giống hệt như nhau người ta thấy rằng một liều Aflatoxin ít hơn 1000 lần so với chất nhuộm màu azoic đã đủ để gây ung thư

Những người Bantou, ở Transvaal, ở Swaziland và ở khắp vùng Nam phi nơi

mà người ta ăn nhiều lạc có mốc A flavus con số ung thư gan rất lớn Những điều

quan sát thấy ở Mazambic và ở Uganda lại còn đáng lo ngại hơn: người ta đã ghi nhận các trường hợp ung thư gan ở Mazambic còn nhiều hơn ở Hoa Kỳ đến 58 lần Mỗi năm cứ 100000 người dân các nước như Hà Lan, Na uy hoặc Canada thì có một người ung thư gan còn ở Bantou cứ 103,8 người, ở Nam Phi 19,2 người, ở Nigieria 9,8 người và ở Hawai 9,7 người thì có một người bị ung thư gan Năm

1970, ở Uganda một thanh niên người Phi bị chết : anh ta bị phù phổi to tim và bị hoại tử giữa tiểu thùy khuếch tán ở gan Đó là triệu chứng thường gặp trong các trường hợp bệnh do độc tố Aflatoxin, đồng thời các người trong gia đình cũng bị đau bụng dữ đội mà thực phẩm chủ yếu của họ là sắn có chứa tới 1,7mg/kg Aflatoxin

Trang 32

* Các ảnh hưởng về mặt hóa sinh học của các Aflatoxin [3]:

Nhiều công trình nghiên cứu đã được tiến hành nhằm làm sáng tỏ phương thức tác động hóa sinh tác động lên các thành phần cấu tạo tế bào và nhất là lên các chất nucleic acid và lên sự chuyển hóa các protein Tác động của Aflatoxin B1 giống với chất actimomicin D

Aflatoxin có thể coi là một chất ức chế các quá trình sinh tổng hợp : liều lượng cao có thể gây ức chế hoàn toàn nhưng liều lượng nhẹ có thể cho những kết quả tiệm tiến

Các giai đoạn kế tiếp nhau của tác động hóa sinh học của Aflatoxin ở các tế bào gan mà mỗi giai đoạn là kết quả của giai đoạn trước

• Tác động qua lại với các DNA và ức chế các polymerase chịu trách nhiệm tổng hợp DNA và RNA

• Đình chỉ sự tổng hợp DNA

• Tiêu giàm sự tổng hợp RNA và ức chế RNA truyền tin

• Xuất hiện những hình thái hạt nhân

A flavus phát triển mạnh trên các thức ăn giàu đạm thực vật, nhất là các loại

thức ăn giàu đạm thức vật như lạc, đỗ tương… và còn thấy nhiều ở ngô, cám gạo Trong quá trình phát triển, chúng sản sinh ra độc tố Aflatoxin M, Aflatoxin B1 gây suy thoái miễn dịch, ngăn cản sự sản sinh kháng thể Vì vậy, ở các cơ sở chăn nuôi

gà, nếu sử dụng thức ăn có nhiễm độc tố này, chắc chắn sẽ xảy ra dịch bệnh truyền nhiễm mặc dù đã tiêm phòng tốt các loại vacxin đó

Trang 33

Sự mẫn cảm của Aflatoxin đối với từng loài rất khác nhau và được chia làm

Ngộ độc Aflatoxin được chia làm hai thể sau:

• Thể cấp tính: Gan biến đổi, màu nhạt, hoại tử, xuất huyết, … và viêm cầu thận nặng

• Thể mạn tính: Con vật bỏ ăn, chậm lớn, gầy yếu, lông xơ xác Mổ khám thấy gan biến đổi nặng nhất như: xơ gan, có các khối u hoặc gan nhiễm mỡ, thoái hóa, xuất huyết, hoại tử

Không có phương pháp điều trị đặc biệt cho gia súc, gia cầm bị ngộ độc độc

tố do loại nấm này sinh ra, vì vậy điều quan trọng là cần chú ý loại bỏ thức ăn bị mốc có chứa Aflatoxin

Trang 34

1.2.5 Mức cho phép tối đa của các loại độc tố trong thức ăn chăn nuôi [2]:

9 Những qui định của Việt nam:

Qui định về độc tố Aflatoxin B1 và Aflatoxin tổng số của Việt Nam do Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn ký ngày 31/10/2001, Số 104/2001/QĐ/BNN như sau:

Bảng 1.3 Qui định hàm lượng tối đa độc tô nấm mốc Aflatoxin B1 và tổng hàm

lượng các Aflatoxin (B1+B2+G1+G2) được tính bằng mg trong 1 kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc gia cầm (ppb):

Loại vật nuôi Aflatoxin B1

Bò nuôi lấy sữa ≤ 20 ≤ 50

- Đối với các loại vật nuôi còn nhỏ ở độ tuỗi từ 1-28 ngày rất mẫn cảm với Aflatoxin, do đó hàm lượng tối đa độc tố Aflatoxin B1 trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh phải nhỏ hơn 20 ppb; đặc biệt đối với vịt con, trong thức ăn không

được chứa Aflatoxin B1

Trang 35

9 Những quy định của Mỹ về độc tố aflatoxin trong thức ăn và thực

Mọi thức ăn (người), trừ sữa B1+B2+G1+G2 20 TLC, HPLC

Sữa (làm thực phẩm cho người) M1 0,5 TLC, HPLC

Thực liệu thức ăn gia súc khác B1+B2+G1+G2 20 TLC, HPLC

Hạt bông vải làm nguyên liệu

thức ăn cho bò thịt, heo, gia cầm B1+B2+G1+G2 300 TLC, HPLC

Bắp và khô dầu phộng (cho bò,

heo, gia cầm trưởng thành vỗ

Bắp cho heo vỗ béo B1+B2+G1+G2 200 TLC, HPLC

- Trong các loại thức ăn trên, sữa là sản phẩm có mức cho phép Aflatoxin rất thấp:

0,5ppb; tiếp đến là thức ăn cho người, thức ăn gia súc, bắp cho thú non và bò sữa

có mức cho phép Aflatoxin: 20 ppb; các loại thức ăn khác ở mức cho phép 100

-300ppb

Trang 36

9 Những quy định của châu Âu về độc tố aflatoxin:

Bảng 1.5 Những quy định về hàm lượng Aflatoxin B1 tối đa trong thức ăn gia súc,

gia cầm ở các nước thuộc EU:

Các loại nguyên liệu, thức ăn động vật Hàm lượng (mg/kg) tối

đa trong thức ăn quy về

độ ẩm 12%

Các loại thức ăn đơn chất: 50

Thức ăn hỗn hợp cho bò, cừu (ngoại trừ bò sữa, bê và

Thức ăn hỗn hợp cho heo và gia cầm (ngoại trừ heo

con và gia cầm non)

20

Các loại thức ăn hỗn hợp khác còn lại 10

Thức ăn bổ sung cho bò, cừu, dê (ngoại trừ cho bò

sữa, bê và cừu non)

50

Thức ăn bổ sung cho heo, gia cầm (ngoại trừ thú non) 30

Những thức ăn khác còn lại đặc biệt là bò sữa 10

Nguyên liệu thức ăn đơn khác như: (đậu phộng, B/d

phộng, B/d dừa, B/d cọ, B/d bông vải và sản phẩm chế

Trang 37

1.3 Phương pháp phát hiện A flavus

1.3.1 Dựa vào đặc điểm hình thái [17], [18]:

Việc phát hiện nấm mốc A flavus thường dựa vào đặc điểm hình thái Nếu

phân loại đến giống thì rất dễ nhận biết dựa vào cuống đính bào tử, nhưng để phân biệt đến loài thì rất phức tạp, thường dựa vào các đặc điểm sau:

+ Đặc điểm đại thể: bao gồm màu sắc bào tử và sợi nấm, đường kính khuẩn

lạc, màu sắc khuẩn lạc thay đổi, sự tạo sắc tố của các giọt tiết

+ Đặc điểm vi thể: phần lớn dựa vào sự sắp xếp, hình dạng và kích thước của

bọng, bào tử và hình thái cuống, sự hiện diện tế bào Hülle, và hình thái của nang bào tử Hơn nữa, tất cả các đặc điểm hình thái phải được xác định trong điều kiện phòng thí nghiệm chuẩn được thực hiện bởi các chuyên gia phân tích nấm để có thể nhận diện chính xác

Thông thường, người ta thường dựa vào một số môi trường nuôi cấy chọn lọc cho nấm như Czapek Dox agar, Potato Dextrose Agar, Malt Extract Agar để nhận diện nấm mốc hoặc sử dụng một số môi trường khác như: để nhận diện nhóm

A flavus dựa trên đặc tính chuyển hóa màu môi trường ở mặt sau đĩa thạch sang

vàng cam đối với môi trường Aspergillus flavus and Aspergilus parasiticus agar

(AFPA) và Coconut cream agar (CCA) dùng để phát hiện những chủng sinh Aflatoxin, sự tạo Aflatoxin được phát hiện bằng cách quan sát huỳnh quang màu xanh lam dưới đèn UV

Trang 38

Hình 1.5 (a) A flavus trên môi trường AFPA (Aspergillus flavus and Aspergilus

parasiticus agar), sau 7 ngày nuôi cấy ủ ở 25ºC, với đặc tính chuyển màu ở mặt sau

môi trường thành màu cam

(b) A flavus sinh độc tố Aflatoxin phát triển trên đĩa CCA (Coconut

cream agar) nhỏ được quan sát dưới đèn UV, sau 7 ngày ủ; đĩa CCA lớn không cấy

chủng nấm A flavus

1.3.2 Dựa trên phương pháp sinh học phân tử [18]:

Phương pháp sinh học phân tử được áp dụng rộng rãi để nhận diện các loài

A flavus Phần lớn thường sử dụng trình tự DNA mục tiêu là một trong những phức

rDNA, thường là vùng ITS1 and ITS2 bên trong vùng phiên mã và vùng thay đổi ở đầu 5’ vùng D1-D2 của 28S rRNA

Tuy nhiên, các loài thuộc nhóm A flavus rất khó phân biệt dựa vào trình tự gen Các loài A flavus, A parasiticus, A oryzae and A sojae có trình tự tương đồng

cao và kích thước cũng tương tự nhau, trình tự DNA của chúng tương đồng từ 91 đếm 100% Nhưng, kỹ thuật phân tích Random Amplified Polymorphic DNA

(RAPD) có thể phân biệt được 2 loài A parasiticus and A sojae

Do đó, để nghiên cứu A flavus, hoặc để so sánh A flavus với các loài

Aspergillus khác và thậm chí nghiên cứu sự khác biệt về đặc tính sinh Aflatoxin,

Trang 39

nhiều vùng phức hợp rDNA và các gen liên quan đến quá trình sản sinh Aflatoxin

đã được thử nghiệm dùng làm markers với những mức độ thành công khác nhau Một số nghiên cứu dựa trên kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) dùng để phân tích sự khác biệt trên trình tự được khuếch đại Nhưng sự khuếch đại trình tự mục tiêu của PCR phải được thực hiện thêm bằng kỹ thuật Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP), Single-Strand Conformation Polymorphisms (SSCP) thì mới dễ dàng phân biệt A flavus với các loài khác dựa trên đoạn 600bp

tương ứng với vùng khuếch đại ITS1/5.8S/ITS2 với cặp mồi ITS1-ITS4 Một số tác giả cho rằng khi sử dụng trình tự khuếch đại lớn kết hợp với phân tích PCR-SSCP

có thể loại bỏ được khó khăn lớn khi có sự thay đổi về mặt chủng loại Tuy nhiên, những phân tích này không phân biệt được những chủng có sinh Aflatoxin và không

sinh Aflatoxin Chang và cộng sự (1995) đã tìm thấy gen aflR để có thể nhận biết chủng A flavus và A parasiticus, nhưng Somashekar và công sự (2004) có thể phân biệt được riêng biệt 2 chủng A flavus và A parasiticus dựa trên kỹ thuật RFLP bằng cách dùng enzyme cắt giới hạn PvuII Multiplex PCR, sử dụng nhiều cặp mồi

để nhận diện vùng mục tiêu là bước tiến nhằm phân biệt các loài này và đã thành

công khi sử dụng aflR, ver-1, omt-1 and nor-1 genes Nhưng phương pháp này

không phân biệt được những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin

Để phân biệt được những chủng sinh độc tố hay không sinh độc tố Aflatoxin phải sử dụng phương pháp reverse transcription PCR (RT-PCR) để xem sự biểu hiện của gen sản sinh Aflatoxin dựa vào các gen liên quan đến quá trình điều hòa và gen cấu trúc trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin Scherm và cộng sự (2005) đã

nghiên cứu trên 13 chủng ở cả 2 loài A flavus và A parasiticus và tìm thấy 3 gen (aflD, aflO [syn dmtA=omtB] and aflP [syn omtA]) có thể sử dụng để phát hiện khả

năng sinh Aflatoxin và được sử dụng làm marker để nhận diện chúng

Do đó, thật khó để phân biệt được chủng A flavus với các loài tương tự như

A nomius and A parasiticus Người ta thường phải kết hợp nhiều phương pháp

khác nhau mới có thể nhận diện và phân biệt chính xác các loài có khả năng sinh Aflatoxin

Trang 40

1.4 Đặc tính và ứng dụng Cylodextrin [19]

1.4.1 Đặc tính

Cyclodextrins đã được biết trong nhiều thập niên qua, vào năm 1881, Villiers

đã sản xuất ra cyclodextrin đầu tiên bằng cách cho Bacillus amylobacter phân hủy

tinh bột và năm 1993, Schardinger chứng minh được cấu trúc vòng của các hợp chất này

Sự thủy phân tinh bột bằng enzyme tạo ra một chuỗi các đơn phân mạch thẳng hoặc nhánh như là glucose, maltose, maltotriose, v.v được biết như là các dextrins Đây là một quá trình thủy phân tinh bột thật sự, khi sản phẩm đầu tiên được cắt ra từ nối glycosidic tương tác với một phân tử nước Tuy nhiên tinh bột được thủy phân bởi enzyme cyd-glucosyltransferase (CGTase), sản phẩm đầu tiên của chuỗi cắt trãi qua quá trình phản ứng bên trong phân tử mà không có sự tham gia của nước và sản phẩm vòng có nối α-1,4 được hình thành Các sản phẩm này là các cyclodextrin (Szejtli, 1988) Các enzyme chuyển hóa glucose đối tạo thành các

cyclodextrin được tạo ra bởi nhiều vi sinh vật như Bacillus macerans, hoặc

B.circulans (Francis và cộng sự, 2002)

Cyclodextrin là các đại phân tử gồm các đơn vị đường glucose Cyclodextrin thường tạo thành dịch đường trong nước Cyclodextrin thường chứa 6, 7, hoặc 8 glucopyranose

Như vậy hoạt hóa tạo vòng là một trường hợp riêng của hoạt tính không cân xứng Giả thuyết được đặt ra là enzyme này có hai trung tâm: một trung tâm chịu trách nhiệm gắn kết chất cho và một trung tâm chịu trách nhiệm gắn kết chất nhận nằm ở điểm khoảng cách 2 đơn vị glucose Sự thủy phân sẽ xảy ra sau khi đã

“chuyển glucose” đến tận gốc glucose không khử tận cùng CGTase có khả năng xúc tác chuyển hóa các mạch thẳng của tinh bột thành các phân tử mạch vòng, chủ yếu là cyclodextrin α, β, γ chứa 6, 7, 8 đơn vị glucose được liên kết bằng liên kết α-1,4 Các chuỗi amilose dài không phải là cơ chất tốt nhất của enzyme này Người ta thấy lượng cyclodextrin thu được cao nhất khi phân tử amilose được phân giải thành các chuỗi có mức độ trùng hợp dưới 100 và có lẫn amilopectin Điều này cho

Tiêu đề	Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang
Tác giả	Võ Thị Thanh Trang
Người hướng dẫn	TS. Lý Thị Thanh Loan
Trường học	Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Sinh học
Thể loại	Luận văn thạc sĩ sinh học
Năm xuất bản	2009
Thành phố	Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	109
Dung lượng	1,84 MB