báo cáo ''''đánh giá các đặc tính probiotic của bacillus trong ống nghiệm phân lập từ cháo lên men tự nhiên từ vùng mông cổ

Đặc tính chức năng của các loại thực phẩm ngũ cốc lên men truyền thống dựa trên liên kết chặt chẽ giữa vi sinh vật có lợi và vi khuẩn Bacillus đã chứng minh là gây một tác dụng đồng lên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỦA TRUNG QUỐC

GV hướng dẫn: Thầy Nguyễn Văn Minh

Cô Dương Nhật Linh

Nhóm sinh viên:

Ngô Văn Quang 30700406

Hồ Sơn Hải 30700106 Văn Đặng Hồng Cẩm 30700035 Thái Duy Tân 30700442 Nguyễn Anh Tôn 30700536 Đào Minh Thịnh 30660234

TPHCM, ngày 29 tháng 9 năm 2010.

MỤC LỤC

Danh mục các bảng 3

Lời mở đầu 4

Phần 1: Probiotic 5

I Khái niệm, các định nghĩa :………5

1 Giới thiệu về probiotic:……….5

2 Các định nghĩa:……….6

II Tính an toàn của probiotic:……….6

1 Tính an tòan về probiotic trước đây và sau này:………6

2 Tính an tòan về probiotic trên động vật:………8

3 Tính an tòan về probiotic trên người:………9

4 An tòan của vi khuẩn đề kháng kháng sinh:……… 10

5 Nghiên cứu lâm sàng:………11

6 Giám sát dịch tễ học:……….11

Phần 2: Đánh giá các đặc tính probiotic của Bacillus trong ống nghiệm phân lập từ cháo lên men tự nhiên ở Inner Mongolia của Trung Quốc 12

I Giới thiệu 12

II Nguyên liệu và phương pháp 13

1 Phân lập Bacillus từ cháo lên men tự nhiên……… 13

2 Nhận dạng 16 rDNA……… 13

3 Thử nghiệm hoạt động kháng khuẩn……….15

4 Các thử nghiệm khuếch tán agar……… 15

Phần 3: Kết quả và thảo luận 16

I Sự cô lập và nhận diện của vi khuẩn Bacillus bằng kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA………16

II Hiệu quả của việc mô tả khả năng vận chuyển của tế bào thực vật của Bacillus……… 17

III Sự đề kháng muối mật………18

IV Hoạt tính kháng sinh……… 19

V Kết luận………20

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bàng 1 Một số vi khuẩn sử dụng làm probiotic và có khả năng gây bệnh

Bảng 2 Nhận dạng và phân loại 33 chủng Bacillus phân lập từ cháo lên men tự nhiên

ở Inner Mongilia dựa trên trình tự 16S rDNA

Bảng 3 Tỷ lệ sống sót của các chủng Bacillus phân lập được lựa chọn từ cháo lên

men tự nhiên ở Inner Mongolia trong môi trường nuôi cấy ở pH 2.5 và dịch

dạ dày nhân tạo ở pH 2.0

Bảng 4 Khả năng chịu mật của 4 chủng Bacillus được chọn

Bảng 5 Khả năng chịu mật của Bacillus licheniformis IMAUB1002 ở mức độ mật

khác nhau

Bảng 6 Vùng ức chế (mm) của 4 chủng Bacillus được chọn

Probiotics thường được sử dụng như là chất bổ sung hữu hiệu đối với động vật bằng cách cải thiện các vi khuẩn ký sinh đường ruột “cân bằng” (Fuller 1992) Hiện tại không

có lớp chung cho vi khuẩn probiotic và các loại hình thương mại nhất hiện có là vi khuẩn acid lactic và vi khuẩn bifidus (Kleerebezem and Vaughan 2009) Có nhiều nghiên cứu

tập trung vào Bacillus spp, Bifidobacteriumspp cho thực phẩm chức năng sử dụng chế phẩm sinh học (Kabir et al 1997; Singh et al 1997) Ngoài ra, một số chủng Bacillus

cũng cho thấy tiềm năng để có probiotic (Cavazzoni and Adami 1993; Kumprecht and Zobac 1996)

Cháo lên men tự nhiên (acidic-guel), một thực phẩm lên men truyền thống ở Inner Mongolia của Trung Quốc, có thể sử dụng như là nguồn tiềm năng để cô lập probiotics

Nó được sản xuất tại hộ gia đình từ nguyên vật liệu ngũ cốc khác nhau như: cỏ đuôi chồn, hạt kê và gạo Hạt kê và gạo được lên men tự nhiên bởi nước bã canh chua trong một bình ở nhiệt độ phòng để qua đêm và sau đó được sử dụng để nấu cho đến khi chín

Do đó, cháo lên men được làm đồ ăn với cả hai hương vị thú vị và có chức năng nâng cao sức khỏe

Bacillus là một chi của vi khuẩn hình que và là chi của bộ phận Firmicutes Bacillus

là một loài vi khuẩn hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi, và xét nghiệm dương tính đối với enzyme catalase (Turnbull 1996) Bacillus được xem là dễ dàng lây lan từ môi trường tự nhiên qua nhiều loại thức ăn thực vật (Roberts et al 1982) Một số chủng vi khuẩn

Bacillus đã được phân lập từ các loại thực phẩm lên men truyền thống bao gồm ngũ cốc

khác nhau, họ đậu và thực vật dựa trên các loại thực phẩm lên men (Gadaga et al 1999; Roy et al 2007; Valero et al 2007) Đặc tính chức năng của các loại thực phẩm ngũ cốc lên men truyền thống dựa trên liên kết chặt chẽ giữa vi sinh vật có lợi và vi khuẩn Bacillus

đã chứng minh là gây một tác dụng đồng lên men với các vi sinh vật khác (Blandino et al 2003; Mante et al 2003)

So với loài lactobacillus mà chủ yếu nhạy cảm với điều kiện sinh lý bình thường,

một số chủng trực khuẩn có thể tồn tại ở nhiệt độ cao, độ chua của dạ dày và các axít mật

toàn cho con người (Endres et al 2009) Hơn nữa, Bacillus subtilis (Hong et al 2009) đã

được phân lập từ đường tiêu hóa của con người và hội sinh ở ruột Do đó, trực khuẩn chothấy một cái mới lạ và nguồn đầy hứa hẹn của các vi khuẩn probiotic

Probiotic được định nghĩa là vi sinh vật sống có thể chống lại dạ dày, mật, và tuyếntụy tiết ra (Del piano et al 2006) Những đặc điểm có thể được quan sát trong ống nghiệm

và có thể được sử dụng để lựa chọn các chủng (Salminen và Wright von et al.1998) Mụctiêu của nghiên cứu để đánh giá tính chất tiềm năng probiotic (kháng pH thấp, dịch dạdày mô phỏng, muối mật và hoạt tính kháng khuẩn) của một số trực khuẩn phân lập từcháo lên men tự nhiên trong ống nghiệm với một nỗ lực để đưa vào danh sách có thể sửdụng được trong y học như là probiotics

Phần 1: PROBIOTIC

I Khái niệm, các định nghĩa về probiotics:

1.Giới thiệu về probiotic:[1]

Theo (Fuller,1922) , probiotic là những vi khuẩn sống mà nó có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng cách cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột và có lợi cho vật chủ Định nghĩa này được mở rộng ra probiotic bao gồm cả một vi khuẩn hay một hệ vi khuẩn sống được dùng cho người hay động vật ảnh hưởng tích cực đến vật chủ bằng cách cải thiện tính chất hệ vikhuẩn đường ruột giúp cho dễ tiêu hóa ,chúng cũng tác động trực tiếp đến hệ tiêu hóa Trong giới hạn của sự nghiên cứu , probiotic có giới hạn rõ ràng là hệ vi khuẩn chỉ phù hợp với một hoặc một vài sản phẩm (theo WHO, 1994)

Về lịch sử thì vi khuẩn và nấm men rất có ích trong nông nghiệp và khoa học dinh dưỡng Ví dụ phổ biến như là sử dụng vi khuẩn (chủ yếu là vi khẩn Lactic) cho những sảnphẩm lên men như cải bắp (món dưa cải) và những sản phẩm lên men từ sữa như sữa

chua, ngoài ra còn có phomat và kefir Còn nấm men (chủ yếu là Saccharomyces

cerevisiae) cho sản phẩm như bánh mì, bia và rượu.

Hệ thống nghiên cứu trong probiotic cho người bắt đầu sử dụng vào thế kỉ 20

Elie Metchnikoff là nhà sinh học Nga người mà làm việc vào khoảng 1900 ở Institut Pasteur tại Pháp học được sự màu nhiệm, kỳ vọng có đời sống thọ của người Cô –đắc ở Bungari Ông ấy kỳ vọng vào việc nâng cao tuổi thọ lên 115 năm và họ đã sử dụng nhiều

sản phẩm lên men từ sữa Ông tìm ra tên thích hợp cho sự lên men Bacillus bulgaricus và sau đó phân loại là Lactobacillus bulgaricus mà được sử dụng lần nữa giúp giảm được

bệnh đau dạ dày ở người sớm vào năm 1920

Có một chủ đề hấp dẫn về probiotic trong suốt 10 năm từ 1960-1970 khi họ đã tái phát hiện khoa học dinh dưỡng ở người và động vật Sản phẩm có hiệu lực đầu tiên về khoa học dinh dưỡng trên động vật là đáp ứng nhu cầu đặc trưng là chất cho thêm vào thức ăn của động vật Không xuất hiện ở thị trường châu Âu cho tới giữa 1980

Ngày nay, nguồn khoa học dinh dưỡng hiện đại ở động vật có sự xuất hiện đầy đủ những định nghĩa của probiotic bao gồm nhóm vi khuẩn Lactic, bào tử Bacillus và nấm men

2 Các định nghĩa:

Probiotic là những vi sinh vật như vi

khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ (Parker, 1974)

Định nghĩa của Guamer và Schaafsma (1998):

" những vi sinh vật sống, nếu được đưa vào có thể với một số lượng đủ có thể đem lại sức khoẻ cho người sử dụng”

Định nghĩa của FAO/WHO[4]: “Probiotic là những vi thể

sống mà với số lượng được kiểm soát hợp lý sẽ giúp bồi bổ sức khoẻ cho người tiếp nhận”

Vậy: Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men nếu được đưa vào cơ thể với số lượng được kiểm soát hợp lí sẽ đem lại sức khỏe cho người sử dụng

Ngoài ra, chúng có thể được thêm vào sản phẩm lên men sữa, và cũng góp một phần trong việc hình thành sản phẩm lên men, hoặc được bổ sung dưới dạng bột đông khô

II Tính an toàn của probiotics:

1 Tính an toàn về probiotic trước đây và hiện nay:[2]

Hiện tại, thông thường probiotic có lợi ích chung là bảo vệ hệ đường ruột và cải thiệnkhả năng tiêu hóa Những chủng vi khuẩn khác thì đang được nghiên cứu cho khả năng chữa trị bệnh viêm ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh, cải thiện bệnh tiêu chảy của những bệnh nhân khác, ngăn ngừa bệnh sâu răng, và làm giảm bớt chứng dị ứng

Đó là những yêu cầu đối với probiotic có vai trò trong sự miễn dịch và ngăn chặn được sự phát sinh bệnh ung thư Trong khi nghiên cứu tập trung trên probiotic sao cho phùhợp với hệ vi khuẩn đường ruột bao gồm dùng qua đường uống, đường hô hấp trên hay niệu sinh dục (dùng tại chỗ)

Probiotic thông thường là những chủng Lactobacillus và Bifidobacterium Ngoại lệ trong số đó cũng có loài Enterococcus và Saccharomyces Các chủng này được coi là an

toàn bởi vì chúng đã được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất bơ sữa Có những vi khuẩn

khác không phải là probiotic thích nghi sống trong vùng ruột non và chúng thường là điều kiện dẫn đến sự nhiễm trùng và gây bệnh.

Hệ vi sinh vật được xem là probiotic khi có ảnh hưởng tích cực trong sản phẩm bơ sữa và những thực phẩm lên men truyền thống

Thành phần của các sản phẩm probiotic trong nhiều thế kỉ thì không có tác dụng phụ

rõ ràng Probiotic tiêu thụ trong thực phẩm và bổ sung vào chế độ ăn kiêng được công nhận là an toàn theo GRAS

Và không cần thực hiện thêm một nguyên tắc nghiêm ngặt nào hơn đối với probiotic,

mà đòi hỏi phải được cải thiện hoặc ngăn chặn bệnh khi đưa vào phân tích “lịch sử của tính an toàn khi sử dụng “ như là một tiêu chuẩn phân loại an toàn đối với vi sinh vật thực phẩm

Trước đây định nghĩa này chưa được xác định pháp lý

Để khắc phục tình trạng này, liên đoàn Quốc tế ngành sữa và thực phẩm châu Âu cùng nhau xem xét hệ vi sinh vật và lịch sử sử dụng trong sản xuất thực phẩm Kiểm tra

danh sách phân loại và ứng dụng của vi khuẩn Lactic ở loài Enterococcus và

Streptococcus, nấm men và nấm mốc.

Nó mở ra sự thay đổi định nghĩa về vi sinh vật là thêm vào hay bớt ra với những thayđổi trong nguyên tắc phân loại Bắt đầu là mục lục có hệ thống các vi sinh vật được cho làhợp lý và cho là an toàn Vì mức độ sử dụng của chúng trong thực phẩm thì không gây bệnh

Nó quy định căn bản cho những chủng, loài, giống về tính an toàn và nguồn gốc từ những giống vi khuẩn mới thì luôn luôn làm ra những sản phẩm probiotic mới

Mức độ an toàn hợp lý của vi khuẩn probiotic mới thì không thể được giả đinh Trước khi kết hợp của những giống mới trong sản phẩm hiệu lực của chúng phải được đánh giá cẩn thận và sự đánh giá phải dựa vào mức độ an toàn của vi sinh vật trong sản phẩm

Người tiêu dùng chống lại sự biến đổi gen của vi sinh vật trong sản phẩm Như vậy

sự biến đổi gen của probiotic thì ít có khả năng được sử dụng gần đây Ngoại trừ có thể cócủa các ứng dụng lâm sàng

Và đã chứng tỏ một probiotic Lactococcus lactics đã tiết ra cytokine interleukin

(IL)-10 ngăn ngừa viêm kết tràng trong thí nghiệm trên chuột

Một chủng tái tổ hợp của Bacilus subtilis 2335 được dùng trong sản xuất protein với

tính chất kháng khuẩn và virus là tăng hiệu quả trị liệu trên chuột

Từ việc thí nghiệm trên một loài chuột người ta đã phát triển hơn và ứng dụng điều trị cho người theo đánh giá yêu cầu về mức độ an toàn đối với probiotic theo GMO

Việc chứng minh tính hiệu lực của probiotics đã mang lại những cơ hội lớn để phát triển đối với các sản phẩm cho người và động vật Việc bổ sung những chủng vi khuẩn mới trong thực phẩm và các sản phẩm điều trị cần được xem xét lại tính an toàn

Những sản phẩm probiotic có yêu cầu về dinh dưỡng chức năng hoặc điều trị Sự khác biệt giữa những hình thức bổ sung vào chế đô ăn hoặc uống thuốc đang là những thách thức để điều chỉnh phù hợp với người tiêu dùng

Bằng chứng cho sự an toàn và hiệu quả của probiotic gần đây được đưa vào những nghiên cứu nhỏ.Vi khuẩn lactic và nấm men dùng trong sản xuất các loại thực phẩm lên men truyền thống được xem là an toàn mà không có bất kì tiêu chuẩn khoa học nào bởi vì chúng tồn tại rất rộng rãi và sự hiện diện của chúng không gây bất lợi nào

Sự giới thiệu một probiotic mới đòi hỏi phải có những chỉ tiêu an toàn, được đề ra bao gồm bản chất của vi khuẩn, cũng như sự hoạt động của enzym, sự đề kháng kháng sinh và sự nhiễm trùng

2 Tính an toàn probiotic trên động vật: [2]

Việc sử dụng probiotic ở động vật và nuôi trồng thủy sản thì được đánh giá

cao.Probiotic giúp cải thiện sức khỏe của động vật, giúp tăng trọng và ngăn chặn tác nhân gây bệnh Sự lạm dụng kháng sinh trong ngành chăn nuôi và khả năng đề kháng kháng sinh đã làm tăng mối quan tâm đến probiotics

Việc sử dụng probiotics trong thực phẩm được đề xuất rằng có thể làm giảm nguy cơgây bệnh truyền từ thực phẩm sang người

Thí nghiệm phân lập E.faecalis và E faecium từ người, gà, lợn có tính nhạy cảm đối

với 12 chủng vi sinh khác và mã hóa gen đề kháng bằng phương pháp PCR Những sự kết hợp của tính đề kháng kháng sinh được giám sát trong quá trình phân lập mẫu từ người và động vật và các gen mã hóa cho tính đề kháng đã được phát hiện

Ủy ban khoa học châu Âu (EC) về dinh dưỡng động vật (2003) đã khuyến cáo rằng, những giống vi khuẩn trước đây có thể chấp nhận như một probiotic động vật thì bản chất của gen đề kháng kháng sinh phải được xác định.

Đối với các loài biết được bản chất của sự đề kháng kháng sinh ví dụ như khả năng

đề kháng vancomycin của lactobacillus, cần xác nhận các gen đề kháng chưa được biết

đến

Những chủng mang gen đề kháng kháng sinh được sử dụng trong y dược thì không nên bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trừ khi vi khuẩn đó có đột biến trên gen đề kháng kháng sinh Chính sách này sẽ ngăn chặn được việc sử dụng các vi khuẩn có khả năng truyền gen kháng kháng sinh sang các vi khuẩn khác làm probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Điều này cũng hạn chế ứng dụng của probiotic cho người

Thực tế probiotic cần thiết được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trong nông nghiệp

và nuôi trồng thủy sản và an toàn đối với người

Probiotic sử dụng cho động vật có nguy cơ nhiễm vào thức ăn của người hoặc truyềnkhả năng đề kháng kháng sinh, do đó nó cần được chứng minh là an toàn đối với người vàđộng vật

Sự bám dính lên niêm mạc đường tiêu hóa của vi khuẩn probiotic được xem là cơ chế quan trọng để ngăn chặn các tác nhân gây bệnh

3 Tính an toàn của probiotic trên người: [3]

Những tiêu chuẩn an toàn về probiotic được đề cập rất nhiều Một vấn đề gây tranh cãi là có nhất thiết probiotic phải bắt buộc có nguồn gốc từ người hay không.Tuy nhiên hầu hết các chủng probiotic được sử dụng thành công hiện nay đều có nguồn gốc từ người.Ngoài ra cũng có những tranh luận khác cho rằng chức năng hoạt động của

probiotic sẽ tốt hơn trong một môi trường mà có những tính chất ban đầu mà chúng được phân lập( chẳng hạn như đường ruột của người) Khía cạnh an toàn bao gồm:

• Không liên quan tới bệnh tật, (nhiễm trùng nội mạc cơ tim,hay gây rối loạn tiêuhóa)

• Đặc điểm di truyền ổn định

Bảng 1: Một số vi khuẩn sử dụng làm probiotic và có khả năng gây bệnh

4 An toàn của vi khuẩn đề kháng kháng sinh: [3]

Việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi ở người và thú y đã góp phần gia tăng tình trạng đề kháng kháng sinh và dẫn đến vấn đề nghiêm trọng trong việc điều trị nhiễm trùng do tự nhiên hoặc mắc phải Đề kháng tự nhiên được xem như là một đặc điểm tự nhiên của loài, trong khi đó đề kháng mắc phải là do những đột biến về di truyền hay thu được từ gen của những vi khuẩn đề kháng kháng sinh khác

Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng đề kháng tự nhiên với nhiều loại kháng sinh,

nhưng trong hầu hết các trường hợp thì các chủng này không có khả năng truyền gen đề

kháng kháng sinh Các chủng Lactobacillus có gen đề kháng kháng sinh không truyền được chưa hẳn được xem là an toàn khi sử dụng một vài chủng Lactobacillus như L

rhamnosus, L casei có tính đề kháng tự nhiên dối với vancomycin.đã có một lịch sử được

sử dụng lâu dài một cách an toàn như là probiotic, và không có biểu hiện nào cho thấy chúng truyền gen đề kháng này cho những vi khuẩn khác

5 Nghiên cứu lâm sàng: [2]

Tên vi sinh vật Khả năng gây bệnh

Lactobacillus Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở các

bệnh nhân suy giảm miễn dịch

Streptococcus Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng cơ hội

Enterococcus Một vài chủng là tác nhân gây bệnh cơ hội với hoạt tính