sử dụng kỹ thuật pcr để phân loại sán dây moniezia nhiễm gia súc ăn cỏ

Các số liệu chính xác của các phương pháp sinh học phân tử đã cho phép ứng dụng những hướng mới và rất có thể sẽ làm thay đổi một phần hệ thống phân loại và chẩn đoán phân biệt loài hiện

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Đồ án này:

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS Nguyễn Đức Tân - Phân Viện trưởng - Phân viện Thú y Miền Trung, TS Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, ThS Lê Đức Quyết - Phó trưởng Bộ môn Ký sinh trùng - Phân viện Thú y Miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Xin cám ơn: ThS Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong

Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các cán bộ - Bộ môn Ký sinh trùng và tập thể cán bộ công nhân viên – Phân viện Thú y miền Trung

đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

Nha Trang, tháng 7 năm 2011

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Loan

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SÁN DÂY TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Trong nước 4

1.2 ĐẶC ĐIỂM VỀ HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA SÁN DÂY MONIEZIA 4

1.3 CHU KỲ SINH HỌC CỦA SÁN DÂY MONIEZIA 8

1.4 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH Ở BÒ, DÊ, CỪU DO SÁN DÂY MONIEZIA GÂY RA 10

1.4.1 Tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc 10

1.4.2 Tình hình nhiễm sán dây theo lứa tuổi 11

1.4.3 Tình hình nhiễm sán dây theo mùa 12

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI SÁN DÂY 13

1.5.1 Chuẩn đoán trong phòng thí nghiệm 13

1.5.2 Phương pháp chẩn đoán trên gia súc chết 16

1.5.3 Phương pháp phân loại dựa vào hình thái cấu tạo 17

1.5.4 Phương pháp phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật phân tử PCR 18

1.5.4.1 Kỹ thuật PCR (Polymerasa Chain Reaction) 18

1.5.4.2 Phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật PCR 29

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 ĐỐI TƯỢNG 31

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 31

2.2.1 Nguyên vật liệu 31

2.2.2 Thiết bị chủ yếu 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Phương pháp thu thập mẫu sán dây 32

2.3.2 Phương pháp bảo quản mẫu nghiên cứu 32

2.3.3 Phương pháp xét nghiệm phân 33

2.3.4 Phương pháp mổ khám phi toàn diện của Skrjabin 34

2.3.5 Phương pháp phân loại sán dây dựa vào hình thái cấu tạo 34

2.3.6 Chiết tách DNA của sán dây Moniezia 35

2.3.7 Thiết kế mồi 36

2.3.8 Tối ưu hóa phản ứng PCR 38

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 41

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 TÌNH HÌNH NHIỄM SÁN DÂY Ở GIA SÚC ĂN CỎ (BÒ, DÊ, CỪU) 42

3.1.1 Tình hình nhiễm sán dây ở gia súc tại một số tỉnh Nam Trung bộ và Tây Nguyên 42

3.1.2 Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái 43

3.1.3 Tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc 44

3.1.4 Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo mùa vụ 45

3.1.5 Tình hình nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo lứa tuổi 47

3.2 XÁC ĐịNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN DÂY BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM CÁC MIN 49

3.3 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI SÁN DÂY BẰNG PCR 52

3.3.1 Kết quả tách chiết DNA sán dây 52

3.3.2 Xác định nồng độ DNA mẫu 52

3.3.3 Xác định nhiệt độ tối ưu cho một số cặp mồi 53

3.3.3 Xác định thành phần loài sán dây bằng phản ứng PCR 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 58

1 KẾT LUẬN 58

2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc 11

Bảng 1.2 Tỷ lệ nhiễm sán dây Moniezia theo lứa tuổi 12

Bảng 2.1 Biến đổi dãy nồng độ 38

Bảng 2.2 Biến đổi dãy nhiệt độ 40

Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm sán dây của gia súc nhai lại ở các tỉnh 42

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm sán dây của gia súc nhai lại theo vùng sinh thái 44

Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc 44

Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm sán dây theo mùa vụ 45

Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm sán dây theo lứa tuổi 48

Bảng 3.6 Kết quả xác định loài sán dây ở bò, dê, cừu bằng phương pháp nhuộm Các min 50

Bảng 3.7 Kết quả xác định nhiệt độ gắn thích hợp của một số mồi 54

Bảng 3.8 Kết quả xác định loài bằng phương pháp PCR và phương pháp nhuộm Các min 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình dạng bên ngoài của sán dây Moniezia 5

Hình 1.2 Hình thái sán dây 5

Hình 1.3 Cấu tạo một đốt thân sán dây Moniezia 6

Hình 1.4 Vòng đời của sán dây Moniezia 8

Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng gradient-PCR 39

Hình 3.1 Trứng sán dây Moniezia sp 42

Hình 3.2 Sán dây Moniezia sp và các đốt sán 49

Hình 3.3 Tuyến giữa đốt của loài Moniezia expansa 51

Hình 3.4 Tuyến giữa đốt của loài Moniezia benedeni 52

Hình 3.5 Kết quả chạy PCR ở các nồng độ DNA mẫu khác nhau 53

Hình 3.6 Kết quả chạy gradient-PCR sử dụng mồi 53

Hình 4.7 Kết quả chạy điện di phân loài sán dây Moniezia 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dịch bệnh trong đó có bệnh sán dây Moniezia thường gặp ở súc vật ăn cỏ nhất

là gia súc còn non Bệnh xảy ra chủ yếu do hai loài sán dây thuộc lớp Cestoda kí

sinh ở ruột non Gia súc bị bệnh sán dây thì gầy yếu, thiếu máu, suy nhược và dễ chết nếu nhiễm nặng

Bệnh ký sinh trùng không gây thành dịch ổ dịch lớn như các bệnh do vi khuẩn

và vi rút khác, nhưng thường kéo dài âm ỉ, làm giảm năng suất chăn nuôi, ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của gia súc, giảm hiệu quả kinh tế tạo điều kiện cho các bệnh truyền nhiễm phát sinh mà còn tác động không tốt đến chủ trương phát triển chăn nuôi gia súc nhai lại ở các vùng đồng bào dân tộc thiểu số nhằm xóa đói giảm nghèo, chuyển dịch cơ cấu nông nhiệp

Việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loại sinh vật, trong đó có ký sinh trùng ở gia súc cho đến gần đây chủ yếu vẫn dựa vào xác định đặc tính hình thái học và nuôi cấy Mặc dầu hình thái học (kiểu hình) trong phân loại là rất thông dụng và đã có những thành tựu hết sức to lớn, nhưng trong nhiều trường hợp khó khăn gặp phải là khó phân biệt loài và dưới loài một cách chính xác (McCarthya, Moore, 2000) Do tiêu tốn thời gian và khó tìm kiếm đúng môi trường thích hợp nuôi cấy cho một số loại vi khuẩn/virus, hay vật chủ cho ký sinh trùng, bệnh phẩm đòi hỏi phải hoàn chỉnh hoặc phải ở trạng thái sống, nên các phương pháp chẩn đoán dựa trên nuôi cấy và hình thái học có rất nhiều hạn chế (Gilbert, 2002; Parida, 2008; Mori và Notomi, 2009) Các phương pháp chẩn đoán truyền thống áp dụng trong lâm sàng và dịch tễ học như xét nghiệm tìm trứng/ấu trùng hay các sản phẩm của ký sinh trùng hoặc các kỹ thuật miễn dịch học đều có những sai số nhất định, tuỳ từng loài ký sinh trùng, đặc biệt khi các dạng ký sinh trùng cùng tồn tại ở một nơi như đường ruột ở hệ tiêu hóa, chất thải ở hệ hô hấp hay máu của hệ tuần hoàn Phương pháp sinh học phân tử nhân bản DNA và phân tích đặc tính sản phẩm thu được, đặc biệt là phân tích biến đổi gen/hệ gen được ứng dụng trong chẩn đoán phân loại và lập phả hệ sinh vật, đã bước đầu chứng minh cho kết quả chính xác

hơn nhiều so với phương pháp truyền thống (Elnifro et al., 2000; De Lellis et al.,

2008; Mori và Notomi, 2009) Các số liệu chính xác của các phương pháp sinh học phân tử đã cho phép ứng dụng những hướng mới và rất có thể sẽ làm thay đổi một

phần hệ thống phân loại và chẩn đoán phân biệt loài hiện có (Galluzzi et al., 2007;

Littlewood, 2008)

Trong hai thập kỷ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới đã có những định hướng phát triển vượt bậc Một trong những thành tựu lớn của nhân loại là sự phát triển phương pháp PCR (Polymerasa Chain Reaction) được ứng dụng cho giám định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh vật, trong đó

có ký sinh trùng (Chandler và Colitz, 2006; Littlewood, 2008) và trở thành một công cụ không thể thiếu được trong công tác giám định, phát hiện sinh vật (kể cả ký sinh trùng) gây bệnh bằng kỹ thuật cao (Ishmael và Stellato, 2008) Do có tính nhạy

và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một lượng rất ít khuôn DNA của đối tượng sinh vật bất kể giai đoạn sinh trưởng nào, PCR đã có thể cho sản phẩm với độ chính xác cao về loại sinh vật cần nghiên cứu

Từ thực tế trên, dưới sự giúp đỡ của Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng Phân

viện Thú y Miền Trung, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Sử dụng kỹ thuật PCR để phân loại sán dây Moniezia nhiễm gia súc ăn cỏ” với mục đích sử dụng kỹ thuật

sinh học phân tử để xác định nhanh các loài sán dây phổ biến nhiễm ở một số loại

gia suac ăn cỏ làm cơ sở cho việc phòng bệnh cho gia súc một cách có hiệu quả

Nội dung của đồ án:

1) Đánh giá tình hình nhiễm sán dây ở bò, dê, cừu ở một số tỉnh Miền Trung

và Tây Nguyên,

2) Xác định thành phần loài và tỷ lệ nhiễm sán dây ở bò, dê, cừu,

3) Sử dụng kỹ thuật PCR để xác định thành phần loài sán dây Moniezia nhiễm

ở bò, dê, cừu

Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn các hạn chế,

em kính mong nhận được các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp

để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn!

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SÁN DÂY TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1.1 Trên thế giới

Bệnh sán dây ở động vật nhai lại (bò, dê, cừu) do các loài Moniezia expansa

và Moniezia benedeni cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu sau:

Năm 2001, Borges và cộng sự cho biết bò vùng Saopaulo của Brazin nhiễm

một loài sán dây là Moniezia expansa với tỷ lệ là 4,76% Năm 2003, Achi và cộng

sự đã điều tra tình hình nhiễm giun sán ở bò tại các lò mổ ở vùng Savannah của Pháp và xác định loại sán thường gặp nhất là sán dây với tỷ lệ nhiễm là 31%

Nwosu và cộng sự (1996) cho biết tỷ lệ nhiễm sán dây ở dê tại Nigeria là 31%

Ở Ethiopia kết quả điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đường ruột ở dê cho thấy

tỷ lệ nhiễm sán dây Moniezia expansa là 32,2% và số lượng trứng/gam phân là

545,2 trứng (Etana debela, 2002) Trong quá trình điều tra ký sinh trùng đường hô

hấp và tiêu hóa ở dê Iceland tác giả Yfirrlot đã phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm Moniezia expansa là 20%

Ở cừu, tỷ lệ nhiễm sán dây theo điều tra của Eeroanska và cộng sự (2005) tại Slovakia là 19,2% Cũng trên đối tượng cừu, kết quả điều tra của Munib và cộng sự (2006) cho thấy sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm giữa các loài sán

dây trên đàn cừu ở Pakistan: tỷ lệ nhiễm M expansa là 71,3% trong khi đó M benedeni là 2,17% và số lượng trứng/gam phân (EPG= eggs per gram faeces) tương

ứng là 388,85 và 11,8 trứng

Lughano Kusiluka và Dominic Kambarage (2006) cho biết có thể dùng một trong các loại thuốc: Niclosamide (liều 80mg/kg), Resoranttel (75 mg/kg), Paraziquantel (15 mg/kg), Albendazole (5mg/kg), Mebendazole (10 mg/kg) để điều trị bệnh sán dây Đặc biệt thuốc Benzimidazole có hiệu lực cao trong việc điều trị

bệnh sán dây họ Anoplocephatidae

1.1.2 Trong nước

Việc nghiên cứu sán dây ở Việt Nam được bắt đầu hơn một thế kỷ nay Năm

1870, Can de J lần đầu tiên mô tả loài sán dây Diphyllobothrium latum tìm thấy ở

người Nam Bộ (Việt Nam) Sau đó 10 năm mới xuất hiện các công trình nghiên cứu

lẻ tẻ về 1 số loài sán dây gây bệnh cho người Từ đó việc nghiên cứu về thành phần

ở người được chú ý hơn, rồi mở rộng phạm vi nghiên cứu sang một số loài động vật

hoang dã

Tổng hợp có hệ thống về sán dây ở gia súc nhai lại Việt Nam, Drozdz j và

Malcrewski A (1971) cho biết, trong họ Acanthocephalidae có giống Moniezia gây bệnh cho dê, cừu; hiếm hơn ở bò, trâu, và các thú nhai lại khác Giống Moniezia có

2 loài là M expansa và M benedeni phân bố khắp các vùng trong cả nước

Theo Phan Địch Lân và cộng sự (1975) bệnh sán dây là một trong những nguyên nhân gây chết ở dê với tỷ lệ khá cao (40%) vì vậy việc khống chế bệnh sán dây cần được quan tâm

Đào Hữu Thanh và Lê Sinh Ngoạn (1980), Phan Địch Lân Và cộng sự (1975), Nguyễn Thế Hùng (1994) cũng xác nhận 2 loài sán dây thuộc giống

Moniezia ký sinh ở dê và các thú nhai lại khác

Nguyễn Thị Kim Lan (2000) cho biết, loài M expansa phổ biến hơn so với loài M benedeni (hệ số thường gặp loài M expansa là 100, trong khi loài M benedeni là 75) Tác giả đã thử nghiệm một số thuốc điều trị bệnh giun sán đường

tiêu hóa ở dê và nhận thấy Niclosamid-Tetramisol B và Vermitan rất an toàn và có hiệu quả trong việc điều trị sán dây

1.2 ĐẶC ĐIỂM VỀ HÌNH THÁI, CẤU TẠO CỦA SÁN DÂY MONIEZIA

Sán dây Moniezia có hình dải băng màu trắng, cơ thể dài, hẹp chia thành ba

phần: đầu hơi tròn (phần đầu có các giác bám), cổ (là những đốt sán nối tiếp sau đầu, có khả năng sinh ra các đốt thân, cơ quan sinh sản ở các đốt cổ chưa hình thành rõ), thân (gồm những đốt sau cổ, có hình dạng và cấu tạo khác nhau) (Hình 1.1)

Thân sán dây gồm ba loại đốt: những đốt chưa thành thục về sinh dục (ở gần cổ), cơ quan sinh dục chưa phát triển đầy đủ, chỉ thấy cơ quan sinh dục đực Những đốt thành thục về sinh dục (ở giữa thân), cơ quan sinh dục đực và cái, có hệ bài tiết, cấu tạo mỗi đốt tương tự như mỗi cơ thể sán lá nhưng khác là không có hệ tiêu hóa Những đốt già (ở cuối thân sán), bên trong đốt sán chứa đầy tử cung với vô số trứng sán dây Ở những đốt già, cơ quan sinh dục đực bị thoái hóa Những đốt già thường xuyên rụng xuống, rời khỏi cơ thể sán và theo phân ra ngoài

Hình 1.1 Hình dạng bên ngoài của sán dây Moniezia

Hình 1.2 Hình thái sán dây

A Moniezia expansa ; B Moniezia benedeni

1 Đầu ; 2 Đốt sán ; 3 Trứng

Sán dây Moniezia được bao bọc bằng lớp da cơ gồm các lớp: cuticun, màng

bazan và lớp dưới cuticun, tiếp theo là lớp cơ Ở lớp cuticun bên ngoài có nhiều lỗ thoát nhỏ, lớp cơ gồm nhiều bó cơ vòng và cơ dọc Bên trong lớp cơ là các khí quan của sán

Sán dây Moniezia cũng giống các sán dây khác ở đặc điểm không có hệ tiêu

hóa, sán lấy thức ăn bằng phương thức thẩm thấu qua bề mặt cơ thể

Hệ thần kinh của sán gồm các hách phân bố ở đầu, nối với 2 dây thần kinh chạy qua các đốt sán về cuối thân Hệ tuần hoàn và hô hấp tiêu giảm, hô hấp theo kiểu yếm khí Hệ bài tiết gồm 2 ống chính đi từ đầu sán đi về cuối thân thông với lỗ bài tiết Ngoài ra, ở mỗi đốt sán còn có những ống ngang nối liền với 2 ống chính

Hệ sinh dục có trong mỗi đốt sán Cơ quan sinh dục đực gồm nhiều tinh hoàn Mỗi tinh hoàn được nối với ống dẫn tinh riêng, các ống này đổ vào ống dẫn tinh chung và thông với túi sinh sản Phần cuối của ống dẫn tinh trong túi sinh sản là dương vật thông với bên ngoài qua lỗ sinh dục đực Cơ quan sinh sản cái gồm Ootype ( ngã tư sinh dục ) Ootype thông với tử cung, buồng trứng tuyến noãn hoàn, tuyến Mehlis, âm đạo Phần cuối của âm đạo là lỗ sinh dục cái thông với bên ngoài

và ở cạnh lỗ sinh dục đực

Hình 1.3 Cấu tạo một đốt thân sán dây Moniezia

Sán dây Moniezia thuộc bộ Cyclophyllidae nên có đặc điểm tử cung phân

nhánh, không có lỗ thông với bên ngoài Tuyến noãn hoàn tập trung có hình khối

Trứng nằm trong tử cung Sán Moniezia không đẻ trứng mà đốt sán già sẽ tách khỏi thân và theo phân ra ngoài Hình thái của Moniezia expansa và Moniezia benedeni

có những đặc điểm riêng:

M.expansa: dài 1 - 5m, chỗ rộng nhất có thể tới 1,6cm Đầu sán hơi tròn, có 4

giác bám hình bầu dục hơi tròn Chiều rộng đốt sán lớn gấp 4 lần chiều dài đốt sán Mối đốt sán có cả cơ quan sinh dục đực và cái Cơ quan sinh dục đực gồm nhiều tinh hoàn (300 - 400 cái) hình cầu nhỏ ở giữa đốt sán Mỗi tinh hoàn có ống dẫn tinh riêng, hợp thành ống chung thông với túi dương vật hình quả lê và lỗ sinh dục đực Cơ quan sinh dục cái kép, gồm buồng trứng phân thùy hình quạt, tuyến dinh dưỡng, tử cung và âm đạo có lỗ thông ra cạnh bên đốt sán Phần sau mỗi đốt sán có tuyến giữa đốt hình hoa thị xếp thành hàng ngang Đốt sán già có tử cung hình túi

chứa đầy trứng sán Trứng của M expansa hình ba cạnh hoặc bốn cạnh hơi tròn,

trong ấu trùng có 6 móc được bao bọc trong cơ quan hình lê Kích thước trứng khoảng 0,05 x 0,06 mm

M.benedeni: dài 2 - 4m, đốt rộng hơn một chút so với đốt của M.expansa Đầu

có 4 giác bám tròn, sâu Nhìn chung, hình thái của sán dây M.benedeni tương đối giống với M.expansa Có một điểm quan trọng để phân biệt 2 loài là sự sắp xếp của

tuyến giữa đốt Ở loại này, tuyến giữa đốt có dạng vạch, nằm tập trung ở giữa đốt sán Trứng sán cũng có hình 3 cạnh hoặc 4 cạnh hơi tròn, trong ấu trùng có 6 móc, kích thước trứng khoảng 0,063 x 0,086mm

Vị trí của sán dây Moniezia trong hệ thống phân loại giun sán ở động vật nuôi

Trong hệ thống phân loại động vật học, theo Phan Thế Việt và cộng sự

(1977), sán dây Moniezia có vị trí như sau:

Lớp sán dây Cestoda Rudolphi, 1808

Phân lớp Eucestoda Southwell, 1930

Bộ Cyclophyllidae Benede in Braun, 1900

Phân bộ Anoplocephalata Skrjbin, 1933

Họ Anoplocephalidae Cholodkowski, 1902

Phân họ Anoplocephalinae Blanchard, 1891

Giống Moniezia Blanchard,1891

Loài Moniezia expansa ( Ridolphi, 1810) Blanchard, 1891 Loài Moniezia benedeni (Moniez, 1879) Banchard, 1891

1.3 CHU KỲ SINH HỌC CỦA SÁN DÂY MONIEZIA

M expansa và M benedeni là hai loại sán dây ký sinh ở ruột non của gia súc

nhai lại Gia súc nhai lại là vật chủ cuối cùng của sán, giúp sán hoàn thành vòng đời

và kí sinh ở giai đoạn thành thục Để hoàn thành vòng đời, sán dây Moniezia cần vật chủ trung gian là nhiều loại nhện đất thuộc họ Orbatidae như Galumna, G Obvius,

G nigara,Scheloribates laevigatus, S latipes (Trịnh Văn Thịnh, 1963; Phan Địch

Lân và Nguyễn Thị Kim Lan, 2002)

Hình 1.4 Vòng đời của sán dây Moniezia

Vòng đời của sán dây Moniezia diễn ra như sau:

- Đốt sán già rụng, theo phân dê, cừu, bò, trâu ra ngoài (sán dây Moniezia thuộc họ Anoplocephalidae, bộ Cyclophyllidea nên không đẻ trứng) Đốt sán phân

huỷ ở ngoại cảnh, giải phóng nhiều trứng sán Trứng sán dây phát tán ở trong đất,

được các loài nhện đất họ Oribatidae ăn phải Vào đường tiêu hoá của nhện đất,

trứng nở thành ấu trùng 6 móc, rồi phát triển thành ấu trùng có sức gây bệnh

(Cysticercoid) trong cơ thể nhện đất Thời gian từ khi nhện đất nuốt trứng sán đến khi phát triển thành Cysticercoid cần khoảng 120 - 180 ngày

- Nhiều tác giả cho biết, có 28 loài nhện đất thuộc họ Oribatidae, nhưng phổ biến là hai loài: Scheloribates laevigatus và S latipes là ký chủ trung gian của sán dây Moniezia Thời gian nhện đất phát triển từ ấu trùng thành trưởng thành rất ngắn,

thời gian sống của chúng lại dài (14 - 19 tháng) Vì vậy, ấu trùng gây bệnh cũng tồn

tại lâu trong thiên nhiên

Nhện đất có đặc điểm là ưa sống trên đất bỏ hoang, số lượng rất lớn, mỗi mét vuông có thể có từ vài nghìn đến hàng chục nghìn con Nếu đồng cỏ được cải tạo luôn thì số lượng nhện đất giảm Nhện đất sống ở môi trường có nhiệt độ, ẩm độ nhất định Nếu quá lạnh hoặc quá nóng thì nhện đất di chuyển đi chỗ khác Khi nóng (30oC) ánh sáng mạnh và khô, chúng từ thân cây, cỏ bò xuống rễ, có khi xuống sâu 4 - 5 cm Khi trời mưa, đất ẩm ướt và ít ánh sáng mặt trời, chúng lại bò

từ dưới đất lên cây cỏ Thường thì chúng hoạt động vào sáng sớm, buổi chiều và tối

Giữa trưa ánh sáng mạnh, ít thấy nhện đất Nhện đất họ Oribatidae có kích thước

nhỏ, thân phủ lớp kính cứng, màu nâu đỏ

- Ký chủ cuối cùng là gia súc nhai lại dê, cừu, bò Khi gia súc nhai lại ăn cỏ có lẫn nhện đất thì bị nhiễm bệnh sán dây Vào đường tiêu hoá, nhện đất được tiêu hoá nhờ enzyme trong đường tiêu hoá gia súc nhai lại, ấu trùng được giải phóng ra, bám vào niêm mạc ruột non, thẩm thấu dinh dưỡng qua bề mặt cơ thể, phát triển thành sán dây trưởng thành Thời gian từ lúc súc vật nhai lại nuốt phải nhện đất mang ấu trùng gây bệnh, đến khi phát triển thành sán dây trưởng thành dài ngắn tuỳ loài sán:

M expansa cần khoảng 37 - 40 ngày, M benedeni cần khoảng 50 ngày

Theo Drozdz J và Malcrewski A (1971), Trịnh Văn Thịnh (1978), 24 - 48 giờ

sau khi trứng sán dây Moniezia được nhện đất nuốt, đã thấy ấu trùng trong xoang cơ

thể nhện Thời gian ấu trùng phát triển trong cơ thể nhện đất khoảng 120 - 180

ngày, thời gian Moniezia phát triển thành trưởng thành ở cơ thể loài nhai lại khoảng

1 tháng Sán dây trưởng thành sống trong cơ thể ký chủ khoảng 75 ngày, trường hợp lâu nhất tới 5 - 6 tháng

Sengbusch H G (1977) cho rằng, những đốt sán và trứng sán được thải theo phân của động vật nhiễm sán Những đốt này có thể bị chim ăn và chim trở thành

nguồn gieo rắc căn bệnh Cysticercoid phát triển trong ký chủ trung gian xấp xỉ 4 tháng Thời gian phát triển thành ấu trùng gây nhiễm Cysticercoid ở trong cơ thể

nhện đất - ký chủ trung gian có thể ngắn hơn (l - 4 tháng) (Urquhart và cộng sự, 1996)

1.4 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH Ở BÒ, DÊ, CỪU DO SÁN DÂY MONIEZIA

GÂY RA

1.4.1 Tình hình nhiễm sán dây theo loài gia súc

Rao J R và Deorani V P S (1988) cho biết, xét nghiệm phân trâu, bò, dê ở

huyện Port Blair (Ấn Độ), thấy bò nhiễm sán dây Moniezia là 2,1%, dê là 3% Xét

nghiệm các mẫu phân của bò, trâu, dê, cừu ở thung lũng Kangra - Ấn Độ, kết quả là trong số 1194 gia súc có 1017 con nhiễm từ một đến nhiều loại ký sinh trùng (85%)

Riêng tỷ lệ nhiễm sán dây Moniezia thì bò nhiễm 1%, trâu 0,7%, không thấy dê và

cừu nhiễm (Krishna L.và cộng sự, 1989) Năm 2003, Achi và cộng sự đã điều tra tình hình nhiễm giun sán ở bò tại các lò mổ ở vùng Savannah của Pháp và xác định loại sán lá thường gặp nhất là sán dây với tỷ lệ nhiễm là 31%

Nwosu và cộng sự (1996) cho biết tỷ lệ nhiễm sán dây ở dê tại Nigeria là 31%

Ở Ethiopia kết quả điều tra tình hình nhiễm ký sinh trùng đường ruột ở dê cho thấy

tỷ lệ nhiễm sán dây Moniezia expansa là 32,2% và số lượng trứng/gam phân là

545,2 trứng (Etana Debela, 2002) Trong quá trình điều tra ký sinh trùng đường hô

hấp và tiêu hóa ở dê Iceland tác giả Yfirlot đã phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm Moniezia expansa là 20%

Ở cừu, tỷ lệ nhiễm sán dây theo điều tra của Eeroanska và cộng sự (2005) tại Slovakia là 19,2% Cũng trên đối tượng cừu kết quả điều tra của Munib và cộng sự (2006) cho thấy sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm giữa các loài sán

dây trên đàn cừu ở Pakistan: tỷ lệ nhiễm Moniezia expansa là 71,3% trong khi đó Moniezia benedeni là 2,17% và số lượng trứng/gam phân (EPG = eggs per gram

faeces) tương ứng là 388,85 và 11,8 trứng

Nguyễn Đức Tân và cộng sự (2010) cho biết tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc ở một số tỉnh Nam Trung Bộ và Tây Nguyên như sau

Bảng 1.1 Tỷ lệ nhiễm sán dây theo loài gia súc

1.4.2 Tình hình nhiễm sán dây theo lứa tuổi

Theo kết quả điều tra của Phan Địch Lân và Phạm Sỹ Lăng (1975), đàn dê của trại X (Nam Hà) nhiễm sán dây như sau: dê đực giống nhiễm 40%, dê cái hậu bị nhiễm 66,6%, dê dưới 1 năm tuổi nhiễm 80%; cường độ nhiễm từ 5 - 14 sán dây/con dê

Theo Phạm Văn Khuê và Phan Lục (1996), tuổi động vật càng cao thì tỷ lệ nhiễm càng thấp Bệnh thường thấy ở cừu, dê, bê từ một tháng rưỡi đến tám tháng tuổi, bê có sức thải sán ra ngoài do đó tỷ lệ bệnh giảm Qua xét nghiệm 666 mẫu phân và mổ khám 27 dê thuộc 3 giống (Bách Thảo, Ấn Độ và dê cỏ) ở một số cơ sở nuôi dê, Nguyễn Thế Hùng (1996) cho biết, dê 4 - 7 tháng tuổi nhiễm nặng nhất (43,7%), thấp nhất là dê trên 12 tháng tuổi (8%)

Bảng 1.2 Tỷ lệ nhiễm sán dây Moniezia theo lứa tuổi

1.4.3 Tình hình nhiễm sán dây theo mùa

Mùa xuân và mùa hè là các mùa ấm, ẩm ướt, mưa nhiều Vì vậy, vào mùa xuân và mùa hè, nhện đất có điều kiện sống, phát triển nhanh về số lượng Đồng thời vào những mùa này, nhện đất trưởng thành cũng có điều kiện thuận lợi hơn để

di chuyển từ dưới đất lên thân cây, cỏ Súc vật nhai lại chăn thả vào những thời

điểm này dễ cảm nhiễm sán dây Moniezia do ăn cỏ cây có lẫn nhện đất mang Cysticercoid

Sengbusch H G (1977) cho biết, bệnh có tính chất mùa vụ rõ rệt Tỷ lệ nhiễm

Moniezia tăng lên vào mùa hè và giảm đi vào mùa đông Tác giả giải thích, nguyên nhân là do nhện đất - ký chủ trung gian của Moniezia ở trên đồng cỏ phát triển

nhiều hơn trong mùa hè, và giảm đi ở mùa đông

Nguyễn Thế Hùng (1994) cũng xác nhận quy luật mùa vụ khi điều tra tình hình nhiễm giun sán ở đàn dê của Trung tâm nghiên cứu dê, thỏ Sơn Tây và nông trường Đồng Mô: tỷ lệ nhiễm ở vụ Hè - Thu cao hơn vụ Đông - Xuân

Nghiên cứu tỷ lệ và cường độ nhiễm sán dây Moniezia ở đàn dê địa phương

của tỉnh Bắc Thái (cũ), Nguyễn Thị Kim Lan và cộng sự (1998) thấy, tỷ lệ nhiễm

Moniezia ở dê trong vụ Đông - Xuân là 12,3 - 15,4%; trong khi tỷ lệ nhiễm trong vụ

Hè - Thu là 20,8 - 28,8%, cường độ nhiễm trong vụ Hè - Thu cũng nặng hơn vụ Đông - Xuân Theo dõi lặp lại hai lần và xử lý thống kê, tác giả khẳng định, sự sai khác về tỷ lệ nhiễm này là rõ rệt

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI SÁN DÂY

1.5.1 Chuẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Mục đích của phương pháp này là tìm các đốt sán hoặc trứng sán dây có trong phân của gia súc nhai lại

Kỹ thuật lấy phân để xét nghiệm: trong đất hoặc trên nền chuồng có chứa số lượng lớn trứng và ấu trùng giun sán sống tự do Khi gia cầm, gia súc thải phân trứng và ấu trùng giun tròn sống tự do có thể dính vào phân gây khó khăn cho việc xét nghiệm chuẩn đoán Vì vậy cần lấy trực tiếp qua hậu môn của con vật Phân của mỗi con vật để riêng vào túi nilon sạch, mỗi mẫu khoảng 20 - 30 gam, có nhãn ghi

số thứ tự mẫu, tính biệt, khối lượng con vật, địa điểm thu thập mẫu Mẫu phân phải đưa về phòng thí nghiệm hoặc cơ sở nghiên cứu để xét nghiệm ngay hoặc bảo quản

ở tủ lạnh dưới < 10 ºC , thời gian bảo quản không quá 7 ngày

* Chẩn đoán định tính

Là phương pháp xác định có hoặc không có các loài giun sán ký sinh ở gia súc, gia cầm tức là tìm giun sán trưởng thành hoặc đốt sán dây, trứng hoặc ấu trùng giun sán trong phân Đây là những phương pháp thông dụng để đánh giá tình hình nhiễm giun sán ở các đàn gia súc, gia cầm

• Phương pháp tìm giun sán trưởng thành

Để tìm giun sán trưởng thành hoặc các đốt sán dây được thải ra theo phân (đặc biệt là khi tẩy giun sán thăm dò), có thể dùng que bới phân và quan sát bằng mắt thường hoặc quan sát kỹ hậu môn của từng con vật (có thể phát hiện cả đoạn sán dây lủng lẳng ở hậu môn gia súc), thu gom toàn bộ phân của mỗi con vật vào chậu rồi hoà tan trong nước, để lắng, gạn nhiều lần cho đến khi cặn lắng trong thì gạn nước đi để tìm giun sán, đốt sán dây trong cặn

• Phương pháp tìm trứng giun sán

Có nhiều phương pháp tìm trứng giun sán, nhưng đạt hiệu quả cao và đơn

giản, dễ làm là: phương pháp phù nổi Fulleborn (1927), phương pháp Darling, phương pháp Cherbovick và phương pháp gạn rửa sa lắng Benedek (1943)

- Phương pháp Fulleborn: là một trong các phương pháp phù nổi dễ làm và

rẻ tiền Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng dung dịch muối ăn (Nacl) bão hoà có tỷ trọng d = 1,18, lớn hơn tỷ trọng của trứng giun sán, làm cho trứng giun sán nổi lên bề mặt dung dịch Dung dịch nước muối bão hoà pha bằng cách: cho tinh thể muối ăn (Nacl) vào chậu hoặc nồi nước sôi, vừa cho vào vừa khuấy cho đến khi muối không hoà tan được nữa (thường dùng 380 - 400 gam muối tinh thể không ngậm nước, hoặc 450 gam muối tinh thể ngậm nước) Để nguội, được dung dịch muối bão hoà dùng để xét nghiệm trứng giun sán

- Phương pháp Darling: là phương pháp phù nổi có độ chính xác cao, tuy

nhiên dụng cụ và thao tác có phức tạp hơn so với phương pháp Fulleborn Trong phương pháp Darling, dung dịch nước muối bão hoà (NaCl) vẫn được sử dụng làm dung dịch xét nghiệm chẩn đoán, song cần có máy ly tâm để thực hiện phương pháp này Sau hai lần ly tâm, trứng giun sán dễ dàng nổi lên bề mặt dung dịch nước muối bão hoà Đồng thời, tiêu bản làm từ phương pháp Darling được loại bỏ cặn tốt hơn nên "sạch" hơn, dễ phát hiện trứng giun sán hơn pháp Fulleborn

- Phương pháp Cherbovick: là phương pháp có độ chính xác cao trong xét

nghiệm trứng giun sán Cách tiến hành phương pháp Cherbovick cũng gồm hai lần

ly tâm như phương pháp Darling, song tuỳ mục đích chẩn đoán mà có thể dùng dung dịch bão hoà khác nhau (dung dịch ma giê sunfat bão hoà, dung dịch nam hyposunfit bão hoà)

- Phương pháp gạn rửa sa lắng: (còn gọi là phương pháp lắng cặn trứng giun

sán): nguyên tắc của phương pháp này là dùng nước lã sạch tách trứng giun sán ra khỏi phân Trứng giun sán có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng của nước lã sẽ chìm xuống,

có thể thu nhận để quan sát chẩn đoán dưới kính hiển vi

Phương pháp gạn rửa sa lắng có thể phát hiện khá tốt trứng sán lá gan, trứng

sán lá dạ cỏ, trứng sán lá ruột lợn, đốt sán dây Nếu để lắng cặn 30 - 60 phút có thể phát hiện trứng giun đũa và một số trứng giun tròn có kích thước lớn khác

Chú ý, khi xét nghiệm phân cần phân biệt trứng giun sán với cặn thức ăn, bào

tử nang của nấm, trứng của các loài tiết túc có thể có trong phân, cũng như phải phân biệt đặc điểm hình thái của từng loại trứng Trứng giun sán thường có 2 hoặc 4 lớp vỏ, nhẵn hoặc lồi lõm, trong trứng có phôi bào hoặc ấu trùng

• Phương pháp đếm trứng Mc Master

Phương pháp này dùng để xác định số lượng trứng giun tròn, trứng sán dây và Oocyst cầu trùng trong 1 gam phân bằng buồng đếm Mc Master Cân 4 gam phân cho vào cốc thuỷ tinh, thêm 56 ml dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan phân Lọc qua lưới thép vào một cốc khác và khuấy đều Trong khi đang khuấy, lấy công tơ hút 1ml cho vào 2 buồng đếm (mỗi buồng đếm có dung tích là 0,15ml) Để yên 5 phút rồi kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 10)

Trong thực tế, để dễ phát hiện và dễ đếm trứng, có thể cải tiến như sau:

+ Bước l: cân 4 gam phân vào cốc thuỷ tinh, thêm nước lã sạch (khoảng 100 -

150 ml), khuấy tan phân, lọc bỏ cặn bã thô Nước lọc để lắng trong 1 - 2 giờ, gạn bỏ nước, giữ lại cặn

+ Bước 2: cho 56 ml dung dịch nước muối bão hoà, khuấy đều cho tan cặn Trong khi đang khuấy, lấy công tơ hút, hút 1 ml dung dịch phân cho đầy 2 buồng đếm Mc Master (mỗi buồng đếm có dung tích là 0,15ml) Để yên 5 phút rồi kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10x10) Đếm toàn bộ số trứng trong những ô của hai buồng đếm, rồi tính theo công thức sau:

Số trứng/1(g) phân = tổng số trứng trên 2 buồng đếm x 2004

1.5.2 Phương pháp chẩn đoán trên gia súc chết

Phương pháp mổ khám gia súc

Phương pháp này chủ yếu là tìm giun sán và ấu trùng giun sán ở các cơ quan nội tạng khi mổ khám xác con vật đã chết Ưu điểm của phương pháp mổ khám là biết được chính xác thành phần loài giun sán ký sinh và mức độ nhiễm nặng hay nhẹ Tuỳ theo mục đích mổ khám mà chúng ta có thể dùng phương pháp mổ khám toàn diện hoặc phương pháp mổ khám cục bộ hay còn gọi là phương pháp mổ khám phi toàn diện của Skrjabin K I (1928)

Mổ khám toàn diện là phương pháp mổ khám giun sán ở tất cả các cơ quan, tổ chức của cơ thể gia súc, gia cầm (phát hiện giun, sán ở xoang mắt, xoang miệng, xoang mũi, xoang ngực, xoang bụng, mô não; toàn bộ hệ tiêu hoá, kể cả gan, tuỵ; hệ

hô hấp; hệ bài tiết; hệ sinh dục; các tổ chức dưới da)

Mổ khám phi toàn diện là phương pháp mổ khám một hệ cơ quan hoặc một cơ quan để phát hiện các loài giun sán nào đó trong cơ thể gia súc, gia cầm

1.5.3 Phương pháp phân loại dựa vào hình thái cấu tạo

Lớp Sán dây được chia làm 2 lớp phụ và 9 bộ, có nhiều loài ký sinh gây bệnh

cho người và gia súc thuộc các bộ như Cyclophyllidea và Pseudophyllidea Trên thế

giới có khoảng 130 triệu người bị nhiễm bệnh sán dây Ở Việt Nam có 200 loài, có một số bộ quan trọng liên quan đến khả năng gây bệnh cho người và gia súc

- Phân lớp Cestodaria: Bao gồm các loài sán dây có cơ thể không chia đốt, chỉ

có 1 hệ sinh dục Ví dụ loài Amphilina foliacea ký sinh trong cơ thể cá tầm Dạng

trưởng thành không sống trong ruột mà sống trong xoang, vật chủ trung gian là giáp xác bơi nghiêng Ấu trùng của loài này sống trong xoang của giáp xác, khi cá ăn giáp xác thì chuyển sang giai đoạn trưởng thành

- Phân lớp sán dây chính thức (Cestoda): Bộ Pseudophyllidea bao gồm các

loài sán dây có cơ quan bám là mép, đôi khi có móc Một số họ đáng chú ý là

Diphyllobothrridae và Lingulidae Một số loài ký sinh gây bệnh cho người và gia súc là: sán mép Diphyllobothrium latum có giai đoạn trưởng thành sống trong ruột

người, thú nuôi và thú hoang Chiều dài cơ thể đạt đến 9 m và có khoảng ba đến bốn

nghìn đốt Phát triển phức tạp qua giáp xác chân kiếm và cá, ấu trùng là Procercoid

và Pleurocercoid Người bị nhiễm bệnh do ăn phải cá khô hay cá không nấu chín Ở Việt Nam thường gặp loài Diphyllobothrium mansoni có giai đoạn trưởng thành ký

sinh ở chó, cáo, mèo… có thể dài tới 2,5m, ấu trùng ký sinh trong giáp xác chân

kiếm Ligulata intestinalis là loài gây bệnh trầm trọng cho cá Cơ thể hình dải, có

nhiều hệ sinh dục nhưng chưa chia thành từng đốt Đầu không phân hoá rõ rệt và có

giác bám kém phát triển, ấu trùng là leurocercoid dài tới 50- 80cm Taeniarhynchus saginatus ký sinh ở người và Taenia solium ký sinh ở lợn Cơ thể chỉ có 3 - 4 đốt,

đầu có 2 vành móc và 4 giác bám Trưởng thành ký sinh trong ruột chó và thú ăn thịt Nang sán ở trong nội quan của dê, cừu, bò, lợn và người Nang sán lớn (có thể nặng tới 60 kg), có nhiều đầu gọi là bao nang nhiều đầu, chèn ép vật chủ gây đau đớn

Sán dây Moniezia ở gia súc nhai lại phổ biến nhất là hai loài Moniezia expansa

và Moniezia benedeni Hình thái của Moniezia expansa và Moniezia benedeni có

những đặc điểm riêng:

M.expansa: dài 1 - 5m, chỗ rộng nhất có thể tới 1,6cm Đầu sán hơi tròn, có 4

giác bám hình bầu dục hơi tròn Chiều rộng đốt sán lớn gấp 4 lần chiều dài đốt sán Mỗi đốt sán có cả cơ quan sinh dục đực và cái Cơ quan sinh dục đực gồm nhiều tinh hoàn (300 - 400 cái) hình cầu nhỏ ở giữa đốt sán Mỗi tinh hoàn có ống dẫn tinh riêng, hợp thành ống chung thông với túi dương vật hình lê và lỗ sinh dục đực Cơ quan sinh dục cái kép, gồm buồng trứng phân thùy hình quạt, tuyến dinh dưỡng, tử cung và âm đạo có lỗ thông ra cạnh bên đốt sán Phần sau mỗi đốt sán có tuyến gian đốt hình hoa thị xếp thành hàng ngang Đốt sán già có tử cung hình túi chứa đầy trứng sán Trứng

của M expansa hình ba cạnh hoặc bốn cạnh hơi tròn, trong ấu trùng có 6 móc được bao

bọc trong cơ quan hình lê Kích thước trứng khoảng 0,05 x 0,06 mm

M benedeni sán dài 2 - 4m, đốt rộng hơn một chút so với đốt của M expansa

Đầu có 4 giác bám tròn, sâu

Nhìn chung, hình thái của sán dây M benedeni tương đối giống với M expansa Có một điểm quan trọng để phân biệt 2 loài là sự sắp xếp của tuyến gian

đốt Ở loại này tuyến gian đốt có dạng vạch, nằm tập trung ở giữa đốt sán Trứng sán cũng có hình 3 cạnh hoặc 4 cạnh hơi tròn, trong ấu trùng có 6 móc, kích thước trứng khoảng 0,063 x 0,086mm

1.5.4 Phương pháp phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật phân tử PCR

1.5.4.1 Kỹ thuật PCR (Polymerasa Chain Reaction)

* Giới thiệu

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerasa Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp – phản ứng khuếch đại gen) Đây là kỹ thuật của sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt, kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 tại công ty Cetus; mặc dù nguyên tắc này đã được mô tả chi tiết trước đó một thập niên bởi Khorana và cộng

sự, (Kleppe và cộng sự, 1971; Panet và cộng sự, 1974), và được giới thiệu lần đầu

tiên tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận được giải thưởng Nobel Hoá sinh học vào năm 1993 Kể từ đó đã tạo nên một tác

động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới

* Nguyên lí

Nguyên lý nhân gen trong tế bào:

DNA là vật chất di truyền của cơ thể sống quy định đặc tính của cơ thể (ngoại trừ một số loại virus có vật chất di truyền là RNA) Đối với những sinh vật có cấu trúc tế bào nhân chuẩn, các phân tử DNA tồn tại dưới dạng kết hợp với protein thành các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào Ngoài ra, tại các cơ quan khác như ty thể và lạp thể (ở thực vật) cũng chứa DNA ở dạng plasmid

Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thường chỉ được nhân lên trong quá trình phân bào nguyên nhiễm Để thực hiện được quá trình này, đòi hỏi phải có mặt enzyme DNA polymerasa, sự tham gia của các đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn vào vào sợi DNA khuôn và các dNTPs làm nguồn cung cấp nucleotit Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép được mở xuắn tách thành các sợi DNA sợi đơn Dưới tác dụng của enzyme DNA polymerase, quá trình tổng hợp DNA được xảy ra theo cách gắn lần lượt các nucleotit vào đoạn mồi để

kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA khuôn

Nguyên lý của kỹ thuật PCR

Nguyên lý của PCR là dùng mồi nucleotide lai bổ sung vào một đầu của đoạn DNA cần tìm rồi men DNA polymerase sẽ khuếch đại và nhân bội lên theo một dây chuyền phản ứng, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới từ đó

dễ dàng cho việc quan sát và xét nghiệm

Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:

+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase

+ Kết hợp với enzyme DNA polymerasa chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp

+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt, chủ động

Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt Ðây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự

có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerasa được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng) Phần lớn các DNA polymerasa chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerasa không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử Nhưng các polymerasa chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 1000C Ở nhiệt độ này DNA

sẽ bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi ra và ở dạng thẳng) Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài

* Chu kỳ nhiệt

Có 3 giai đoạn chính trong phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ)

• Giai đoạn biến tính (denaturation):

Tách chuỗi DNA từ sợi đôi tách thành 2 sợi đơn Nhiệt độ tăng lên 94 - 96°C

để tách hai sợi DNA ra Bước này gọi là biến tính, nhiệt độ tăng lên sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen của chuỗi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian ở giai đoạn này khoảng: 1 - 2 phút

• Giai đoạn bắt cặp (annealing):

Gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính khoảng 45 - 60°C

Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian bắt cặp từ 1 2 phút

• Giai đoạn kéo dài (extension):

Tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc DNA polymerasa gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerasa Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerasa và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại Như một quy tắc 1000bp/1 phút Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau

n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n

* Phân loại phản ứng PCR

RT- PCR (Reverse Transcriptase PCR)

Là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần phát hiện là RNA Để có thể thực hiện được PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược (RT, reverse transcription) thành cDNA, rồi sau đó sẽ dùng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này Vì phải thực hiện hai giai đoạn RT rồi mới đến PCR nên kỹ thuật này gọi là kỹ thuật RT-PCR

Giai đoạn phiên mã ngược (RT) là một giai đoạn hết sức quan trọng quyết định sự thành công của RT-PCR Enzyme được sử dụng trong giai đoạn này là Reverse transcriptase được tách chiết từ Moloney murine leukemia virus (M-MLV) gây bệnh ung thư bạch cầu trên chuột, hay từ Avian myeloblastosis virus (AMV) gây bệnh ung tủy trên gia cầm Enzyme reverse transcriptase là một loại DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cNA, complementary DNA, do vậy giai đoạn RT còn được gọi là giai đoạn tổng hợp cDNA

Để enzyme reverse transcriptase có thể tổng hợp được cDNA từ sợi khuôn mạch đơn RNA, cần phải có mồi đặc hiệu bám lên trên sợi khuôn RNA và cũng cần dNTP để enzyme reverse transcriptase khi trượt trên mạch khuôn RNA có thể kéo dài được mạch cDNA, và mồi này có thể là mồi xuôi hay mồi ngược của giai đoạn PCR tùy chiều 5’ đến 3’ của RNA đích bắt cặp được mồi nào Nhà nghiên cứu cũng

có thể sử dụng mồi chỉ có 6 nucleotide có thứ tự ngẫu nhiên gọi là mồi ngẫu nhiên (random hexamer) để phiên mã ngược toàn bộ RNA có trong mẫu thành các cDNA.Tuy nhiên mồi ngẫu nhiên chỉ có hiệu quả để phiên mã ngược các đoạn cDNA dài dưới 600 bases, còn nếu muốn có những đoạn cDNA dài trên 600bps thì phải dùng mồi đặc hiệu mới hiệu quả Ngoài mồi đặc hiệu và mồi ngẫu nhiên, nếu muốn có cDNA của mRNA biểu hiện từ một gene nhà nghiên cứu có thể dùng mồi Oligo(dT)15 (gọi là mồi poly T) vì mRNA luôn có đuôi là poly(A)+ Mồi Oligo(dT)15 thường được dùng để làm thư viện cDNA của biểu hiện gene hay là dùng để phát hiện vi khuẩn sống trong bệnh phẩm

Đối tượng của RT là RNA đích Bản chất của RNA là rất dễ bị phân hủy trong môi trường cũng như bị enzyme RNAse tiết ra từ các vi sinh vật ở trong môi trường, chai lọ, thiết bị dụng cụ và dung dịch Enzyme RNAse lại rất bền, khó hủy bởi nhiệt

độ Do vậy thao tác trong pha chế các thuốc thử để pha phản ứng RT phải tuyệt đối tôn trọng nguyên tắc vô trùng và thực hiện với các dụng cụ, thiết bị, thuốc thử tinh sạch Dung dịch RT sau khi pha xong nên được sử dụng ngay bằng cách cho mẫu chứa RNA đích vào Sau đó ống nghiệm phản ứng được giữ ở nhiệt độ 420C trong 10-15 phút để mồi bắt cặp vào sợi khuôn RNA và enzyme reverse transcriptase tổng hợp được cDNA Nếu dùng mồi ngẫu nhiên thì trước khi ủ 420C, nên để ống nghiệm phản ứng ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 10 phút để mồi bắt cặp vào sợi RNA khuôn Nếu dùng mồi đặc hiệu thì thời gian ủ 420C có thể kéo dài đến 60 phút Sau khi hoàn tất tổng hợp cDNA ở 420C, enzyme reverse transcriptase phải hủy diệt đi bằng cách đưa ống nghiệm phản ứng lên 850C trong vòng 5 phút Sản phẩm cDNA này sãn sàng đưa đi khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu Nếu chưa thực hiện PCR thì có thể giữ sản phẩm cDNA ở tủ đông

Có hai phương pháp thực hiện PT-PCR Đó là phương pháp RT-PCR hai bước

và phương pháp RT-PCR một bước

Trong phương pháp RT-PCR hai bước, người làm thí nghiệm thực hiện giai đoạn RT để tổng hợp cDNA trong một ống nghiệm, sau đó lấy sản phẩm cDNA cho vào ống nghiệm PCR có chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để chạy giai đoạn PCR khuếch đại trình tự DNA đích muốn tìm Phương pháp này sẽ có nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại do phải mở nắp tube PCR để cho sản phẩm cDNA của giai đoạn RT vào Tuy nhiên ngày nay nguy cơ này hoàn toàn có thể bị loại bỏ nhờ việc cho dUTP và UNG vào PCR mix của giai đoạn PCR

Trong phương pháp RT-PCR một bước, người làm thí nghiệm thực hiện cả hai giai đoạn RT và giai đoạn PCR trong cùng một ống phản ứng, nghĩa là sau khi cho tách chiết RNA từ mẫu thử cho vào ống phản ứng, giai đoạn RT sẽ được thực hiện trước và sau đó giai đoạn PCR sẽ đi liền theo sau Để thực hiện được phản ứng PT-PCR một bước, trong ống phản ứng phải có đủ thành phần hóa chất và thuốc thử để chạy RT và PCR, tức là phải có enzyme reverse transcriptase sử dụng cho enzyme

Taq polymerase sử dụng cho PCR Trong phương pháp RT-PCR một bước, toàn bộ

sản phẩm cDNA đều tham gia vào PCR và không nhất thiết phải có mồi riêng cho

RT vì chính mồi của PCR sẽ được sủ dụng làm mồi cho RT RT-PCR một bước được nhieeug người thích hơn là RT-PCR hai bước vì tiện lợi hơn và tránh được nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại do phải mở tube PCR để cho sản phẩm cDNA vào Tuy nhiên trong RT-PCR một bước không thể sư dụng phương pháp chống ngoại nhiễm bằng cách cho dUTP và enzyme UNG vào dung dịch phản ứng

vì UNG sẽ bắt cặp toàn bộ cDNA tổng hợp được trong giai đoạn RT

PCR đa mồi ( mutiplex PCR)

Là PCR sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho các đoạn DNA đích đặc hiệu từ nhiều vi sinh vật muốn được phát hiện đồng thời Để thiết kế được Mutiplex PCR thì quan trọng nhất là phải làm sao thiết kế được các mồi có nhiệt độ bắt cặp (Ta) lên DNA đích, đồng thời các mồi này không được bắt cặp với nhau, và quan trọng

nhất là độ nhạy phát hiện từng tác nhân đích không bị giảm mà vẫn tương đương như độ nhạy của PCR đơn mồi Tuy nhiên rất khó để đạt được các điều kiện như vậy, nhất là khi muốn phát hiện trên 2 tác nhân vi sinh trực tiếp trong bệnh phẩm

Do vậy PCR đa mồi phát hiện trên 2 tác nhân vi sinh chỉ có thể áp dụng để phát hiện nhiều tác nhân vi sinh cùng một lúc trong các môi trường nuôi cấy tăng sinhvi khuẩn từ thực phẩm vì lượng DNA của vi khuẩn đích nếu có mặt sẽ hiện diện khá

nhiều trong các môi trường tăng sinh này

• Enzyme Platinum Taq polymerase (Life Technologies) và Taq Start

(Clontech): một kháng thể đơn dòng và enzyme polymerase

- Nhiệt độ thường: Chúng liên kết và làm bất hoạt enzyme taq

- Nhiệt độ cao: kháng thể bị biến tính và enzyme trở thành dạng hoạt động

• Nếu primers được thiết kế tốt và mẫu DNA nhiều thì phản ứng host start PCR là không cần thiết Kỹ thuật này rất có ích khi:

- Mẫu DNA có ít hơn 104 DNA phân tử

- Phản ứng PCR với phân tử DNA có trọng lượng lớn

- Multiplex PCR

PCR tổ (nested PCR)

Là PCR có hai giai đoạn: giai đoạn đầu là PCR dùng một cặp mồi ngoài (gọi

là PCR vòng ngoài) để khuếch đại một đoạn DNA trong đo có chứa các trình tự đặc hiệu muốn tìm, sau đó dùng sản phẩm PCR vòng ngoài này làm khuôn cho vào ống PCR có cặp mồi trong (gọi là PCR vòng trong) để khuếch đại trình tự đặc hiệu muốn tìm này

Ngoài nested PCR, còn có semi-nested hay hemi-nested PCR là biến thể của nested PCR với một mồi vòng ngoài được dùng làm một trong hai mồi của cặp mồi vòng trong Ưu điểm của nested PCR là làm tăng độ nhạy của PCR khi mà mồi cho trình tự đặc hiệu muốn tìm có độ nhạy thấp (như trong các trường hợp phải dùng mồi có degenerative base) Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là nguy cơ ngoại nhiễm cao do phải mở tube PCR vòng trong để cho sản phẩm PCR vòng ngoài vào

PCR tổ không dừng(non-stop nested PCR)

Là PCR tổ nhưng được thiết kế để cả hai giai đoạn PCR vòng ngoài và PCR vòng trong đều được thực hiện trong cùng một tube PCR nhờ vậy mà sau khi hoàn tất PCR vòng ngoài thì chạy tiếp chương trình PCR vòng trong chứ không cần dừng lại nhờ sản phẩm khuếch đại của PCR vòng ngoài trở thành bản gốc cho PCR vòng trong ngay trong cùng tube phản ứng Để có thể làm được non-stop nested PCR, nhà nghiên cứu phải thiết kế mồi vòng ngoài sao cho có nhiệt độ bắt cặp cao hơn 80C đến 100C so với mồi trong để khi chạy PCR vòng ngoài với nhiệt độ bắt cặp thích hợp cho PCR vòng ngoài sẽ không có sự bắt cặp của mồi PCR vòng trong lên DNA đích, đồng thời nhà nghiên cứu cũng phải tối ưu cho được tỷ lệ mồi vòng ngoài so với mồi vòng trong sao cho sau khi chạy PCR vòng trong sẽ không còn mồi vòng ngoài để có thể tiếp tục bắt cặp lên DNA đích Ưu điểm của non-stop nested PCR là vừa có độ nhạy cao, vừa tránh được nguy cơ ngoại nhiễm mà nested PCR phải gặp

vì phải mở nắp tube PCR vòng trong để cho sản phẩm PCR vòng ngoài vào, và đông thời có thể áp dụng phương pháp chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại bằng cách thêm dUTP và UGN vào PCR mix (phương pháp này không thể áp dụng cho nested PCR)

Touch-down PCR

Là PCR có chương trình luân nhiệt có nhiệt độ bắt cặp giảm dần trong 10 hay

20 chu kỳ đầu, cứ sau mỗi chu kỳ giảm 0,50C đến 10C, hay chỉ qua 1 đến 2 bước giảm nhiệt độ với mỗi bước giảm 50C, để đạt đến nhiệt độ bắt cặp thích hợp nhất

của mồi Trong 10-20 chu kỳ có nhiệt độ bắt cặp giảm dần hay giảm 2 bước đến nhiệt độ bắt cặp thích hợp nhất của mồi

Touch-down PCR thường được nhà nghiên cứu sử dụng để làm tăng độ đặc hiệu của mồi khi bắt cặp vào DNA đích Lý do là nhờ nhiệt độ bắt cặp hạ xuống dần

sẽ làm cho mồi được đưa dần đến vị trí bổ sung nhất với nó trên mạch khuôn của DNA đích, tránh được hiện tượng mồi bắt cặp vào các vị trí không đặc hiệu Chúng tôi thường sử dụng touch-down PCR một khi PCR cho nhiều sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu biểu hiện trên điện di thấy nhiều vạch phụ mà các giải pháp điều chỉnh khác không giải quyết được

Realtime PCR

• Là phương pháp phát hiện và định lượng sản phẩm khuyếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên

về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang

• Sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, các probe (mẫu dò) hoặc primer (mồi) đặc hiệu chuỗi được đánh dấu huỳnh quang (taqman PCR)

• Thiết bị ổn nhiệt đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuyếch đại xảy ra

• Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuyếch đại trong mỗi chu kỳ

Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0,5 - 5 mM Chính ion Mg2+ gắn liên kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi Nồng độ MgCl2 cao

sẽ tạo nhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCl2 quá thấp sẽ không tạo sản phẩm PCR

• dNTP

(Deoxy nucleoside triphosphate), tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích dNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là Adenine (dATP) hay Thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay Guanine (dGTP), ở carbone số 1 (C1) Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) của phân tử deoxyribose này và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi bổ sung trên chuỗi DNA đích Năng lượng để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lượng của triphosphate trên dNTP Ðó cũng chính là lý do tại sao phải là dNTP chứ không phải là dNDP (diphosphate) hay dNMP(monophosphate)

• Mồi (primer)

Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng

dây chuyền tổng hợp DNA Chúng nhận ra phần DNA cần được nhân lên, bắt cặp

bổ sung với một đầu của DNA mẫu và tạo ra vị trí bắt đầu tái bản Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer) Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng

Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính:

- Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu

- Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi

• Enzyme DNA polymerase (Taq)

Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp, phải là men polymerase chịu được nhiệt độ cao Vào thập niên

1960, nhà vi sinh vật học Thomas Brock đã đến Công viên Quốc gia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) để nghiên cứu các vi sinh vật ưa nhiệt sống trong suối nước nóng 80 - 900C Ông đã phát hiện một loài vi khuẩn phát triển mạnh ở nhiệt độ cao,

có tên là Thermus aquaticus Hai mươi năm sau, các nhà khoa học của tập đoàn

Cetus (Tập đoàn Công nghệ Sinh học California) đã nhận thấy rằng DNA

polymerase từ Thermus aquaticus (Taq-polymerase) có khả năng giải quyết vấn đề

của enzyme biến tính sau mỗi chu kỳ DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR lần đầu tiên được bán trên thị trường là Taq-polymerase Từ đó đến nay, một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã được khám phá và người ta đã tách chiết thêm được các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR

như Vent- polymerase (Tli-polymerase), Pfu- polymerase,rTth…

• DNA mẫu (DNA template):

Là mẫu DNA mà chúng ta sẽ khuếch đại Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu DNA khuôn có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất

1.5.4.2 Phân loại sán dây dựa vào kỹ thuật PCR

PCR được ứng dụng cho giám định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh vật, trong đó có ký sinh trùng (Chandler và Colitz, 2006; Littlewood, 2008) và trở thành một công cụ không thể thiếu được trong công tác giám định, phát hiên sinh vật (kể cả ký sinh trùng) gây bệnh bằng kỹ thuật cao Dễ làm, có tính nhạy và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một lượng rất ít khuôn DNA của đối tượng sinh vật bất kể giai đoạn sinh trưởng nào, PCR đã có thể cho sản phẩm với độ chính xác cao về loại sinh vật cần nghiên cứu Với lợi thế như vậy, PCR đã thực sự được ứng dụng rộng rãi trong mọi lĩnh vực, trước hết là chẩn đoán phân tử xác định và phân biệt các loài gây bệnh (Ishmael và Stellato, 2008)

Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để giám định thành phần loài và chẩn đoán phân biệt các loài giun/sán ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR sử dụng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể đã được một số tác giả thực hiện có hiệu quả, đặc biệt trong 10

năm gần đây Trước hết, đó là nghiên cứu xác định loài sán dây châu Á Taenia asiatica đầu tiên ở Việt Nam (Lê Thanh Hòa và cs, 2002; Nguyễn Văn Đề, Lê

Thanh Hoà, 2006) Sau đó các loài sán khác lần lượt đã được thẩm định thành phần

loài như: sán lá gan nhỏ C sinensis, sán lá ruột Fasciolopsis buski, sán lá gan lớn Fasciola gigantica, sán lá phổi Paragonimus heterotremus, P vietnamensis, P proliferus (Le và cs, 2006; Doanh và cs, 2007; 2008; 2009); sán dây T saginata, T solium ký sinh trên người, ấu trùng sán dây lợn trên lợn và trên người cũng đã được

thẩm định bằng sinh học phân tử hệ gen ty thể (Lê Thanh Hoà và cs, 2002; Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà, 2006) và lần lượt một số chuỗi gen đã đăng ký trong Ngân hàng Gen thế giới Những kết quả bước đầu này đã góp phần giải quyết một số vấn

đề trong xác định thành phần loài giun sán tại Việt Nam và đã làm cơ sở khoa học

cho việc nghiên cứu kit để chẩn đoán xác định bệnh giun sán Đồng thời đó cũng là

cơ sở dữ liệu quý báu cho khoa học trong nghiên cứu đa dạng sinh học và đóng góp vào hoạch định chiến lược phòng chống giun sán có hiệu quả ở Việt Nam

Đối với lĩnh vực ký sinh trùng, kỹ thuật phân tử đã và đang được sử dụng trong việc chẩn đoán xác định và chẩn đoán phân biệt với mục đích giám định, phân loại các loài ký sinh trùng Các kỹ thuật thường dùng là PCR thông thường, PCR

lồng, PCR đa mồi và real-time PCR (Kubista et al., 2006)